Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कंपॅटिबिलिटी मोड बंद करा). यादरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय प्रदर्शित करू.
सिस्टिक फायब्रोसिस फुफ्फुस रोगाच्या उपचारासाठी वापरल्या जाणाऱ्या जीन व्हेक्टर्सनी वाहक श्वासनलिकेला लक्ष्य केले पाहिजे, कारण फुफ्फुसाच्या परिघीय भागातील ट्रान्सडक्शनमुळे उपचारात्मक फायदा मिळत नाही. व्हायरल ट्रान्सडक्शनची कार्यक्षमता व्हेक्टरच्या वास्तव्याच्या कालावधीशी थेट संबंधित असते. तथापि, जीन वाहकांसारखे वितरण द्रव श्वास घेताना नैसर्गिकरित्या वायुकोशांमध्ये पसरतात आणि कोणत्याही स्वरूपातील उपचारात्मक कण म्युकोसिलियरी वहनाद्वारे वेगाने बाहेर टाकले जातात. श्वासनलिकेमध्ये जीन वाहकांचा वास्तव्याचा कालावधी वाढवणे महत्त्वाचे आहे, परंतु ते साध्य करणे कठीण आहे. जीन वाहकांशी जोडलेले चुंबकीय कण, जे श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर निर्देशित केले जाऊ शकतात, ते प्रादेशिक लक्ष्यीकरण सुधारू शकतात. इन विवो व्हिज्युअलायझेशनमधील आव्हानांमुळे, लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावरील अशा लहान चुंबकीय कणांचे वर्तन फारसे समजलेले नाही. या अभ्यासाचा उद्देश, भूल दिलेल्या उंदरांच्या श्वासनलिकेतील चुंबकीय कणांच्या मालिकेच्या इन विवो हालचालींचे व्हिज्युअलायझेशन करण्यासाठी सिंक्रोट्रॉन इमेजिंगचा वापर करणे, आणि इन विवोमध्ये वैयक्तिक व एकत्रित कणांच्या वर्तनाची गतिशीलता आणि नमुने तपासणे हा होता. त्यानंतर आम्ही हे देखील तपासले की चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत लेंटिव्हायरल चुंबकीय कणांच्या वितरणाने ट्रान्सडक्शन वाढेल का. उंदराच्या श्वासनलिकेतील कार्यक्षमता. सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंगमुळे इन विट्रो आणि इन व्हिवोमध्ये स्थिर आणि गतिमान चुंबकीय क्षेत्रांमधील चुंबकीय कणांचे वर्तन दिसून येते. चुंबकांच्या साहाय्याने कण जिवंत श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावरून सहजपणे ओढले जाऊ शकत नाहीत, परंतु वाहतुकीदरम्यान, हे कण दृष्टिक्षेत्रात केंद्रित होतात, जिथे चुंबकीय क्षेत्र सर्वात मजबूत असते. जेव्हा चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत लेंटिव्हायरल चुंबकीय कण पोहोचवले गेले, तेव्हा ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता देखील सहा पटीने वाढली. एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की लेंटिव्हायरल चुंबकीय कण आणि चुंबकीय क्षेत्रे हे जीन व्हेक्टर लक्ष्यीकरण सुधारण्यासाठी आणि इन व्हिवोमधील वाहक श्वासनलिकेमध्ये ट्रान्सडक्शन पातळी वाढवण्यासाठी मौल्यवान दृष्टिकोन असू शकतात.
सिस्टिक फायब्रोसिस (CF) हा CF ट्रान्समेम्ब्रेन कंडक्टन्स रेग्युलेटर (CFTR) नावाच्या एकाच जनुकातील फरकामुळे होतो. CFTR प्रथिन हे एक आयन चॅनल आहे जे संपूर्ण शरीरातील अनेक एपिथेलियल पेशींमध्ये असते, ज्यात श्वासवाहिन्यांचा समावेश आहे, जे CF रोगजननाचे एक प्रमुख ठिकाण आहे. CFTR मधील दोषांमुळे पाण्याची असामान्य वाहतूक होते, श्वासवाहिनीचा पृष्ठभाग निर्जलित होतो आणि श्वासवाहिनीच्या पृष्ठभागावरील द्रवाच्या (ASL) थराची जाडी कमी होते. यामुळे श्वासवाहिनीतून आत घेतलेले कण आणि रोगजंतू बाहेर टाकण्याची म्युकोसिलिअरी ट्रान्सपोर्ट (MCT) प्रणालीची क्षमता देखील कमी होते. आमचे ध्येय CFTR जनुकाची योग्य प्रत पोहोचवण्यासाठी आणि ASL, MCT व फुफ्फुसांचे आरोग्य सुधारण्यासाठी लेंटिव्हायरल (LV) जनुकीय उपचारपद्धती विकसित करणे, तसेच शरीरातच (in vivo) हे मापदंड मोजण्यास सक्षम नवीन तंत्रज्ञान विकसित करणे हे आहे.
एलव्ही व्हेक्टर्स हे सिस्टिक फायब्रोसिस (CF) एअरवे जीन थेरपीसाठी प्रमुख पर्यायांपैकी एक आहेत, मुख्यत्वे कारण ते उपचारात्मक जनुकाला एअरवेच्या बेसल पेशींमध्ये (एअरवे स्टेम सेल्स) कायमस्वरूपी एकत्रित करू शकतात. हे महत्त्वाचे आहे कारण ते कार्यात्मक, जनुकीय-दुरुस्त केलेल्या CF-संबंधित एअरवेच्या पृष्ठभागावरील पेशींमध्ये रूपांतरित होऊन सामान्य हायड्रेशन आणि कफ साफ करण्याची प्रक्रिया पुनर्संचयित करू शकतात, ज्यामुळे आयुष्यभराचे फायदे मिळतात. एलव्ही व्हेक्टर्स वाहक एअरवेच्या दिशेने निर्देशित केले पाहिजेत, कारण येथूनच CF फुफ्फुसांच्या आजाराची सुरुवात होते. व्हेक्टर फुफ्फुसात खोलवर पोहोचवल्यास अल्व्होलर ट्रान्सडक्शन होऊ शकते, परंतु CF मध्ये याचा कोणताही उपचारात्मक फायदा नाही. तथापि, जनुकीय वाहकांसारखे द्रव पदार्थ पोहोचवल्यानंतर श्वास घेताना नैसर्गिकरित्या अल्व्होलीमध्ये स्थलांतरित होतात³⁴ आणि उपचारात्मक कण एमसीटीद्वारे (MCT) वेगाने तोंडाच्या पोकळीत साफ केले जातात. एलव्ही ट्रान्सडक्शनची कार्यक्षमता व्हेक्टर लक्ष्य पेशींच्या जवळ किती काळ राहतो याच्याशी थेट संबंधित आहे, ज्यामुळे पेशींमध्ये त्याचे शोषण होऊ शकते – याला "रेसिडेन्स टाइम"⁵ म्हणतात – जो सामान्य प्रादेशिक वायुप्रवाह तसेच कणांद्वारे कफात समन्वितपणे शोषले जाणे आणि एमसीटीद्वारे सहजपणे कमी केला जाऊ शकतो. CF साठी, एअरवेमध्ये एलव्हीचा रेसिडेन्स टाइम वाढवण्याची क्षमता महत्त्वाची आहे. या प्रदेशात उच्च पातळीचे ट्रान्सडक्शन साध्य करणे, परंतु आतापर्यंत ते आव्हानात्मक राहिले आहे.
या अडथळ्यावर मात करण्यासाठी, आम्ही सुचवतो की एलव्ही चुंबकीय कण (एमपी) दोन पूरक मार्गांनी मदत करू शकतात. पहिले, लक्ष्यीकरण सुधारण्यासाठी आणि जनुकीय वाहक कणांना श्वासनलिकेच्या इच्छित भागात राहण्यास मदत करण्यासाठी त्यांना चुंबकीयरित्या श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर मार्गदर्शित केले जाऊ शकते; आणि दुसरे, एएसएल) पेशींच्या थर ६ पर्यंत जाण्यासाठी. जेव्हा एमपी अँटीबॉडीज, केमोथेरपीची औषधे किंवा पेशींच्या पडद्यांना चिकटणाऱ्या किंवा संबंधित पेशींच्या पृष्ठभागावरील रिसेप्टर्सना जोडल्या जाणाऱ्या इतर लहान रेणूंना बांधले जातात आणि स्थिर विद्युताच्या उपस्थितीत ट्यूमरच्या ठिकाणी जमा होतात, तेव्हा त्यांचा लक्ष्यित औषध वितरण वाहक म्हणून मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जातो. कर्करोग उपचारासाठी चुंबकीय क्षेत्र ७. इतर “हायपरथर्मल” तंत्रांचा उद्देश दोलायमान चुंबकीय क्षेत्रांच्या संपर्कात आल्यावर एमपींना (MPs) गरम करणे हा असतो, ज्यामुळे ट्यूमर पेशी नष्ट होतात. चुंबकीय ट्रान्सफेक्शनचे तत्त्व, ज्यामध्ये पेशींमध्ये डीएनएचे हस्तांतरण वाढवण्यासाठी चुंबकीय क्षेत्राचा ट्रान्सफेक्शन एजंट म्हणून वापर केला जातो, ते सामान्यतः इन विट्रोमध्ये, ट्रान्सड्यूस करण्यास कठीण असलेल्या सेल लाइन्ससाठी विविध नॉन-व्हायरल आणि व्हायरल जीन व्हेक्टर्स वापरून वापरले जाते. एलव्ही मॅग्नेटोट्रान्सफेक्शनची परिणामकारकता स्थापित झाली आहे, ज्यामध्ये स्थिर चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत मानवी ब्रोन्कियल एपिथेलियल सेल लाइनमध्ये एलव्ही-एमपींच्या इन विट्रो वितरणाने, केवळ एलव्ही व्हेक्टरच्या तुलनेत ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता १८६ पटीने वाढवली. एलव्ही-एमपी इन विट्रो सीएफ मॉडेलमध्ये देखील लागू केले गेले आहे, जिथे चुंबकीय ट्रान्सफेक्शनने सीएफ थुंकीच्या उपस्थितीत एअर-लिक्विड इंटरफेस कल्चरमध्ये एलव्ही ट्रान्सडक्शन २० पटीने वाढवले. तथापि, अवयवांच्या इन विवो मॅग्नेटोट्रान्सफेक्शनकडे तुलनेने कमी लक्ष दिले गेले आहे आणि त्याचे मूल्यांकन फक्त काही प्राण्यांमध्ये केले गेले आहे. अभ्यास11,12,13,14,15, विशेषतः फुफ्फुसांमध्ये16,17. तरीही, सीएफ फुफ्फुस थेरपीमध्ये चुंबकीय ट्रान्सफेक्शनच्या संधी स्पष्ट आहेत. टॅन एट अल.(2020) यांनी नमूद केले आहे की “कार्यक्षम चुंबकीय नॅनोपार्टिकल पल्मोनरी डिलिव्हरीचा एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अभ्यास सीएफ रुग्णांमधील क्लिनिकल परिणाम सुधारण्यासाठी भविष्यातील सीएफटीआर इनहेलेशन धोरणांसाठी मार्ग मोकळा करेल”6.
लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावरील लहान चुंबकीय कणांचे वर्तन पाहणे आणि अभ्यासणे कठीण आहे, आणि त्यामुळे ते नीट समजलेले नाही. इतर अभ्यासांमध्ये, आम्ही ASL खोलीतील¹⁸ आणि MCT वर्तनातील¹⁹,²⁰ सूक्ष्म इन-विवो बदल नॉन-इन्व्हेसिव्ह पद्धतीने पाहण्यासाठी आणि त्यांचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी, गॅस कॅनालच्या पृष्ठभागावरील हायड्रेशन थेट मोजण्यासाठी आणि उपचारांच्या परिणामकारकतेचा प्रारंभिक सूचक म्हणून वापरण्यासाठी एक सिंक्रोट्रॉन-प्रोपॅगेशन-आधारित फेज-कॉन्ट्रास्ट एक्स-रे इमेजिंग (PB-PCXI) पद्धत विकसित केली. याव्यतिरिक्त, आमच्या MCT मूल्यांकन पद्धतीमध्ये PB-PCXI²¹ वापरून दिसणारे MCT मार्कर म्हणून ॲल्युमिना किंवा उच्च अपवर्तक निर्देशांक असलेल्या काचेपासून बनलेले १०-३५ µm व्यासाचे कण वापरले जातात. दोन्ही तंत्रे MP सह विविध प्रकारच्या कणांच्या व्हिज्युअलायझेशनसाठी योग्य आहेत.
त्याच्या उच्च अवकाशीय आणि कालिक विभेदन क्षमतेमुळे, आमची PB-PCXI-आधारित ASL आणि MCT विश्लेषण तंत्रे शरीरांतर्गत (in vivo) एकल आणि मोठ्या कणांच्या वर्तणुकीची गतिशीलता आणि नमुने तपासण्यासाठी अत्यंत योग्य आहेत, ज्यामुळे आम्हाला MP जनुकीय वितरण तंत्रे समजून घेण्यास आणि अनुकूलित करण्यास मदत होते. आम्ही येथे वापरत असलेली पद्धत SPring-8 BL20B2 बीमलाइन वापरून केलेल्या आमच्या अभ्यासातून घेतली आहे, ज्यामध्ये आम्ही आमच्या जनुकीय वाहक डोसवरील प्राण्यांवरील अभ्यासात 3,4 आढळलेल्या असमान जनुकीय अभिव्यक्तीच्या नमुन्यांचे स्पष्टीकरण देण्यासाठी उंदरांच्या नाकाच्या आणि फुफ्फुसाच्या वायुमार्गांमध्ये बनावट वेक्टर डोस दिल्यानंतर होणाऱ्या द्रवाच्या हालचालीचे दृश्यीकरण केले.
या अभ्यासाचा उद्देश, जिवंत उंदरांच्या श्वासनलिकेतील मायक्रोप्लास्टिकच्या (MPs) मालिकेच्या शरीरांतर्गत हालचालींचे दृश्यीकरण करण्यासाठी सिंक्रोट्रॉन PB-PCXI चा वापर करणे हा होता. हे PB-PCXI इमेजिंग अभ्यास, मायक्रोप्लास्टिकच्या हालचालींवर होणारा परिणाम निश्चित करण्यासाठी विविध प्रकारचे मायक्रोप्लास्टिक, चुंबकीय क्षेत्राची तीव्रता आणि स्थाने तपासण्यासाठी तयार केले होते. आमची अशी गृहीत कल्पना होती की बाहेरून लावलेले चुंबकीय क्षेत्र, पोहोचवलेल्या मायक्रोप्लास्टिकला लक्ष्यित क्षेत्रात थांबण्यास किंवा त्या दिशेने जाण्यास मदत करेल. या अभ्यासांमुळे आम्हाला अशा चुंबक रचना ओळखता आल्या, ज्या जमा झाल्यानंतर श्वासनलिकेत टिकून राहणाऱ्या कणांची संख्या वाढवतात. अभ्यासांच्या दुसऱ्या मालिकेत, आम्ही या इष्टतम रचनेचा वापर करून, उंदराच्या श्वासनलिकेत LV-MPs च्या शरीरांतर्गत वितरणातून निर्माण होणारा ट्रान्सडक्शन पॅटर्न दाखवण्याचा प्रयत्न केला. हे या गृहीतकावर आधारित होते की, श्वासनलिकेला लक्ष्य करण्याच्या संदर्भात LV-MPs च्या वितरणामुळे LV ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमतेत सुधारणा होईल.
सर्व प्राणी अभ्यास अॅडलेड विद्यापीठ (M-2019-060 आणि M-2020-022) आणि स्प्रिंग-8 सिंक्रोट्रॉन प्राणी नीती समितीने मंजूर केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार करण्यात आले. प्रयोग ARRIVE मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार करण्यात आले.
सर्व एक्स-रे इमेजिंग जपानमधील SPring-8 सिंक्रोट्रॉन येथील BL20XU बीमलाइनवर, पूर्वी वर्णन केलेल्या सेटअपप्रमाणेच सेटअप वापरून केले गेले²¹,²². थोडक्यात, प्रायोगिक बॉक्स सिंक्रोट्रॉन स्टोरेज रिंगपासून २४५ मीटर अंतरावर होता. फेज कॉन्ट्रास्ट इफेक्ट्स निर्माण करण्यासाठी, पार्टिकल इमेजिंग अभ्यासाकरिता सॅम्पल-टू-डिटेक्टर अंतर ०.६ मीटर आणि इन-व्हिव्हो इमेजिंग अभ्यासाकरिता ०.३ मीटर वापरले जाते. २५ keV ची मोनोक्रोमॅटिक बीम ऊर्जा वापरली गेली. sCMOS डिटेक्टरला जोडलेल्या हाय-रिझोल्यूशन एक्स-रे कन्व्हर्टर (SPring-8 BM3) चा वापर करून प्रतिमा कॅप्चर केल्या गेल्या. हा कन्व्हर्टर १० µm जाडीच्या सिंटिलेटरचा (Gd3Al2Ga3O12) वापर करून एक्स-रेचे दृश्य प्रकाशात रूपांतर करतो, जो नंतर × १० मायक्रोस्कोप ऑब्जेक्टिव्ह (NA ०.३) वापरून sCMOS सेन्सरकडे निर्देशित केला जातो. sCMOS डिटेक्टर Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, जपान) होता. २०४८ × २०४८ पिक्सेलच्या अॅरे आकारासह आणि ६.५ × ६.५ µm च्या रॉ पिक्सेल आकारासह. या सेटअपमुळे ०.५१ µm चा प्रभावी आयसोट्रॉपिक पिक्सेल आकार आणि अंदाजे १.१ मिमी × १.१ मिमीचे फील्ड ऑफ व्ह्यू मिळते. श्वासनलिकेच्या आत आणि बाहेर असलेल्या चुंबकीय कणांचे सिग्नल-टू-नॉइज गुणोत्तर वाढवण्यासाठी आणि श्वासोच्छ्वासामुळे होणारे मोशन आर्टिफॅक्ट्स कमी करण्यासाठी १०० एमएसचा एक्सपोजर कालावधी निवडण्यात आला. इन विवो अभ्यासांसाठी, एक्सपोजरच्या दरम्यान एक्स-रे बीम रोखून रेडिएशन डोस मर्यादित करण्यासाठी एक्स-रे मार्गात एक फास्ट एक्स-रे शटर ठेवण्यात आला होता.
कोणत्याही SPring-8 PB-PCXI इमेजिंग अभ्यासात LV कॅरियरचा वापर केला गेला नाही, कारण BL20XU इमेजिंग चेंबर बायोसेफ्टी लेव्हल २ प्रमाणित नाही. त्याऐवजी, आम्ही दोन व्यावसायिक पुरवठादारांकडून विविध आकार, साहित्य, लोहाची सांद्रता आणि उपयोगांचा समावेश असलेले, चांगल्या प्रकारे वैशिष्ट्यीकृत MP निवडले. हे प्रथम काचेच्या केशवाहिन्यांमध्ये आणि नंतर जिवंत श्वासनलिकेमध्ये चुंबकीय क्षेत्र MP च्या हालचालीवर कसा परिणाम करतात हे समजून घेण्यासाठी केले गेले. पृष्ठभागावर. एमपी (MPs) चा आकार ०.२५ ते १८ μm पर्यंत असतो आणि ते विविध पदार्थांपासून बनलेले असतात (तक्ता १ पहा), परंतु प्रत्येक नमुन्याची रचना, ज्यात एमपीमधील चुंबकीय कणांच्या आकाराचा समावेश आहे, अज्ञात आहे. आमच्या विस्तृत एमसीटी (MCT) अभ्यासांवर आधारित १९, २०, २१, २३, २४, आम्हाला अपेक्षा आहे की ५ μm इतके लहान एमपी श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर दिसू शकतात, उदाहरणार्थ, एमपीच्या हालचालीची वाढलेली दृश्यमानता पाहण्यासाठी सलग फ्रेम्स वजा करून. एकच ०.२५ μm आकाराचा एमपी इमेजिंग उपकरणाच्या रिझोल्यूशनपेक्षा लहान आहे, परंतु पीबी-पीसीएक्सआय (PB-PCXI) त्यांच्या व्हॉल्यूम कॉन्ट्रास्टला आणि ते जमा झाल्यानंतर ज्या पृष्ठभागावरील द्रवावर जमा होतात त्या द्रवाच्या हालचालीला ओळखेल अशी अपेक्षा आहे.
सारणी १ मधील प्रत्येक एमपीसाठीचे नमुने ०.६३ मिमी आतील व्यास असलेल्या २० μl काचेच्या केशिकांमध्ये (ड्रमंड मायक्रोकेप्स, पीए, यूएसए) तयार करण्यात आले. कॉर्पस्क्युलर कण पाण्यात उपलब्ध आहेत, तर कॉम्बीमॅग कण उत्पादकाच्या मालकीच्या द्रवात उपलब्ध आहेत. प्रत्येक नळी द्रवाने अर्धी भरली जाते (अंदाजे ११ μl) आणि नमुना धारकावर ठेवली जाते (आकृती १ पहा). काचेच्या केशिका इमेजिंग बॉक्समधील नमुना स्टेजवर अनुक्रमे आडव्या ठेवल्या गेल्या आणि द्रवाच्या कडांवर स्थित केल्या गेल्या. १.१७ टेस्लाचे अवशिष्ट चुंबकीकरण असलेला १९ मिमी व्यासाचा (२८ मिमी लांबीचा) निकेल शेल रेअर अर्थ निओडिमियम आयर्न बोरॉन (NdFeB) चुंबक (N35, कॅट. नं. LM1652, जेकार इलेक्ट्रॉनिक्स, ऑस्ट्रेलिया) इमेजिंग दरम्यान दूरस्थपणे त्याची स्थिती बदलण्यासाठी एका वेगळ्या ट्रान्सलेशन स्टेजला जोडला गेला होता. जेव्हा चुंबक नमुन्याच्या अंदाजे ३० मिमी वर स्थित असतो तेव्हा एक्स-रे प्रतिमा संपादन सुरू होते आणि प्रतिमा एका दराने मिळवल्या जातात. प्रति सेकंद ४ फ्रेम्सच्या दराने. इमेजिंग दरम्यान, चुंबकाला काचेच्या केशिका नळीच्या जवळ (सुमारे १ मिमी अंतरावर) आणले गेले आणि नंतर क्षेत्राची तीव्रता आणि स्थितीचे परिणाम तपासण्यासाठी नळीच्या बाजूने सरकवले गेले.
सॅम्पल एक्सवाय ट्रान्सलेशन स्टेजवर काचेच्या केशिकांमध्ये एमपी नमुने असलेले इन विट्रो इमेजिंग सेटअप. एक्स-रे शलाकेचा मार्ग लाल तुटक रेषेने दर्शविला आहे.
एकदा एमपींची इन विट्रो दृश्यमानता स्थापित झाल्यावर, त्यापैकी काहींची इन व्हिवो चाचणी वाइल्ड-टाइप मादी अल्बिनो विस्टार उंदरांमध्ये (~१२ आठवड्यांच्या, ~२०० ग्रॅम) करण्यात आली. उंदरांना इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शनद्वारे ०.२४ मिग्रॅ/किलो मेडेटोमिडीन (डोमिटर®, झेनोएक, जपान), ३.२ मिग्रॅ/किलो मिडाझोलम (डॉर्मिकम®, एस्टेलस फार्मा, जपान) आणि ४ मिग्रॅ/किलो ब्युटोरफॅनॉल (वेटोरफेल®, मेइजी सेका फार्मा), जपान यांच्या मिश्रणाने भूल देण्यात आली. भूल दिल्यानंतर, श्वासनलिकेभोवतीचे केस काढून, एंडोट्रॅचियल ट्यूब (ET; १६ गेज आयव्ही कॅन्युला, टेरुमो बीसीटी) घालून आणि शरीराचे तापमान राखण्यासाठी थर्मल बॅग असलेल्या कस्टम-मेड इमेजिंग प्लेटवर त्यांना पाठीवर झोपवून इमेजिंगसाठी तयार करण्यात आले. त्यानंतर इमेजिंग प्लेट इमेजिंग बॉक्समधील सॅम्पल ट्रान्सलेशन स्टेजला किंचित कोनात जोडण्यात आली, जेणेकरून श्वासनलिका एक्स-रेमध्ये क्षैतिजरित्या संरेखित होईल. आकृती 2a मध्ये दाखवल्याप्रमाणे प्रतिमा.
(अ) SPring-8 इमेजिंग बॉक्समधील इन व्हिविओ इमेजिंग सेटअप, एक्स-रे शलाकेचा मार्ग लाल तुटक रेषेने दर्शविला आहे. (ब, क) एकमेकांना काटकोनात बसवलेल्या दोन आयपी कॅमेऱ्यांचा वापर करून श्वासनलिकेवरील चुंबकाचे स्थान दूरस्थपणे निश्चित करण्यात आले. स्क्रीनवरील प्रतिमेच्या डाव्या बाजूला, डोके धरून ठेवणारा तारेचा फास आणि ईटी ट्यूबमध्ये योग्य जागी असलेली डिलिव्हरी कॅन्युला दिसतो.
१०० μl काचेची सिरिंज वापरणारी एक रिमोट-कंट्रोल्ड सिरिंज पंप प्रणाली (UMP2, वर्ल्ड प्रिसीजन इन्स्ट्रुमेंट्स, सारासोटा, FL) ३० गेज सुईद्वारे PE10 ट्यूबिंगला (बाह्य व्यास ०.६१ मिमी, अंतर्गत व्यास ०.२८ मिमी) जोडण्यात आली. ईटी ट्यूब घालताना श्वासनलिकेमध्ये टोक योग्य स्थितीत आहे याची खात्री करण्यासाठी ट्यूबवर खूण करा. मायक्रोपंप वापरून, सिरिंजचा प्लंजर मागे खेचण्यात आला, तर ट्यूबचे टोक पोहोचवायच्या असलेल्या एमपी नमुन्यामध्ये बुडवण्यात आले. त्यानंतर भरलेली डिलिव्हरी ट्यूब एंडोट्रॅचियल ट्यूबमध्ये घालण्यात आली, आणि तिचे टोक आमच्या अपेक्षित लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राच्या सर्वात मजबूत भागात ठेवण्यात आले. आमच्या अर्डुइनो-आधारित टाइमिंग बॉक्सला जोडलेल्या श्वसन डिटेक्टरचा वापर करून प्रतिमा संपादन नियंत्रित केले गेले, आणि सर्व सिग्नल (उदा. तापमान, श्वसन, शटर उघडणे/बंद करणे आणि प्रतिमा संपादन) पॉवरलॅब आणि लॅबचार्ट (AD इन्स्ट्रुमेंट्स, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) २२ वापरून रेकॉर्ड केले गेले. जेव्हा आवरण दुर्गम होते, तेव्हा दोन आयपी कॅमेरे वापरून प्रतिमा काढण्यात आल्या. (पॅनासोनिक BB-SC382) एकमेकांपासून अंदाजे 90° कोनात ठेवण्यात आले होते आणि इमेजिंग दरम्यान श्वासनलिकेच्या सापेक्ष चुंबकाच्या स्थितीचे निरीक्षण करण्यासाठी त्यांचा वापर करण्यात आला (आकृती 2b,c). हालचालीमुळे होणारे दोष कमी करण्यासाठी, एंड-टायडल फ्लो पठारादरम्यान प्रत्येक श्वासामागे एक प्रतिमा मिळवण्यात आली.
एक चुंबक दुसऱ्या स्टेजला जोडलेला असतो, जो इमेजिंग हाऊसिंगच्या बाहेरून दूरवर ठेवता येतो. चुंबकाच्या विविध स्थिती आणि रचनांची चाचणी घेण्यात आली, ज्यात खालील गोष्टींचा समावेश होता: श्वासनलिकेच्या वर अंदाजे ३०° च्या कोनात बसवलेले (आकृती २अ आणि ३अ मध्ये रचना दर्शविल्या आहेत); एक चुंबक प्राण्याच्या वर आणि दुसरा खाली, ज्यांचे ध्रुव एकमेकांना आकर्षित करतील अशा स्थितीत ठेवलेले (आकृती ३ब); एक चुंबक प्राण्याच्या वर आणि दुसरा खाली, ज्यांचे ध्रुव एकमेकांना दूर ढकलतील अशा स्थितीत ठेवलेले (आकृती ३क); आणि एक चुंबक श्वासनलिकेच्या वर आणि तिला लंबवत (आकृती ३ड). एकदा प्राणी आणि चुंबक यांची रचना निश्चित झाल्यावर आणि चाचणीसाठी असलेले एमपी (MP) सिरिंज पंपमध्ये भरल्यावर, प्रतिमा घेत असताना ४ μl/सेकंद या दराने ५० μl डोस द्या. त्यानंतर प्रतिमा घेणे सुरू ठेवत चुंबक श्वासनलिकेच्या बाजूने किंवा आडव्या दिशेने पुढे-मागे सरकवला जातो.
इन विवो इमेजिंगसाठी चुंबकाची मांडणी (अ) श्वासनलिकेच्या वर सुमारे ३०° च्या कोनात एकच चुंबक, (ब) आकर्षित करण्यासाठी ठेवलेले दोन चुंबक, (क) प्रतिकर्षण करण्यासाठी ठेवलेले दोन चुंबक, (ड) श्वासनलिकेच्या वर आणि लंबवत असलेला एकच चुंबक. निरीक्षकाने श्वासनलिकेतून तोंडापासून फुफ्फुसांपर्यंत खाली पाहिले आणि एक्स-रे किरणपुंज उंदराच्या डाव्या बाजूने जाऊन उजव्या बाजूने बाहेर पडला. चुंबक एकतर श्वासनलिकेच्या लांबीनुसार किंवा श्वासनलिकेच्या वर एक्स-रे किरणपुंजाच्या दिशेने डावी-उजवीकडे हलवला जातो.
श्वासोच्छ्वास आणि हृदयाच्या हालचालींचा अडथळा नसताना, श्वासनलिकेतील कणांची दृश्यमानता आणि वर्तन कसे असते, हे निश्चित करण्याचाही आमचा प्रयत्न होता. त्यामुळे, इमेजिंग कालावधीच्या शेवटी, पेंटोबार्बिटलच्या अतिमात्रेमुळे (सोम्नोपेंटिल, पिटमन-मूर, वॉशिंग्टन क्रॉसिंग, यूएसए; ~६५ मिग्रॅ/किलो आयपी) प्राण्यांना मानवीय पद्धतीने मारण्यात आले. काही प्राण्यांना इमेजिंग प्लॅटफॉर्मवरच ठेवण्यात आले आणि एकदा त्यांचा श्वासोच्छ्वास व हृदयाचे ठोके थांबल्यावर, इमेजिंग प्रक्रिया पुन्हा करण्यात आली; जर श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर कोणतेही मायक्रोपिगमेंट (MP) दिसले नाही, तर MP चा एक अतिरिक्त डोस देण्यात आला.
मिळवलेल्या प्रतिमांना फ्लॅट-फिल्ड आणि डार्क-फिल्ड दुरुस्त करण्यात आले आणि नंतर MATLAB (R2020a, The Mathworks) मध्ये लिहिलेल्या कस्टम स्क्रिप्टचा वापर करून एका मूव्हीमध्ये (20 फ्रेम्स प्रति सेकंद; श्वसन दरावर अवलंबून सामान्य गतीच्या 15-25 पट) एकत्र केले गेले.
एलव्ही जीन व्हेक्टर डिलिव्हरीचे सर्व अभ्यास अॅडलेड विद्यापीठातील प्रयोगशाळा प्राणी संशोधन सुविधेत आयोजित करण्यात आले होते आणि त्यांचा उद्देश SPring-8 प्रयोगाच्या निकालांचा वापर करून हे तपासणे होता की चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत एलव्ही-एमपी डिलिव्हरीमुळे इन विवो (in vivo) जीन ट्रान्सफर वाढू शकते का. एमपी आणि चुंबकीय क्षेत्राचे परिणाम तपासण्यासाठी, प्राण्यांच्या दोन गटांवर उपचार करण्यात आले: एका गटाला चुंबक ठेवून एलव्ही-एमपी देण्यात आले, आणि दुसऱ्या गटाला चुंबकाशिवाय एलव्ही-एमपी असलेला नियंत्रण गट (control group) देण्यात आला.
पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धती २५, २६ वापरून एलव्ही जीन व्हेक्टर तयार केले गेले. लॅकझेड व्हेक्टर, कॉन्स्टिट्यूटिव्ह एमपीएसव्ही प्रमोटरद्वारे (एलव्ही-लॅकझेड) चालवलेले न्यूक्लियर-लोकलाइज्ड बीटा-गॅलॅक्टोसिडेस जीन व्यक्त करतो, जे ट्रान्सड्यूस्ड पेशींमध्ये एक निळे प्रतिक्रिया उत्पादन तयार करते, जे फुफ्फुसाच्या ऊतींच्या फ्रंट्स आणि ऊतींच्या सेक्शनमध्ये दृश्यमान असते. पेशी संवर्धनामध्ये, टीयू/एमएल मध्ये टायटरची गणना करण्यासाठी हेमोसायटोमीटरने लॅकझेड पॉझिटिव्ह पेशींची संख्या हाताने मोजून टायट्रेशन केले गेले. वाहक -८०°C वर क्रायोप्रिझर्व्ह केले जातात, वापरण्यापूर्वी वितळवले जातात आणि १:१ प्रमाणात मिसळून कॉम्बीमॅगला बांधले जातात व वितरणापूर्वी किमान ३० मिनिटे बर्फावर ठेवले जातात.
सामान्य स्प्रॅग डॉली उंदरांना (n = ३/गट, ~२-३, महिन्यांचे) ०.४ मिग्रॅ/किलो मेडेटोमिडीन (डोमिटर, इलियम, ऑस्ट्रेलिया) आणि ६० मिग्रॅ/किलो केटामाइन (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) यांच्या मिश्रणाचे इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन देऊन भूल देण्यात आली आणि १६ गेज आयव्ही कॅन्युला वापरून शस्त्रक्रियेविना तोंडावाटे कॅन्युलेशन करण्यात आले. श्वासनलिकेच्या ऊतींना एलव्ही ट्रान्सडक्शन मिळावे याची खात्री करण्यासाठी, आमच्या पूर्वी वर्णन केलेल्या यांत्रिक व्यत्यय प्रोटोकॉलचा वापर करून त्याला अनुकूलित करण्यात आले, ज्यामध्ये श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागाला वायर बास्केटने (एन-सर्कल, नायटिनॉल टिपलेस स्टोन एक्सट्रॅक्टर NTSE-022115 -UDH, कुक मेडिकल, यूएसए) ३० सेकंदांसाठी अक्षीयपणे घासण्यात आले. त्यानंतर, व्यत्ययानंतर सुमारे १० मिनिटांनी जैविक सुरक्षा कॅबिनेटमध्ये श्वासनलिकेद्वारे एलव्ही-एमपी देण्यात आले.
या प्रयोगात वापरलेले चुंबकीय क्षेत्र इन विवो एक्स-रे इमेजिंग अभ्यासाप्रमाणेच तयार केले होते, ज्यामध्ये डिस्टिलेशन स्टेंट क्लिप्स वापरून तेच चुंबक श्वासनलिकेवर धरले होते (आकृती ४). पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, जेल टीप असलेल्या पिपेटचा वापर करून श्वासनलिकेत ५० μl (२ × २५ μl चे भाग) LV-MP दिले गेले (n = ३ प्राणी). नियंत्रण गटाला (n = ३ प्राणी) चुंबकाचा वापर न करता तेच LV-MPs दिले गेले. औषध देण्याची प्रक्रिया पूर्ण झाल्यावर, कॅन्युला ET ट्यूबमधून काढला जातो आणि प्राण्याची ट्यूब काढली जाते. चुंबक १० मिनिटे जागेवर ठेवला जातो, त्यानंतर तो काढला जातो. उंदरांना मेलॉक्सिकॅमचा (१ मिली/किलो) त्वचेखालील डोस (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) देण्यात आला, त्यानंतर १ मिलीग्राम/किलो एटिपामाझोल हायड्रोक्लोराइडचे (अँटिसेडान, झोएटिस, ऑस्ट्रेलिया) आयपी इंजेक्शन देऊन भूल उतरवण्यात आली. उंदीर पूर्णपणे बरे होईपर्यंत त्यांना उबदार ठेवले गेले आणि त्यांच्यावर लक्ष ठेवले गेले. भूल दिल्यानंतर शुद्धीवर येणे.
जैविक सुरक्षा कॅबिनेटमधील एलव्ही-एमपी वितरण उपकरण. ईटी ट्यूबचा फिकट राखाडी ल्युअर हब तोंडामधून बाहेर डोकावताना दिसतो आणि चित्रात दाखवलेल्या पिपेटचे जेल टोक ईटी ट्यूबमधून श्वासनलिकेमध्ये इच्छित खोलीपर्यंत घातले जाते.
एलव्ही-एमपी डोसिंग प्रक्रियेनंतर एका आठवड्याने, प्राण्यांना १००% CO2 श्वासावाटे देऊन मानवी पद्धतीने मारण्यात आले आणि आमच्या मानक एक्स-गॅल उपचारांचा वापर करून लॅकझेड (LacZ) अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन करण्यात आले. एंडोट्रॅचियल ट्यूब बसवल्यामुळे होणारे कोणतेही यांत्रिक नुकसान किंवा द्रव साठणे विश्लेषणात समाविष्ट होणार नाही याची खात्री करण्यासाठी, सर्वात मागच्या तीन उपास्थीच्या कड्या काढून टाकण्यात आल्या. विश्लेषणासाठी प्रत्येक श्वासनलिका लांबीच्या दिशेने कापून तिचे दोन अर्धे भाग करण्यात आले, आणि आतील पृष्ठभाग पाहण्यासाठी ते मिनुटियन सुई (फाइन सायन्स टूल्स) वापरून सिलिकॉन रबर (सिल्गार्ड, डाऊ इंक) असलेल्या डिशमध्ये बसवण्यात आले. रूपांतरित पेशींचे वितरण आणि नमुना, डिजीलाइट कॅमेरा आणि टीकॅप्चर सॉफ्टवेअर (टक्सन फोटोनिक्स, चीन) असलेल्या निकॉन मायक्रोस्कोप (SMZ1500) चा वापर करून समोरून केलेल्या छायाचित्रणाद्वारे निश्चित करण्यात आले. प्रतिमा २०x आवर्धनावर (श्वासनलिकेच्या संपूर्ण रुंदीसाठी सर्वोच्च सेटिंगसह) मिळवण्यात आल्या, ज्यात श्वासनलिकेची संपूर्ण लांबी टप्प्याटप्प्याने चित्रित केली गेली, आणि प्रत्येक प्रतिमेमध्ये पुरेसा ओव्हरलॅप सुनिश्चित करण्यात आला जेणेकरून प्रतिमा स्पष्ट दिसेल. "स्टिचिंग". त्यानंतर प्रत्येक श्वासनलिकेतील प्रतिमांना, प्लेनर मोशन अल्गोरिदमचा वापर करून इमेज कंपोझिट एडिटर v2.0.3 (मायक्रोसॉफ्ट रिसर्च) द्वारे एकाच संमिश्र प्रतिमेमध्ये एकत्र जोडण्यात आले. प्रत्येक प्राण्याच्या श्वासनलिकेच्या संमिश्र प्रतिमांमधील LacZ अभिव्यक्ती क्षेत्रांचे परिमाणीकरण, पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, 0.35 < ह्यू < 0.58, सॅचुरेशन > 0.15, आणि व्हॅल्यू < 0.7 या सेटिंग्जचा वापर करून एका स्वयंचलित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, मॅथवर्क्स) द्वारे करण्यात आले. ऊतींच्या बाह्यरेषांचा मागोवा घेऊन, ऊतींचे क्षेत्र ओळखण्यासाठी आणि श्वासनलिकेच्या ऊतींच्या बाहेरील कोणत्याही चुकीच्या शोधांना टाळण्यासाठी, प्रत्येक संमिश्र प्रतिमेकरिता GIMP v2.10.24 मध्ये एक मास्क हाताने तयार करण्यात आला. प्रत्येक प्राण्याच्या सर्व संमिश्र प्रतिमांमधील डाग पडलेल्या क्षेत्रांची बेरीज करून त्या प्राण्याचे एकूण डाग पडलेले क्षेत्र तयार करण्यात आले. त्यानंतर डाग पडलेल्या क्षेत्राला एकूण मास्क क्षेत्राने भागून सामान्यीकृत क्षेत्र तयार करण्यात आले.
प्रत्येक श्वासनलिका पॅराफिनमध्ये एम्बेड केली गेली आणि 5 μm चे सेक्शन कापले गेले. सेक्शनना 5 मिनिटांसाठी न्यूट्रल फास्ट रेडने काउंटरस्टेन केले गेले आणि निकॉन एक्लिप्स E400 मायक्रोस्कोप, DS-Fi3 कॅमेरा आणि NIS एलिमेंट कॅप्चर सॉफ्टवेअर (आवृत्ती 5.20.00) वापरून प्रतिमा मिळवल्या गेल्या.
सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे ग्राफपॅड प्रिझम v9 (ग्राफपॅड सॉफ्टवेअर, इंक.) मध्ये करण्यात आली. सांख्यिकीय सार्थकता p ≤ 0.05 वर निश्चित करण्यात आली. शॅपिरो-विल्क चाचणीचा वापर करून सामान्यतेची पडताळणी करण्यात आली आणि अनपेअर्ड टी-टेस्टचा वापर करून लॅकझेड स्टेनिंगमधील फरकांचे मूल्यांकन करण्यात आले.
सारणी १ मध्ये वर्णन केलेल्या सहा एमपींची पीसीएक्सआय (PCXI) वापरून तपासणी करण्यात आली आणि त्यांची दृश्यमानता सारणी २ मध्ये वर्णन केली आहे. दोन पॉलिस्टीरिन एमपी (एमपी१ आणि एमपी२; अनुक्रमे १८ μm आणि ०.२५ μm) पीसीएक्सआय (PCXI) खाली दिसले नाहीत, परंतु बाकीचे नमुने ओळखता आले (उदाहरणे आकृती ५ मध्ये दर्शविली आहेत). एमपी३ आणि एमपी४ (१०-१५% Fe3O4; अनुक्रमे ०.२५ μm आणि ०.९ μm) अस्पष्टपणे दिसतात. तपासलेल्या सर्वात लहान कणांपैकी काही कण असूनही, एमपी५ (९८% Fe3O4; ०.२५ μm) सर्वात जास्त ठळक होता. कॉम्बीमॅग उत्पादन एमपी६ शोधणे कठीण आहे. सर्व प्रकरणांमध्ये, केशिकेला समांतर चुंबक पुढे-मागे सरकवल्याने एमपी शोधण्याची आमची क्षमता लक्षणीयरीत्या वाढली. जेव्हा चुंबक केशिकेपासून दूर गेले, तेव्हा कण लांब धाग्यांच्या रूपात पसरले, परंतु जसे चुंबक जवळ आले आणि चुंबकीय क्षेत्राची तीव्रता वाढली, तसे कणांचे धागे... कण केशिकेच्या वरच्या पृष्ठभागाकडे सरकल्यामुळे ते लहान झाले (पूरक व्हिडिओ S1: MP4 पहा), ज्यामुळे पृष्ठभागावरील कणांची घनता वाढली. याउलट, जेव्हा चुंबक केशिकेमधून काढला जातो, तेव्हा क्षेत्राची तीव्रता कमी होते आणि एमपी (MPs) केशिकेच्या वरच्या पृष्ठभागापासून लांब धाग्यांमध्ये पुन्हा व्यवस्थित होतात (पूरक व्हिडिओ S2: MP4 पहा). चुंबकाची हालचाल थांबल्यानंतर, कण समतोल स्थितीला पोहोचल्यानंतर थोड्या काळासाठी पुढे सरकत राहतात. जेव्हा एमपी (MP) केशिकेच्या वरच्या पृष्ठभागाकडे आणि त्यापासून दूर सरकतो, तेव्हा चुंबकीय कण सामान्यतः कचरा द्रवामधून ओढतात.
PCXI अंतर्गत MP ची दृश्यमानता नमुन्यांनुसार लक्षणीयरीत्या बदलते. (अ) MP3, (ब) MP4, (क) MP5 आणि (ड) MP6. येथे दाखवलेल्या सर्व प्रतिमा केशिकेच्या थेट वर अंदाजे १० मिमी अंतरावर चुंबक ठेवून घेतल्या आहेत. दिसणारी मोठी वर्तुळे ही केशिकांमध्ये अडकलेले हवेचे बुडबुडे आहेत, जे फेज कॉन्ट्रास्ट इमेजिंगची काळ्या आणि पांढऱ्या कडांची वैशिष्ट्ये स्पष्टपणे दाखवतात. लाल चौकटीत कॉन्ट्रास्ट वाढवणारे आवर्धन आहे. लक्षात घ्या की सर्व आकृत्यांमधील चुंबकाच्या योजनाचित्रांचे व्यास प्रमाणबद्ध नाहीत आणि ते दर्शविलेल्या व्यासापेक्षा अंदाजे १०० पट मोठे आहेत.
जेव्हा चुंबक केशिकेच्या वरच्या बाजूने डावीकडे आणि उजवीकडे सरकवला जातो, तेव्हा MP स्ट्रिंगचा कोन चुंबकाशी संरेखित होण्यासाठी बदलतो (आकृती 6 पहा), ज्यामुळे चुंबकीय क्षेत्र रेषा स्पष्ट दिसतात. MP3-5 साठी, कॉर्ड एका विशिष्ट कोनापर्यंत पोहोचल्यानंतर, कण केशिकेच्या वरच्या पृष्ठभागावरून ओढले जातात. यामुळे अनेकदा, जिथे चुंबकीय क्षेत्र सर्वात मजबूत असते, त्याजवळ MPs मोठ्या गटांमध्ये एकत्र येतात (पूरक व्हिडिओ S3:MP5 पहा). केशिकेच्या टोकाजवळ इमेजिंग करताना हे विशेषतः स्पष्ट दिसते, ज्यामुळे द्रव-हवा इंटरफेसवर MPs एकत्र येतात आणि केंद्रित होतात. MP6 मधील कण, जे MP3-5 पेक्षा ओळखण्यास अधिक कठीण होते, ते चुंबक केशिकेवरून सरकताना ओढले गेले नाहीत, परंतु MP स्ट्रिंग्ज विलग झाल्या, ज्यामुळे कण दृष्टिक्षेत्रात राहिले (पूरक व्हिडिओ S4:MP6 पहा). काही प्रकरणांमध्ये, जेव्हा चुंबकाला इमेजिंग स्थानापासून मोठ्या अंतरावर हलवून लागू केलेले चुंबकीय क्षेत्र कमी केले गेले, तेव्हा कोणतेही उर्वरित MPs स्ट्रिंगमध्ये राहून गुरुत्वाकर्षणामुळे हळूहळू ट्यूबच्या खालच्या पृष्ठभागावर उतरले (पूरक व्हिडिओ पहा). S5: MP3).
केशिकेच्या वर चुंबक उजवीकडे सरकवल्यावर MP स्ट्रिंगचा कोन बदलतो. (अ) MP3, (ब) MP4, (क) MP5 आणि (ड) MP6. लाल चौकटीत कॉन्ट्रास्ट वाढवणारे विवर्धन आहे. लक्षात घ्या की पूरक व्हिडिओ माहितीपूर्ण आहेत कारण ते कणांची महत्त्वाची रचना आणि गतिशील माहिती प्रकट करतात, जी या स्थिर प्रतिमांमध्ये पाहता येत नाही.
आमच्या चाचण्यांमधून असे दिसून आले की, श्वासनलिकेमध्ये चुंबक हळू हळू पुढे-मागे हलवल्याने शरीरातील गुंतागुंतीच्या हालचालींच्या संदर्भात MP चे दृश्यीकरण सुलभ होते. पॉलीस्टायरीन मणी (MP1 आणि MP2) केशिकेमध्ये दिसत नसल्यामुळे शरीरातील चाचणी केली गेली नाही. उर्वरित चार MP पैकी प्रत्येकाची शरीरातील चाचणी, चुंबकाचा लांब अक्ष श्वासनलिकेच्या वर उभ्या रेषेशी सुमारे 30° च्या कोनात ठेवून केली गेली (आकृती 2b आणि 3a पहा), कारण यामुळे MP च्या लांब साखळ्या तयार झाल्या आणि चुंबकाच्या टोकाकडील रचनेपेक्षा ही पद्धत अधिक प्रभावी ठरली. MP3, MP4 आणि MP6 कोणत्याही जिवंत प्राण्यांच्या श्वासनलिकेमध्ये आढळले नाहीत. प्राण्यांना मानवी पद्धतीने मारल्यानंतर जेव्हा उंदरांच्या श्वासनलिकेचे चित्रण केले गेले, तेव्हा सिरिंज पंपाने अतिरिक्त द्रव टाकूनही कण अदृश्य राहिले. MP5 मध्ये आयर्न ऑक्साईडचे प्रमाण सर्वाधिक होते आणि तो एकमेव दृश्यमान कण होता, आणि म्हणूनच MP च्या शरीरातील वर्तनाचे मूल्यांकन आणि वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी त्याचा वापर केला गेला.
एमपी वितरणादरम्यान श्वासनलिकेवर चुंबक ठेवल्यामुळे, सर्वच नव्हे, तर बरेच एमपी दृष्टिपथात केंद्रित झाले. श्वासनलिकेत प्रवेश करणारे कण मानवीय पद्धतीने बळी दिलेल्या प्राण्यांमध्ये उत्तम प्रकारे पाहिले जातात. आकृती ७ आणि पूरक व्हिडिओ S6: एमपी५ श्वासनलिकेच्या अधर पृष्ठभागावर कणांचे जलद चुंबकीय ग्रहण आणि संरेखन दर्शवते, जे सूचित करते की एमपींना श्वासनलिकेच्या इच्छित भागांकडे निर्देशित केले जाऊ शकते. एमपी वितरणानंतर श्वासनलिकेच्या अधिक दूरच्या भागाकडे शोध घेतला असता, काही एमपी कॅरिनाच्या जवळ आढळले, जे सूचित करते की सर्व एमपी गोळा करण्यासाठी आणि टिकवून ठेवण्यासाठी चुंबकीय क्षेत्राची शक्ती अपुरी होती, कारण द्रव प्रक्रियेदरम्यान ते सर्वाधिक चुंबकीय क्षेत्राच्या तीव्रतेच्या प्रदेशातून वितरित केले गेले होते. तरीही, प्रतिमांकित क्षेत्राभोवती प्रसूतीनंतरची एमपी सांद्रता जास्त होती, जे सूचित करते की बरेच एमपी वायुमार्गाच्या त्या प्रदेशात राहिले जिथे लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राची तीव्रता सर्वाधिक होती.
नुकत्याच इच्छामरण दिलेल्या उंदराच्या श्वासनलिकेत MP5 पोहोचवण्यापूर्वीची (a) आणि पोहोचवल्यानंतरची (b) छायाचित्रे, ज्यात चुंबक थेट इमेजिंग क्षेत्राच्या वर ठेवलेला आहे. इमेज केलेले क्षेत्र दोन उपास्थींच्या (कार्टिलेज) कड्यांच्या मध्ये स्थित आहे. MP पोहोचवण्यापूर्वी, श्वासनलिकेत थोडे द्रव आहे. लाल चौकटीत कॉन्ट्रास्ट वाढवणारे विवर्धन (मॅग्निफिकेशन) आहे. ही छायाचित्रे पूरक व्हिडिओ S6:MP5 मध्ये दाखवलेल्या व्हिडिओमधून घेतली आहेत.
जिवंत श्वासनलिकेवर चुंबक फिरवल्यामुळे, केशवाहिन्यांमध्ये दिसणाऱ्या पद्धतीप्रमाणेच, श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर MP साखळीचा कोन बदलला (आकृती ८ आणि पूरक व्हिडिओ S7:MP5 पहा). तथापि, आमच्या अभ्यासात, केशवाहिन्यांप्रमाणे MPs जिवंत श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावरून ओढले जाऊ शकले नाहीत. काही प्रकरणांमध्ये, चुंबक डावीकडे आणि उजवीकडे सरकल्यावर MP साखळी अधिक लांब होते. विशेष म्हणजे, आम्हाला असेही आढळले की जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेवर रेखांशाच्या दिशेने फिरवला जातो, तेव्हा कणांच्या माळेची पृष्ठभागावरील द्रव थराची खोली बदलते आणि जेव्हा चुंबक थेट डोक्यावर नेला जातो व कणांच्या माळेला उभ्या स्थितीत फिरवले जाते, तेव्हा ती विस्तारते (पूरक व्हिडिओ S7 पहा). : MP5 मध्ये ०:०९ वाजता, खाली उजवीकडे). जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेच्या लांबीच्या दिशेने न सरकवता, श्वासनलिकेच्या वरच्या भागावरून बाजूने (म्हणजे प्राण्याच्या डावीकडे किंवा उजवीकडे) सरकवला गेला, तेव्हा गतीचा वैशिष्ट्यपूर्ण नमुना बदलला. कण हलत असतानाही ते स्पष्टपणे दिसत होते, परंतु जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेवरून काढण्यात आला, तेव्हा कणांच्या माळांची टोके दिसू लागली (पूरक व्हिडिओ S8:MP5, ०:०८ पासून पहा). काचेच्या केशिकेमध्ये लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राखाली आम्ही निरीक्षण केलेल्या MP च्या वर्तनाशी हे सुसंगत आहे.
जिवंत, भूल दिलेल्या उंदराच्या श्वासनलिकेतील MP5 दर्शवणारी उदाहरणादाखल चित्रे. (a) श्वासनलिकेच्या वर आणि डावीकडील प्रतिमा घेण्यासाठी चुंबकाचा वापर केला जातो, त्यानंतर (b) चुंबक उजवीकडे हलवल्यानंतर. लाल चौकटीत कॉन्ट्रास्ट वाढवणारे विवर्धन आहे. ही चित्रे पूरक व्हिडिओ S7:MP5 मध्ये दाखवलेल्या व्हिडिओमधून घेतली आहेत.
जेव्हा दोन ध्रुव श्वासनलिकेच्या वर आणि खाली उत्तर-दक्षिण दिशेत मांडले होते (म्हणजे एकमेकांना आकर्षित करणारे; आकृती ३ब), तेव्हा एमपी कॉर्ड्स अधिक लांब दिसले आणि ते श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर असण्याऐवजी श्वासनलिकेच्या बाजूच्या भिंतीवर स्थित होते (पूरक व्हिडिओ एस९: एमपी५ पहा). तथापि, जेव्हा दुहेरी-चुंबक उपकरण वापरले गेले, तेव्हा द्रव दिल्यानंतर एकाच ठिकाणी (म्हणजे श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर) कणांचे उच्च प्रमाण आढळले नाही, जे सामान्यतः एकल-चुंबक उपकरण वापरल्यास घडते. त्यानंतर जेव्हा एक चुंबक उलट्या ध्रुवांसह एकमेकांना दूर ढकलण्यासाठी मांडला गेला (आकृती ३क), तेव्हा द्रव दिल्यानंतर दृष्टिक्षेत्रात दिसणाऱ्या कणांची संख्या वाढलेली दिसली नाही. दोन्ही दुहेरी-चुंबक रचनांची मांडणी आव्हानात्मक आहे, कारण चुंबकांना अनुक्रमे खेचणाऱ्या किंवा ढकलणाऱ्या चुंबकीय क्षेत्राची तीव्रता जास्त असते. त्यानंतर मांडणी बदलून एकच चुंबक श्वासनलिकेला समांतर पण ९० अंशातून जाईल असा ठेवण्यात आला, जेणेकरून क्षेत्र रेषा श्वासनलिकेच्या भिंतीला काटकोनात छेदतील (आकृती ३ड), ही एक अशी मांडणी आहे. बाजूच्या भिंतीवर कणांचे एकत्रीकरण पाहता येते का हे ठरवण्यासाठी रचना केली होती. तथापि, या संरचनेत, एमपी संचयनाची किंवा चुंबकाच्या हालचालीची कोणतीही ओळखण्यायोग्य हालचाल दिसून आली नाही. या सर्व परिणामांच्या आधारावर, इन व्हिवो जीन वाहक अभ्यासासाठी एकल-चुंबक, ३०-अंश अभिमुखता संरचना (आकृती ३अ) निवडण्यात आली.
प्राण्याला मानवीय पद्धतीने मारल्यानंतर लगेचच जेव्हा त्याचे वारंवार इमेजिंग केले गेले, तेव्हा ऊतींच्या गोंधळात टाकणाऱ्या हालचालींच्या अभावामुळे, स्पष्ट इंटरकॉन्ड्रल क्षेत्रात अधिक बारीक आणि लहान कणांच्या रेषा ओळखता आल्या, ज्या चुंबकाच्या स्थानांतरण गतीच्या रेषेत "डगमगत" होत्या. तरीही, MP6 कणांची उपस्थिती आणि त्यांची हालचाल अजूनही स्पष्टपणे दिसू शकत नाही.
एलव्ही-लॅकझेड (LV-LacZ) टायटर 1.8 × 108 TU/ml होता, आणि कॉम्बीमॅग एमपी (MP6) सोबत 1:1 प्रमाणात मिसळल्यानंतर, प्राण्यांना 9 × 107 TU/ml एलव्ही व्हेइकलचा (LV vehicle) 50 μl श्वासनलिकेतील डोस देण्यात आला (म्हणजे 4.5 × 106 TU/उंदीर). या अभ्यासांमध्ये, प्रसूतीदरम्यान चुंबक हलवण्याऐवजी, आम्ही चुंबक एकाच स्थितीत स्थिर ठेवला, हे ठरवण्यासाठी की एलव्ही ट्रान्सडक्शन (अ) चुंबकीय क्षेत्राच्या अनुपस्थितीत वेक्टर डिलिव्हरीच्या तुलनेत सुधारले जाऊ शकते का, आणि (ब) ते केंद्रित केले जाऊ शकते का. श्वासनलिकेतील पेशी वरच्या श्वासनलिकेच्या चुंबकीय लक्ष्य क्षेत्रांमध्ये ट्रान्सड्यूस केल्या जातात.
आमच्या मानक एलव्ही व्हेक्टर वितरण प्रोटोकॉलप्रमाणेच, चुंबकांची उपस्थिती आणि एलव्ही व्हेक्टर्ससह कॉम्बीमॅगचा वापर यांचा प्राण्यांच्या आरोग्यावर कोणताही प्रतिकूल परिणाम झालेला दिसला नाही. यांत्रिक व्यत्यय आलेल्या श्वासनलिका प्रदेशाच्या समोरील प्रतिमांवरून (पूरक आकृती १) असे दिसून आले की, जेव्हा चुंबक उपस्थित होता, तेव्हा एलव्ही-एमपीने उपचार केलेल्या प्राण्यांच्या गटामध्ये ट्रान्सडक्शनची पातळी लक्षणीयरीत्या जास्त होती (आकृती ९अ). नियंत्रण गटामध्ये निळ्या लॅकझेड (LacZ) रंगाचे डाग फक्त अल्प प्रमाणात होते (आकृती ९ब). सामान्यीकृत एक्स-गॅल (X-Gal) डाग असलेल्या क्षेत्रांच्या प्रमाणीकरणावरून असे दिसून आले की, चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत एलव्ही-एमपी दिल्याने अंदाजे ६-पट सुधारणा झाली (आकृती ९क).
LV-MP द्वारे श्वासनलिकेचे ट्रान्सडक्शन दर्शविणाऱ्या संयुक्त प्रतिमांचे उदाहरण (a) चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत आणि (b) चुंबकाच्या अनुपस्थितीत. (c) चुंबक वापरताना श्वासनलिकेतील सामान्यीकृत LacZ ट्रान्सडक्शन क्षेत्रात सांख्यिकीयदृष्ट्या लक्षणीय सुधारणा (*p = 0.029, टी-टेस्ट, प्रत्येक गटात n = 3, सरासरी ± SEM).
न्यूट्रल फास्ट रेड-स्टेन्ड सेक्शनमध्ये (उदाहरण परिशिष्ट आकृती २ मध्ये दाखवले आहे) पूर्वी नोंदवल्याप्रमाणेच समान नमुन्यात आणि ठिकाणी LacZ-स्टेन्ड पेशी आढळून आल्या.
वायुमार्ग जनुकीय उपचारापुढील एक प्रमुख आव्हान म्हणजे वाहक कणांना इच्छित भागांमध्ये अचूकपणे स्थानबद्ध करणे आणि हवेचा प्रवाह व सक्रिय श्लेष्म निर्मूलनाच्या उपस्थितीत, गतिमान फुफ्फुसामध्ये उच्च पातळीची पारगमन कार्यक्षमता प्राप्त करणे. सिस्टिक फायब्रोसिस (CF) वायुमार्ग रोगावर उपचार करण्यासाठी तयार केलेल्या LV वाहकांसाठी, वाहक वायुमार्गांमध्ये वाहक कणांचा निवासकाळ वाढवणे हे आतापर्यंत एक अवघड ध्येय राहिले आहे. कॅस्टेलानी आणि त्यांच्या सहकाऱ्यांनी निदर्शनास आणल्याप्रमाणे, इलेक्ट्रोपोरेशनसारख्या इतर जनुकीय वितरण पद्धतींच्या तुलनेत पारगमन सुधारण्यासाठी चुंबकीय क्षेत्रांचा वापर करण्याचे फायदे आहेत, कारण यामुळे साधेपणा, किफायतशीरपणा, वितरणाचे स्थानबद्धीकरण, वाढलेली कार्यक्षमता, कमी ऊष्मायन कालावधी आणि शक्यतो कमी वाहक मात्रा¹⁰ या गोष्टी एकत्र साधता येतात. तथापि, बाह्य चुंबकीय शक्तींच्या प्रभावाखाली वायुमार्गांमध्ये चुंबकीय कणांचे शरीरांतर्गत संचयन आणि वर्तन यांचे वर्णन कधीही केले गेले नाही, तसेच अखंड जिवंत वायुमार्गांमध्ये जनुकीय अभिव्यक्तीची पातळी वाढवण्यासाठी या पद्धतीची व्यवहार्यता शरीरांतर्गत प्रत्यक्षात सिद्ध केली गेली नाही.
आमच्या इन विट्रो सिंक्रोट्रॉन PCXI प्रयोगांनी दाखवून दिले की, पॉलिस्टीरिन MP वगळता, आम्ही तपासलेले सर्व कण आम्ही वापरलेल्या इमेजिंग सेटअपमध्ये दृश्यमान होते. चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत, MPs अशा माळा तयार करतात ज्यांची लांबी कणाचा प्रकार आणि चुंबकीय क्षेत्राची तीव्रता (म्हणजेच चुंबकाची जवळीक आणि गती) यांच्याशी संबंधित असते. आकृती १० मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, आपण पाहतो त्या माळा प्रत्येक वैयक्तिक कण चुंबकीकृत झाल्यामुळे आणि स्वतःचे स्थानिक चुंबकीय क्षेत्र प्रेरित केल्यामुळे तयार होतात. ही वेगवेगळी क्षेत्रे इतर समान कणांना एकत्र येण्यास आणि जोडण्यास कारणीभूत ठरतात, ज्यामुळे इतर कणांच्या स्थानिक आकर्षण आणि प्रतिकारक शक्तींमुळे स्थानिक बलांद्वारे समूहाच्या माळेसारखी हालचाल होते.
(अ, ब) द्रवाने भरलेल्या केशवाहिन्यांमध्ये आणि (क, ड) हवेने भरलेल्या श्वासनलिकेमध्ये निर्माण झालेल्या कणांच्या मालिका दर्शवणारी योजनाबद्ध आकृती. लक्षात घ्या की केशवाहिन्या आणि श्वासनलिका प्रमाणबद्ध काढलेल्या नाहीत. पॅनेल (अ) मध्ये एमपीचे (MP) वर्णन देखील आहे, ज्यामध्ये Fe3O4 चे कण माळेच्या स्वरूपात रचलेले असतात.
जेव्हा चुंबक केशिकेच्या वर हलवला गेला, तेव्हा Fe3O4 असलेल्या MP3-5 साठी कणांच्या माळेचा कोन एका क्रांतिक मर्यादेपर्यंत पोहोचला, ज्यानंतर कणांची माळ मूळ स्थितीत न राहता, पृष्ठभागावरून एका नवीन स्थानाकडे सरकली. हा परिणाम बहुधा घडतो कारण काचेच्या केशिकेचा पृष्ठभाग ही हालचाल होऊ देण्याइतका गुळगुळीत असतो. विशेष म्हणजे, MP6 (कॉम्बीमॅग) ने असे वर्तन केले नाही, कदाचित कारण कण लहान होते, त्यांच्यावर वेगवेगळे आवरण किंवा पृष्ठभागावरील विद्युत प्रभार होते, किंवा एका विशिष्ट वाहक द्रवाने त्यांच्या हालचाल करण्याच्या क्षमतेवर परिणाम केला होता. कॉम्बीमॅग कणांचा प्रतिमा कॉन्ट्रास्ट देखील कमकुवत आहे, यावरून असे सूचित होते की द्रव आणि कणांची घनता समान असू शकते आणि त्यामुळे ते एकमेकांकडे सहजपणे सरकत नाहीत. चुंबक खूप वेगाने हलल्यास कण अडकू शकतात, हे दर्शवते की चुंबकीय क्षेत्राची शक्ती द्रवातील कणांमधील घर्षणावर नेहमीच मात करू शकत नाही, ज्यामुळे कदाचित चुंबकीय क्षेत्राची शक्ती आणि चुंबक व लक्ष्य क्षेत्रामधील अंतर खूप महत्त्वाचे आहे यात आश्चर्य नाही. एकत्रितपणे, हे परिणाम असेही सूचित करतात की, जरी चुंबक लक्ष्य क्षेत्रातून वाहणारे अनेक सूक्ष्म कण पकडू शकत असले तरी, ते एकाच ठिकाणी जमा होण्याची शक्यता कमी आहे. श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावरून कॉम्बीमॅग कणांना पुढे सरकवण्यासाठी चुंबकांवर अवलंबून राहता येते. म्हणून, आम्ही असा निष्कर्ष काढतो की इन व्हिवो एलव्ही-एमपी अभ्यासांमध्ये वायुमार्गाच्या विशिष्ट भागांना प्रत्यक्ष लक्ष्य करण्यासाठी स्थिर चुंबकीय क्षेत्रांचा वापर केला पाहिजे.
जेव्हा कण शरीरात पोहोचवले जातात, तेव्हा शरीरातील गुंतागुंतीच्या आणि सतत हलणाऱ्या ऊतींच्या संदर्भात त्यांना ओळखणे कठीण असते, परंतु श्वासनलिकेच्या वर चुंबक आडवा सरकवून MP स्ट्रिंग्ज 'हलवल्याने' त्यांना शोधण्याची क्षमता वाढली. जरी थेट इमेजिंग शक्य असले तरी, प्राण्याला मानवी पद्धतीने मारल्यानंतर कणांची हालचाल ओळखणे सोपे जाते. जेव्हा चुंबक इमेजिंग क्षेत्राच्या वर ठेवला होता, तेव्हा या ठिकाणी MP चे प्रमाण साधारणपणे सर्वाधिक होते, जरी काही कण सहसा श्वासनलिकेमध्ये पुढेही आढळले. इन विट्रो अभ्यासांच्या विपरीत, चुंबक सरकवून कणांना श्वासनलिकेतून ओढता येत नाही. हा निष्कर्ष श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर आवरण घालणारा श्लेष्मा सामान्यतः श्वासावाटे आत घेतलेल्या कणांवर कशी प्रक्रिया करतो, त्यांना श्लेष्मामध्ये अडकवतो आणि नंतर श्लेष्म-पक्ष्माभिकीय निर्मूलन यंत्रणेद्वारे बाहेर टाकतो, याच्याशी सुसंगत आहे.
आम्ही असा अंदाज लावला होता की श्वासनलिकेच्या वर आणि खाली आकर्षणासाठी चुंबकांचा वापर केल्यास (आकृती ३ब), एकाच बिंदूवर अत्यंत केंद्रित चुंबकीय क्षेत्राऐवजी, अधिक एकसमान चुंबकीय क्षेत्र निर्माण होऊ शकते, ज्यामुळे कणांचे अधिक एकसमान वितरण होण्याची शक्यता आहे. तथापि, आमच्या प्राथमिक अभ्यासात या अंदाजाला पाठिंबा देणारा कोणताही स्पष्ट पुरावा आढळला नाही. त्याचप्रमाणे, एकमेकांना दूर ढकलणाऱ्या चुंबकांची जोडी लावल्याने (आकृती ३क) प्रतिमांकित क्षेत्रात अधिक कण जमा झाले नाहीत. या दोन निष्कर्षांवरून असे दिसून येते की दुहेरी-चुंबकीय रचनेमुळे एमपी लक्ष्यीकरणावरील स्थानिक नियंत्रणात लक्षणीय सुधारणा होत नाही, आणि परिणामी निर्माण होणारी तीव्र चुंबकीय बले तयार करणे कठीण असते, ज्यामुळे ही पद्धत कमी व्यावहारिक ठरते. त्याचप्रमाणे, चुंबक श्वासनलिकेच्या वर आणि मधून लावल्याने (आकृती ३ड) देखील प्रतिमांकित क्षेत्रात टिकून राहिलेल्या कणांच्या संख्येत वाढ झाली नाही. यापैकी काही पर्यायी रचना यशस्वी होऊ शकत नाहीत कारण त्यामुळे कण जमा होण्याच्या क्षेत्रात चुंबकीय क्षेत्राची तीव्रता कमी होते. म्हणून, ३०-अंश कोनातील एकल चुंबकाची रचना (आकृती ३अ) ही शरीरांतर्गत चाचणीसाठी सर्वात सोपी आणि सर्वात कार्यक्षम पद्धत मानली जाते.
एलव्ही-एमपी अभ्यासात असे दिसून आले की, जेव्हा एलव्ही व्हेक्टर्सना कॉम्बीमॅगसोबत एकत्र करून चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत भौतिक हस्तक्षेपानंतर पोहोचवले गेले, तेव्हा नियंत्रणांच्या तुलनेत श्वासनलिकेतील ट्रान्सडक्शनची पातळी लक्षणीयरीत्या वाढली. सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग अभ्यास आणि लॅकझेड (LacZ) निकालांवर आधारित, असे दिसून आले की चुंबकीय क्षेत्र श्वासनलिकेमध्ये एलव्हीचे संरक्षण करण्यास आणि फुफ्फुसाच्या खोलवर त्वरित प्रवेश करणाऱ्या व्हेक्टर कणांची संख्या कमी करण्यास सक्षम होते. अशा लक्ष्यीकरणातील सुधारणांमुळे उच्च कार्यक्षमता मिळू शकते, तसेच पोहोचवलेले टायटर्स, ऑफ-टार्गेट ट्रान्सडक्शन, दाहक आणि रोगप्रतिकारक दुष्परिणाम आणि जनुकीय वाहकांचा खर्च कमी होऊ शकतो. महत्त्वाचे म्हणजे, निर्मात्यानुसार, कॉम्बीमॅगचा वापर इतर जनुकीय हस्तांतरण पद्धतींसोबत केला जाऊ शकतो, ज्यामध्ये इतर व्हायरल व्हेक्टर्स (जसे की एएव्ही) आणि न्यूक्लिक ॲसिड्स यांचा समावेश आहे.