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I vettori genici per il trattamento della malattia polmonare della fibrosi cistica dovrebbero mirare alle vie aeree di conduzione perché la trasduzione polmonare periferica non fornisce benefici terapeutici. L'efficienza della trasduzione virale è direttamente correlata al tempo di permanenza del vettore. Tuttavia, i fluidi di somministrazione come i vettori genici diffondono naturalmente negli alveoli durante l'inspirazione e le particelle terapeutiche di qualsiasi forma vengono rapidamente eliminate dal trasporto mucociliare. Prolungare il tempo di permanenza dei vettori genici nelle vie aeree è importante ma difficile da ottenere. Le particelle magnetiche coniugate ai vettori genici che possono essere dirette alla superficie delle vie aeree possono migliorare il targeting regionale. A causa delle difficoltà di visualizzazione in vivo, il comportamento di tali piccole particelle magnetiche sulla superficie delle vie aeree in presenza di un campo magnetico applicato è poco compreso. Lo scopo di questo studio era di utilizzare l'imaging a sincrotrone per visualizzare il movimento in vivo di una serie di particelle magnetiche nella trachea di ratti anestetizzati per esaminare la dinamica e i modelli del comportamento delle singole particelle e del loro insieme in vivo. Abbiamo quindi anche valutato se la somministrazione di particelle magnetiche lentivirali in presenza di un campo magnetico avrebbe aumentato l'efficienza di trasduzione nel ratto trachea. L'imaging a raggi X di sincrotrone rivela il comportamento delle particelle magnetiche in campi magnetici stazionari e in movimento in vitro e in vivo. Le particelle non possono essere facilmente trascinate lungo la superficie delle vie aeree viventi con i magneti, ma durante il trasporto, i depositi si concentrano nel campo visivo dove il campo magnetico è più forte. L'efficienza di trasduzione è stata inoltre aumentata di sei volte quando le particelle magnetiche lentivirali sono state somministrate in presenza di un campo magnetico. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che le particelle magnetiche lentivirali e i campi magnetici potrebbero essere approcci validi per migliorare il targeting dei vettori genici e aumentare i livelli di trasduzione nelle vie aeree di conduzione in vivo.
La fibrosi cistica (FC) è causata da una variazione in un singolo gene chiamato CFTR (regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica). La proteina CFTR è un canale ionico presente in molte cellule epiteliali in tutto il corpo, comprese le vie aeree di conduzione, una delle principali sedi della patogenesi della FC. I difetti del CFTR portano ad un trasporto anomalo dell'acqua, disidratando la superficie delle vie aeree e riducendo lo spessore dello strato di liquido di superficie delle vie aeree (ASL). Ciò compromette anche la capacità del sistema di trasporto mucociliare (MCT) di eliminare le particelle inalate e i patogeni dalle vie aeree. Il nostro obiettivo è sviluppare una terapia genica lentivirale (LV) per veicolare la copia corretta del gene CFTR e migliorare l'ASL, l'MCT e la salute polmonare, e continuare a sviluppare nuove tecnologie in grado di misurare questi parametri in vivo1.
I vettori LV sono uno dei principali candidati per la terapia genica delle vie aeree nella fibrosi cistica, principalmente perché possono integrare permanentemente il gene terapeutico nelle cellule basali delle vie aeree (cellule staminali delle vie aeree). Questo è importante perché possono ripristinare la normale idratazione e la clearance del muco differenziandosi in cellule superficiali delle vie aeree associate alla fibrosi cistica e geneticamente corrette, con conseguenti benefici a vita. I vettori LV dovrebbero essere diretti contro le vie aeree di conduzione, poiché è qui che inizia la malattia polmonare nella fibrosi cistica. La somministrazione del vettore più in profondità nel polmone può comportare la trasduzione alveolare, ma ciò non ha alcun beneficio terapeutico nella fibrosi cistica. Tuttavia, i fluidi come i vettori genici migrano naturalmente verso gli alveoli durante l'inspirazione dopo la somministrazione3,4 e le particelle terapeutiche vengono rapidamente eliminate nella cavità orale tramite MCT. L'efficienza della trasduzione LV è direttamente correlata alla durata del tempo in cui il vettore rimane vicino alle cellule bersaglio per consentire l'assorbimento cellulare – il "tempo di residenza"5 – che è facilmente ridotto dal tipico flusso d'aria regionale, nonché dalla cattura coordinata delle particelle nel muco e dall'MCT. Per la fibrosi cistica, la capacità di prolungare il tempo di residenza del vettore LV all'interno delle vie aeree è È importante raggiungere alti livelli di trasduzione in questa regione, ma finora si è rivelato difficile.
Per superare questo ostacolo, suggeriamo che le particelle magnetiche LV (MP) possano essere d'aiuto in due modi complementari. In primo luogo, possono essere guidate magneticamente verso la superficie delle vie aeree per migliorare il targeting e aiutare le particelle vettrici del gene a risiedere nella regione desiderata delle vie aeree; e ASL) per spostarsi allo strato cellulare 6. Le MP sono state ampiamente utilizzate come veicoli per la somministrazione mirata di farmaci quando si legano ad anticorpi, farmaci chemioterapici o altre piccole molecole che si attaccano alle membrane cellulari o si legano ai recettori di superficie cellulare rilevanti e si accumulano nei siti tumorali in presenza di elettricità statica. Campi magnetici per il trattamento del cancro 7. Altre tecniche “ipertermiche” mirano a riscaldare le MP quando sono esposte a campi magnetici oscillanti, distruggendo così le cellule tumorali. Il principio della trasfezione magnetica, in cui un campo magnetico viene utilizzato come agente di trasfezione per migliorare il trasferimento del DNA alle cellule, è comunemente utilizzato in vitro utilizzando una gamma di vettori genici virali e non virali per linee cellulari difficili da trasdurre. L'efficacia della magnetotrasfezione LV è stata stabilita, con la somministrazione in vitro di LV-MP a una linea cellulare epiteliale bronchiale umana in presenza di un campo magnetico statico, aumentando l'efficienza di trasduzione di 186 volte rispetto al solo vettore LV. LV-MP è stato anche applicato a un modello di fibrosi cistica in vitro, dove la trasfezione magnetica ha aumentato la trasduzione LV in colture all'interfaccia aria-liquido di 20 volte in presenza di espettorato di pazienti con fibrosi cistica10. Tuttavia, la magnetotrasfezione in vivo degli organi ha ricevuto relativamente poca attenzione ed è stata valutata solo in pochi animali studi11,12,13,14,15, soprattutto nei polmoni16,17.Ciononostante, le opportunità per la transfezione magnetica nella terapia polmonare della CF sono chiare.Tan et al.(2020) hanno affermato che "uno studio di prova di concetto sull'efficace somministrazione polmonare di nanoparticelle magnetiche aprirà la strada a future strategie di inalazione di CFTR per migliorare gli esiti clinici nei pazienti con CF"6.
Il comportamento di piccole particelle magnetiche sulle superfici delle vie aeree in presenza di un campo magnetico applicato è difficile da visualizzare e studiare, e quindi poco compreso. In altri studi, abbiamo sviluppato un metodo di imaging a raggi X a contrasto di fase basato sulla propagazione del sincrotrone (PB-PCXI) per visualizzare e quantificare in modo non invasivo le minime variazioni in vivo della profondità dell'ASL18 e del comportamento dell'MCT19,20 per misurare direttamente l'idratazione della superficie del canale gassoso e utilizzarlo come indicatore precoce dell'efficacia del trattamento. Inoltre, il nostro metodo di valutazione dell'MCT utilizza particelle di diametro compreso tra 10 e 35 µm composte da allumina o vetro ad alto indice di rifrazione come marcatori MCT visibili utilizzando PB-PCXI21. Entrambe le tecniche sono adatte alla visualizzazione di una gamma di tipi di particelle, incluso MP.
Grazie alla sua elevata risoluzione spaziale e temporale, le nostre tecniche di analisi ASL e MCT basate su PB-PCXI sono particolarmente adatte per esaminare le dinamiche e i modelli di comportamento di singole particelle e di particelle aggregate in vivo, aiutandoci a comprendere e ottimizzare le tecniche di somministrazione genica MP. L'approccio che impieghiamo qui deriva dai nostri studi condotti con la linea di fascio SPring-8 BL20B2, in cui abbiamo visualizzato il movimento dei fluidi in seguito alla somministrazione di una dose fittizia di vettore nelle vie aeree nasali e polmonari dei topi, al fine di spiegare i modelli di espressione genica non uniformi osservati nei nostri studi sugli animali con dosi di vettore genico 3,4.
Lo scopo di questo studio era utilizzare il sincrotrone PB-PCXI per visualizzare i movimenti in vivo di una serie di microparticelle (MP) nella trachea di ratti vivi. Questi studi di imaging con PB-PCXI sono stati progettati per testare una gamma di MP, intensità di campo magnetico e posizioni per determinarne l'effetto sul movimento delle MP. Abbiamo ipotizzato che un campo magnetico applicato esternamente avrebbe aiutato le MP rilasciate a rimanere o a spostarsi verso l'area bersaglio. Questi studi ci hanno anche permesso di identificare le configurazioni magnetiche che massimizzano il numero di particelle trattenute nella trachea dopo il deposito. In una seconda serie di studi, abbiamo cercato di utilizzare questa configurazione ottimale per dimostrare il modello di trasduzione risultante dal rilascio in vivo di microparticelle a basso volume (LV-MP) nelle vie aeree del ratto, basandoci sul presupposto che il rilascio di LV-MP nel contesto del targeting delle vie aeree avrebbe portato a una migliore efficienza di trasduzione a basso volume.
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti secondo i protocolli approvati dall'Università di Adelaide (M-2019-060 e M-2020-022) e dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Sincrotrone SPring-8. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida ARRIVE.
Tutte le immagini a raggi X sono state acquisite sulla linea di fascio BL20XU del sincrotrone SPring-8 in Giappone, utilizzando una configurazione simile a quella descritta in precedenza21,22. In breve, la scatola sperimentale era situata a 245 m dall'anello di accumulo del sincrotrone. Una distanza campione-rivelatore di 0,6 m viene utilizzata per gli studi di imaging delle particelle e di 0,3 m per gli studi di imaging in vivo per generare effetti di contrasto di fase. È stata utilizzata un'energia del fascio monocromatico di 25 keV. Le immagini sono state acquisite utilizzando un convertitore di raggi X ad alta risoluzione (SPring-8 BM3) accoppiato a un rivelatore sCMOS. Il convertitore converte i raggi X in luce visibile utilizzando uno scintillatore spesso 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), che viene quindi diretto a un sensore sCMOS utilizzando un obiettivo per microscopio × 10 (NA 0,3). Il rivelatore sCMOS era Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Giappone) con una dimensione dell'array di 2048 × 2048 pixel e una dimensione grezza del pixel di 6,5 × 6,5 µm. Questa configurazione produce una dimensione effettiva isotropica del pixel di 0,51 µm e un campo visivo di circa 1,1 mm × 1,1 mm. È stata scelta una durata di esposizione di 100 ms per massimizzare il rapporto segnale/rumore delle particelle magnetiche all'interno e all'esterno delle vie aeree, riducendo al minimo gli artefatti da movimento indotti dalla respirazione. Per gli studi in vivo, è stato posizionato un otturatore a raggi X veloce nel percorso dei raggi X per limitare la dose di radiazioni bloccando il fascio di raggi X tra le esposizioni.
Il supporto LV non è stato utilizzato in alcuno studio di imaging SPring-8 PB-PCXI perché la camera di imaging BL20XU non è certificata di livello di biosicurezza 2. Abbiamo invece selezionato una gamma di microparticelle (MP) ben caratterizzate da due fornitori commerciali, che coprono una varietà di dimensioni, materiali, concentrazioni di ferro e applicazioni, dapprima per comprendere come i campi magnetici influenzano il movimento delle MP all'interno dei capillari di vetro e poi nelle vie aeree viventi. sulla superficie. Le MP hanno dimensioni che variano da 0,25 a 18 μm e sono costituite da una varietà di materiali (vedere Tabella 1), ma la composizione di ciascun campione, comprese le dimensioni delle particelle magnetiche all'interno della MP, è sconosciuta. Sulla base dei nostri ampi studi MCT 19, 20, 21, 23, 24, ci aspettiamo che MP di dimensioni fino a 5 μm possano essere viste sulla superficie delle vie aeree tracheali, ad esempio sottraendo fotogrammi consecutivi per vedere una maggiore visibilità del movimento delle MP. Una singola MP di dimensioni pari a 0,25 μm è più piccola della risoluzione del dispositivo di imaging, ma si prevede che PB-PCXI rilevi il loro contrasto di volume e il movimento del fluido superficiale su cui sono depositate dopo la deposizione.
I campioni per ciascuna MP nella Tabella 1 sono stati preparati in capillari di vetro da 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) con un diametro interno di 0,63 mm. Le particelle corpuscolari sono disponibili in acqua, mentre le particelle CombiMag sono disponibili nel fluido proprietario del produttore. Ogni provetta è riempita a metà con liquido (circa 11 μl) e posizionata sul portacampioni (vedere Figura 1). I capillari di vetro sono stati posizionati orizzontalmente sul supporto del campione nella camera di imaging, rispettivamente, e posizionati ai bordi del fluido. Un magnete al neodimio-ferro-boro (NdFeB) con guscio di nichel di 19 mm di diametro (28 mm di lunghezza) (N35, n. cat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) con una magnetizzazione residua di 1,17 Tesla è stato fissato a un traslatore separato per consentirne la modifica remota della posizione durante l'imaging. L'acquisizione delle immagini a raggi X inizia quando il magnete è posizionato a circa 30 mm sopra il campione e le immagini vengono acquisite a una velocità di 4 fotogrammi al secondo. Durante l'imaging, il magnete è stato avvicinato al tubo capillare di vetro (a circa 1 mm di distanza) e quindi traslato lungo il tubo per valutare gli effetti dell'intensità del campo e della posizione.
Configurazione per l'imaging in vitro contenente campioni MP in capillari di vetro sul traslatore xy del campione. Il percorso del fascio di raggi X è indicato da una linea tratteggiata rossa.
Una volta stabilita la visibilità in vitro delle MP, un sottoinsieme di esse è stato testato in vivo in ratti Wistar albini femmina di tipo selvatico (~12 settimane di età, ~200 g). 0,24 mg/kg di medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Giappone), 3,2 mg/kg di midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Giappone) e 4 mg/kg di butorfanolo (Vetorphale®, Meiji Seika) I ratti sono stati anestetizzati con una miscela di Pharma), Giappone) mediante iniezione intraperitoneale. Dopo l'anestesia, sono stati preparati per l'imaging rimuovendo il pelo intorno alla trachea, inserendo un tubo endotracheale (ET; cannula iv da 16 Ga, Terumo BCT) e immobilizzandoli supini su una piastra di imaging personalizzata contenente una borsa termica per mantenere la temperatura corporea 22. La piastra di imaging è stata quindi fissata al piano di traslazione del campione nella scatola di imaging con una leggera angolazione per allineare la trachea orizzontalmente nei raggi X immagine, come mostrato nella Figura 2a.
(a) Configurazione per l'imaging in vivo nella camera di imaging SPring-8; il percorso del fascio di raggi X è indicato da una linea tratteggiata rossa. (b,c) La localizzazione del magnete sulla trachea è stata eseguita a distanza utilizzando due telecamere IP montate ortogonalmente. Sul lato sinistro dell'immagine sullo schermo, si può vedere l'anello di filo che sostiene la testa e la cannula di somministrazione in posizione all'interno del tubo endotracheale.
Un sistema di pompa a siringa telecomandato (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) utilizzando una siringa di vetro da 100 μl è stato collegato a un tubo PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) tramite un ago da 30 Ga. Contrassegnare il tubo per assicurarsi che la punta sia nella posizione corretta nella trachea durante l'inserimento del tubo ET. Utilizzando la micropompa, lo stantuffo della siringa è stato ritirato mentre la punta del tubo era immersa nel campione MP da somministrare. Il tubo di somministrazione caricato è stato quindi inserito nel tubo endotracheale, posizionando la punta all'interno della parte più forte del nostro campo magnetico applicato previsto. L'acquisizione delle immagini è stata controllata utilizzando un rilevatore di respirazione collegato alla nostra centralina di temporizzazione basata su Arduino e tutti i segnali (ad esempio temperatura, respirazione, apertura/chiusura dell'otturatore e acquisizione delle immagini) sono stati registrati utilizzando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Durante l'imaging Quando l'involucro era inaccessibile, due telecamere IP (Panasonic BB-SC382) sono state posizionate a circa 90° l'uno rispetto all'altro e sono stati utilizzati per monitorare la posizione del magnete rispetto alla trachea durante l'imaging (Fig. 2b,c). Per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, è stata acquisita un'immagine per respiro durante il plateau del flusso di fine espirazione.
Un magnete è fissato a un secondo stadio che può essere posizionato a distanza dall'esterno dell'alloggiamento di imaging. Sono state testate varie posizioni e configurazioni del magnete, tra cui: montato con un angolo di circa 30° sopra la trachea (configurazioni mostrate nelle Figure 2a e 3a); un magnete sopra l'animale e l'altro sotto, con i poli impostati per attrarre (Figura 3b); un magnete sopra l'animale e l'altro sotto, con i poli impostati per respingere (Figura 3c); e un magnete sopra e perpendicolare alla trachea (Figura 3d). Una volta configurati l'animale e il magnete e caricato il MP da testare nella pompa a siringa, somministrare una dose di 50 μl a una velocità di 4 μl/sec acquisendo contemporaneamente le immagini. Il magnete viene quindi spostato avanti e indietro lungo o lateralmente attraverso la trachea continuando ad acquisire le immagini.
Configurazione del magnete per l'imaging in vivo: (a) un singolo magnete sopra la trachea con un angolo di circa 30°, (b) due magneti impostati per attrarsi, (c) due magneti impostati per respingersi, (d) un singolo magnete sopra e perpendicolare alla trachea. L'osservatore guardava dall'alto verso il basso, dalla bocca ai polmoni attraverso la trachea, e il fascio di raggi X attraversava il lato sinistro del ratto ed usciva dal lato destro. Il magnete viene spostato lungo le vie aeree o a sinistra e a destra sopra la trachea nella direzione del fascio di raggi X.
Abbiamo inoltre cercato di determinare la visibilità e il comportamento delle particelle nelle vie aeree in assenza di movimenti respiratori e cardiaci che potessero interferire con i risultati. Pertanto, al termine del periodo di imaging, gli animali sono stati soppressi in modo indolore per sovradosaggio di pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Alcuni animali sono stati lasciati sulla piattaforma di imaging e, una volta che la respirazione e il battito cardiaco si sono arrestati, il processo di imaging è stato ripetuto, aggiungendo un'ulteriore dose di MP se non era visibile alcuna particella sulla superficie delle vie aeree.
Le immagini acquisite sono state corrette per la distorsione del campo piatto e del campo scuro e quindi assemblate in un filmato (20 fotogrammi al secondo; 15-25 volte la velocità normale a seconda della frequenza respiratoria) utilizzando uno script personalizzato scritto in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tutti gli studi sulla somministrazione del vettore genico LV sono stati condotti presso la struttura di ricerca sugli animali da laboratorio dell'Università di Adelaide e miravano a utilizzare i risultati dell'esperimento SPring-8 per valutare se la somministrazione di LV-MP in presenza di un campo magnetico potesse migliorare il trasferimento genico in vivo. Per valutare gli effetti di MP e del campo magnetico, sono stati trattati due gruppi di animali: a un gruppo è stato somministrato LV-MP con un magnete posizionato, e l'altro gruppo ha ricevuto un gruppo di controllo con LV-MP senza magnete.
I vettori genici LV sono stati generati utilizzando metodi precedentemente descritti 25, 26. Il vettore LacZ esprime il gene della beta-galattosidasi localizzato nel nucleo, guidato dal promotore costitutivo MPSV (LV-LacZ), che produce un prodotto di reazione blu nelle cellule trasdotte, visibile nei fronti del tessuto polmonare e nelle sezioni di tessuto. La titolazione è stata eseguita in colture cellulari contando manualmente il numero di cellule positive al LacZ con un emocitometro per calcolare il titolo in TU/ml. I vettori sono crioconservati a -80 °C, scongelati prima dell'uso e legati a CombiMag mediante miscelazione in rapporto 1:1 e incubazione su ghiaccio per almeno 30 minuti prima della somministrazione.
Ratti Sprague Dawley normali (n = 3/gruppo, ~2-3 sono stati anestetizzati per via intraperitoneale con una miscela di 0,4 mg/kg di medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) e 60 mg/kg di ketamina (Ilium, Australia) di un mese di età) ip) iniezione e cannulazione orale non chirurgica con una cannula iv da 16 Ga. Per garantire che il tessuto delle vie aeree tracheali riceva la trasduzione LV, è stato condizionato utilizzando il nostro protocollo di perturbazione meccanica precedentemente descritto, in cui la superficie delle vie aeree tracheali è stata strofinata assialmente con un cestello di filo (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. La somministrazione tracheale di LV-MP è stata quindi eseguita in una cabina di sicurezza biologica circa 10 minuti dopo la perturbazione.
Il campo magnetico utilizzato in questo esperimento è stato configurato in modo simile allo studio di imaging a raggi X in vivo, con gli stessi magneti tenuti sopra la trachea utilizzando clip di stent di distillazione (Figura 4). Un volume di 50 μl (2 aliquote da 25 μl) di LV-MP è stato somministrato nella trachea (n = 3 animali) utilizzando una pipetta contenente una punta di gel come precedentemente descritto. Un gruppo di controllo (n = 3 animali) ha ricevuto gli stessi LV-MP senza l'uso di un magnete. Dopo il completamento dell'infusione, la cannula viene rimossa dal tubo endotracheale e l'animale viene estubato. Il magnete rimane in posizione per 10 minuti, quindi viene rimosso. I ratti hanno ricevuto una dose sottocutanea di meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguita dall'inversione dell'anestesia mediante iniezione intraperitoneale di 1 mg/kg di atipamazolo cloridrato (Antisedan, Zoetis, Australia). I ratti sono stati tenuti al caldo e monitorati fino al completo recupero da anestesia.
Dispositivo di somministrazione LV-MP in una cabina di sicurezza biologica. Il raccordo Luer grigio chiaro del tubo endotracheale è visibile sporgere dalla bocca e la punta in gel della pipetta mostrata in foto viene inserita attraverso il tubo endotracheale fino alla profondità desiderata nella trachea.
Una settimana dopo la procedura di somministrazione di LV-MP, gli animali sono stati soppressi in modo umano mediante inalazione di CO2 al 100% e l'espressione di LacZ è stata valutata utilizzando il nostro trattamento standard con X-gal. I tre anelli cartilaginei più caudali sono stati rimossi per garantire che eventuali danni meccanici o ritenzione di liquidi dovuti al posizionamento del tubo endotracheale non fossero inclusi nell'analisi. Ogni trachea è stata tagliata longitudinalmente per creare due metà per l'analisi, e sono state montate in una piastra contenente gomma siliconica (Sylgard, Dow Inc) utilizzando un ago Minutien (Fine Science Tools) per visualizzare la superficie luminale. La distribuzione e il modello delle cellule trasdotte sono stati confermati mediante fotografia frontale utilizzando un microscopio Nikon (SMZ1500) con una telecamera DigiLite e il software TCapture (Tucsen Photonics, Cina). Le immagini sono state acquisite a un ingrandimento di 20x (inclusa l'impostazione più alta per l'intera larghezza della trachea), con l'intera lunghezza della trachea ripresa passo dopo passo, garantendo una sovrapposizione sufficiente tra ciascuna immagine per consentire l'"unione" delle immagini. Le immagini di ciascuna trachea sono state quindi assemblate in un'unica immagine composita utilizzando Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) con un algoritmo di movimento planare. Le aree di espressione di LacZ nelle immagini composite della trachea di ciascun animale sono state quantificate utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come precedentemente descritto, con le seguenti impostazioni: 0,35 < Tonalità < 0,58, Saturazione > 0,15 e Valore < 0,7. Tracciando i contorni del tessuto, è stata generata manualmente una maschera in GIMP v2.10.24 per ciascuna immagine composita al fine di identificare l'area del tessuto e prevenire falsi rilevamenti al di fuori del tessuto tracheale. Le aree colorate di tutte le immagini composite di ciascun animale sono state sommate per generare l'area colorata totale per quell'animale. L'area colorata è stata quindi divisa per l'area totale della maschera per generare l'area normalizzata.
Ciascuna trachea è stata inclusa in paraffina e sono state tagliate sezioni di 5 μm. Le sezioni sono state controcolorate con rosso neutro rapido per 5 minuti e le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio Nikon Eclipse E400, una telecamera DS-Fi3 e il software di acquisizione NIS Element (versione 5.20.00).
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite con GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). La significatività statistica è stata fissata a p ≤ 0,05. La normalità è stata verificata mediante il test di Shapiro-Wilk e le differenze nella colorazione LacZ sono state valutate mediante il test t non appaiato.
Le sei MP descritte nella Tabella 1 sono state esaminate utilizzando PCXI e la visibilità è descritta nella Tabella 2. Due MP di polistirene (MP1 e MP2; rispettivamente 18 μm e 0,25 μm) non erano visibili con PCXI, ma il resto dei campioni era identificabile (esempi sono mostrati nella Figura 5). MP3 e MP4 (10-15% Fe3O4; rispettivamente 0,25 μm e 0,9 μm) sono debolmente visibili. Sebbene contenga alcune delle particelle più piccole testate, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) era la più pronunciata. Il prodotto CombiMag MP6 è difficile da individuare. In tutti i casi, la nostra capacità di rilevare MP è stata significativamente migliorata traslando il magnete avanti e indietro parallelamente al capillare. Quando i magneti si allontanavano dal capillare, le particelle si estendevano in lunghe stringhe, ma man mano che i magneti si avvicinavano e l'intensità del campo magnetico aumentava, la particella Le stringhe si accorciano man mano che le particelle migrano verso la superficie superiore del capillare (vedi Video supplementare S1: MP4), aumentando la densità delle particelle sulla superficie. Al contrario, quando il magnete viene rimosso dal capillare, l'intensità del campo diminuisce e le MP si riorganizzano in lunghe stringhe che si estendono dalla superficie superiore del capillare (vedi Video supplementare S2: MP4). Dopo che il magnete smette di muoversi, le particelle continuano a muoversi per un breve periodo dopo aver raggiunto la posizione di equilibrio. Mentre la MP si muove verso e lontano dalla superficie superiore del capillare, le particelle magnetiche in genere trascinano i detriti attraverso il fluido.
La visibilità di MP in PCXI varia significativamente tra i campioni. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. Tutte le immagini qui mostrate sono state scattate con un magnete posizionato a circa 10 mm direttamente sopra il capillare. I cerchi apparentemente grandi sono bolle d'aria intrappolate nei capillari, che mostrano chiaramente le caratteristiche dei bordi in bianco e nero dell'imaging a contrasto di fase. Il riquadro rosso contiene l'ingrandimento che migliora il contrasto. Si noti che i diametri degli schemi dei magneti in tutte le figure non sono in scala e sono circa 100 volte più grandi di quanto mostrato.
Mentre il magnete viene traslato a sinistra e a destra lungo la parte superiore del capillare, l'angolo della stringa di MP cambia per allinearsi con il magnete (vedere Figura 6), delineando così le linee del campo magnetico. Per MP3-5, dopo che la corda raggiunge un angolo di soglia, le particelle vengono trascinate lungo la superficie superiore del capillare. Ciò spesso si traduce in MP che si raggruppano in gruppi più grandi vicino a dove il campo magnetico è più forte (vedere Video supplementare S3:MP5). Ciò è anche particolarmente evidente quando si effettua l'imaging vicino all'estremità del capillare, il che fa sì che le MP si aggreghino e si concentrino all'interfaccia fluido-aria. Le particelle in MP6, che erano più difficili da distinguere rispetto a MP3-5, non venivano trascinate mentre il magnete si muoveva lungo il capillare, ma le stringhe di MP si dissociavano, lasciando le particelle nel campo visivo (vedere Video supplementare S4:MP6). In alcuni casi, quando il campo magnetico applicato veniva ridotto spostando il magnete a grande distanza dalla posizione di imaging, le MP rimanenti scendevano lentamente verso la superficie inferiore del tubo per gravità rimanendo nella stringa (vedere Video supplementare Video S5: MP3).
L'angolo della stringa MP cambia quando il magnete viene traslato verso destra sopra il capillare. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6. Il riquadro rosso contiene l'ingrandimento che migliora il contrasto. Si noti che i video supplementari sono informativi in ​​quanto rivelano importanti informazioni sulla struttura delle particelle e sulla dinamica che non possono essere visualizzate in queste immagini statiche.
I nostri test hanno dimostrato che muovere lentamente il magnete avanti e indietro lungo la trachea facilita la visualizzazione delle MP nel contesto di movimenti complessi in vivo. I test in vivo non sono stati eseguiti poiché le microsfere di polistirene (MP1 e MP2) non erano visibili nel capillare. Ciascuna delle restanti quattro MP è stata testata in vivo con l'asse lungo del magnete configurato sopra la trachea con un angolo di circa 30° rispetto alla verticale (vedere Figure 2b e 3a), poiché ciò ha determinato catene di MP più lunghe ed è risultato più efficace rispetto alla configurazione del magnete precedente. MP3, MP4 e MP6 non sono state rilevate nella trachea di alcun animale vivo. Quando le vie aeree dei ratti sono state visualizzate dopo che gli animali sono stati soppressi in modo umano, le particelle sono rimaste invisibili anche quando è stato aggiunto ulteriore volume utilizzando una pompa a siringa. MP5 aveva il più alto contenuto di ossido di ferro ed era l'unica particella visibile, ed è stata quindi utilizzata per valutare e caratterizzare il comportamento in vivo delle MP.
Posizionando il magnete sopra la trachea durante la somministrazione di MP, molte, ma non tutte, le MP si sono concentrate nel campo visivo. Le particelle che entrano nella trachea sono meglio osservate negli animali sacrificati in modo etico. La Figura 7 e il Video supplementare S6: MP5 mostrano la rapida cattura magnetica e l'allineamento delle particelle sulla superficie della trachea ventrale, indicando che le MP possono essere dirette verso le regioni desiderate della trachea. Quando si cerca più distalmente lungo la trachea dopo la somministrazione di MP, alcune MP sono state trovate più vicine alla carena, suggerendo che l'intensità del campo magnetico non era sufficiente a raccogliere e trattenere tutte le MP, poiché sono state somministrate attraverso la regione di massima intensità del campo magnetico durante il processo fluido. Ciononostante, le concentrazioni di MP post-parto erano più elevate intorno all'area ripresa, suggerendo che molte MP sono rimaste nelle regioni delle vie aeree dove l'intensità del campo magnetico applicato era maggiore.
Immagini (a) prima e (b) dopo la somministrazione di MP5 nella trachea di un ratto recentemente soppresso, con il magnete posizionato direttamente sopra l'area di acquisizione. L'area di acquisizione si trova tra i due anelli cartilaginei. Prima della somministrazione di MP, è presente del liquido nelle vie aeree. Il riquadro rosso contiene l'ingrandimento per il contrasto. Queste immagini provengono dal video mostrato nel Video supplementare S6:MP5.
Traslando il magnete lungo la trachea in vivo, la catena di MP ha cambiato angolazione all'interno della superficie delle vie aeree in modo simile a quanto osservato nei capillari (vedere Figura 8 e Video supplementare S7:MP5). Tuttavia, nel nostro studio, le MP non potevano essere trascinate lungo la superficie delle vie aeree viventi come accadeva con i capillari. In alcuni casi, la catena di MP si allunga man mano che il magnete si sposta a sinistra e a destra. È interessante notare che abbiamo anche scoperto che la stringa di particelle sembra modificare la profondità dello strato di fluido superficiale quando il magnete viene spostato longitudinalmente lungo la trachea e si espande quando il magnete viene spostato direttamente sopra e la stringa di particelle viene ruotata in posizione verticale (vedere Video supplementare S7). (MP5 a 0:09, in basso a destra). Il caratteristico schema di movimento è cambiato quando il magnete è stato traslato lateralmente sulla parte superiore della trachea (cioè a sinistra o a destra dell'animale, anziché lungo la lunghezza della trachea). Le particelle erano ancora chiaramente visibili mentre si muovevano, ma quando il magnete è stato rimosso dalla trachea, le punte dei filamenti di particelle sono diventate visibili (vedi Video supplementare S8:MP5, a partire da 0:08). Ciò è coerente con il comportamento MP che abbiamo osservato sotto un campo magnetico applicato in un capillare di vetro.
Immagini di esempio che mostrano MP5 nella trachea di un ratto vivo anestetizzato. (a) Il magnete viene utilizzato per acquisire immagini sopra e a sinistra della trachea, quindi (b) dopo che il magnete è stato spostato a destra. Il riquadro rosso contiene l'ingrandimento per migliorare il contrasto. Queste immagini sono tratte dal video mostrato nel Video supplementare S7:MP5.
Quando i due poli erano configurati in un orientamento nord-sud sopra e sotto la trachea (cioè attrattivi; Fig. 3b), le corde MP apparivano più lunghe e si trovavano sulla parete laterale della trachea piuttosto che sulla superficie dorsale della trachea (vedere Video supplementare S9:MP5). Tuttavia, non sono state rilevate alte concentrazioni di particelle in un'unica posizione (cioè la superficie dorsale della trachea) dopo l'erogazione del fluido quando è stato utilizzato un dispositivo a doppio magnete, cosa che in genere accade quando si utilizza un dispositivo a singolo magnete. Quindi, quando un magnete è stato configurato per respingere i poli invertiti (Fig. 3c), il numero di particelle visibili nel campo visivo non sembrava aumentare dopo l'erogazione. L'impostazione di entrambe le configurazioni a doppio magnete è impegnativa a causa delle elevate intensità del campo magnetico che attraggono o respingono i magneti, rispettivamente. L'impostazione è stata quindi modificata in un singolo magnete parallelo alle vie aeree ma passante attraverso le vie aeree a 90 gradi in modo che le linee di campo attraversassero la parete tracheale ortogonalmente (Fig. 3d), un orientamento progettato per determinare se fosse possibile osservare l'aggregazione di particelle sulla parete laterale. Tuttavia, in questa configurazione, non è stato identificato alcun movimento di accumulo di MP o movimento del magnete. Sulla base di tutti questi risultati, è stata scelta una configurazione a magnete singolo con orientamento a 30 gradi (Figura 3a) per gli studi sui vettori genici in vivo.
Quando l'animale è stato sottoposto a ripetute immagini immediatamente dopo l'eutanasia, l'assenza di movimenti tissutali che potessero interferire con le immagini ha permesso di distinguere linee di particelle più sottili e più corte nel chiaro campo intercondrale, "ondeggianti" in linea con il movimento traslazionale del magnete. Ciononostante, non è ancora possibile visualizzare chiaramente la presenza e il movimento delle particelle MP6.
Il titolo LV-LacZ era 1,8 × 10⁸ TU/ml e, dopo la miscelazione 1:1 con CombiMag MP (MP6), gli animali hanno ricevuto una dose tracheale di 50 μl di veicolo LV a 9 × 10⁷ TU/ml (ovvero 4,5 × 10⁶ TU/ratto). In questi studi, invece di traslare il magnete durante il travaglio, abbiamo fissato il magnete in una posizione per determinare se la trasduzione LV (a) potesse essere migliorata rispetto alla somministrazione del vettore in assenza di un campo magnetico e (b) potesse essere focalizzata. Le cellule delle vie aeree vengono trasdotte in regioni bersaglio magnetiche delle vie aeree superiori.
La presenza di magneti e l'uso di CombiMag combinato con vettori LV non sembrano avere effetti avversi sulla salute degli animali, così come il nostro protocollo standard di somministrazione di vettori LV. Le immagini frontali della regione tracheale sottoposta a perturbazione meccanica (Figura supplementare 1) hanno indicato che vi erano livelli di trasduzione significativamente più elevati nel gruppo di animali trattati con LV-MP quando era presente il magnete (Figura 9a). Solo una piccola quantità di colorazione blu LacZ era presente nel gruppo di controllo (Figura 9b). La quantificazione delle aree colorate con X-Gal normalizzate ha mostrato che la somministrazione di LV-MP in presenza di un campo magnetico ha prodotto un miglioramento di circa 6 volte (Figura 9c).
Esempio di immagini composite che mostrano la trasduzione tracheale da parte di LV-MP (a) in presenza di un campo magnetico e (b) in assenza di un magnete. (c) Miglioramento statisticamente significativo nell'area di trasduzione LacZ normalizzata all'interno della trachea quando si utilizza il magnete (*p = 0,029, test t, n = 3 per gruppo, media ± SEM).
Le sezioni colorate con rosso neutro rapido (esempio mostrato nella Figura supplementare 2) hanno mostrato cellule colorate con LacZ presenti con un pattern e una localizzazione simili a quelli precedentemente riportati.
Una sfida fondamentale per la terapia genica delle vie aeree rimane l'accurata localizzazione delle particelle vettrici nelle regioni di interesse e il raggiungimento di elevati livelli di efficienza di trasduzione nel polmone in movimento in presenza di flusso d'aria e attiva eliminazione del muco. Per i vettori LV progettati per trattare la malattia delle vie aeree nella fibrosi cistica, aumentare il tempo di permanenza delle particelle vettrici all'interno delle vie aeree di conduzione è stato finora un obiettivo irraggiungibile. Come sottolineato da Castellani et al., l'uso di campi magnetici per migliorare la trasduzione presenta vantaggi rispetto ad altri metodi di somministrazione genica come l'elettroporazione, in quanto può combinare semplicità, economicità, localizzazione della somministrazione, maggiore efficienza e tempi di incubazione più brevi, e possibilmente una dose di vettore inferiore10. Tuttavia, la deposizione e il comportamento in vivo delle particelle magnetiche nelle vie aeree sotto l'influenza di forze magnetiche esterne non sono mai stati descritti, né è stata effettivamente dimostrata in vivo la fattibilità di questo metodo per migliorare i livelli di espressione genica in vie aeree viventi intatte.
I nostri esperimenti in vitro con sincrotrone PCXI hanno dimostrato che tutte le particelle testate, ad eccezione delle microparticelle di polistirene, erano visibili nella configurazione di imaging utilizzata. In presenza di un campo magnetico, le microparticelle formano delle stringhe la cui lunghezza è correlata al tipo di particella e all'intensità del campo magnetico (ovvero alla prossimità e al movimento del magnete). Come mostrato nella Figura 10, le stringhe che osserviamo si formano perché ogni singola particella è magnetizzata e induce il proprio campo magnetico locale. Questi campi separati inducono altre particelle simili ad aggregarsi e a connettersi, con movimenti di gruppo simili a stringhe dovuti alle forze locali di attrazione e repulsione tra le altre particelle.
Schema che mostra (a,b) treni di particelle generati all'interno di capillari pieni di fluido e (c,d) trachee piene d'aria. Si noti che i capillari e le trachee non sono disegnati in scala. Il pannello (a) contiene anche una descrizione dell'MP, che contiene particelle di Fe3O4 disposte in filamenti.
Quando il magnete è stato spostato sopra il capillare, l'angolo della stringa di particelle ha raggiunto una soglia critica per MP3-5 contenente Fe3O4, dopodiché la stringa di particelle non è più rimasta nella posizione originale, ma si è spostata lungo la superficie verso una nuova posizione. Questo effetto si verifica probabilmente perché la superficie del capillare di vetro è sufficientemente liscia da consentire questo movimento. È interessante notare che MP6 (CombiMag) non si è comportato in questo modo, forse perché le particelle erano più piccole, avevano rivestimenti o cariche superficiali diversi, oppure un fluido vettore proprietario ha influenzato la loro capacità di muoversi. Anche il contrasto dell'immagine delle particelle CombiMag è più debole, il che suggerisce che il fluido e le particelle possono avere densità simili e quindi non muoversi facilmente l'uno verso l'altro. Le particelle possono anche bloccarsi se il magnete si muove troppo velocemente, indicando che la forza del campo magnetico non può sempre superare l'attrito tra le particelle nel fluido, suggerendo che forse non è sorprendente che la forza del campo magnetico e la distanza tra il magnete e l'area target siano molto importanti. Nel complesso, questi risultati suggeriscono anche che, mentre i magneti possono catturare molte MP che scorrono attraverso l'area target, È improbabile che ci si possa affidare ai magneti per spostare le particelle CombiMag lungo la superficie della trachea. Pertanto, concludiamo che gli studi LV-MP in vivo dovrebbero utilizzare campi magnetici statici per colpire fisicamente regioni specifiche dell'albero bronchiale.
Quando le particelle vengono introdotte nell'organismo, è difficile identificarle nel contesto di tessuti corporei complessi e in movimento, ma la capacità di rilevarle è stata migliorata spostando orizzontalmente il magnete sopra la trachea per "muovere" i filamenti di microparticelle. Sebbene sia possibile l'imaging in vivo, è più facile distinguere il movimento delle particelle una volta che l'animale è stato soppresso in modo umano. Le concentrazioni di microparticelle erano generalmente più elevate in questa posizione quando il magnete era posizionato sopra l'area di imaging, sebbene alcune particelle fossero solitamente trovate più avanti lungo la trachea. A differenza degli studi in vitro, le particelle non possono essere trascinate lungo la trachea spostando il magnete. Questo risultato è coerente con il modo in cui il muco che riveste la superficie della trachea elabora tipicamente le particelle inalate, intrappolandole nel muco e successivamente eliminandole tramite il meccanismo di clearance mucociliare.
Abbiamo ipotizzato che l'uso di magneti per l'attrazione sopra e sotto la trachea (Fig. 3b) potesse risultare in un campo magnetico più uniforme, piuttosto che in un campo magnetico altamente concentrato in un punto, portando potenzialmente a una distribuzione più uniforme delle particelle. Tuttavia, il nostro studio preliminare non ha trovato prove chiare a supporto di questa ipotesi. Allo stesso modo, la configurazione di una coppia di magneti per respingersi (Fig. 3c) non ha comportato una maggiore deposizione di particelle nell'area di imaging. Questi due risultati dimostrano che la configurazione a doppio magnete non migliora significativamente il controllo locale del targeting MP e che le conseguenti forti forze magnetiche sono difficili da configurare, rendendo questo approccio meno pratico. Allo stesso modo, anche l'orientamento del magnete sopra e attraverso la trachea (Fig. 3d) non ha aumentato il numero di particelle trattenute nell'area di imaging. Alcune di queste configurazioni alternative potrebbero non avere successo perché comportano intensità di campo magnetico inferiori all'interno dell'area di deposizione. Pertanto, la configurazione a singolo magnete con angolo di 30 gradi (Figura 3a) è considerata il metodo più semplice ed efficiente per in test in vivo.
Lo studio LV-MP ha dimostrato che, quando i vettori LV venivano combinati con CombiMag e somministrati dopo una perturbazione fisica in presenza di un campo magnetico, i livelli di trasduzione risultavano significativamente aumentati nella trachea rispetto ai controlli. Sulla base degli studi di imaging al sincrotrone e dei risultati di LacZ, il campo magnetico è stato apparentemente in grado di preservare il vettore LV all'interno della trachea e ridurre il numero di particelle vettoriali che penetravano immediatamente in profondità nei polmoni. Tali miglioramenti nel targeting possono portare a una maggiore efficacia, riducendo al contempo i titoli somministrati, la trasduzione fuori bersaglio, gli effetti collaterali infiammatori e immunitari e i costi del vettore genico. È importante sottolineare che, secondo il produttore, CombiMag può essere utilizzato in combinazione con altri metodi di trasferimento genico, inclusi altri vettori virali (come AAV) e acidi nucleici.