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I vettori genici per il trattamento della malattia polmonare della fibrosi cistica dovrebbero essere indirizzati alle vie aeree conduttive perché la trasduzione polmonare periferica non fornisce benefici terapeutici. L'efficienza della trasduzione virale è direttamente correlata al tempo di residenza del vettore. Tuttavia, i fluidi di somministrazione come i portatori genici si diffondono naturalmente negli alveoli durante l'inspirazione e le particelle terapeutiche di qualsiasi forma vengono rapidamente eliminate dal trasporto mucociliare. Prolungare il tempo di residenza dei portatori genici nelle vie aeree è importante ma difficile da ottenere. Le particelle magnetiche coniugate al portatore genico che possono essere dirette sulla superficie delle vie aeree possono migliorare il targeting regionale. A causa delle difficoltà della visualizzazione in vivo, il comportamento di queste piccole particelle magnetiche sulla superficie delle vie aeree in presenza di un campo magnetico applicato è poco compreso. Lo scopo di questo studio era di utilizzare l'imaging di sincrotrone per visualizzare il movimento in vivo di una serie di particelle magnetiche nella trachea di ratti anestetizzati per esaminare le dinamiche e i modelli del comportamento delle particelle individuali e in massa in vivo. Abbiamo quindi anche valutato se la somministrazione di particelle magnetiche lentivirali in presenza di un campo magnetico avrebbe aumentato l'efficienza di trasduzione in trachea di ratto. L'imaging a raggi X con sincrotrone rivela il comportamento delle particelle magnetiche nei campi magnetici stazionari e in movimento in vitro e in vivo. Le particelle non possono essere facilmente trascinate lungo la superficie delle vie aeree viventi con i magneti, ma durante il trasporto i depositi si concentrano nel campo visivo dove il campo magnetico è più forte. L'efficienza di trasduzione è stata inoltre aumentata di sei volte quando le particelle magnetiche lentivirali sono state somministrate in presenza di un campo magnetico. Insieme, questi risultati suggeriscono che le particelle magnetiche lentivirali e i campi magnetici possono essere approcci preziosi per migliorare il targeting del vettore genico e aumentare i livelli di trasduzione nelle vie aeree conduttrici in vivo.
La fibrosi cistica (FC) è causata da una variazione in un singolo gene chiamato regolatore della conduttanza transmembrana della FC (CFTR). La proteina CFTR è un canale ionico presente in molte cellule epiteliali in tutto il corpo, comprese le vie aeree conduttrici, un sito importante nella patogenesi della FC. I difetti della CFTR causano un trasporto anomalo di acqua, disidratando la superficie delle vie aeree e riducendo la profondità dello strato di liquido superficiale delle vie aeree (ASL). Ciò compromette anche la capacità del sistema di trasporto mucociliare (MCT) di eliminare particelle inalate e patogeni dalle vie aeree. Il nostro obiettivo è sviluppare una terapia genica lentivirale (LV) per fornire la copia corretta del gene CFTR e migliorare ASL, MCT e la salute polmonare, e continuare a sviluppare nuove tecnologie in grado di misurare questi parametri in vivo1.
I vettori LV sono uno dei principali candidati per la terapia genica delle vie aeree nella fibrosi cistica, principalmente perché possono integrare in modo permanente il gene terapeutico nelle cellule basali delle vie aeree (cellule staminali delle vie aeree). Ciò è importante perché possono ripristinare la normale idratazione e la clearance del muco differenziandosi in cellule di superficie delle vie aeree associate alla fibrosi cistica con geni corretti funzionali, con conseguenti benefici per tutta la vita. I vettori LV dovrebbero essere diretti contro le vie aeree conduttive, poiché è qui che inizia la malattia polmonare da fibrosi cistica. La somministrazione del vettore più in profondità nel polmone può comportare la trasduzione alveolare, ma ciò non ha alcun beneficio terapeutico nella fibrosi cistica. Tuttavia, i fluidi come i trasportatori del gene migrano naturalmente verso gli alveoli durante l'inspirazione dopo la somministrazione3,4 e le particelle terapeutiche vengono rapidamente eliminate nella cavità orale tramite MCT. L'efficienza della trasduzione del LV è direttamente correlata alla durata del tempo in cui il vettore rimane accanto alle cellule bersaglio per consentire l'assorbimento cellulare, il "tempo di residenza"5, che viene facilmente ridotto dal tipico flusso d'aria regionale nonché dalla cattura coordinata del muco delle particelle e dalla MCT. Per la fibrosi cistica, la capacità di prolungare il tempo di residenza del LV all'interno Le vie aeree sono importanti per raggiungere elevati livelli di trasduzione in questa regione, ma finora si sono rivelate difficili.
Per superare questo ostacolo, suggeriamo che le particelle magnetiche LV (MP) possano aiutare in due modi complementari. Innanzitutto, possono essere guidate magneticamente sulla superficie delle vie aeree per migliorare il targeting e aiutare le particelle trasportatrici del gene a risiedere nella regione desiderata delle vie aeree; e ASL) per spostarsi allo strato cellulare 6. Le MP sono state ampiamente utilizzate come veicoli di somministrazione mirata di farmaci quando si legano ad anticorpi, farmaci chemioterapici o altre piccole molecole che si attaccano alle membrane cellulari o si legano ai recettori della superficie cellulare pertinenti e si accumulano nei siti tumorali in presenza di elettricità statica. Campi magnetici per il trattamento del cancro 7. Altre tecniche "ipertermiche" mirano a riscaldare le MP quando sono esposte a campi magnetici oscillanti, distruggendo così le cellule tumorali. Il principio della trasfezione magnetica, in cui un campo magnetico viene utilizzato come agente di trasfezione per migliorare il trasferimento del DNA alle cellule, è comunemente utilizzato in vitro utilizzando una gamma di vettori genici non virali e virali per linee cellulari difficili da trasdurre. L'efficacia della magnetotrasfezione di LV è stata stabilita, con la somministrazione in vitro di LV-MP a una linea cellulare epiteliale bronchiale umana in presenza di un campo magnetico statico, aumentando l'efficienza di trasduzione di 186 volte rispetto al solo vettore LV. LV-MP è stato applicato anche a un modello di CF in vitro, in cui la trasfezione magnetica ha aumentato la trasduzione di LV nelle colture di interfaccia aria-liquido di 20 volte in presenza di espettorato di CF10. Tuttavia, la magnetotrasfezione in vivo degli organi ha ricevuto relativamente poca attenzione ed è stata valutata solo in pochi animali studi11,12,13,14,15, soprattutto nei polmoni16,17. Tuttavia, le opportunità della trasfezione magnetica nella terapia polmonare della fibrosi cistica sono chiare. Tan et al.(2020) hanno affermato che "uno studio di prova di concetto sulla somministrazione polmonare efficiente di nanoparticelle magnetiche aprirà la strada a future strategie di inalazione di CFTR per migliorare i risultati clinici nei pazienti con fibrosi cistica"6.
Il comportamento delle piccole particelle magnetiche sulle superfici delle vie aeree in presenza di un campo magnetico applicato è difficile da visualizzare e studiare e quindi poco compreso. In altri studi, abbiamo sviluppato un metodo di imaging a raggi X a contrasto di fase basato sulla propagazione di sincrotrone (PB-PCXI) per visualizzare e quantificare in modo non invasivo piccole modifiche in vivo nella profondità dell'ASL18 e nel comportamento dell'MCT19,20 per misurare direttamente l'idratazione della superficie del canale gassoso e utilizzarlo come indicatore precoce dell'efficacia del trattamento. Inoltre, il nostro metodo di valutazione dell'MCT utilizza particelle di diametro pari a 10-35 µm composte da allumina o vetro ad alto indice di rifrazione come marcatori MCT visibili utilizzando PB-PCXI21. Entrambe le tecniche sono adatte per la visualizzazione di una gamma di tipi di particelle, tra cui MP.
Grazie alla loro elevata risoluzione spaziale e temporale, le nostre tecniche di analisi ASL e MCT basate su PB-PCXI sono adatte per esaminare le dinamiche e i modelli del comportamento di particelle singole e in massa in vivo per aiutarci a comprendere e ottimizzare le tecniche di somministrazione del gene MP. L'approccio che impieghiamo qui deriva dai nostri studi che utilizzano la linea di luce SPring-8 BL20B2, in cui abbiamo visualizzato il movimento del fluido in seguito alla somministrazione di una dose di vettore fittizio nelle vie aeree nasali e polmonari dei topi per aiutare a spiegare i nostri modelli di espressione genica non uniformi osservati nei nostri studi sugli animali con la dose del vettore genico 3,4 .
Lo scopo di questo studio era di utilizzare il sincrotrone PB-PCXI per visualizzare i movimenti in vivo di una serie di MP nella trachea di ratti viventi. Questi studi di imaging PB-PCXI sono stati progettati per testare una gamma di MP, intensità di campo magnetico e posizioni per determinarne l'effetto sul movimento degli MP. Abbiamo ipotizzato che un campo magnetico applicato esternamente avrebbe aiutato gli MP rilasciati a rimanere o a spostarsi nell'area bersaglio. Questi studi ci hanno anche permesso di identificare configurazioni magnetiche che massimizzano il numero di particelle trattenute nella trachea dopo la deposizione. In una seconda serie di studi, abbiamo cercato di utilizzare questa configurazione ottimale per dimostrare il modello di trasduzione risultante dalla somministrazione in vivo di LV-MP nelle vie aeree del ratto, partendo dal presupposto che la somministrazione di LV-MP nel contesto del targeting delle vie aeree avrebbe comportato un miglioramento dell'efficienza di trasduzione del LV.
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti secondo protocolli approvati dall'Università di Adelaide (M-2019-060 e M-2020-022) e dal Comitato etico per gli animali del sincrotrone SPring-8. Gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida ARRIVE.
Tutte le immagini a raggi X sono state eseguite presso la linea di luce BL20XU presso il sincrotrone SPring-8 in Giappone, utilizzando una configurazione simile a quella descritta in precedenza21,22. In breve, la scatola sperimentale era situata a 245 m dall'anello di accumulazione del sincrotrone. Per gli studi di imaging delle particelle viene utilizzata una distanza campione-rivelatore di 0,6 m e per gli studi di imaging in vivo di 0,3 m per generare effetti di contrasto di fase. È stata utilizzata un'energia del fascio monocromatico di 25 keV. Le immagini sono state acquisite utilizzando un convertitore di raggi X ad alta risoluzione (SPring-8 BM3) accoppiato a un rivelatore sCMOS. Il convertitore converte i raggi X in luce visibile utilizzando uno scintillatore spesso 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), che viene quindi diretto a un sensore sCMOS utilizzando un obiettivo per microscopio × 10 (NA 0,3). Il rivelatore sCMOS era Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Giappone) con una matrice dimensioni di 2048 × 2048 pixel e una dimensione pixel grezza di 6,5 × 6,5 µm. Questa configurazione produce una dimensione pixel isotropica effettiva di 0,51 µm e un campo visivo di circa 1,1 mm × 1,1 mm. È stata scelta una lunghezza di esposizione di 100 ms per massimizzare il rapporto segnale/rumore delle particelle magnetiche all'interno e all'esterno delle vie aeree, riducendo al minimo gli artefatti da movimento indotti dalla respirazione. Per gli studi in vivo, un otturatore a raggi X veloce è stato posizionato nel percorso dei raggi X per limitare la dose di radiazioni bloccando il fascio di raggi X tra le esposizioni.
Il trasportatore LV non è stato utilizzato in nessuno studio di imaging SPring-8 PB-PCXI perché la camera di imaging BL20XU non è certificata di livello di biosicurezza 2. Invece, abbiamo selezionato una gamma di MP ben caratterizzati da due fornitori commerciali, che coprono una gamma di dimensioni, materiali, concentrazioni di ferro e applicazioni, prima per capire come i campi magnetici influenzano il movimento degli MP all'interno dei capillari di vetro e poi nelle vie aeree viventi. sulla superficie. Le dimensioni degli MP variano da 0,25 a 18 μm e sono realizzati con vari materiali (vedere Tabella 1), ma la composizione di ciascun campione, inclusa la dimensione delle particelle magnetiche all'interno dell'MP, è sconosciuta. Sulla base dei nostri approfonditi studi MCT 19, 20, 21, 23, 24, prevediamo che MP di dimensioni pari a 5 μm possano essere visualizzati sulla superficie delle vie aeree tracheali, ad esempio sottraendo fotogrammi consecutivi per vedere una maggiore visibilità del movimento degli MP. Un singolo MP di dimensioni pari a 0,25 μm è più piccolo della risoluzione del dispositivo di imaging, ma si prevede che PB-PCXI rilevi il contrasto del loro volume e il movimento del fluido superficiale su cui vengono depositati dopo la deposizione.
I campioni per ciascun MP nella Tabella 1 sono stati preparati in capillari di vetro da 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) con un diametro interno di 0,63 mm. Le particelle corpuscolari sono disponibili in acqua, mentre le particelle CombiMag sono disponibili nel fluido proprietario del produttore. Ogni provetta è riempita a metà con liquido (circa 11 μl) e posizionata sul portacampione (vedere Figura 1). I capillari di vetro sono stati posizionati orizzontalmente sul piatto portacampione nella scatola di imaging, rispettivamente, e hanno posizionato i bordi del fluido. Un magnete in terre rare al neodimio ferro boro (NdFeB) con guscio di nichel da 19 mm di diametro (28 mm di lunghezza) (N35, n. cat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) con una magnetizzazione residua di 1,17 Tesla è stato collegato a un piatto di traslazione separato per ottenere Modificare la sua posizione da remoto durante l'imaging. L'acquisizione delle immagini a raggi X inizia quando il magnete è posizionato a circa 30 mm sopra il campione e le immagini vengono acquisite a una velocità di 4 fotogrammi al secondo. Durante l'acquisizione delle immagini, il magnete è stato avvicinato al tubo capillare in vetro (a circa 1 mm di distanza) e poi spostato lungo il tubo per valutare gli effetti dell'intensità del campo e della posizione.
Configurazione di imaging in vitro contenente campioni MP in capillari di vetro sulla fase di traslazione xy del campione. Il percorso del fascio di raggi X è contrassegnato da una linea tratteggiata rossa.
Una volta stabilita la visibilità in vitro degli MP, un sottoinsieme di essi è stato testato in vivo su ratti albini Wistar di tipo selvatico (~12 settimane di età, ~200 g). 0,24 mg/kg di medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Giappone), 3,2 mg/kg di midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Giappone) e 4 mg/kg di butorfanolo (Vetorphale®, Meiji Seika). I ratti sono stati anestetizzati con una miscela di Pharma), Giappone) mediante iniezione intraperitoneale. Dopo l'anestesia, sono stati preparati per l'imaging rimuovendo la pelliccia attorno alla trachea, inserendo un tubo endotracheale (ET; cannula iv da 16 Ga, Terumo BCT) e immobilizzandoli in posizione supina su una piastra per imaging personalizzata contenente una borsa termica per mantenere la temperatura corporea 22. La piastra per imaging è stata quindi fissata al palco di traslazione del campione nella scatola per imaging con una leggera angolazione per allineare la trachea orizzontalmente nel Immagine radiografica, come mostrato nella Figura 2a.
(a) Configurazione di imaging in vivo nel box di imaging SPring-8, il percorso del fascio di raggi X è contrassegnato da una linea tratteggiata rossa. (b,c) La localizzazione del magnete sulla trachea è stata eseguita in remoto utilizzando due telecamere IP montate ortogonalmente. Sul lato sinistro dell'immagine sullo schermo, è possibile vedere l'anello di filo che tiene la testa e la cannula di somministrazione in posizione all'interno del tubo endotracheale.
Un sistema di pompa a siringa a controllo remoto (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) che utilizza una siringa di vetro da 100 μl è stato collegato al tubo PE10 (diametro esterno 0,61 mm, diametro interno 0,28 mm) tramite un ago da 30 Ga. Contrassegnare il tubo per assicurarsi che la punta sia nella posizione corretta nella trachea durante l'inserimento del tubo ET. Utilizzando la micropompa, lo stantuffo della siringa è stato ritirato mentre la punta del tubo era immersa nel campione MP da somministrare. Il tubo di somministrazione caricato è stato quindi inserito nel tubo endotracheale, posizionando la punta all'interno della parte più forte del nostro campo magnetico applicato previsto. L'acquisizione delle immagini è stata controllata utilizzando un rilevatore di respirazione collegato alla nostra scatola di temporizzazione basata su Arduino e tutti i segnali (ad esempio temperatura, respirazione, apertura/chiusura dell'otturatore e acquisizione delle immagini) sono stati registrati utilizzando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Durante l'imaging Quando l'involucro era inaccessibile, due telecamere IP (Panasonic BB-SC382) erano posizionati a circa 90° l'uno rispetto all'altro e sono stati utilizzati per monitorare la posizione del magnete rispetto alla trachea durante l'imaging (Fig. 2b,c). Per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, è stata acquisita un'immagine per respiro durante il plateau del flusso di fine espirazione.
Un magnete è collegato a una seconda fase che può essere posizionata in remoto dall'esterno dell'alloggiamento per l'imaging. Sono state testate varie posizioni e configurazioni del magnete, tra cui: montato a un angolo di circa 30° sopra la trachea (configurazioni illustrate nelle Figure 2a e 3a); un magnete sopra l'animale e l'altro sotto, con i poli impostati per attrarsi (Figura 3b); un magnete sopra l'animale e l'altro sotto, con i poli impostati per respingersi (Figura 3c); e un magnete sopra e perpendicolare alla trachea (Figura 3d). Una volta che l'animale e il magnete sono configurati e il MP da testare è caricato nella pompa a siringa, somministrare una dose di 50 μl a una velocità di 4 μl/sec durante l'acquisizione delle immagini. Il magnete viene quindi spostato avanti e indietro lungo o lateralmente attraverso la trachea continuando ad acquisire immagini.
Configurazione del magnete per l'imaging in vivo (a) un singolo magnete sopra la trachea con un angolo di circa 30°, (b) due magneti impostati per attrarsi, (c) due magneti impostati per respingersi, (d) un singolo magnete sopra e perpendicolarmente alla trachea. L'osservatore guardava in basso dalla bocca ai polmoni attraverso la trachea e il fascio di raggi X attraversava il lato sinistro del ratto ed usciva dal lato destro. Il magnete viene spostato lungo la lunghezza delle vie aeree oppure a sinistra e a destra sopra la trachea nella direzione del fascio di raggi X.
Abbiamo anche cercato di determinare la visibilità e il comportamento delle particelle nelle vie aeree in assenza di respirazione e movimento cardiaco confondenti. Pertanto, al termine del periodo di imaging, gli animali sono stati sacrificati per overdose di pentobarbital (Somnoneptil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Alcuni animali sono stati lasciati sulla piattaforma di imaging e, una volta cessati respiro e battito cardiaco, il processo di imaging è stato ripetuto, aggiungendo un'ulteriore dose di MP se non era visibile MP sulla superficie delle vie aeree.
Le immagini acquisite sono state corrette in campo piatto e in campo scuro e poi assemblate in un filmato (20 fotogrammi al secondo; 15-25 volte la velocità normale a seconda della frequenza respiratoria) utilizzando uno script personalizzato scritto in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tutti gli studi sulla somministrazione del vettore genico LV sono stati condotti presso il Laboratory Animal Research Facility dell'Università di Adelaide e miravano a utilizzare i risultati dell'esperimento SPring-8 per valutare se la somministrazione di LV-MP in presenza di un campo magnetico potesse migliorare il trasferimento genico in vivo. Per valutare gli effetti di MP e campo magnetico, sono stati trattati due gruppi di animali: a un gruppo è stato somministrato LV-MP con un magnete posizionato, mentre l'altro gruppo ha ricevuto un gruppo di controllo con LV-MP senza magnete.
I vettori del gene LV sono stati generati utilizzando metodi precedentemente descritti 25, 26. Il vettore LacZ esprime il gene della beta-galattosidasi localizzato nel nucleo guidato dal promotore costitutivo MPSV (LV-LacZ), che produce un prodotto di reazione blu nelle cellule trasdotte, visibile nei fronti del tessuto polmonare e nelle sezioni tissutali. La titolazione è stata eseguita nelle colture cellulari contando manualmente il numero di cellule LacZ positive con un emocitometro per calcolare il titolo in TU/ml. I vettori vengono crioconservati a -80 °C, scongelati prima dell'uso e legati a CombiMag miscelando in un rapporto 1:1 e incubando su ghiaccio per almeno 30 minuti prima della somministrazione.
Ratti Sprague Dawley normali (n = 3/gruppo, ~2-3 sono stati anestetizzati per via intraperitoneale con una miscela di 0,4 mg/kg di medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) e 60 mg/kg di ketamina (Ilium, Australia) di un mese) tramite iniezione ip e cannulazione orale non chirurgica con una cannula ev da 16 Ga. Per garantire che il tessuto delle vie aeree tracheali riceva la trasduzione del ventricolo sinistro (LV), è stato condizionato utilizzando il nostro protocollo di perturbazione meccanica precedentemente descritto, in cui la superficie delle vie aeree tracheali è stata strofinata assialmente con un cestello metallico (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. La somministrazione tracheale di LV-MP è stata quindi eseguita in una cabina di sicurezza biologica circa 10 minuti dopo la perturbazione.
Il campo magnetico utilizzato in questo esperimento è stato configurato in modo simile allo studio di imaging a raggi X in vivo, con gli stessi magneti mantenuti sopra la trachea utilizzando clip per stent di distillazione (Figura 4). Un volume di 50 μl (2 aliquote da 25 μl) di LV-MP è stato somministrato nella trachea (n = 3 animali) utilizzando una pipetta contenente una punta in gel come precedentemente descritto. Un gruppo di controllo (n = 3 animali) ha ricevuto gli stessi LV-MP senza l'uso di un magnete. Dopo il completamento dell'infusione, la cannula viene rimossa dal tubo ET e l'animale viene estubato. Il magnete rimane in posizione per 10 minuti, quindi viene rimosso. I ratti hanno ricevuto una dose sottocutanea di meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguita dall'inversione dell'anestesia mediante iniezione ip di 1 mg/kg di cloridrato di atipamazolo (Antisedan, Zoetis, Australia). I ratti sono stati tenuti al caldo e monitorati fino al completo ripresa dall'anestesia.
Dispositivo di somministrazione LV-MP in una cabina di sicurezza biologica. Si può vedere il raccordo Luer grigio chiaro del tubo endotracheale che sporge dalla bocca e la punta in gel della pipetta mostrata nell'immagine viene inserita attraverso il tubo endotracheale fino alla profondità desiderata nella trachea.
Una settimana dopo la procedura di dosaggio LV-MP, gli animali sono stati sacrificati in modo umano mediante inalazione di CO2 al 100% e l'espressione di LacZ è stata valutata utilizzando il nostro trattamento standard X-gal. I tre anelli cartilaginei più caudali sono stati rimossi per garantire che eventuali danni meccanici o ritenzione di liquidi derivanti dal posizionamento del tubo endotracheale non fossero inclusi nell'analisi. Ogni trachea è stata tagliata longitudinalmente per creare due metà per l'analisi e sono state montate in una capsula contenente gomma siliconica (Sylgard, Dow Inc) utilizzando un ago Minutien (Fine Science Tools) per visualizzare la superficie luminale. La distribuzione e il modello delle cellule trasdotte sono stati confermati dalla fotografia frontale utilizzando un microscopio Nikon (SMZ1500) con una fotocamera DigiLite e il software TCapture (Tucsen Photonics, Cina). Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento 20x (inclusa l'impostazione più alta per l'intera larghezza della trachea), con l'intera lunghezza della trachea ripresa passo dopo passo, garantendo una sovrapposizione sufficiente tra ciascuna immagine per consentire l'immagine "cucitura". Le immagini di ciascuna trachea sono state quindi assemblate in un'unica immagine composita utilizzando Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) utilizzando un algoritmo di movimento planare. Le aree di espressione di LacZ nelle immagini composite della trachea di ciascun animale sono state quantificate utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come descritto in precedenza, utilizzando le impostazioni di 0,35 < Tonalità < 0,58, Saturazione > 0,15 e Valore < 0,7. Tracciando i contorni del tessuto, è stata generata manualmente una maschera in GIMP v2.10.24 per ciascuna immagine composita al fine di identificare l'area del tessuto ed evitare qualsiasi falso rilevamento dall'esterno del tessuto tracheale. Le aree colorate di tutte le immagini composite di ciascun animale sono state sommate per generare l'area colorata totale per quell'animale. L'area colorata è stata quindi divisa per l'area totale della maschera per generare l'area normalizzata.
Ogni trachea è stata inclusa in paraffina e sono state tagliate sezioni da 5 μm. Le sezioni sono state controcolorate con rosso neutro veloce per 5 minuti e le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio Nikon Eclipse E400, una fotocamera DS-Fi3 e il software di acquisizione degli elementi NIS (versione 5.20.00).
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). La significatività statistica è stata impostata a p ≤ 0,05. La normalità è stata verificata utilizzando il test di Shapiro-Wilk e le differenze nella colorazione LacZ sono state valutate utilizzando il t-test non accoppiato.
I sei MP descritti nella Tabella 1 sono stati esaminati utilizzando PCXI e la visibilità è descritta nella Tabella 2. Due MP di polistirene (MP1 e MP2; rispettivamente 18 μm e 0,25 μm) non erano visibili sotto PCXI, ma il resto dei campioni era identificabile (esempi sono mostrati nella Figura 5). MP3 e MP4 (rispettivamente 10-15% Fe3O4; 0,25 μm e 0,9 μm) sono debolmente visibili. Sebbene contenga alcune delle particelle più piccole testate, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) era la più pronunciata. Il prodotto CombiMag MP6 è difficile da individuare. In tutti i casi, la nostra capacità di rilevare MP è stata significativamente migliorata traslando il magnete avanti e indietro parallelamente al capillare. Quando i magneti si allontanavano dal capillare, le particelle si estendevano in lunghe stringhe, ma man mano che i magneti si avvicinavano e l'intensità del campo magnetico Aumentando, le stringhe di particelle si accorciavano man mano che le particelle migravano verso la superficie superiore del capillare (vedere Video supplementare S1: MP4), aumentando la densità delle particelle sulla superficie. Viceversa, quando il magnete viene rimosso dal capillare, l'intensità del campo diminuisce e le MP si riorganizzano in lunghe stringhe che si estendono dalla superficie superiore del capillare (vedere Video supplementare S2: MP4). Dopo che il magnete smette di muoversi, le particelle continuano a muoversi per un breve periodo dopo aver raggiunto la posizione di equilibrio. Quando le MP si muovono verso e lontano dalla superficie superiore del capillare, le particelle magnetiche in genere trascinano i detriti attraverso il fluido.
La visibilità di MP sotto PCXI varia significativamente tra i campioni. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. Tutte le immagini mostrate qui sono state scattate con un magnete posizionato a circa 10 mm direttamente sopra il capillare. I grandi cerchi apparenti sono bolle d'aria intrappolate nei capillari, che mostrano chiaramente le caratteristiche dei bordi bianchi e neri dell'imaging a contrasto di fase. Il riquadro rosso contiene l'ingrandimento per migliorare il contrasto. Si noti che i diametri degli schemi dei magneti in tutte le figure non sono in scala e sono circa 100 volte più grandi di quelli mostrati.
Mentre il magnete viene traslato a sinistra e a destra lungo la parte superiore del capillare, l'angolo della stringa MP cambia per allinearsi con il magnete (vedere Figura 6), delineando così le linee del campo magnetico. Per MP3-5, dopo che la corda raggiunge un angolo di soglia, le particelle vengono trascinate lungo la superficie superiore del capillare. Ciò spesso si traduce in un raggruppamento di MP in gruppi più grandi vicino a dove il campo magnetico è più intenso (vedere Video supplementare S3:MP5). Ciò è particolarmente evidente anche quando si acquisiscono immagini vicino all'estremità del capillare, che fa sì che le MP si aggreghino e si concentrino all'interfaccia fluido-aria. Le particelle in MP6, che erano più difficili da distinguere rispetto a MP3-5, non venivano trascinate mentre il magnete si muoveva lungo il capillare, ma le stringhe MP si dissociavano, lasciando le particelle nel campo visivo (vedere Video supplementare S4:MP6). In alcuni casi, quando il campo magnetico applicato veniva ridotto spostando il magnete a una grande distanza dal punto di acquisizione delle immagini, le MP rimanenti scendevano lentamente verso la superficie inferiore del tubo per gravità, pur rimanendo nella stringa. (vedere Video supplementare S5: MP3).
L'angolo della stringa MP cambia quando il magnete viene spostato verso destra sopra il capillare. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. Il riquadro rosso contiene l'ingrandimento per migliorare il contrasto. Si noti che i video supplementari sono informativi in ​​quanto rivelano importanti informazioni sulla struttura delle particelle e sulla dinamica che non possono essere visualizzate in queste immagini statiche.
I nostri test hanno dimostrato che muovere lentamente il magnete avanti e indietro lungo la trachea facilita la visualizzazione di MP nel contesto di movimenti complessi in vivo. I test in vivo non sono stati eseguiti poiché le sfere di polistirene (MP1 e MP2) non erano visibili nel capillare. Ciascuno dei restanti quattro MP è stato testato in vivo con l'asse longitudinale del magnete configurato sopra la trachea con un angolo di circa 30° rispetto alla verticale (vedere Figure 2b e 3a), poiché ciò ha prodotto catene MP più lunghe ed è stato più efficace della configurazione del magnete terminata. MP3, MP4 e MP6 non sono stati rilevati nella trachea di alcun animale vivo. Quando le vie aeree del ratto sono state sottoposte a imaging dopo che gli animali erano stati soppressi in modo umano, le particelle sono rimaste invisibili anche quando è stato aggiunto volume aggiuntivo utilizzando una pompa a siringa. MP5 aveva il più alto contenuto di ossido di ferro ed era l'unica particella visibile, ed è stata quindi utilizzata per valutare e caratterizzare il comportamento in vivo di MP.
Posizionando il magnete sulla trachea durante il parto di MP, molti MP, ma non tutti, si sono concentrati nel campo visivo. Le particelle che entrano nella trachea si osservano meglio negli animali sacrificati in modo umano. La Figura 7 e il Video supplementare S6: MP5 mostrano la rapida cattura magnetica e l'allineamento delle particelle sulla superficie della trachea ventrale, indicando che gli MP possono essere diretti verso le regioni desiderate della trachea. Cercando più distalmente lungo la trachea dopo il parto di MP, alcuni MP sono stati trovati più vicini alla carena, suggerendo che l'intensità del campo magnetico era insufficiente per raccogliere e trattenere tutti gli MP, poiché venivano somministrati attraverso la regione di massima intensità del campo magnetico durante il processo del fluido. Ciononostante, le concentrazioni di MP postpartum erano più elevate intorno all'area sottoposta a imaging, suggerendo che molti MP rimanevano nelle regioni delle vie aeree dove l'intensità del campo magnetico applicato era più elevata.
Immagini (a) prima e (b) dopo la somministrazione di MP5 nella trachea di un ratto recentemente soppresso, con il magnete posizionato direttamente sopra l'area di imaging. L'area sottoposta ad imaging si trova tra i due anelli cartilaginei. Prima della somministrazione di MP, è presente del liquido nelle vie aeree. Il riquadro rosso contiene l'ingrandimento con contrasto. Queste immagini provengono dal video mostrato nel video supplementare S6:MP5.
Traslando il magnete lungo la trachea in vivo, la catena MP ha cambiato angolazione all'interno della superficie delle vie aeree in un modo simile a quanto osservato nei capillari (vedere Figura 8 e Video supplementare S7:MP5). Tuttavia, nel nostro studio, le MP non potevano essere trascinate lungo la superficie delle vie aeree viventi come potevano accadere con i capillari. In alcuni casi, la catena MP si allunga quando il magnete si muove a sinistra e a destra. È interessante notare che abbiamo anche scoperto che la stringa di particelle sembra modificare la profondità dello strato di fluido superficiale quando il magnete viene spostato longitudinalmente lungo la trachea e si espande quando il magnete viene spostato direttamente sopra la testa e la stringa di particelle viene ruotata in posizione verticale (vedere Video supplementare S7). : MP5 a 0:09, in basso a destra). Il caratteristico schema di movimento cambiava quando il magnete veniva spostato lateralmente lungo la parte superiore della trachea (ovvero, a sinistra o a destra dell'animale anziché lungo la lunghezza della trachea). Le particelle erano ancora chiaramente visibili durante il movimento, ma quando il magnete veniva rimosso dalla trachea, le punte delle stringhe di particelle diventavano visibili (vedere il video supplementare S8:MP5, a partire da 0:08). Ciò è coerente con il comportamento MP che abbiamo osservato sotto un campo magnetico applicato in un capillare di vetro.
Immagini di esempio che mostrano MP5 nella trachea di un ratto vivo anestetizzato. (a) Il magnete viene utilizzato per acquisire immagini sopra e a sinistra della trachea, quindi (b) dopo che il magnete viene spostato verso destra. Il riquadro rosso contiene l'ingrandimento per migliorare il contrasto. Queste immagini provengono dal video mostrato nel video supplementare S7:MP5.
Quando i due poli venivano configurati in un orientamento nord-sud sopra e sotto la trachea (vale a dire attraendosi; Fig. 3b), le corde MP apparivano più lunghe e si trovavano sulla parete laterale della trachea anziché sulla superficie dorsale della trachea (vedere il video supplementare S9:MP5). Tuttavia, elevate concentrazioni di particelle in un'unica posizione (vale a dire la superficie dorsale della trachea) non venivano rilevate dopo la somministrazione di liquidi quando veniva utilizzato un dispositivo a doppio magnete, cosa che in genere accade quando viene utilizzato un dispositivo a magnete singolo. Quindi, quando un magnete veniva configurato per respingere i poli invertiti (Fig. 3c), il numero di particelle visibili nel campo visivo non sembrava aumentare dopo la somministrazione. L'impostazione di entrambe le configurazioni a doppio magnete è complessa a causa delle elevate intensità del campo magnetico che attraggono o spingono rispettivamente i magneti. L'impostazione è stata quindi modificata in un singolo magnete parallelo alle vie aeree ma che le attraversa a 90 gradi in modo che le linee di campo attraversassero la parete tracheale ortogonalmente (Fig. 3d), un orientamento progettato per determinare se fosse possibile osservare l'aggregazione di particelle sulla parete laterale. Tuttavia, in questa configurazione, non è stato rilevato alcun movimento identificabile di accumulo di MP o movimento del magnete. Sulla base di tutti questi risultati, è stata scelta una configurazione con orientamento a 30 gradi e magnete singolo (Figura 3a) per gli studi sui portatori genici in vivo.
Quando l'animale è stato ripetutamente ripreso subito dopo l'uccisione, l'assenza di movimenti tissutali confondenti ha fatto sì che si potessero distinguere linee di particelle più sottili e corte nel campo intercondrale chiaro, "ondeggianti" in linea con il moto traslazionale del magnete. Ciononostante, non è ancora possibile vedere chiaramente la presenza e il movimento delle particelle MP6.
Il titolo LV-LacZ era 1,8 × 108 TU/ml e, dopo una miscelazione 1:1 con CombiMag MP (MP6), gli animali hanno ricevuto una dose tracheale di 50 μl di 9 × 107 TU/ml di veicolo LV (ovvero 4,5 × 106 TU/ratto). In questi studi, invece di traslare il magnete durante il travaglio, abbiamo fissato il magnete in una posizione per determinare se la trasduzione LV (a) potesse essere migliorata rispetto alla somministrazione del vettore in assenza di un campo magnetico e (b) potesse essere focalizzata. Le cellule delle vie aeree vengono trasdotte in regioni bersaglio magnetiche delle vie aeree superiori.
La presenza di magneti e l'uso di CombiMag combinato con vettori LV non sembrano avere effetti negativi sulla salute degli animali, così come il nostro protocollo standard di somministrazione di vettori LV. Le immagini frontali della regione tracheale sottoposta a perturbazione meccanica (Fig. 1 supplementare) hanno indicato che c'erano livelli significativamente più elevati di trasduzione nel gruppo di animali trattati con LV-MP quando era presente il magnete (Fig. 9a). Solo una piccola quantità di colorazione blu LacZ era presente nel gruppo di controllo (Fig. 9b). La quantificazione delle aree normalizzate colorate con X-Gal ha mostrato che la somministrazione di LV-MP in presenza di un campo magnetico ha prodotto un miglioramento di circa 6 volte (Fig. 9c).
Immagini composite di esempio che mostrano la trasduzione tracheale tramite LV-MP (a) in presenza di un campo magnetico e (b) in assenza di un magnete. (c) Miglioramento statisticamente significativo nell'area di trasduzione LacZ normalizzata all'interno della trachea quando si utilizza il magnete (*p = 0,029, t-test, n = 3 per gruppo, media ± SEM).
Le sezioni colorate con rosso neutro veloce (esempio mostrato nella Figura supplementare 2) hanno mostrato che le cellule colorate con LacZ erano presenti in uno schema e in una posizione simili a quelli precedentemente riportati.
Una sfida fondamentale per la terapia genica delle vie aeree rimane la localizzazione accurata delle particelle trasportatrici nelle regioni di interesse e il raggiungimento di elevati livelli di efficienza di trasduzione nel polmone in movimento in presenza di flusso d'aria e clearance attiva del muco. Per i vettori LV progettati per trattare la malattia delle vie aeree nella fibrosi cistica, aumentare il tempo di residenza delle particelle trasportatrici all'interno delle vie aeree conduttrici è stato un obiettivo finora irraggiungibile. Come sottolineato da Castellani et al., l'uso di campi magnetici per migliorare la trasduzione presenta dei vantaggi rispetto ad altri metodi di somministrazione genica come l'elettroporazione, in quanto può combinare semplicità, economicità, localizzazione della somministrazione, maggiore efficienza e tempi di incubazione più brevi, e possibilmente una dose di vettore inferiore10. Tuttavia, la deposizione in vivo e il comportamento delle particelle magnetiche nelle vie aeree sotto l'influenza di forze magnetiche esterne non sono mai stati descritti, né è stata effettivamente dimostrata la fattibilità di questo metodo in vivo per migliorare i livelli di espressione genica nelle vie aeree viventi intatte.
I nostri esperimenti in vitro con il sincrotrone PCXI hanno dimostrato che tutte le particelle testate, ad eccezione del polistirene MP, erano visibili nell'impostazione di imaging utilizzata. In presenza di un campo magnetico, gli MP formano stringhe le cui lunghezze sono correlate al tipo di particella e all'intensità del campo magnetico (ovvero prossimità e movimento del magnete). Come mostrato nella Figura 10, le stringhe che osserviamo si formano perché ogni singola particella viene magnetizzata e induce il proprio campo magnetico locale. Questi campi separati fanno sì che altre particelle simili si aggregano e si colleghino, con movimenti di gruppo simili a stringhe dovuti alle forze locali derivanti dalle forze attrattive e repulsive locali di altre particelle.
Schema che mostra (a,b) treni di particelle generati all'interno di capillari pieni di liquido e (c,d) trachee piene d'aria. Si noti che i capillari e la trachea non sono disegnati in scala. Il pannello (a) contiene anche una descrizione del MP, che contiene particelle di Fe3O4 disposte in stringhe.
Quando il magnete è stato spostato sopra il capillare, l'angolo della stringa di particelle ha raggiunto una soglia critica per MP3-5 contenente Fe3O4, dopodiché la stringa di particelle non è più rimasta nella posizione originale, ma si è spostata lungo la superficie verso una nuova posizione. Questo effetto si verifica probabilmente perché la superficie del capillare di vetro è sufficientemente liscia da consentire questo movimento. È interessante notare che MP6 (CombiMag) non si è comportato in questo modo, probabilmente perché le particelle erano più piccole, avevano rivestimenti o cariche superficiali diversi o un fluido vettore proprietario ha influenzato la loro capacità di movimento. Anche il contrasto dell'immagine delle particelle CombiMag è più debole, suggerendo che il fluido e le particelle potrebbero avere densità simili e quindi non muoversi facilmente l'una verso l'altra. Le particelle possono anche rimanere bloccate se il magnete si muove troppo velocemente, indicando che l'intensità del campo magnetico non può sempre superare l'attrito tra le particelle nel fluido, suggerendo che forse non sorprende che l'intensità del campo magnetico e la distanza tra il magnete e l'area bersaglio siano molto importanti. Presi insieme, questi risultati suggeriscono anche che, mentre i magneti possono catturare molti MP che scorrono attraverso il bersaglio area, è improbabile che ci si possa affidare ai magneti per spostare le particelle CombiMag lungo la superficie della trachea. Pertanto, concludiamo che gli studi LV-MP in vivo dovrebbero utilizzare campi magnetici statici per colpire fisicamente regioni specifiche dell'albero delle vie aeree.
Quando le particelle vengono rilasciate nel corpo, sono difficili da identificare nel contesto di tessuti corporei complessi in movimento, ma la capacità di rilevarle è stata migliorata spostando il magnete orizzontalmente sopra la trachea per "muovere" le stringhe MP. Sebbene sia possibile ottenere immagini in tempo reale, è più facile discernere il movimento delle particelle una volta che l'animale è stato soppresso in modo umano. Le concentrazioni di MP erano generalmente più elevate in questa posizione quando il magnete era posizionato sopra l'area di imaging, sebbene alcune particelle si trovassero solitamente più lungo la trachea. Contrariamente agli studi in vitro, le particelle non possono essere trascinate lungo la trachea spostando il magnete. Questa scoperta è coerente con il modo in cui il muco che ricopre la superficie della trachea elabora tipicamente le particelle inalate, intrappolandole nel muco e successivamente eliminate dal meccanismo di clearance mucociliare.
Abbiamo ipotizzato che l'uso di magneti per l'attrazione sopra e sotto la trachea (Fig. 3b) potrebbe comportare un campo magnetico più uniforme, piuttosto che un campo magnetico altamente concentrato in un punto, portando potenzialmente a una distribuzione più uniforme delle particelle. Tuttavia, il nostro studio preliminare non ha trovato prove chiare a supporto di questa ipotesi. Allo stesso modo, la configurazione di una coppia di magneti per respingersi (Fig. 3c) non ha comportato una maggiore deposizione di particelle nell'area sottoposta a imaging. Questi due risultati dimostrano che la configurazione a doppio magnete non migliora significativamente il controllo locale del targeting MP e che le forti forze magnetiche risultanti sono difficili da configurare, rendendo questo approccio meno pratico. Analogamente, l'orientamento del magnete sopra e attraverso la trachea (Fig. 3d) non ha aumentato il numero di particelle trattenute nell'area sottoposta a imaging. Alcune di queste configurazioni alternative potrebbero non avere successo perché comportano intensità di campo magnetico inferiori all'interno dell'area di deposizione. Pertanto, la configurazione con un singolo magnete ad angolo di 30 gradi (Figura 3a) è considerata la più semplice ed efficiente metodo per test in vivo.
Lo studio LV-MP ha dimostrato che quando i vettori LV venivano combinati con CombiMag e somministrati dopo perturbazione fisica in presenza di un campo magnetico, i livelli di trasduzione aumentavano significativamente nella trachea rispetto ai controlli. Sulla base degli studi di imaging di sincrotrone e dei risultati di LacZ, il campo magnetico era apparentemente in grado di preservare il LV all'interno della trachea e ridurre il numero di particelle del vettore che penetravano immediatamente in profondità nel polmone. Tali miglioramenti del targeting possono portare a una maggiore efficacia riducendo al contempo i titoli somministrati, la trasduzione fuori bersaglio, gli effetti collaterali infiammatori e immunitari e i costi dei vettori genici. È importante notare che, secondo il produttore, CombiMag può essere utilizzato insieme ad altri metodi di trasferimento genico, compresi altri vettori virali (come AAV) e acidi nucleici.