Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड बंद करा). दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि जावास्क्रिप्टशिवाय साइट प्रदर्शित करू.
सिस्टिक फायब्रोसिस फुफ्फुसाच्या आजाराच्या उपचारांसाठी जीन वेक्टरने वाहक वायुमार्गांना लक्ष्य केले पाहिजे कारण परिधीय फुफ्फुसांचे ट्रान्सडक्शन उपचारात्मक फायदे देत नाही. व्हायरल ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता थेट वेक्टर निवास वेळेशी संबंधित आहे. तथापि, जीन वाहकांसारखे डिलिव्हरी द्रव नैसर्गिकरित्या प्रेरणा दरम्यान अल्व्होलीमध्ये पसरतात आणि कोणत्याही स्वरूपाचे उपचारात्मक कण म्यूकोसिलरी ट्रान्सपोर्टद्वारे जलद साफ केले जातात. वायुमार्गांमध्ये जीन वाहकांचा निवास वेळ वाढवणे महत्वाचे आहे परंतु साध्य करणे कठीण आहे. जीन वाहक-संयुग्मित चुंबकीय कण जे वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर निर्देशित केले जाऊ शकतात ते प्रादेशिक लक्ष्यीकरण सुधारू शकतात. इन व्हिव्हो व्हिज्युअलायझेशनच्या आव्हानांमुळे, लागू चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर अशा लहान चुंबकीय कणांचे वर्तन फारसे समजलेले नाही. या अभ्यासाचे उद्दिष्ट सिंक्रोट्रॉन इमेजिंगचा वापर करून ऍनेस्थेटाइज्ड उंदरांच्या श्वासनलिकेतील चुंबकीय कणांच्या मालिकेतील इन व्हिव्हो गतीची कल्पना करणे आणि व्हिव्होमध्ये वैयक्तिक आणि मोठ्या प्रमाणात कण वर्तनाची गतिशीलता आणि नमुने तपासणे होते. त्यानंतर आम्ही हे देखील मूल्यांकन केले की चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत लेन्टीव्हायरल चुंबकीय कणांचे वितरण उंदरांमध्ये ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता वाढवेल का. श्वासनलिका.सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंगमध्ये स्थिर आणि गतिमान चुंबकीय क्षेत्रांमध्ये चुंबकीय कणांचे वर्तन दिसून येते. चुंबकांसह जिवंत वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर कण सहजपणे ओढता येत नाहीत, परंतु वाहतुकीदरम्यान, निक्षेप दृश्य क्षेत्रात केंद्रित होतात जिथे चुंबकीय क्षेत्र सर्वात मजबूत असते. चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत लेंटिवायरल चुंबकीय कण वितरित केले गेले तेव्हा ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता देखील सहा पट वाढली. एकत्रितपणे, हे निकाल सूचित करतात की लेंटिवायरल चुंबकीय कण आणि चुंबकीय क्षेत्र जीन वेक्टर लक्ष्यीकरण सुधारण्यासाठी आणि व्हिव्होमध्ये कंडक्टिंग वायुमार्गांमध्ये ट्रान्सडक्शन पातळी वाढवण्यासाठी मौल्यवान दृष्टिकोन असू शकतात.
सिस्टिक फायब्रोसिस (CF) हा CF ट्रान्समेम्ब्रेन कंडक्टन्स रेग्युलेटर (CFTR) नावाच्या एकाच जनुकातील फरकामुळे होतो. CFTR प्रथिने ही एक आयन चॅनेल आहे जी संपूर्ण शरीरातील अनेक उपकला पेशींमध्ये असते, ज्यामध्ये CF रोगजनकांचे प्रमुख स्थळ असलेल्या वाहक वायुमार्गांचा समावेश आहे. CFTR दोषांमुळे असामान्य जलवाहतूक होते, वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर निर्जलीकरण होते आणि वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावरील द्रव (ASL) थराची खोली कमी होते. यामुळे श्वसनमार्गातून श्वास घेतलेले कण आणि रोगजनकांना साफ करण्याची म्यूकोसिलरी ट्रान्सपोर्ट (MCT) प्रणालीची क्षमता देखील बिघडते. CFTR जनुकाची योग्य प्रत देण्यासाठी आणि ASL, MCT आणि फुफ्फुसांचे आरोग्य सुधारण्यासाठी लेन्टीव्हायरल (LV) जनुक थेरपी विकसित करणे आणि vivo1 मध्ये हे पॅरामीटर्स मोजण्यास सक्षम नवीन तंत्रज्ञान विकसित करणे हे आमचे ध्येय आहे.
सीएफ एअरवे जीन थेरपीसाठी एलव्ही व्हेक्टर हे आघाडीचे उमेदवार आहेत, मुख्यतः कारण ते उपचारात्मक जीनला वायुमार्गाच्या बेसल पेशींमध्ये (वायुमार्गाच्या स्टेम पेशी) कायमचे एकत्रित करू शकतात. हे महत्वाचे आहे कारण ते कार्यात्मक जीन-सुधारित सीएफ-संबंधित वायुमार्गाच्या पृष्ठभागाच्या पेशींमध्ये फरक करून सामान्य हायड्रेशन आणि श्लेष्मा क्लिअरन्स पुनर्संचयित करू शकतात, ज्यामुळे आयुष्यभर फायदे मिळतात. एलव्ही व्हेक्टर हे वाहक वायुमार्गाच्या विरूद्ध निर्देशित केले पाहिजेत, कारण येथून सीएफ फुफ्फुसाचा आजार सुरू होतो. फुफ्फुसात खोलवर वेक्टरचा प्रसूतीमुळे अल्व्होलर ट्रान्सडक्शन होऊ शकते, परंतु सीएफमध्ये याचा कोणताही उपचारात्मक फायदा नाही. तथापि, प्रसूतीनंतर प्रेरणा मिळाल्यावर जीन वाहक नैसर्गिकरित्या अल्व्होलीत स्थलांतरित होतात3,4 आणि उपचारात्मक कण एमसीटीद्वारे तोंडी पोकळीत जलद साफ केले जातात. एलव्ही ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता सेल्युलर अपटेकला अनुमती देण्यासाठी वेक्टर लक्ष्य पेशींच्या शेजारी किती वेळ राहतो याच्याशी थेट संबंधित आहे - "निवास वेळ"5 - जो सामान्य प्रादेशिक वायुप्रवाह तसेच समन्वित कण श्लेष्मा कॅप्चर आणि एमसीटी द्वारे सहजपणे कमी केला जातो. सीएफसाठी, या प्रदेशात उच्च पातळीचे ट्रान्सडक्शन साध्य करण्यासाठी वायुमार्गात एलव्हीचा निवास वेळ वाढवण्याची क्षमता महत्त्वाची आहे, परंतु आतापर्यंत आव्हानात्मक राहिले आहे.
या अडथळ्यावर मात करण्यासाठी, आम्ही असे सुचवितो की LV चुंबकीय कण (MPs) दोन पूरक मार्गांनी मदत करू शकतात. पहिले, लक्ष्यीकरण सुधारण्यासाठी आणि जनुक वाहक कणांना इच्छित वायुमार्गाच्या प्रदेशात राहण्यास मदत करण्यासाठी त्यांना चुंबकीयरित्या वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर निर्देशित केले जाऊ शकते; आणि ASL) पेशी थर 6 मध्ये जाण्यासाठी. जेव्हा ते अँटीबॉडीज, केमोथेरप्यूटिक औषधे किंवा पेशी पडद्याशी जोडलेल्या किंवा संबंधित पेशी पृष्ठभागाच्या रिसेप्टर्सशी बांधलेल्या आणि स्थिर विजेच्या उपस्थितीत ट्यूमर साइटवर जमा होणाऱ्या इतर लहान रेणूंशी बांधले जातात तेव्हा MPs लक्ष्यित औषध वितरण वाहने म्हणून मोठ्या प्रमाणावर वापरले गेले आहेत. कर्करोगाच्या उपचारांसाठी चुंबकीय क्षेत्रे 7. इतर "हायपरथर्मल" तंत्रांचा उद्देश एमपींना दोलनशील चुंबकीय क्षेत्रांच्या संपर्कात आल्यावर गरम करणे आहे, ज्यामुळे ट्यूमर पेशी नष्ट होतात. चुंबकीय संक्रमणाचे तत्व, ज्यामध्ये पेशींमध्ये डीएनएचे हस्तांतरण वाढविण्यासाठी चुंबकीय क्षेत्राचा वापर ट्रान्सफेक्शन एजंट म्हणून केला जातो, तो सामान्यतः इन विट्रोमध्ये वापरला जातो ज्यामध्ये ट्रान्सड्यूस करणे कठीण असलेल्या सेल लाईन्ससाठी नॉन-व्हायरल आणि व्हायरल जीन वेक्टरचा वापर केला जातो. एलव्ही मॅग्नेटोट्रान्सफेक्शनची प्रभावीता स्थापित केली गेली आहे, स्थिर चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत मानवी ब्रोन्कियल एपिथेलियल सेल लाईनवर एलव्ही-एमपीच्या इन विट्रो डिलिव्हरीसह, केवळ एलव्ही वेक्टरच्या तुलनेत ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता 186 पट वाढवते. एलव्ही-एमपी इन विट्रो सीएफ मॉडेलवर देखील लागू केले गेले आहे, जिथे चुंबकीय संक्रमणाने सीएफ थुंकीच्या उपस्थितीत एअर-लिक्विड इंटरफेस कल्चरमध्ये एलव्ही ट्रान्सडक्शन 20 पट वाढवले ​​आहे10. तथापि, अवयवांच्या इन विवो मॅग्नेटोट्रान्सफेक्शनला तुलनेने कमी लक्ष मिळाले आहे आणि फक्त काही प्राण्यांमध्ये त्याचे मूल्यांकन केले गेले आहे. अभ्यास११,१२,१३,१४,१५, विशेषतः फुफ्फुसांमध्ये१६,१७. तरीही, CF फुफ्फुसांच्या थेरपीमध्ये चुंबकीय संक्रमणाच्या संधी स्पष्ट आहेत. टॅन एट अल. (२०२०) यांनी म्हटले आहे की "कार्यक्षम चुंबकीय नॅनोपार्टिकल पल्मोनरी डिलिव्हरीचा पुरावा-संकल्पना अभ्यास CF रुग्णांमध्ये क्लिनिकल परिणाम सुधारण्यासाठी भविष्यातील CFTR इनहेलेशन धोरणांसाठी मार्ग मोकळा करेल"६.
लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर लहान चुंबकीय कणांचे वर्तन दृश्यमान करणे आणि अभ्यास करणे कठीण आहे आणि त्यामुळे ते फारसे समजत नाही. इतर अभ्यासांमध्ये, आम्ही सिंक्रोट्रॉन-प्रसार-आधारित फेज-कॉन्ट्रास्ट एक्स-रे इमेजिंग (PB-PCXI) पद्धत विकसित केली आहे जी नॉन-इनवेसिव्हली व्हिज्युअलायझेशन आणि ASL डेप्थ18 आणि MCT वर्तन19,20 मध्ये मिनिट इन व्हिव्हो बदलांचे प्रमाण मोजण्यासाठी वापरली जाते जेणेकरून गॅस कॅनल पृष्ठभाग हायड्रेशन थेट मोजता येईल आणि उपचार प्रभावीतेचे प्रारंभिक सूचक म्हणून वापरले जाईल. याव्यतिरिक्त, आमची MCT मूल्यांकन पद्धत PB-PCXI21 वापरून दृश्यमान MCT मार्कर म्हणून अॅल्युमिना किंवा उच्च अपवर्तक निर्देशांक काचेने बनलेले 10-35 µm व्यासाचे कण वापरते. दोन्ही तंत्रे MP सह विविध कण प्रकारांच्या दृश्यमानतेसाठी योग्य आहेत.
उच्च स्थानिक आणि तात्पुरत्या रिझोल्यूशनमुळे, आमची PB-PCXI-आधारित ASL आणि MCT विश्लेषण तंत्रे MP जनुक वितरण तंत्रे समजून घेण्यास आणि ऑप्टिमाइझ करण्यास मदत करण्यासाठी विवोमध्ये एकल आणि बल्क कण वर्तनाची गतिशीलता आणि नमुने तपासण्यासाठी योग्य आहेत. आम्ही येथे वापरत असलेला दृष्टिकोन SPring-8 BL20B2 बीमलाइन वापरून केलेल्या आमच्या अभ्यासातून आला आहे, ज्यामध्ये आम्ही उंदरांच्या नाक आणि फुफ्फुसीय वायुमार्गांमध्ये बनावट वेक्टर डोस वितरणानंतर द्रव हालचालीची कल्पना केली जेणेकरून आमच्या जीन कॅरियर डोस प्राण्यांच्या अभ्यास 3,4 मध्ये आढळलेल्या आमच्या नॉन-युनिफॉर्म जीन अभिव्यक्ती नमुन्यांचे स्पष्टीकरण देण्यात मदत होईल.
या अभ्यासाचे उद्दिष्ट सिंक्रोट्रॉन PB-PCXI चा वापर करून जिवंत उंदरांच्या श्वासनलिकेतील MPs च्या मालिकेतील इन व्हिव्हो हालचालींचे दृश्यमान करणे होते. हे PB-PCXI इमेजिंग अभ्यास MPs च्या श्रेणी, चुंबकीय क्षेत्राची ताकद आणि स्थाने तपासण्यासाठी डिझाइन केले होते जेणेकरून MP गतीवर त्यांचा प्रभाव निश्चित होईल. आम्ही असे गृहीत धरले की बाह्यरित्या लागू केलेले चुंबकीय क्षेत्र वितरित MP ला लक्ष्य क्षेत्रात राहण्यास किंवा हलविण्यास मदत करेल. या अभ्यासांमुळे आम्हाला चुंबक कॉन्फिगरेशन ओळखण्याची परवानगी देखील मिळाली जी जमा झाल्यानंतर श्वासनलिकेमध्ये ठेवलेल्या कणांची संख्या वाढवते. अभ्यासाच्या दुसऱ्या मालिकेत, आम्ही LV-MPs च्या उंदराच्या वायुमार्गात इन व्हिव्हो डिलिव्हरीमुळे होणारे ट्रान्सडक्शन पॅटर्न प्रदर्शित करण्यासाठी या इष्टतम कॉन्फिगरेशनचा वापर करण्याचा प्रयत्न केला, या गृहीतावर आधारित की वायुमार्ग लक्ष्यीकरणाच्या संदर्भात LV-MPs च्या डिलिव्हरीमुळे LV ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता सुधारेल.
सर्व प्राण्यांचे अभ्यास अ‍ॅडलेड विद्यापीठाने (M-2019-060 आणि M-2020-022) आणि SPring-8 सिंक्रोट्रॉन अ‍ॅनिमल एथिक्स कमिटीने मंजूर केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार केले गेले. ARRIVE मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार प्रयोग केले गेले.
सर्व एक्स-रे इमेजिंग जपानमधील SPring-8 सिंक्रोट्रॉन येथील BL20XU बीमलाइनवर केले गेले, ज्यामध्ये आधी वर्णन केलेल्या 21,22 सारख्या सेटअपचा वापर केला गेला. थोडक्यात, प्रायोगिक बॉक्स सिंक्रोट्रॉन स्टोरेज रिंगपासून 245 मीटर अंतरावर होता. फेज कॉन्ट्रास्ट इफेक्ट्स निर्माण करण्यासाठी कण इमेजिंग अभ्यासासाठी 0.6 मीटरचा नमुना-ते-डिटेक्टर अंतर आणि इन व्हिव्हो इमेजिंग अभ्यासासाठी 0.3 मीटर वापरला जातो. 25 keV ची मोनोक्रोमॅटिक बीम ऊर्जा वापरली गेली. sCMOS डिटेक्टरशी जोडलेल्या उच्च-रिझोल्यूशन एक्स-रे कन्व्हर्टर (SPring-8 BM3) वापरून प्रतिमा कॅप्चर करण्यात आल्या. कन्व्हर्टर 10 µm जाडीच्या सिंटिलेटर (Gd3Al2Ga3O12) वापरून एक्स-रे दृश्यमान प्रकाशात रूपांतरित करतो, जो नंतर × 10 मायक्रोस्कोप ऑब्जेक्टिव्ह (NA 0.3) वापरून sCMOS सेन्सरकडे निर्देशित केला जातो. sCMOS डिटेक्टर Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) होता. अ‍ॅरे आकार २०४८ × २०४८ पिक्सेल आणि कच्चा पिक्सेल आकार ६.५ × ६.५ µm आहे. या सेटअपमुळे ०.५१ µm चा प्रभावी समस्थानिक पिक्सेल आकार आणि अंदाजे १.१ मिमी × १.१ मिमी दृश्य क्षेत्र मिळते. श्वसनमार्गाच्या आत आणि बाहेर चुंबकीय कणांचे सिग्नल-टू-नॉइज गुणोत्तर जास्तीत जास्त करण्यासाठी १०० मिलीसेकंदची एक्सपोजर लांबी निवडण्यात आली आणि श्वासोच्छवासामुळे निर्माण होणाऱ्या गती कलाकृती कमीत कमी केल्या. इन व्हिव्हो अभ्यासांसाठी, एक्सपोजर दरम्यान एक्स-रे बीम ब्लॉक करून रेडिएशन डोस मर्यादित करण्यासाठी एक्स-रे मार्गात एक जलद एक्स-रे शटर ठेवण्यात आला.
BL20XU इमेजिंग चेंबर बायोसेफ्टी लेव्हल 2 प्रमाणित नसल्यामुळे कोणत्याही SPring-8 PB-PCXI इमेजिंग अभ्यासात LV वाहक वापरला गेला नाही. त्याऐवजी, आम्ही दोन व्यावसायिक पुरवठादारांकडून चांगल्या वैशिष्ट्यीकृत MPs ची श्रेणी निवडली - ज्यामध्ये आकार, साहित्य, लोह सांद्रता आणि अनुप्रयोगांची श्रेणी समाविष्ट आहे - प्रथम काचेच्या केशिकांमध्ये आणि नंतर जिवंत वायुमार्गांमध्ये चुंबकीय क्षेत्र MP गतीवर कसा परिणाम करतात हे समजून घेण्यासाठी. पृष्ठभागावर.MPs चा आकार 0.25 ते 18 μm पर्यंत असतो आणि ते विविध पदार्थांपासून बनवले जातात (तक्ता 1 पहा), परंतु MP मधील चुंबकीय कणांच्या आकारासह प्रत्येक नमुन्याची रचना अज्ञात आहे. आमच्या विस्तृत MCT अभ्यास 19, 20, 21, 23, 24 वर आधारित, आम्हाला अपेक्षा आहे की 5 μm इतके लहान MP श्वासनलिकेतील वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर दिसू शकतात, उदाहरणार्थ MP गतीची वाढलेली दृश्यमानता पाहण्यासाठी सलग फ्रेम्स वजा करून. एकच 0.25 μm आकाराचा MP इमेजिंग डिव्हाइसच्या रिझोल्यूशनपेक्षा लहान असतो, परंतु PB-PCXI त्यांच्या व्हॉल्यूम कॉन्ट्रास्ट आणि पृष्ठभागावरील द्रवपदार्थाची गती शोधेल अशी अपेक्षा आहे ज्यावर ते जमा झाल्यानंतर जमा केले जातात.
टेबल १ मधील प्रत्येक MP साठी नमुने २० μl काचेच्या केशिका (ड्रमंड मायक्रोकॅप्स, पीए, यूएसए) मध्ये तयार केले गेले होते ज्यांचा आतील व्यास ०.६३ मिमी आहे. कॉर्पस्क्युलर कण पाण्यात उपलब्ध आहेत, तर कॉम्बीमॅग कण उत्पादकाच्या मालकीच्या द्रवपदार्थात उपलब्ध आहेत. प्रत्येक ट्यूब द्रवाने अर्धी भरलेली आहे (अंदाजे ११ μl) आणि नमुना धारकावर ठेवली आहे (आकृती १ पहा). काचेच्या केशिका अनुक्रमे इमेजिंग बॉक्समधील नमुना टप्प्यावर आडव्या ठेवल्या गेल्या होत्या आणि द्रवाच्या कडा स्थित केल्या होत्या. १९ मिमी व्यासाचा (२८ मिमी लांब) निकेल शेल दुर्मिळ पृथ्वी निओडायमियम लोह बोरॉन (NdFeB) चुंबक (N35, मांजर क्रमांक LM1652, जयकार इलेक्ट्रॉनिक्स, ऑस्ट्रेलिया) १.१७ च्या अवशिष्ट चुंबकीकरणासह टेस्लाला इमेजिंग दरम्यान दूरस्थपणे त्याचे स्थान बदलण्यासाठी वेगळ्या भाषांतर टप्प्याशी जोडले गेले होते. चुंबक नमुन्याच्या वर सुमारे ३० मिमी स्थित असताना एक्स-रे प्रतिमा संपादन सुरू होते आणि प्रतिमा प्रति सेकंद ४ फ्रेम्सच्या दराने मिळवल्या जातात. दरम्यान इमेजिंग करताना, चुंबक काचेच्या केशिका नळीच्या जवळ (सुमारे १ मिमी अंतरावर) आणला गेला आणि नंतर फील्ड स्ट्रेंथ आणि स्थितीच्या परिणामांचे मूल्यांकन करण्यासाठी नळीच्या बाजूने बदलला गेला.
नमुना xy भाषांतर टप्प्यावर काचेच्या केशिकांमध्ये MP नमुने असलेले इन विट्रो इमेजिंग सेटअप. एक्स-रे बीमचा मार्ग लाल तुटक रेषेने चिन्हांकित केलेला आहे.
एकदा MPs ची इन विट्रो दृश्यमानता स्थापित झाल्यानंतर, त्यांच्या एका उपसमूहाची चाचणी जंगली प्रकारच्या मादी अल्बिनो विस्टार उंदरांमध्ये (~१२ आठवडे जुने, ~२०० ग्रॅम) करण्यात आली. ०.२४ मिग्रॅ/किलो मेडेटोमिडीन (डोमिटर®, झेनोआक, जपान), ३.२ मिग्रॅ/किलो मिडाझोलम (डोर्मिकम®, अ‍ॅस्टेलास फार्मा, जपान) आणि ४ मिग्रॅ/किलो ब्युटोरफॅनॉल (व्हेटोरफेल®, मेईजी सेइका) उंदरांना इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शनद्वारे फार्मा, जपान) च्या मिश्रणाने भूल देण्यात आली. भूल दिल्यानंतर, श्वासनलिकेच्या सभोवतालची फर काढून, एंडोट्रॅचियल ट्यूब (ET; १६ Ga iv कॅन्युला, टेरुमो BCT) घालून आणि शरीराचे तापमान राखण्यासाठी थर्मल बॅग असलेल्या कस्टम-मेड इमेजिंग प्लेटवर त्यांना स्थिर करून इमेजिंगसाठी तयार करण्यात आले. त्यानंतर इमेजिंग प्लेट इमेजिंग बॉक्समधील नमुना भाषांतर टप्प्याशी थोड्या कोनात जोडली गेली जेणेकरून श्वासनलिका क्षैतिजरित्या संरेखित होईल. आकृती २अ मध्ये दाखवल्याप्रमाणे एक्स-रे प्रतिमा.
(a) SPring-8 इमेजिंग बॉक्समध्ये इन व्हिव्हो इमेजिंग सेटअपमध्ये, एक्स-रे बीमचा मार्ग लाल डॅश केलेल्या रेषेने चिन्हांकित केला आहे. (b,c) दोन ऑर्थोगोनली माउंट केलेल्या आयपी कॅमेऱ्यांचा वापर करून श्वासनलिकेवरील चुंबकीय स्थानिकीकरण दूरस्थपणे केले गेले. स्क्रीन इमेजच्या डाव्या बाजूला, डोके धरून ठेवलेला वायर लूप आणि ET ट्यूबमध्ये डिलिव्हरी कॅन्युला दिसू शकतो.
१०० μl काचेच्या सिरिंजचा वापर करून रिमोट-कंट्रोल्ड सिरिंज पंप सिस्टम (UMP2, वर्ल्ड प्रिसिजन इन्स्ट्रुमेंट्स, सारासोटा, FL) ३० Ga सुईद्वारे PE10 ट्यूबिंग (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) शी जोडली गेली. ET ट्यूब घालताना टीप श्वासनलिकेमध्ये योग्य स्थितीत आहे याची खात्री करण्यासाठी ट्यूबवर चिन्हांकित करा. मायक्रोपंप वापरून, ट्यूबची टीप वितरित करण्यासाठी MP नमुन्यात बुडवताना सिरिंज प्लंजर मागे घेण्यात आला. लोड केलेली डिलिव्हरी ट्यूब नंतर एंडोट्रॅचियल ट्यूबमध्ये घातली गेली, ज्यामुळे टीप आमच्या अपेक्षित लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राच्या सर्वात मजबूत भागात ठेवली गेली. आमच्या Arduino आधारित टायमिंग बॉक्सशी जोडलेल्या श्वसन डिटेक्टरचा वापर करून प्रतिमा संपादन नियंत्रित केले गेले आणि सर्व सिग्नल (उदा. तापमान, श्वसन, शटर उघडणे/बंद करणे आणि प्रतिमा संपादन) पॉवरलॅब आणि लॅबचार्ट (AD इन्स्ट्रुमेंट्स, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) वापरून रेकॉर्ड केले गेले. २२. इमेजिंग करताना जेव्हा एन्क्लोजर प्रवेश करण्यायोग्य नव्हता, तेव्हा दोन IP कॅमेरे (Panasonic BB-SC382) अंदाजे ९०° वर स्थित होते. एकमेकांशी आणि इमेजिंग दरम्यान श्वासनलिकेशी संबंधित चुंबकाच्या स्थितीचे निरीक्षण करण्यासाठी वापरले गेले (आकृती 2b,c). गती कलाकृती कमी करण्यासाठी, शेवटच्या भरतीच्या प्रवाह पठारावर प्रति श्वास एक प्रतिमा प्राप्त केली गेली.
इमेजिंग हाऊसिंगच्या बाहेरून दूरस्थपणे स्थित करता येणाऱ्या दुसऱ्या टप्प्याला एक चुंबक जोडला जातो. चुंबकाच्या विविध स्थिती आणि कॉन्फिगरेशनची चाचणी घेण्यात आली, ज्यात हे समाविष्ट आहे: श्वासनलिकेच्या वर अंदाजे 30° च्या कोनात बसवलेले (आकृती 2a आणि 3a मध्ये दर्शविलेले कॉन्फिगरेशन); एक चुंबक प्राण्याच्या वर आणि दुसरा खाली, ध्रुव आकर्षित करण्यासाठी सेट केलेले (आकृती 3b); एक चुंबक प्राण्याच्या वर आणि दुसरा खाली, ध्रुव दूर करण्यासाठी सेट केलेले (आकृती 3c); आणि एक चुंबक वर आणि श्वासनलिकेला लंब (आकृती 3d). एकदा प्राणी आणि चुंबक कॉन्फिगर केले गेले आणि चाचणीसाठी MP सिरिंज पंपमध्ये लोड केला गेला की, प्रतिमा मिळवताना 4 μl/सेकंद दराने 50 μl डोस द्या. नंतर प्रतिमा मिळवत असताना चुंबक श्वासनलिकेवर पुढे-मागे किंवा बाजूने हलवला जातो.
इन व्हिव्हो इमेजिंगसाठी चुंबक संरचना (अ) श्वासनलिकेच्या वर सुमारे ३०° च्या कोनात एकच चुंबक, (ब) आकर्षित करण्यासाठी सेट केलेले दोन चुंबक, (क) मागे टाकण्यासाठी सेट केलेले दोन चुंबक, (ड) श्वासनलिकेत वर आणि लंब असलेला एकच चुंबक. निरीक्षकाने तोंडातून श्वासनलिकेच्या माध्यमातून फुफ्फुसांकडे पाहिले आणि क्ष-किरण किरण उंदराच्या डाव्या बाजूने गेला आणि उजव्या बाजूने बाहेर पडला. चुंबक एकतर वायुमार्गाच्या लांबीने किंवा क्ष-किरण किरणाच्या दिशेने श्वासनलिकेच्या वर डावीकडे आणि उजवीकडे हलविला जातो.
आम्ही गोंधळात टाकणारे श्वासोच्छ्वास आणि हृदय गती नसतानाही श्वसनमार्गातील कणांची दृश्यमानता आणि वर्तन निश्चित करण्याचा प्रयत्न केला. म्हणून, इमेजिंग कालावधीच्या शेवटी, पेंटोबार्बिटल ओव्हरडोजसाठी प्राण्यांना मानवीरित्या मारण्यात आले (सोम्नोपेंटिल, पिटमन-मूर, वॉशिंग्टन क्रॉसिंग, यूएसए; ~65 मिग्रॅ/किलो आयपी). काही प्राण्यांना इमेजिंग प्लॅटफॉर्मवर सोडण्यात आले आणि एकदा श्वासोच्छ्वास आणि हृदयाचे ठोके थांबले की, इमेजिंग प्रक्रिया पुन्हा केली गेली, जर श्वसनमार्गाच्या पृष्ठभागावर कोणताही एमपी दिसत नसेल तर एमपीचा अतिरिक्त डोस जोडण्यात आला.
मिळवलेल्या प्रतिमा फ्लॅट-फील्ड आणि डार्क-फील्ड दुरुस्त केल्या गेल्या आणि नंतर MATLAB (R2020a, द मॅथवर्क्स) मध्ये लिहिलेल्या कस्टम स्क्रिप्टचा वापर करून चित्रपटात (प्रति सेकंद २० फ्रेम; श्वसन दरावर अवलंबून १५-२५ × सामान्य गती) एकत्र केल्या गेल्या.
सर्व LV जीन वेक्टर डिलिव्हरी अभ्यास अॅडलेड विद्यापीठातील प्रयोगशाळेतील प्राणी संशोधन सुविधा येथे आयोजित केले गेले आणि SPring-8 प्रयोगाच्या निकालांचा वापर करून चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत LV-MP डिलिव्हरीमुळे जीवसृष्टीत जनुक हस्तांतरण वाढू शकते का याचे मूल्यांकन करण्याचा उद्देश होता. MP आणि चुंबकीय क्षेत्राच्या परिणामांचे मूल्यांकन करण्यासाठी, प्राण्यांच्या दोन गटांवर उपचार करण्यात आले: एका गटाला चुंबक ठेवून LV-MP देण्यात आले आणि दुसऱ्या गटाला चुंबकाशिवाय LV-MP असलेला नियंत्रण गट देण्यात आला.
पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धती 25, 26 वापरून LV जनुक वेक्टर तयार केले गेले. LacZ वेक्टर हा घटक MPSV प्रमोटर (LV-LacZ) द्वारे चालवल्या जाणाऱ्या न्यूक्लियर-लोकलाइज्ड बीटा-गॅलेक्टोसिडेस जनुकाला व्यक्त करतो, जो ट्रान्सड्यूस्ड पेशींमध्ये निळा प्रतिक्रिया उत्पादन तयार करतो, जो फुफ्फुसाच्या ऊतींच्या फ्रंट्स आणि टिश्यू सेक्शनमध्ये दृश्यमान असतो. TU/ml मध्ये टायटरची गणना करण्यासाठी हेमोसाइटोमीटरने LacZ पॉझिटिव्ह पेशींची संख्या मॅन्युअली मोजून सेल कल्चरमध्ये टायट्रेशन केले गेले. कॅरियर्स -80 °C वर क्रायोप्रिझर्व केले जातात, वापरण्यापूर्वी वितळवले जातात आणि 1:1 गुणोत्तरात मिसळून आणि डिलिव्हरीपूर्वी किमान 30 मिनिटे बर्फावर उष्मायन करून CombiMag ला बांधले जातात.
सामान्य स्प्रेग डॉली उंदरांना (n = 3/गट, ~2-3) 0.4 मिलीग्राम/किलो मेडेटोमिडीन (डोमिटर, इलियम, ऑस्ट्रेलिया) आणि 60 मिलीग्राम/किलो केटामाइन (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) महिन्याचे) आयपी) इंजेक्शन आणि नॉन-सर्जिकल ओरल कॅन्युलेशनच्या मिश्रणाने इंट्रापेरिटोनली भूल देण्यात आली. श्वासनलिकेतील वायुमार्गाच्या ऊतींना एलव्ही ट्रान्सडक्शन मिळेल याची खात्री करण्यासाठी, आमच्या पूर्वी वर्णन केलेल्या मेकॅनिकल पेर्टर्बेशन प्रोटोकॉलचा वापर करून ते कंडिशन केले गेले, ज्यामध्ये श्वासनलिकेतील वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर वायर बास्केट (एन-सर्कल, निटिनॉल टिपलेस स्टोन एक्स्ट्रॅक्टर एनटीएसई-022115) -यूडीएच, कुक मेडिकल, यूएसए) 30 एस28 ने अक्षीयपणे घासण्यात आले. पेर्टर्बेशननंतर सुमारे 10 मिनिटांनी जैविक सुरक्षा कॅबिनेटमध्ये एलव्ही-एमपीचे श्वासनलिकेतील प्रशासन केले गेले.
या प्रयोगात वापरलेले चुंबकीय क्षेत्र इन व्हिव्हो एक्स-रे इमेजिंग अभ्यासाप्रमाणेच कॉन्फिगर केले गेले होते, ज्यामध्ये डिस्टिलेशन स्टेंट क्लिप वापरून श्वासनलिकेच्या वर समान चुंबक धरले गेले होते (आकृती 4). पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे जेल टिप असलेल्या पिपेटचा वापर करून LV-MP चे 50 μl व्हॉल्यूम (2 × 25 μl अ‍ॅलिकॉट्स) श्वासनलिकेत (n = 3 प्राणी) वितरित केले गेले. एका नियंत्रण गटाला (n = 3 प्राणी) चुंबकाचा वापर न करता तेच LV-MP मिळाले. ओतणे पूर्ण झाल्यानंतर, ET ट्यूबमधून कॅन्युला काढून टाकला जातो आणि प्राण्याला बाहेर काढले जाते. चुंबक 10 मिनिटे जागेवर राहतो, नंतर तो काढून टाकला जातो. उंदरांना मेलॉक्सिकॅम (1 मिली/किलो) (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) चा त्वचेखालील डोस मिळाला आणि त्यानंतर 1 मिलीग्राम/किलो अ‍ॅटिपामाझोल हायड्रोक्लोराइड (अँटीसेडन, झोएटिस, ऑस्ट्रेलिया) च्या आयपी इंजेक्शनद्वारे भूल उलटवली गेली. भूल देण्यापासून पूर्णपणे बरे होईपर्यंत उंदरांना उबदार ठेवण्यात आले आणि त्यांचे निरीक्षण करण्यात आले.
जैविक सुरक्षा कॅबिनेटमध्ये LV-MP डिलिव्हरी डिव्हाइस. ET ट्यूबचा हलका राखाडी रंगाचा लुअर हब तोंडातून बाहेर पडताना दिसतो आणि चित्रात दाखवलेल्या पिपेटचा जेल टीप ET ट्यूबमधून श्वासनलिकेत इच्छित खोलीपर्यंत घातला जातो.
LV-MP डोसिंग प्रक्रियेच्या एका आठवड्यानंतर, प्राण्यांना 100% CO2 इनहेलेशनने मानवीरित्या मारण्यात आले आणि आमच्या मानक X-gal उपचारांचा वापर करून LacZ अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन करण्यात आले. विश्लेषणात एंडोट्रॅचियल ट्यूब प्लेसमेंटमधून कोणतेही यांत्रिक नुकसान किंवा द्रव धारणा समाविष्ट नाही याची खात्री करण्यासाठी तीन पुच्छ सर्वात कार्टिलाजिनस रिंग काढून टाकण्यात आल्या. विश्लेषणासाठी दोन भाग तयार करण्यासाठी प्रत्येक श्वासनलिका रेखांशाने कापण्यात आली आणि ल्युमिनल पृष्ठभागाची कल्पना करण्यासाठी मिन्युटियन सुई (फाइन सायन्स टूल्स) वापरून सिलिकॉन रबर असलेल्या डिशमध्ये (सिलगार्ड, डाऊ इंक) बसवण्यात आली. डिजिलाइट कॅमेरा आणि टीकॅप्चर सॉफ्टवेअर (टक्सन फोटोनिक्स, चीन) सह निकॉन मायक्रोस्कोप (SMZ1500) वापरून फ्रंटल फोटोग्राफीद्वारे ट्रान्सड्यूस्ड पेशींचे वितरण आणि नमुना पुष्टी करण्यात आला. 20x मॅग्निफिकेशनवर प्रतिमा मिळवण्यात आल्या (श्वासनलिकेच्या पूर्ण रुंदीसाठी सर्वोच्च सेटिंगसह), श्वासनलिकेची संपूर्ण लांबी चरण-दर-चरण प्रतिमांसह, प्रत्येक प्रतिमेमध्ये पुरेसा ओव्हरलॅप सुनिश्चित करून प्रतिमा तयार करण्यासाठी. "शिलाई". त्यानंतर प्रत्येक श्वासनलिकेतील प्रतिमा इमेज कंपोझिट एडिटर v2.0.3 (मायक्रोसॉफ्ट रिसर्च) वापरून एका समग्र प्रतिमेत एकत्र केल्या गेल्या ज्यामध्ये प्लॅनर मोशन अल्गोरिदम वापरला गेला. प्रत्येक प्राण्याच्या श्वासनलिकेतील संमिश्र प्रतिमांमधील LacZ अभिव्यक्ती क्षेत्रे पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे स्वयंचलित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) वापरून मोजली गेली, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 आणि Value < 0.7 च्या सेटिंग्ज वापरून. ऊतींचे आकृतिबंध ट्रेस करून, ऊतींचे क्षेत्र ओळखण्यासाठी आणि श्वासनलिकेतील ऊतींच्या बाहेरून कोणतेही खोटे शोध रोखण्यासाठी प्रत्येक संमिश्र प्रतिमेसाठी GIMP v2.10.24 मध्ये एक मुखवटा मॅन्युअली तयार केला गेला. प्रत्येक प्राण्याच्या सर्व संमिश्र प्रतिमांमधील डाग असलेले क्षेत्र त्या प्राण्यासाठी एकूण डाग असलेले क्षेत्र निर्माण करण्यासाठी एकत्रित केले गेले. नंतर सामान्यीकृत क्षेत्र निर्माण करण्यासाठी डाग असलेले क्षेत्र एकूण मास्क क्षेत्राने विभागले गेले.
प्रत्येक श्वासनलिका पॅराफिनमध्ये एम्बेड केली गेली आणि 5 μm विभाग कापले गेले. विभागांना 5 मिनिटांसाठी न्यूट्रल फास्ट रेडने काउंटरस्टेन केले गेले आणि Nikon Eclipse E400 मायक्रोस्कोप, DS-Fi3 कॅमेरा आणि NIS एलिमेंट कॅप्चर सॉफ्टवेअर (आवृत्ती 5.20.00) वापरून प्रतिमा मिळवल्या गेल्या.
सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे ग्राफपॅड प्रिझम v9 (ग्राफपॅड सॉफ्टवेअर, इंक.) मध्ये केली गेली. सांख्यिकीय महत्त्व p ≤ 0.05 वर सेट केले गेले. शापिरो-विल्क चाचणी वापरून सामान्यता सत्यापित केली गेली आणि अनपेअर टी-टेस्ट वापरून LacZ स्टेनिंगमधील फरकांचे मूल्यांकन केले गेले.
तक्ता १ मध्ये वर्णन केलेल्या सहा MPs ची PCXI वापरून तपासणी करण्यात आली आणि दृश्यमानता तक्ता २ मध्ये वर्णन करण्यात आली आहे. PCXI अंतर्गत दोन पॉलिस्टीरिन MPs (MP1 आणि MP2; अनुक्रमे १८ μm आणि ०.२५ μm) दृश्यमान नव्हते, परंतु उर्वरित नमुने ओळखण्यायोग्य होते (उदाहरणे आकृती ५ मध्ये दाखवली आहेत). MP3 आणि MP4 (अनुक्रमे १०-१५% Fe3O4; ०.२५ μm आणि ०.९ μm) अस्पष्टपणे दृश्यमान आहेत. चाचणी केलेल्या काही सर्वात लहान कणांचा समावेश असला तरी, MP5 (९८% Fe3O4; ०.२५ μm) सर्वात स्पष्ट होते. CombiMag उत्पादन MP6 शोधणे कठीण आहे. सर्व प्रकरणांमध्ये, चुंबकाला केशिकाच्या समांतर पुढे आणि मागे स्थानांतरित करून MP शोधण्याची आमची क्षमता लक्षणीयरीत्या वाढली. जेव्हा चुंबक केशिकापासून दूर गेले, तेव्हा कण लांब तारांमध्ये वाढले, परंतु चुंबक जवळ येत गेले आणि चुंबकीय क्षेत्राची ताकद वाढत गेली, तेव्हा कण केशिकाच्या वरच्या पृष्ठभागाकडे स्थलांतरित झाल्यामुळे कण तार लहान होत गेले (पूरक पहा). व्हिडिओ S1: MP4), पृष्ठभागाची कण घनता वाढवते. याउलट, जेव्हा चुंबक केशिकामधून काढून टाकला जातो, तेव्हा क्षेत्रीय शक्ती कमी होते आणि MPs केशिकाच्या वरच्या पृष्ठभागापासून लांब तारांमध्ये पुनर्रचना करतात (पूरक व्हिडिओ S2:MP4 पहा). चुंबक हालचाल थांबवल्यानंतर, समतोल स्थितीत पोहोचल्यानंतर कण थोड्या काळासाठी हालचाल करत राहतात. MP केशिकाच्या वरच्या पृष्ठभागाकडे आणि त्यापासून दूर जात असताना, चुंबकीय कण सामान्यतः द्रवपदार्थातून कचरा ओढतात.
PCXI अंतर्गत MP ची दृश्यमानता नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या बदलते. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 आणि (d) MP6. येथे दाखवलेल्या सर्व प्रतिमा केशिकाच्या थेट वर सुमारे 10 मिमी असलेल्या चुंबकाने घेतल्या आहेत. उघड मोठे वर्तुळ हे केशिकांमध्ये अडकलेले हवेचे बुडबुडे आहेत, जे फेज कॉन्ट्रास्ट इमेजिंगची काळी आणि पांढरी धार वैशिष्ट्ये स्पष्टपणे दर्शवितात. लाल बॉक्समध्ये कॉन्ट्रास्ट वाढवणारे मोठेीकरण आहे. लक्षात ठेवा की सर्व आकृत्यांमधील चुंबक योजनांचे व्यास मोजमापानुसार नाहीत आणि ते दर्शविल्यापेक्षा अंदाजे 100 पट मोठे आहेत.
चुंबकाचे रूपांतर केशिकाच्या वरच्या बाजूने डावीकडे आणि उजवीकडे केले जात असताना, MP स्ट्रिंगचा कोन चुंबकाशी संरेखित होण्यासाठी बदलतो (आकृती 6 पहा), अशा प्रकारे चुंबकीय क्षेत्र रेषा रेखाटतो. MP3-5 साठी, जीवा एका उंबरठ्याच्या कोनात पोहोचल्यानंतर, कण केशिकाच्या वरच्या पृष्ठभागावर ओढले जातात. यामुळे बहुतेकदा MPs चुंबकीय क्षेत्र सर्वात मजबूत असलेल्या ठिकाणी मोठ्या गटांमध्ये एकत्रित होतात (पूरक व्हिडिओ S3:MP5 पहा). हे विशेषतः केशिकाच्या टोकाच्या जवळ इमेजिंग करताना स्पष्ट होते, ज्यामुळे MPs द्रव-हवेच्या इंटरफेसवर एकत्रित होतात आणि लक्ष केंद्रित करतात. MP6 मधील कण, जे MP3-5 पेक्षा ओळखणे अधिक कठीण होते, ते चुंबक केशिकाच्या बाजूने हलवल्यामुळे ओढले गेले नाहीत, परंतु MP स्ट्रिंग वेगळे झाले, ज्यामुळे कण दृश्याच्या क्षेत्रात राहिले (पूरक व्हिडिओ S4:MP6 पहा). काही प्रकरणांमध्ये, जेव्हा लागू केलेले चुंबकीय क्षेत्र चुंबकाला इमेजिंग स्थानापासून मोठ्या अंतरावर हलवून कमी केले गेले, तेव्हा उर्वरित कोणतेही MP स्ट्रिंगमध्ये राहून गुरुत्वाकर्षणाने ट्यूबच्या खालच्या पृष्ठभागावर हळूहळू खाली आले (पूरक व्हिडिओ S5: MP3 पहा).
चुंबक केशिकाच्या वर उजवीकडे वळला की MP स्ट्रिंगचा कोन बदलतो. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 आणि (d) MP6. लाल बॉक्समध्ये कॉन्ट्रास्ट वाढवणारे मॅग्निफिकेशन आहे. लक्षात ठेवा की पूरक व्हिडिओ माहितीपूर्ण आहेत कारण ते महत्वाच्या कण रचना आणि गतिमान माहिती प्रकट करतात जी या स्थिर प्रतिमांमध्ये दृश्यमान केली जाऊ शकत नाहीत.
आमच्या चाचण्यांमधून असे दिसून आले की श्वासनलिकेजवळ चुंबकाला हळूहळू पुढे-मागे हलवल्याने जटिल हालचालींच्या संदर्भात MP चे दृश्यमानता सुलभ होते. पॉलीस्टीरिन मणी (MP1 आणि MP2) केशिकामध्ये दिसत नसल्याने इन व्हिव्हो चाचणी घेण्यात आली नाही. उर्वरित चार MP पैकी प्रत्येकाची श्वासनलिकेवर सुमारे 30° ते उभ्या कोनात कॉन्फिगर केलेल्या चुंबकाच्या लांब अक्षाने इन व्हिव्हो चाचणी करण्यात आली (आकृती 2b आणि 3a पहा), कारण यामुळे MP साखळ्या लांब झाल्या आणि चुंबक कॉन्फिगरेशन संपुष्टात आणल्यापेक्षा अधिक प्रभावी होत्या. कोणत्याही जिवंत प्राण्यांच्या श्वासनलिकेमध्ये MP3, MP4 आणि MP6 आढळले नाहीत. प्राण्यांना मानवीरित्या मारल्यानंतर उंदरांच्या वायुमार्गांची प्रतिमा काढली गेली तेव्हा सिरिंज पंप वापरून अतिरिक्त व्हॉल्यूम जोडला गेला तरीही कण अदृश्य राहिले. MP5 मध्ये सर्वाधिक लोह ऑक्साईड सामग्री होती आणि तो एकमेव दृश्यमान कण होता, आणि म्हणूनच MP च्या इन व्हिव्हो वर्तनाचे मूल्यांकन आणि वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी वापरला गेला.
MP प्रसूतीदरम्यान श्वासनलिकेवर चुंबक ठेवल्याने अनेक, परंतु सर्वच नाही, MP दृश्य क्षेत्रात केंद्रित झाले. श्वासनलिकेत प्रवेश करणारे कण मानवीरित्या बळी दिलेल्या प्राण्यांमध्ये सर्वोत्तमपणे दिसून येतात. आकृती 7 आणि पूरक व्हिडिओ S6: MP5 मध्ये व्हेंट्रल श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर कणांचे जलद चुंबकीय कॅप्चर आणि संरेखन दर्शविले आहे, जे दर्शविते की MP श्वासनलिकेच्या इच्छित क्षेत्रांकडे निर्देशित केले जाऊ शकतात. MP प्रसूतीनंतर श्वासनलिकेजवळ अधिक दूरवर शोध घेताना, काही MP कॅरिनाच्या जवळ आढळले, जे सूचित करते की चुंबकीय क्षेत्राची ताकद सर्व MP गोळा करण्यासाठी आणि टिकवून ठेवण्यासाठी अपुरी होती, कारण ते द्रव प्रक्रियेदरम्यान जास्तीत जास्त चुंबकीय क्षेत्र शक्तीच्या क्षेत्रातून वितरित केले गेले होते. तरीही, प्रतिमा केलेल्या क्षेत्राभोवती प्रसुतिपूर्व MP सांद्रता जास्त होती, ज्यामुळे असे सूचित होते की बरेच MP वायुमार्गाच्या प्रदेशात राहिले जेथे लागू चुंबकीय क्षेत्र शक्ती सर्वाधिक होती.
(अ) नुकत्याच युथनाइज्ड झालेल्या उंदराच्या श्वासनलिकेमध्ये MP5 प्रसूतीपूर्वी आणि (ब) नंतरच्या प्रतिमा ज्यामध्ये चुंबक इमेजिंग क्षेत्राच्या थेट वर स्थित आहे. प्रतिमा घेतलेला भाग दोन कार्टिलेज रिंग्जमध्ये स्थित आहे. MP प्रसूतीपूर्वी, वायुमार्गात काही द्रवपदार्थ असतो. लाल बॉक्समध्ये कॉन्ट्रास्ट वाढवणारे मॅग्निफिकेशन असते. या प्रतिमा पूरक व्हिडिओ S6:MP5 मध्ये दर्शविलेल्या व्हिडिओमधील आहेत.
श्वासनलिकेजवळ चुंबकाचे रूपांतर केल्याने MP साखळीने श्वसनमार्गाच्या पृष्ठभागाच्या आत कोन बदलला, जसे केशिकांप्रमाणेच (आकृती 8 आणि पूरक व्हिडिओ S7:MP5 पहा). तथापि, आमच्या अभ्यासात, MP ला जिवंत वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर केशिकांप्रमाणे ओढता येत नव्हते. काही प्रकरणांमध्ये, चुंबक डावीकडे आणि उजवीकडे सरकत असताना MP साखळी लांब होते. मनोरंजक म्हणजे, आम्हाला असेही आढळले की जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेजवळ रेखांशाने हलवला जातो तेव्हा कणांची तार पृष्ठभागावरील द्रव थराची खोली बदलते आणि जेव्हा चुंबक थेट वर हलवला जातो आणि कणांची तार उभ्या स्थितीत फिरवली जाते तेव्हा ती विस्तारते (पूरक व्हिडिओ S7 पहा). : MP5 0:09 वाजता, तळाशी उजवीकडे). जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेच्या वरच्या बाजूला (म्हणजेच, श्वासनलिकेच्या लांबीच्या बाजूने न जाता प्राण्यांच्या डावीकडे किंवा उजवीकडे) वळवला गेला तेव्हा गतीचा वैशिष्ट्यपूर्ण नमुना बदलला. कण हलतानाही स्पष्टपणे दिसत होते, परंतु जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेतून काढून टाकला गेला तेव्हा कणांच्या तारांचे टोक दृश्यमान झाले (0:08 पासून सुरू होणारा पूरक व्हिडिओ S8:MP5 पहा). हे काचेच्या केशिकामध्ये लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राखाली आपण पाहिलेल्या MP वर्तनाशी सुसंगत आहे.
जिवंत भूल दिलेल्या उंदराच्या श्वासनलिकेत MP5 दाखवणाऱ्या प्रतिमांची उदाहरणे. (a) श्वासनलिकेच्या वर आणि डावीकडे प्रतिमा मिळविण्यासाठी चुंबकाचा वापर केला जातो, नंतर (b) चुंबक उजवीकडे हलवल्यानंतर. लाल बॉक्समध्ये कॉन्ट्रास्ट वाढवणारे मोठेीकरण आहे. या प्रतिमा पूरक व्हिडिओ S7:MP5 मध्ये दाखवलेल्या व्हिडिओमधील आहेत.
जेव्हा दोन्ही ध्रुव श्वासनलिकेच्या वर आणि खाली उत्तर-दक्षिण दिशेने कॉन्फिगर केले गेले (म्हणजेच आकर्षित करणे; आकृती 3b), तेव्हा MP कॉर्ड्स लांब दिसले आणि पृष्ठीय श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागाऐवजी श्वासनलिकेच्या बाजूच्या भिंतीवर स्थित होते (पूरक व्हिडिओ S9:MP5 पहा). तथापि, दुहेरी-चुंबक उपकरण वापरताना द्रव वितरणानंतर एकाच ठिकाणी (म्हणजेच, श्वासनलिकेचा पृष्ठीय पृष्ठभाग) कणांची उच्च सांद्रता आढळली नाही, जी सामान्यतः एकल-चुंबक उपकरण वापरताना होते. नंतर जेव्हा एक चुंबक ध्रुव उलटे करण्यासाठी कॉन्फिगर केले गेले (आकृती 3c), प्रसूतीनंतर दृश्य क्षेत्रात दिसणार्‍या कणांची संख्या वाढलेली दिसून आली नाही. चुंबकांना खेचणाऱ्या किंवा ढकलणाऱ्या उच्च चुंबकीय क्षेत्र शक्तींमुळे दोन्ही दुहेरी-चुंबक संरचनांचे सेटअप आव्हानात्मक आहे. नंतर सेटअप वायुमार्गाच्या समांतर एका चुंबकात बदलण्यात आला परंतु 90 अंशांवर वायुमार्गातून जात असे जेणेकरून क्षेत्र रेषा श्वासनलिकेच्या भिंतीला ऑर्थोगोनली ओलांडतात (आकृती 3d), एक अभिमुखता जी कण एकत्रीकरण निर्धारित करण्यासाठी डिझाइन केलेली आहे की नाही बाजूची भिंत पाहता आली. तथापि, या कॉन्फिगरेशनमध्ये, MP संचय किंवा चुंबक हालचालीची ओळखण्यायोग्य हालचाल आढळली नाही. या सर्व निकालांवर आधारित, इन व्हिव्हो जीन कॅरियर अभ्यासासाठी एकल-चुंबक, 30-अंश अभिमुखता कॉन्फिगरेशन (आकृती 3a) निवडण्यात आले.
मानवी हत्येनंतर लगेचच जेव्हा प्राण्याची वारंवार प्रतिमा काढली गेली, तेव्हा गोंधळात टाकणाऱ्या ऊतींच्या हालचालीचा अभाव असल्याने चुंबकाच्या ट्रान्सलेशनल गतीनुसार स्पष्ट इंटरकॉन्ड्रल क्षेत्रात बारीक आणि लहान कण रेषा ओळखता आल्या. तरीही, MP6 कणांची उपस्थिती आणि हालचाल स्पष्टपणे दिसत नाही.
LV-LacZ टायटर 1.8 × 108 TU/ml होता आणि CombiMag MP (MP6) सोबत 1:1 मिसळल्यानंतर, प्राण्यांना 9 × 107 TU/ml LV वाहनाचा 50 μl श्वासनलिकेचा डोस मिळाला (म्हणजेच 4.5 × 106 TU/उंदीर). या अभ्यासांमध्ये, प्रसूतीदरम्यान चुंबकाचे भाषांतर करण्याऐवजी, चुंबकीय क्षेत्राच्या अनुपस्थितीत वेक्टर डिलिव्हरीच्या तुलनेत LV ट्रान्सडक्शन (a) सुधारता येईल का आणि (b) लक्ष केंद्रित करता येईल का हे निर्धारित करण्यासाठी आम्ही चुंबकाला एकाच स्थितीत निश्चित केले. वायुमार्ग पेशी वरच्या वायुमार्गाच्या चुंबकीय लक्ष्य प्रदेशात ट्रान्सड्यूस केल्या जातात.
चुंबकांची उपस्थिती आणि LV व्हेक्टरसह CombiMag चा वापर यांचा प्राण्यांच्या आरोग्यावर विपरीत परिणाम झाल्याचे दिसून आले नाही, जसे की आमच्या मानक LV व्हेक्टर डिलिव्हरी प्रोटोकॉलवर झाले. यांत्रिक गोंधळाच्या अधीन असलेल्या श्वासनलिका क्षेत्राच्या समोरील प्रतिमा (पूरक आकृती 1) दर्शवितात की जेव्हा चुंबक उपस्थित होता तेव्हा LV-MP ने उपचार केलेल्या प्राण्यांच्या गटात ट्रान्सडक्शनचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या जास्त होते (आकृती 9a). नियंत्रण गटात (आकृती 9b) फक्त थोड्या प्रमाणात निळा LacZ स्टेनिंग उपस्थित होता. सामान्यीकृत X-Gal स्टेन्ड क्षेत्रांचे प्रमाणीकरण दर्शविते की चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत LV-MP च्या प्रशासनाने अंदाजे 6 पट सुधारणा निर्माण केली (आकृती 9c).
LV-MP द्वारे श्वासनलिकेचे ट्रान्सडक्शन दर्शविणारी संयुक्त प्रतिमांची उदाहरणे (a) चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत आणि (b) चुंबकाच्या अनुपस्थितीत. (c) चुंबक वापरताना श्वासनलिकेतील सामान्यीकृत LacZ ट्रान्सडक्शन क्षेत्रात सांख्यिकीयदृष्ट्या लक्षणीय सुधारणा (*p = 0.029, t-चाचणी, n = 3 प्रति गट, सरासरी ± SEM).
तटस्थ जलद लाल-डाग असलेल्या विभागांमध्ये (उदाहरणार्थ पूरक आकृती 2 मध्ये दर्शविले आहे) पूर्वी नोंदवल्याप्रमाणे LacZ-डाग असलेल्या पेशी समान नमुन्यात आणि स्थानावर उपस्थित असल्याचे दिसून आले.
वायुमार्ग जनुक थेरपीसाठी एक प्रमुख आव्हान म्हणजे वाहक कणांचे स्वारस्य असलेल्या प्रदेशांमध्ये अचूक स्थानिकीकरण करणे आणि हलत्या फुफ्फुसांमध्ये वायुप्रवाह आणि सक्रिय श्लेष्मा क्लिअरन्सच्या उपस्थितीत उच्च पातळीचे ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता प्राप्त करणे. CF वायुमार्ग रोगावर उपचार करण्यासाठी डिझाइन केलेल्या LV वाहकांसाठी, वाहक वायुमार्गांमध्ये वाहक कणांचा निवास वेळ वाढवणे हे आतापर्यंत एक अविश्वसनीय ध्येय राहिले आहे. कॅस्टेलानी आणि इतरांनी सांगितल्याप्रमाणे, इलेक्ट्रोपोरेशनसारख्या इतर जनुक वितरण पद्धतींच्या तुलनेत ट्रान्सडक्शन सुधारण्यासाठी चुंबकीय क्षेत्रांचा वापर फायदे देतो, कारण ते साधेपणा, किफायतशीरता, वितरण स्थानिकीकरण, वाढलेली कार्यक्षमता आणि कमी उष्मायन वेळ आणि शक्यतो लहान वाहक डोस एकत्र करू शकते. तथापि, बाह्य चुंबकीय शक्तींच्या प्रभावाखाली वायुमार्गांमध्ये चुंबकीय कणांचे इन व्हिव्हो निक्षेपण आणि वर्तन कधीही वर्णन केलेले नाही, किंवा अखंड जिवंत वायुमार्गांमध्ये जनुक अभिव्यक्ती पातळी वाढविण्यासाठी या पद्धतीची व्यवहार्यता प्रत्यक्षात इन व्हिव्होमध्ये प्रदर्शित केलेली नाही.
आमच्या इन विट्रो सिंक्रोट्रॉन PCXI प्रयोगांवरून असे दिसून आले की पॉलीस्टीरिन MP वगळता आम्ही तपासलेले सर्व कण आम्ही वापरलेल्या इमेजिंग सेटअपमध्ये दृश्यमान होते. चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत, MP तार तयार करतात ज्यांची लांबी कण प्रकार आणि चुंबकीय क्षेत्राच्या ताकदीशी (म्हणजेच चुंबकाची समीपता आणि गती) संबंधित असते. आकृती १० मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, आपण पाहत असलेल्या तार प्रत्येक वैयक्तिक कण चुंबकीकृत झाल्यामुळे आणि त्याचे स्वतःचे स्थानिक चुंबकीय क्षेत्र प्रेरित केल्यामुळे तयार होतात. हे वेगळे क्षेत्र इतर समान कण एकत्रित करण्यास आणि जोडण्यास कारणीभूत ठरतात, इतर कणांच्या स्थानिक आकर्षक आणि प्रतिकर्षक बलांपासून स्थानिक बलांमुळे गट स्ट्रिंगसारख्या हालचालींसह.
(a,b) द्रवाने भरलेल्या केशिकांमध्ये निर्माण झालेले कण ट्रेन आणि (c,d) हवेने भरलेले श्वासनलिका दर्शविणारे योजनाबद्ध. लक्षात ठेवा की केशिका आणि श्वासनलिका स्केलवर काढल्या जात नाहीत. पॅनेल (a) मध्ये MP चे वर्णन देखील आहे, ज्यामध्ये तारांमध्ये व्यवस्थित Fe3O4 कण आहेत.
जेव्हा चुंबक केशिकाच्या वर हलवला गेला तेव्हा कण स्ट्रिंगचा कोन Fe3O4 असलेल्या MP3-5 साठी एका गंभीर उंबरठ्यावर पोहोचला, त्यानंतर कण स्ट्रिंग मूळ स्थितीत राहिला नाही, परंतु पृष्ठभागावरून नवीन स्थानावर गेला. चुंबक. हा परिणाम होण्याची शक्यता आहे कारण काचेच्या केशिका पृष्ठभागाची ही हालचाल होण्यास परवानगी देण्यासाठी पुरेशी गुळगुळीत आहे. मनोरंजक म्हणजे, MP6 (CombiMag) असे वागले नाही, कदाचित कारण कण लहान होते, वेगवेगळे कोटिंग्ज किंवा पृष्ठभागावरील शुल्क होते किंवा मालकीच्या वाहक द्रवपदार्थामुळे त्यांच्या हालचालीच्या क्षमतेवर परिणाम झाला. CombiMag कणांचा प्रतिमा कॉन्ट्रास्ट देखील कमकुवत आहे, जो सूचित करतो की द्रव आणि कणांची घनता समान असू शकते आणि म्हणून ते एकमेकांकडे सहजपणे जाऊ शकत नाहीत. चुंबक खूप वेगाने हलल्यास कण देखील अडकू शकतात, हे सूचित करते की चुंबकीय क्षेत्राची शक्ती नेहमीच द्रवपदार्थातील कणांमधील घर्षणावर मात करू शकत नाही, असे सूचित करते की कदाचित हे आश्चर्यकारक नाही की चुंबकीय क्षेत्राची शक्ती आणि चुंबक आणि लक्ष्य क्षेत्रामधील अंतर खूप महत्वाचे आहे. एकत्रितपणे, हे परिणाम असेही सूचित करतात की, चुंबक लक्ष्य क्षेत्रातून वाहणाऱ्या अनेक MPs कॅप्चर करू शकतात, परंतु हे संभव नाही की श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर कॉम्बीमॅग कण हलविण्यासाठी चुंबकांवर अवलंबून राहता येते. म्हणून, आम्ही असा निष्कर्ष काढतो की इन विवो LV-MP अभ्यासात वायुमार्गाच्या विशिष्ट क्षेत्रांना भौतिकदृष्ट्या लक्ष्य करण्यासाठी स्थिर चुंबकीय क्षेत्रांचा वापर केला पाहिजे.
जेव्हा कण शरीरात पोहोचवले जातात तेव्हा ते जटिल हालचाल करणाऱ्या शरीराच्या ऊतींच्या संदर्भात ओळखणे कठीण असते, परंतु चुंबकाला श्वासनलिकेच्या वर आडवे स्थानांतरित करून MP तारांना "हलवणे" करून त्यांना शोधण्याची क्षमता वाढवली गेली. जरी लाइव्ह इमेजिंग शक्य असले तरी, प्राण्याला मानवीरित्या मारल्यानंतर कणांची हालचाल ओळखणे सोपे होते. जेव्हा चुंबक इमेजिंग क्षेत्राच्या वर स्थित होता तेव्हा MP सांद्रता सामान्यतः या ठिकाणी सर्वाधिक होती, जरी काही कण सहसा श्वासनलिकेच्या बाजूने पुढे आढळले. इन विट्रो अभ्यासांच्या विपरीत, चुंबकाचे भाषांतर करून कणांना श्वासनलिकेच्या बाजूने ओढता येत नाही. हा निष्कर्ष श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर आवरण घालणारा श्लेष्मा सामान्यतः श्वास घेतलेल्या कणांवर प्रक्रिया करतो, त्यांना श्लेष्मामध्ये अडकवतो आणि नंतर म्यूकोसिलरी क्लिअरन्स यंत्रणेद्वारे कसा साफ करतो याच्याशी सुसंगत आहे.
आम्ही असे गृहीत धरले की श्वासनलिकेवर आणि खाली आकर्षणासाठी चुंबकांचा वापर केल्याने (आकृती 3b) एका बिंदूवर जास्त केंद्रित असलेल्या चुंबकीय क्षेत्राऐवजी अधिक एकसमान चुंबकीय क्षेत्र निर्माण होऊ शकते, ज्यामुळे कणांचे अधिक एकसमान वितरण होऊ शकते. तथापि, आमच्या प्राथमिक अभ्यासात या गृहीतकाला समर्थन देण्यासाठी स्पष्ट पुरावे आढळले नाहीत. त्याचप्रमाणे, चुंबकांच्या जोडीला मागे टाकण्यासाठी (आकृती 3c) कॉन्फिगर केल्याने प्रतिमा केलेल्या क्षेत्रात अधिक कण जमा झाले नाहीत. हे दोन निष्कर्ष दर्शवितात की दुहेरी-चुंबक सेटअप MP लक्ष्यीकरणाच्या स्थानिक नियंत्रणात लक्षणीय सुधारणा करत नाही आणि परिणामी मजबूत चुंबकीय शक्ती कॉन्फिगर करणे कठीण आहे, ज्यामुळे हा दृष्टिकोन कमी व्यावहारिक बनतो. त्याचप्रमाणे, श्वासनलिकेवर आणि माध्यमातून चुंबकाला दिशा देण्याने (आकृती 3d) देखील प्रतिमा केलेल्या क्षेत्रात राखून ठेवलेल्या कणांची संख्या वाढवली नाही. यापैकी काही पर्यायी कॉन्फिगरेशन यशस्वी होऊ शकत नाहीत कारण त्यांच्या परिणामी निक्षेपण क्षेत्रात चुंबकीय क्षेत्राची ताकद कमी होते. म्हणून, एकल 30-अंश कोन चुंबक कॉन्फिगरेशन (आकृती 3a) इन व्हिव्हो चाचणीसाठी सर्वात सोपी आणि सर्वात कार्यक्षम पद्धत मानली जाते.
LV-MP अभ्यासातून असे दिसून आले की जेव्हा LV व्हेक्टर CombiMag सोबत एकत्र केले गेले आणि चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत शारीरिक गोंधळानंतर वितरित केले गेले, तेव्हा नियंत्रणांच्या तुलनेत श्वासनलिकेमध्ये ट्रान्सडक्शन पातळी लक्षणीयरीत्या वाढली. सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग अभ्यास आणि LacZ निकालांवर आधारित, चुंबकीय क्षेत्र श्वासनलिकेमध्ये LV जतन करण्यास आणि फुफ्फुसात खोलवर प्रवेश करणाऱ्या वेक्टर कणांची संख्या कमी करण्यास सक्षम असल्याचे दिसून आले. अशा लक्ष्यीकरण सुधारणांमुळे वितरित टायटर्स, ऑफ-टार्गेट ट्रान्सडक्शन, दाहक आणि रोगप्रतिकारक दुष्परिणाम आणि जीन कॅरियर खर्च कमी करताना उच्च कार्यक्षमता मिळू शकते. महत्त्वाचे म्हणजे, उत्पादकाच्या मते, CombiMag इतर जीन ट्रान्सफर पद्धतींसह वापरला जाऊ शकतो, ज्यामध्ये इतर व्हायरल व्हेक्टर (जसे की AAV) आणि न्यूक्लिक अॅसिडचा समावेश आहे.