Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo kwa CSS. Kwa matumizi bora, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime hali ya utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Vekta za jeni kwa ajili ya matibabu ya ugonjwa wa mapafu wa cystic fibrosis zinapaswa kulenga njia za hewa zinazoendeshwa kwa sababu uhamishaji wa mapafu ya pembeni hautoi faida ya matibabu. Ufanisi wa uhamishaji wa virusi unahusiana moja kwa moja na muda wa kuishi wa vekta. Hata hivyo, majimaji ya uwasilishaji kama vile wabebaji wa jeni huenea kiasili kwenye alveoli wakati wa msukumo, na chembe za matibabu za aina yoyote husafishwa haraka na usafirishaji wa mucociliary. Kuongeza muda wa kuishi wa wabebaji wa jeni kwenye njia za hewa ni muhimu lakini ni vigumu kufikia. Chembe za sumaku zilizounganishwa na wabebaji wa jeni ambazo zinaweza kuelekezwa kwenye uso wa njia za hewa zinaweza kuboresha ulengaji wa kikanda. Kutokana na changamoto za taswira ya ndani ya mwili, tabia ya chembe ndogo kama hizo za sumaku kwenye uso wa njia ya hewa mbele ya uwanja wa sumaku uliotumika haieleweki vizuri. Lengo la utafiti huu lilikuwa kutumia upigaji picha wa synchrotron kuibua mwendo wa ndani ya mwili wa mfululizo wa chembe za sumaku kwenye trachea ya panya walio na ganzi ili kuchunguza mienendo na mifumo ya tabia ya chembe za kibinafsi na za wingi katika mwili. Kisha pia tulitathmini ikiwa uwasilishaji wa chembe za sumaku za lentiviral mbele ya uwanja wa sumaku ungeongeza ufanisi wa uhamishaji katika panya. trachea. Upigaji picha wa X-ray wa Synchrotron unaonyesha tabia ya chembe za sumaku katika sehemu za sumaku zisizosimama na zinazosonga katika vitro na katika mwili. Chembe haziwezi kuvutwa kwa urahisi kwenye uso wa njia ya hewa iliyo hai kwa kutumia sumaku, lakini wakati wa usafirishaji, amana hujilimbikizia katika uwanja wa mtazamo ambapo uwanja wa sumaku ni mkubwa zaidi. Ufanisi wa upitishaji pia uliongezeka mara sita wakati chembe za sumaku za lentiviral zilitolewa mbele ya uwanja wa sumaku. Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha kwamba chembe za sumaku za lentiviral na sehemu za sumaku zinaweza kuwa mbinu muhimu za kuboresha ulengaji wa vekta ya jeni na kuongeza viwango vya upitishaji katika kuendesha njia za hewa katika mwili.
Fibrosisi ya cystic (CF) husababishwa na tofauti katika jeni moja inayoitwa kidhibiti cha upitishaji wa CF transmembrane (CFTR). Protini ya CFTR ni njia ya ioni ambayo inapatikana katika seli nyingi za epithelial kote mwilini, ikiwa ni pamoja na njia za hewa zinazoendesha, eneo kuu la pathogenesis ya CF. Kasoro za CFTR husababisha usafirishaji usio wa kawaida wa maji, kukausha uso wa njia ya hewa na kupunguza kina cha safu ya kioevu cha uso wa njia ya hewa (ASL). Hii pia huathiri uwezo wa mfumo wa usafirishaji wa mucociliary (MCT) kuondoa chembe za hewa na vimelea kutoka kwa njia ya hewa. Lengo letu ni kutengeneza tiba ya jeni ya lentiviral (LV) ili kutoa nakala sahihi ya jeni ya CFTR na kuboresha afya ya ASL, MCT, na mapafu, na kuendelea kutengeneza teknolojia mpya zinazoweza kupima vigezo hivi katika mwili.
Vekta za LV ni mojawapo ya wagombea wanaoongoza kwa tiba ya jeni ya njia ya hewa ya CF, hasa kwa sababu zinaweza kuunganisha jeni ya matibabu katika seli za msingi za njia ya hewa (seli shina za njia ya hewa). Hii ni muhimu kwa sababu zinaweza kurejesha unyevu wa kawaida na uwazi wa kamasi kwa kutofautisha katika seli za uso wa njia ya hewa zinazohusishwa na CF zinazofanya kazi, na kusababisha faida za maisha yote. Vekta za LV zinapaswa kuelekezwa dhidi ya njia ya hewa inayofanya kazi, kwani hapa ndipo ugonjwa wa mapafu wa CF unapoanza. Uwasilishaji wa vekta ndani ya mapafu unaweza kusababisha uhamishaji wa alveoli, lakini hii haina faida ya matibabu katika CF. Hata hivyo, vimiminika kama vile vibebaji vya jeni huhamia kwenye alveoli baada ya msukumo baada ya kujifungua3,4 na chembe za matibabu husafishwa haraka kwenye cavity ya mdomo na MCT. Ufanisi wa uhamishaji wa LV unahusiana moja kwa moja na muda ambao vekta hubaki karibu na seli lengwa ili kuruhusu ufyonzaji wa seli - "muda wa kukaa"5 - ambao hupunguzwa kwa urahisi na mtiririko wa kawaida wa hewa wa kikanda pamoja na uratibu wa kamasi ya chembe na MCT. Kwa CF, uwezo wa kuongeza muda wa makazi ya LV ndani ya njia ya hewa ni muhimu ili kufikia viwango vya juu vya uhamishaji katika eneo hili, lakini umesababisha. imekuwa changamoto sana.
Ili kushinda kikwazo hiki, tunapendekeza kwamba chembe za sumaku za LV (MPs) zinaweza kusaidia kwa njia mbili zinazosaidiana. Kwanza, zinaweza kuongozwa kwa sumaku hadi kwenye uso wa njia ya hewa ili kuboresha kulenga na kusaidia chembe za jeni kukaa katika eneo linalohitajika la njia ya hewa; na ASL) kuhamia kwenye safu ya seli 6. MPs zimetumika sana kama vyombo vya kupeleka dawa vinavyolengwa zinapojifunga kwenye kingamwili, dawa za kimotherapeutic, au molekuli zingine ndogo zinazojifunga kwenye utando wa seli au kujifunga kwenye vipokezi husika vya uso wa seli na kujikusanya kwenye maeneo ya uvimbe mbele ya umeme tuli. Sehemu za Sumaku kwa Matibabu ya Saratani 7. Mbinu zingine za "joto kupita kiasi" zinalenga kuwasha MP zinapokabiliwa na sehemu za sumaku zinazoyumba, na hivyo kuharibu seli za uvimbe. Kanuni ya uhamishaji wa sumaku, ambapo sehemu ya sumaku hutumika kama wakala wa uhamishaji ili kuongeza uhamishaji wa DNA hadi kwenye seli, hutumika sana ndani ya vitro kwa kutumia aina mbalimbali za vekta za jeni zisizo za virusi na virusi kwa mistari ya seli ngumu kuhamisha. Ufanisi wa uhamishaji wa sumaku wa LV umeanzishwa, huku uwasilishaji wa LV-MPs ndani ya vitro kwa mstari wa seli ya epithelial ya bronchial ya binadamu mbele ya uwanja wa sumaku tuli, na kuongeza ufanisi wa uhamishaji kwa mara 186 ikilinganishwa na vekta ya LV pekee. LV-MP pia imetumika kwa modeli ya CF ndani ya vitro, ambapo uhamishaji wa sumaku uliongeza uhamishaji wa LV katika tamaduni za kiolesura cha hewa-kioevu kwa mara 20 mbele ya makohozi ya CF10.Hata hivyo, uhamishaji wa sumaku wa ndani ya viungo umepokea umakini mdogo na umetathminiwa tu kwa wanyama wachache. masomo11,12,13,14,15, hasa katika mapafu16,17. Hata hivyo, fursa za uhamishaji wa sumaku katika tiba ya mapafu ya CF ziko wazi. Tan et al.(2020) walisema kwamba "utafiti wa uthibitisho wa dhana ya utoaji bora wa mapafu ya nanochembe chembe chembe utafungua njia kwa mikakati ya baadaye ya kuvuta pumzi ya CFTR ili kuboresha matokeo ya kliniki kwa wagonjwa wa CF"6.
Tabia ya chembe ndogo za sumaku kwenye nyuso za njia ya hewa mbele ya uwanja wa sumaku uliotumika ni vigumu kuibua na kusoma, na hivyo kueleweka vibaya. Katika tafiti zingine, tulitengeneza mbinu ya upigaji picha wa X-ray unaotegemea uenezaji wa awamu-tofauti (PB-PCXI) bila kuvamia ili kuibua na kupima mabadiliko ya dakika katika mwili katika kina cha ASL18 na tabia ya MCT19,20 ili kupima moja kwa moja gesi. Unyevu wa uso wa mfereji na kutumika kama kiashiria cha mapema cha ufanisi wa matibabu. Zaidi ya hayo, mbinu yetu ya tathmini ya MCT hutumia chembe zenye kipenyo cha 10–35 µm zilizoundwa na alumina au glasi ya faharisi ya juu ya kuakisi kama alama za MCT zinazoonekana kwa kutumia PB-PCXI21. Mbinu zote mbili zinafaa kwa kuibua aina mbalimbali za chembe, ikiwa ni pamoja na MP.
Kutokana na azimio lake la juu la anga na muda, mbinu zetu za uchambuzi wa ASL na MCT zinazotegemea PB-PCXI zinafaa vyema kwa kuchunguza mienendo na mifumo ya tabia ya chembe moja na kubwa katika mwili ili kutusaidia kuelewa na kuboresha mbinu za utoaji wa jeni la MP. Mbinu tunayotumia hapa inatokana na tafiti zetu kwa kutumia mstari wa SPring-8 BL20B2, ambapo tuliona mwendo wa umajimaji kufuatia utoaji wa kipimo cha vekta bandia kwenye njia za hewa za pua na mapafu za panya ili kusaidia kuelezea mifumo yetu ya usemi wa jeni isiyo sawa inayoonekana katika masomo yetu ya wanyama ya kipimo cha kubeba jeni 3,4.
Lengo la utafiti huu lilikuwa kutumia synchrotron PB-PCXI kuibua mienendo ya ndani ya mwili ya mfululizo wa MP katika trachea ya panya walio hai. Masomo haya ya upigaji picha wa PB-PCXI yalibuniwa kujaribu aina mbalimbali za MP, nguvu za uwanja wa sumaku, na maeneo ili kubaini athari zao kwenye mwendo wa MP. Tulidhani kwamba uwanja wa sumaku unaotumika nje ungesaidia MP iliyowasilishwa kukaa au kuhamia kwenye eneo lengwa. Masomo haya pia yalituruhusu kutambua usanidi wa sumaku unaoongeza idadi ya chembe zilizohifadhiwa kwenye trachea baada ya kuwekwa. Katika mfululizo wa pili wa tafiti, tulitaka kutumia usanidi huu bora kuonyesha muundo wa upitishaji unaotokana na uwasilishaji wa LV-MPs katika mwili hadi kwenye njia ya hewa ya panya, kulingana na dhana kwamba uwasilishaji wa LV-MPs katika muktadha wa ulengaji wa njia ya hewa ungesababisha ufanisi bora wa upitishaji wa LV.
Uchunguzi wote wa wanyama ulifanywa kulingana na itifaki zilizoidhinishwa na Chuo Kikuu cha Adelaide (M-2019-060 na M-2020-022) na Kamati ya Maadili ya Wanyama ya Synchrotron ya SPring-8. Majaribio yalifanywa kulingana na miongozo ya ARRIVE.
Upigaji picha wote wa X-ray ulifanywa kwenye mstari wa boriti wa BL20XU kwenye synchrotron ya SPring-8 huko Japani, kwa kutumia mpangilio sawa na ule ulioelezwa hapo awali. Kwa ufupi, kisanduku cha majaribio kilikuwa mita 245 kutoka kwa pete ya kuhifadhi synchrotron. Umbali wa sampuli hadi kigunduzi wa mita 0.6 unatumika kwa masomo ya upigaji picha wa chembe na mita 0.3 kwa masomo ya upigaji picha wa ndani ya mwili ili kutoa athari za utofautishaji wa awamu. Nishati ya boriti ya monochromatic ya keV 25 ilitumika. Picha zilinaswa kwa kutumia kibadilishaji cha X-ray chenye ubora wa juu (SPring-8 BM3) kilichounganishwa na kigunduzi cha sCMOS. Kibadilishaji hubadilisha miale ya X kuwa mwanga unaoonekana kwa kutumia scintillator yenye unene wa µm 10 (Gd3Al2Ga3O12), ambayo kisha huelekezwa kwenye kitambuzi cha sCMOS kwa kutumia lengo la darubini ya × 10 (NA 0.3). Kigunduzi cha sCMOS kilikuwa Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japani) chenye ukubwa wa safu ya Pikseli 2048 × 2048 na saizi mbichi ya pikseli ya 6.5 × 6.5 µm. Mpangilio huu hutoa saizi bora ya pikseli ya isotropiki ya 0.51 µm na uwanja wa mtazamo wa takriban 1.1 mm × 1.1 mm. Urefu wa mfiduo wa 100 ms ulichaguliwa ili kuongeza uwiano wa ishara-kwa-kelele wa chembe za sumaku ndani na nje ya njia ya hewa huku ikipunguza mabaki ya mwendo unaosababishwa na kupumua. Kwa masomo ya ndani ya mwili, shutter ya haraka ya X-ray iliwekwa kwenye njia ya X-ray ili kupunguza kipimo cha mionzi kwa kuzuia miale ya X-ray kati ya mfiduo.
Kibebaji cha LV hakikutumika katika tafiti zozote za upigaji picha za SPring-8 PB-PCXI kwa sababu chumba cha upigaji picha cha BL20XU hakijaidhinishwa na Kiwango cha 2 cha Usalama wa Kibiolojia. Badala yake, tulichagua aina mbalimbali za MP zenye sifa nzuri kutoka kwa wauzaji wawili wa kibiashara—wakijumuisha ukubwa, vifaa, viwango vya chuma, na matumizi mbalimbali—kwanza ili kuelewa jinsi sehemu za sumaku zinavyoathiri mwendo wa MP ndani ya kapilari za kioo, na kisha katika njia za hewa zilizo hai. juu ya uso.MP zina ukubwa kuanzia 0.25 hadi 18 μm na zimetengenezwa kwa vifaa mbalimbali (tazama Jedwali 1), lakini muundo wa kila sampuli, ikiwa ni pamoja na ukubwa wa chembe za sumaku ndani ya MP, haujulikani. Kulingana na tafiti zetu za kina za MCT 19, 20, 21, 23, 24, tunatarajia kwamba MP ndogo kama 5 μm zinaweza kuonekana kwenye uso wa njia ya hewa ya trachea, kwa mfano kwa kutoa fremu mfululizo ili kuona mwonekano ulioboreshwa wa mwendo wa MP. MP moja ya ukubwa wa 0.25 μm ni ndogo kuliko azimio la kifaa cha upigaji picha, lakini PB-PCXI inatarajiwa kugundua utofautishaji wao wa ujazo na mwendo wa umajimaji wa uso ambao huwekwa baada ya kuwekwa.
Sampuli za kila MP katika Jedwali 1 zilitayarishwa katika kapilari za kioo za 20 μl (Drummond Microcaps, PA, Marekani) zenye kipenyo cha ndani cha 0.63 mm. Chembe za korpuscular zinapatikana katika maji, huku chembe za CombiMag zikipatikana katika umajimaji wa mtengenezaji. Kila mrija umejazwa nusu na umajimaji (takriban 11 μl) na kuwekwa kwenye kishikilia sampuli (tazama Mchoro 1). Kapilari za kioo ziliwekwa mlalo kwenye hatua ya sampuli kwenye kisanduku cha upigaji picha, mtawalia, na kuwekwa kingo za umajimaji. Sumaku ya kipenyo cha 19 mm (urefu wa 28 mm) ya nikeli ya ardhi adimu ya neodymium iron boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) yenye sumaku iliyobaki ya 1.17 Tesla iliunganishwa kwenye hatua tofauti ya utafsiri ili kufikia Badilisha nafasi yake kwa mbali wakati wa upigaji picha. Upatikanaji wa picha za X-ray huanza wakati sumaku imewekwa takriban 30 mm juu ya sampuli, na picha hupatikana kwa kiwango cha fremu 4 kwa sekunde. Wakati wa upigaji picha, sumaku ililetwa karibu na kioo. mrija wa kapilari (karibu 1 mm mbali) na kisha kuhamishiwa kando ya mrija ili kutathmini athari za nguvu ya uwanja na nafasi.
Mpangilio wa upigaji picha wa ndani ya vitro ulio na sampuli za MP katika kapilari za kioo kwenye hatua ya utafsiri wa xy ya sampuli. Njia ya boriti ya X-ray imewekwa alama na mstari mwekundu wenye dashibodi.
Mara tu mwonekano wa MPs ndani ya vitro ulipothibitishwa, kundi lao lilijaribiwa ndani ya mwili katika panya wa kike albino wa aina ya Wistar (wenye umri wa zaidi ya wiki 12, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japani), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japani) na 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) panya walitibiwa ganzi kwa mchanganyiko wa Pharma), Japani) kwa sindano ya ndani ya peritoneal. Baada ya ganzi, waliandaliwa kwa ajili ya upigaji picha kwa kuondoa manyoya kuzunguka trachea, wakiingiza mirija ya endotracheal (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) na kuwazuia kuhama kwenye bamba la upigaji picha lililotengenezwa maalum lenye mfuko wa joto ili kudumisha halijoto ya mwili 22. Bamba la upigaji picha kisha liliunganishwa kwenye hatua ya utafsiri wa sampuli kwenye kisanduku cha upigaji picha kwa pembe kidogo ili kupanga trachea kwa usawa katika picha ya X-ray, kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 2a.
(a) Usanidi wa upigaji picha wa ndani ya mwili katika kisanduku cha upigaji picha cha SPring-8, njia ya boriti ya X-ray imewekwa alama na mstari mwekundu wenye mistari.(b,c) Ujanibishaji wa sumaku kwenye trachea ulifanywa kwa mbali kwa kutumia kamera mbili za IP zilizowekwa kwa njia ya orthogonal. Upande wa kushoto wa picha ya skrini, kitanzi cha waya kinachoshikilia kichwa kinaweza kuonekana, na kanula ya uwasilishaji ikiwa mahali pake ndani ya bomba la ET.
Mfumo wa pampu ya sindano inayodhibitiwa kwa mbali (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) kwa kutumia sindano ya glasi ya 100 μl uliunganishwa kwenye mrija wa PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) kupitia sindano ya 30 Ga. Weka alama kwenye mrija ili kuhakikisha kwamba ncha iko katika nafasi sahihi kwenye trachea wakati wa kuingiza mrija wa ET. Kwa kutumia pampu ndogo, kipulizio cha sindano kiliondolewa huku ncha ya mrija ikitumbukizwa kwenye sampuli ya MP itakayotolewa. Mrija wa uwasilishaji uliopakiwa kisha uliingizwa kwenye mrija wa endotracheal, ukiweka ncha ndani ya sehemu yenye nguvu zaidi ya uwanja wetu wa sumaku uliotarajiwa kutumika. Upatikanaji wa picha ulidhibitiwa kwa kutumia kigunduzi cha kupumua kilichounganishwa na kisanduku chetu cha muda kinachotegemea Arduino, na ishara zote (km halijoto, kupumua, ufunguzi/kufunga kwa shutter na upataji wa picha) zilirekodiwa kwa kutumia Powerlab na LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Wakati wa kupiga picha Wakati sehemu iliyofungwa haikuweza kufikiwa, kamera mbili za IP (Panasonic BB-SC382) ziliwekwa takriban 90° hadi kila mmoja na zilitumika kufuatilia nafasi ya sumaku ikilinganishwa na trachea wakati wa upigaji picha (Mchoro 2b, c). Ili kupunguza mabaki ya mwendo, picha moja ilipatikana kwa kila pumzi wakati wa uwanda wa mtiririko wa mawimbi ya mwisho.
Sumaku imeunganishwa kwenye hatua ya pili ambayo inaweza kupatikana kwa mbali kutoka nje ya nyumba ya upigaji picha. Nafasi na usanidi mbalimbali wa sumaku ulijaribiwa, ikiwa ni pamoja na: Imewekwa kwa pembe ya takriban 30° juu ya trachea (usanidi unaoonyeshwa kwenye Mchoro 2a na 3a); sumaku moja juu ya mnyama na nyingine chini, huku nguzo zikiwa zimepangwa kuvutia (Mchoro 3b); sumaku moja juu ya mnyama na nyingine chini, huku nguzo zikiwa zimepangwa kurudisha nyuma (Mchoro 3c); na sumaku moja juu na ikiwa imesimama kwenye trachea (Mchoro 3d). Mara tu mnyama na sumaku zitakapowekwa na MP itakayojaribiwa imepakiwa kwenye pampu ya sindano, toa kipimo cha 50 μl kwa kiwango cha 4 μl/sekunde huku ukipata picha. Sumaku kisha husogezwa mbele na nyuma kando au kando kando ya trachea huku ikiendelea kupata picha.
Usanidi wa sumaku kwa ajili ya upigaji picha wa ndani ya mwili (a) sumaku moja juu ya trachea kwa pembe ya takriban 30°, (b) sumaku mbili zilizowekwa ili kuvutia, (c) sumaku mbili zilizowekwa ili kurudisha nyuma, (d) sumaku moja juu na iliyosimama kwenye trachea. Mtazamaji aliangalia chini kutoka mdomoni hadi kwenye mapafu kupitia trachea, na miale ya X-ray ilipita upande wa kushoto wa panya na kutoka upande wa kulia. Sumaku husogezwa kando ya urefu wa njia ya hewa au kushoto na kulia juu ya trachea kuelekea mwale wa X-ray.
Pia tulitafuta kubaini mwonekano na tabia ya chembe kwenye njia za hewa bila kupumua na mwendo wa moyo unaochanganya. Kwa hivyo, mwishoni mwa kipindi cha upigaji picha, wanyama waliuawa kinyama kwa kutumia dawa ya kupita kiasi ya pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Marekani; ~65 mg/kg ip). Baadhi ya wanyama waliachwa kwenye jukwaa la upigaji picha, na mara tu kupumua na mapigo ya moyo yaliposimama, mchakato wa upigaji picha ulirudiwa, na kuongeza kipimo cha ziada cha MP ikiwa hakuna MP aliyeonekana kwenye uso wa njia ya hewa.
Picha zilizopatikana zilirekebishwa katika sehemu tambarare na sehemu nyeusi na kisha kukusanywa katika filamu (fremu 20 kwa sekunde; kasi ya kawaida ya 15-25 × kulingana na kiwango cha kupumua) kwa kutumia hati maalum iliyoandikwa katika MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Uchunguzi wote wa utoaji wa vekta ya jeni ya LV ulifanyika katika Kituo cha Utafiti wa Wanyama cha Maabara katika Chuo Kikuu cha Adelaide na ulilenga kutumia matokeo ya jaribio la SPring-8 kutathmini kama utoaji wa LV-MP mbele ya uwanja wa sumaku unaweza kuongeza uhamishaji wa jeni mwilini. Ili kutathmini athari za MP na uwanja wa sumaku, makundi mawili ya wanyama yalitibiwa: kundi moja lilipewa LV-MP likiwa na sumaku iliyowekwa, na kundi lingine lilipokea kundi la udhibiti lenye LV-MP bila sumaku.
Vekta za jeni za LV zilizalishwa kwa kutumia mbinu zilizoelezwa hapo awali 25, 26. Vekta ya LacZ inaelezea jeni la beta-galactosidase lililowekwa ndani ya nyuklia linaloendeshwa na kichocheo cha MPSV (LV-LacZ), ambacho hutoa bidhaa ya mmenyuko wa bluu katika seli zilizobadilishwa, zinazoonekana katika sehemu za tishu za mapafu na sehemu za tishu. Utiti ulifanywa katika tamaduni za seli kwa kuhesabu kwa mikono idadi ya seli chanya za LacZ kwa kutumia hemocytomita ili kuhesabu titer katika TU/ml. Vibebaji huhifadhiwa kwa -80 °C, huyeyuka kabla ya matumizi, na kufungwa kwa CombiMag kwa kuchanganya kwa uwiano wa 1:1 na kuanguliwa kwenye barafu kwa angalau dakika 30 kabla ya kujifungua.
Panya wa kawaida wa Sprague Dawley (n = 3/kundi, ~2-3 walipatiwa ganzi ndani ya peritone kwa kutumia mchanganyiko wa 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) na sindano ya 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) ya mwezi mmoja) ip) na kukatwa kwa mdomo bila upasuaji kwa kutumia kanula ya 16 Ga iv. Ili kuhakikisha kwamba tishu za njia ya hewa ya trachea hupokea upitishaji wa LV, ilirekebishwa kwa kutumia itifaki yetu ya mitambo ya kuvuruga, ambapo uso wa njia ya hewa ya trachea ulisuguliwa kwa mhimili kwa kutumia kikapu cha waya (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Utoaji wa LV-MP kwa trachea kisha ulifanywa katika kabati la usalama la kibiolojia takriban dakika 10 baada ya kuvuruga.
Sehemu ya sumaku iliyotumika katika jaribio hili iliundwa kwa njia sawa na utafiti wa picha za X-ray za ndani ya mwili, huku sumaku zile zile zikiwa zimeshikiliwa juu ya trachea kwa kutumia klipu za stent za kunereka (Mchoro 4). Kiasi cha 50 μl (aliquoti 2 × 25 μl) cha LV-MP kiliingizwa kwenye trachea (n = wanyama 3) kwa kutumia bomba lenye ncha ya jeli kama ilivyoelezwa hapo awali. Kundi la udhibiti (n = wanyama 3) lilipokea LV-MP zile zile bila kutumia sumaku. Baada ya uingizwaji kukamilika, kanula huondolewa kwenye bomba la ET na mnyama huondolewa. Sumaku hubaki mahali pake kwa dakika 10, kisha huondolewa. Panya walipokea kipimo cha chini ya ngozi cha meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) ikifuatiwa na kubadilishwa kwa ganzi kwa sindano ya ip ya 1 mg/kg ya atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). Panya waliwekwa joto na kufuatiliwa hadi watakapopona kabisa kutokana na ganzi.
Kifaa cha kutolea cha LV-MP kwenye kabati la usalama la kibiolojia. Kitovu cha Luer cha kijivu hafifu cha mrija wa ET kinaweza kuonekana kikitoka mdomoni na ncha ya jeli ya mrija unaoonyeshwa kwenye picha imeingizwa kupitia mrija wa ET hadi kina kinachohitajika ndani ya trachea.
Wiki moja baada ya utaratibu wa kipimo cha LV-MP, wanyama waliuawa kinyama kwa kuvuta pumzi ya CO2 100% na usemi wa LacZ ulipimwa kwa kutumia matibabu yetu ya kawaida ya X-gal. Pete tatu za cartilaginous zilizo na mkia mkubwa zaidi ziliondolewa ili kuhakikisha kwamba uharibifu wowote wa kiufundi au uhifadhi wa umajimaji kutoka kwa uwekaji wa mirija ya endotracheal haukujumuishwa katika uchambuzi. Kila trachea ilikatwa kwa urefu ili kuunda nusu mbili kwa ajili ya uchambuzi, na ziliwekwa kwenye sahani iliyo na mpira wa silicone (Sylgard, Dow Inc) kwa kutumia sindano ya Minutien (Fine Science Tools) ili kuibua uso wa mwanga. Usambazaji na muundo wa seli zilizobadilishwa ulithibitishwa na upigaji picha wa mbele kwa kutumia darubini ya Nikon (SMZ1500) kwa kutumia kamera ya DigiLite na programu ya TCapture (Tucsen Photonics, China). Picha zilipatikana kwa ukuzaji wa mara 20 (ikiwa ni pamoja na mpangilio wa juu zaidi kwa upana kamili wa trachea), huku urefu wote wa trachea ukipigwa picha hatua kwa hatua, kuhakikisha mwingiliano wa kutosha kati ya kila picha ili kuruhusu "kushonwa" kwa picha. Picha kutoka kila moja Kisha trachea zilikusanywa katika picha moja mchanganyiko kwa kutumia Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) kwa kutumia algoriti ya mwendo wa sayari. Maeneo ya usemi wa LacZ katika picha mchanganyiko za trachea kutoka kwa kila mnyama yalipimwa kwa kutumia hati otomatiki ya MATLAB (R2020a, MathWorks) kama ilivyoelezwa hapo awali, kwa kutumia mipangilio ya 0.35 < Hue < 0.58, Kueneza > 0.15, na Thamani < 0.7. Kwa kufuatilia miinuko ya tishu, barakoa ilitengenezwa kwa mikono katika GIMP v2.10.24 kwa kila picha mchanganyiko ili kutambua eneo la tishu na kuzuia ugunduzi wowote wa uwongo kutoka nje ya tishu ya trachea. Maeneo yaliyotiwa rangi kutoka kwa picha zote mchanganyiko kutoka kwa kila mnyama yalifupishwa ili kutoa eneo lote lililotiwa rangi kwa mnyama huyo. Eneo lililotiwa rangi kisha likagawanywa na eneo lote la barakoa ili kutoa eneo la kawaida.
Kila trachea ilipachikwa kwenye mafuta ya taa na sehemu za μm 5 zilikatwa. Sehemu ziliwekwa rangi nyekundu isiyo na rangi kwa dakika 5 na picha zilipatikana kwa kutumia darubini ya Nikon Eclipse E400, kamera ya DS-Fi3 na programu ya kukamata elementi ya NIS (toleo la 5.20.00).
Uchambuzi wote wa takwimu ulifanyika katika GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Umuhimu wa takwimu uliwekwa katika p ≤ 0.05. Ukawaida ulithibitishwa kwa kutumia jaribio la Shapiro-Wilk, na tofauti katika upakaji rangi wa LacZ zilipimwa kwa kutumia jaribio la t lisilounganishwa.
MP sita zilizoelezwa katika Jedwali la 1 zilichunguzwa kwa kutumia PCXI, na mwonekano umeelezewa katika Jedwali la 2. MP mbili za polisthireni (MP1 na MP2; 18 μm na 0.25 μm, mtawalia) hazikuonekana chini ya PCXI, lakini sampuli zilizobaki zilitambulika (mifano imeonyeshwa katika Mchoro 5). MP3 na MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm na 0.9 μm, mtawalia) zinaonekana kidogo. Ingawa zina baadhi ya chembe ndogo zaidi zilizojaribiwa, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) ndiyo iliyotamkwa zaidi. Bidhaa ya CombiMag MP6 ni vigumu kuiona. Katika visa vyote, uwezo wetu wa kugundua MP uliimarishwa kwa kiasi kikubwa kwa kutafsiri sumaku mbele na nyuma sambamba na kapilari. Sumaku zilipohama kutoka kwenye kapilari, chembe zilipanuka kwa nyuzi ndefu, lakini kadri sumaku zilivyokaribia na nguvu ya uwanja wa sumaku ikiongezeka, nyuzi za chembe zilifupishwa kadri chembe zilivyohamia kuelekea juu ya kapilari. (tazama Video ya Nyongeza S1: MP4), ikiongeza msongamano wa chembe za uso. Kinyume chake, sumaku inapoondolewa kwenye kapilari, nguvu ya uwanja hupungua na MP hupangwa upya katika nyuzi ndefu zinazoenea kutoka kwenye uso wa juu wa kapilari (tazama Video ya Nyongeza S2: MP4). Baada ya sumaku kuacha kusonga, chembe huendelea kusonga kwa muda mfupi baada ya kufikia nafasi ya usawa. MP inaposogea kuelekea na mbali na uso wa juu wa kapilari, chembe za sumaku kwa kawaida huvuta uchafu kupitia umajimaji.
Mwonekano wa MP chini ya PCXI hutofautiana sana kati ya sampuli.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 na (d) MP6. Picha zote zinazoonyeshwa hapa zilipigwa na sumaku iliyoko takriban milimita 10 moja kwa moja juu ya kapilari. Miduara mikubwa inayoonekana ni viputo vya hewa vilivyonaswa kwenye kapilari, ikionyesha wazi sifa za ukingo mweusi na mweupe za upigaji picha wa utofautishaji wa awamu. Kisanduku chekundu kina ukuzaji unaoongeza utofautishaji. Kumbuka kwamba kipenyo cha michoro ya sumaku katika takwimu zote si cha kiwango na ni takriban mara 100 zaidi ya inavyoonyeshwa.
Sumaku inapotafsiriwa kushoto na kulia kando ya sehemu ya juu ya kapilari, pembe ya kamba ya MP hubadilika ili kuendana na sumaku (tazama Mchoro 6), hivyo kufafanua mistari ya uwanja wa sumaku. Kwa MP3-5, baada ya gumzo kufikia pembe ya kizingiti, chembe huburutwa kando ya sehemu ya juu ya kapilari. Hii mara nyingi husababisha MP kukusanyika katika vikundi vikubwa karibu na mahali ambapo uwanja wa sumaku ni wenye nguvu zaidi (tazama Video ya Nyongeza S3:MP5). Hii pia inaonekana wazi wakati wa kupiga picha karibu na mwisho wa kapilari, ambayo husababisha MP kukusanyika na kuzingatia kwenye kiolesura cha ugiligili-hewa. Chembe katika MP6, ambazo zilikuwa ngumu zaidi kutambua kuliko MP3-5, hazikuburutwa huku sumaku ikisogea kando ya kapilari, lakini nyuzi za MP zilitengana, na kuacha chembe hizo kwenye uwanja wa mwonekano (tazama Video ya Nyongeza S4:MP6). Katika baadhi ya matukio, wakati uwanja wa sumaku uliotumika ulipunguzwa kwa kusogeza sumaku umbali mkubwa kutoka eneo la upigaji picha, MP zozote zilizobaki zilishuka polepole hadi kwenye sehemu ya chini ya bomba kwa mvuto huku zikibaki kwenye kamba (tazama Video ya Nyongeza S5: MP3).
Pembe ya kamba ya MP hubadilika kadri sumaku inavyohamishwa kulia juu ya kapilari.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 na (d) MP6. Kisanduku chekundu kina ukuzaji unaoongeza utofautishaji. Kumbuka kwamba video za ziada zinaelimisha kwani zinafichua muundo muhimu wa chembe na taarifa inayobadilika ambayo haiwezi kuonekana katika picha hizi tuli.
Vipimo vyetu vilionyesha kuwa kusogeza sumaku polepole nyuma na mbele kando ya trachea hurahisisha taswira ya MP katika muktadha wa mwendo tata ndani ya mwili. Upimaji wa ndani ya mwili haukufanywa kwani shanga za polistini (MP1 na MP2) hazikuonekana kwenye kapilari. Kila moja ya MP nne zilizobaki zilijaribiwa ndani ya mwili huku mhimili mrefu wa sumaku ukiwa umeundwa juu ya trachea kwa pembe ya takriban 30° hadi wima (tazama Michoro 2b na 3a), kwani hii ilisababisha minyororo mirefu ya MP na ilikuwa na ufanisi zaidi kuliko usanidi wa sumaku uliomalizika. MP3, MP4 na MP6 hazikugunduliwa kwenye trachea ya wanyama wowote walio hai. Wakati njia za hewa za panya zilipopigwa picha baada ya wanyama kuuawa kibinadamu, chembe zilibaki hazionekani hata wakati ujazo wa ziada uliongezwa kwa kutumia pampu ya sindano. MP5 ilikuwa na kiwango cha juu zaidi cha oksidi ya chuma na ilikuwa chembe pekee inayoonekana, na kwa hivyo ilitumika kutathmini na kuainisha tabia ya ndani ya mwili ya MP.
Kuweka sumaku juu ya trachea wakati wa utoaji wa MP kulisababisha MP nyingi, lakini sio zote, kujilimbikizia katika uwanja wa mtazamo. Chembe zinazoingia kwenye trachea huonekana vyema kwa wanyama waliotolewa kafara kwa kibinadamu. Mchoro 7 na Video ya Ziada S6: MP5 inaonyesha ukamataji wa haraka wa sumaku na mpangilio wa chembe kwenye uso wa trachea ya tumbo, ikionyesha kwamba MP zinaweza kuelekezwa kwenye maeneo yanayohitajika ya trachea. Wakati wa kutafuta kwa mbali zaidi kando ya trachea baada ya utoaji wa MP, baadhi ya MP zilipatikana karibu na carina, ikidokeza kwamba nguvu ya uwanja wa sumaku haitoshi kukusanya na kuhifadhi MP zote, kwani zilitolewa kupitia eneo la nguvu ya juu ya uwanja wa sumaku wakati wa mchakato wa umajimaji. Hata hivyo, viwango vya MP baada ya kujifungua vilikuwa vya juu zaidi kuzunguka eneo lililopigwa picha, ikidokeza kwamba MP nyingi zilibaki katika maeneo ya njia ya hewa ambapo nguvu ya uwanja wa sumaku iliyotumika ilikuwa ya juu zaidi.
Picha kutoka (a) kabla na (b) baada ya kupelekwa kwa MP5 kwenye trachea ya panya aliyeuawa hivi karibuni huku sumaku ikiwa imewekwa moja kwa moja juu ya eneo la upigaji picha. Eneo lililopigwa picha liko kati ya pete mbili za gegedu. Kabla ya kupelekwa kwa MP, kuna umajimaji fulani kwenye njia ya hewa. Kisanduku chekundu kina ukuzaji unaoongeza utofautishaji. Picha hizi zinatoka kwenye video inayoonyeshwa katika Video ya Nyongeza S6:MP5.
Kutafsiri sumaku kando ya trachea katika mwili kulisababisha mnyororo wa MP kubadilisha pembe ndani ya uso wa njia ya hewa kwa njia sawa na ile inayoonekana kwenye kapilari (tazama Mchoro 8 na Video ya Nyongeza S7: MP5). Hata hivyo, katika utafiti wetu, MP hazikuweza kuvutwa kando ya uso wa njia ya hewa hai kama zinavyoweza kwa kapilari. Katika baadhi ya matukio, mnyororo wa MP utaongezeka kadri sumaku inavyosogea kushoto na kulia. Cha kufurahisha, pia tuligundua kuwa kamba ya chembe inaonekana kubadilisha kina cha safu ya umajimaji wa uso wakati sumaku inasogezwa kwa urefu kando ya trachea, na hupanuka wakati sumaku inasogezwa moja kwa moja juu na kamba ya chembe inazungushwa hadi nafasi ya wima (tazama Video ya Nyongeza S7). : MP5 saa 0:09, chini kulia). Muundo wa tabia wa mwendo ulibadilika wakati sumaku ilipohamishwa juu ya trachea upande wa pili (yaani, kushoto au kulia kwa mnyama badala ya kando ya urefu wa trachea). Chembe bado zilionekana wazi zilipokuwa zikisogea, lakini sumaku ilipoondolewa kwenye trachea, ncha za nyuzi za chembe zilionekana (tazama Video ya Ziada S8:MP5, kuanzia saa 0:08). Hii inaendana na tabia ya MP tuliyoiona chini ya uwanja wa sumaku uliotumika kwenye kapilari ya glasi.
Mifano ya picha zinazoonyesha MP5 katika trachea ya panya aliye hai aliyepewa ganzi.(a) Sumaku hutumika kupata picha zilizo juu na kushoto mwa trachea, kisha (b) baada ya sumaku kusogezwa kulia. Kisanduku chekundu kina ukuzaji unaoongeza utofautishaji. Picha hizi zinatoka kwenye video inayoonyeshwa katika Video ya Ziada S7:MP5.
Wakati nguzo hizo mbili zilipowekwa katika mwelekeo wa kaskazini-kusini juu na chini ya trachea (yaani kuvutia; Mchoro 3b), chords za MP zilionekana ndefu zaidi na zilikuwa kwenye ukuta wa kando wa trachea badala ya kwenye uso wa trachea ya mgongoni (tazama Video ya Nyongeza S9: MP5). Hata hivyo, viwango vya juu vya chembe katika eneo moja (yaani, uso wa mgongo wa trachea) havikugunduliwa baada ya uwasilishaji wa maji wakati kifaa cha sumaku mbili kilitumika, ambayo kwa kawaida hutokea wakati kifaa cha sumaku moja kinatumika. Kisha wakati sumaku moja ilipowekwa ili kurudisha nguzo zilizogeuzwa (Mchoro 3c), idadi ya chembe zinazoonekana katika uwanja wa mwonekano haikuonekana kuongezeka baada ya uwasilishaji. Usanidi wa usanidi wote wa sumaku mbili ni changamoto kutokana na nguvu kubwa za uwanja wa sumaku zinazovuta au kusukuma sumaku, mtawalia. Usanidi huo kisha ulibadilishwa kuwa sumaku moja sambamba na njia ya hewa lakini ikipitia njia ya hewa kwa digrii 90 ili mistari ya uwanja ivuke ukuta wa trachea kimtazamo (Mchoro 3d), mwelekeo ulioundwa kubaini kama mkusanyiko wa chembe upande. ukuta ungeweza kuzingatiwa. Hata hivyo, katika usanidi huu, hakukuwa na mwendo unaotambulika wa mkusanyiko wa MP au mwendo wa sumaku. Kulingana na matokeo haya yote, usanidi wa mwelekeo wa sumaku moja, digrii 30 (Mchoro 3a) ulichaguliwa kwa ajili ya masomo ya wabebaji wa jeni katika mwili.
Wakati mnyama huyo alipopigwa picha mara kwa mara mara tu baada ya mauaji ya kibinadamu, kutokuwepo kwa mwendo wa tishu unaochanganya kulimaanisha kwamba mistari mifupi na nyembamba ya chembe inaweza kutambuliwa katika uwanja wazi wa kati ya chondral, "ikitetemeka" sambamba na mwendo wa tafsiri wa sumaku. Hata hivyo, bado haiwezi kuona wazi uwepo na mwendo wa chembe za MP6.
Kiwango cha LV-LacZ kilikuwa 1.8 × 108 TU/ml, na baada ya kuchanganya 1:1 na CombiMag MP (MP6), wanyama walipokea kipimo cha trachea cha 50 μl cha 9 × 107 TU/ml LV (yaani 4.5 × 106 TU/rat). ). Katika tafiti hizi, badala ya kutafsiri sumaku wakati wa leba, tuliweka sumaku katika nafasi moja ili kubaini kama transduction ya LV (a) inaweza kuboreshwa ikilinganishwa na uwasilishaji wa vekta bila uwanja wa sumaku, na (b) inaweza kulenga. Seli za njia ya hewa huhamishiwa kwenye maeneo lengwa ya sumaku ya njia ya juu ya hewa.
Uwepo wa sumaku na matumizi ya CombiMag pamoja na vekta za LV haukuonekana kuwa na athari mbaya kwa afya ya wanyama, kama ilivyokuwa kwa itifaki yetu ya kawaida ya utoaji wa vekta za LV. Picha za mbele za eneo la trachea lililoathiriwa na msukosuko wa mitambo (Mchoro wa Nyongeza 1) zilionyesha kuwa kulikuwa na viwango vya juu zaidi vya uhamishaji katika kundi la wanyama waliotibiwa na LV-MP wakati sumaku ilikuwepo (Mchoro 9a). Kiasi kidogo tu cha madoa ya bluu ya LacZ kilikuwepo katika kundi la udhibiti (Mchoro 9b). Upimaji wa maeneo yaliyo na madoa ya X-Gal yaliyorekebishwa ulionyesha kuwa usimamizi wa LV-MP mbele ya uwanja wa sumaku ulileta uboreshaji wa takriban mara 6 (Mchoro 9c).
Mfano wa picha mchanganyiko zinazoonyesha upitishaji wa trachea na LV-MP (a) mbele ya uwanja wa sumaku na (b) bila sumaku.(c) Uboreshaji muhimu wa kitakwimu katika eneo la upitishaji la LacZ lililorekebishwa ndani ya trachea wakati wa kutumia sumaku (*p = 0.029, t-test, n = 3 kwa kila kundi, wastani ± SEM).
Sehemu zenye rangi nyekundu zisizo na rangi zisizo na rangi (mfano unaoonyeshwa kwenye Mchoro wa Nyongeza wa 2) zilionyesha seli zenye rangi ya LacZ zikiwa katika muundo na eneo sawa kama ilivyoripotiwa hapo awali.
Changamoto muhimu kwa tiba ya jeni ya njia ya hewa inabaki kuwa ujanibishaji sahihi wa chembe za kubeba katika maeneo yanayovutia na kufikia viwango vya juu vya ufanisi wa uhamishaji katika mapafu yanayosonga mbele mbele ya mtiririko wa hewa na uwazi wa kamasi unaofanya kazi. Kwa wabebaji wa LV walioundwa kutibu ugonjwa wa njia ya hewa ya CF, kuongeza muda wa kukaa wa chembe za kubeba ndani ya njia za hewa zinazoendesha imekuwa lengo lisilowezekana hadi sasa. Kama ilivyoonyeshwa na Castellani et al., matumizi ya uwanja wa sumaku kuboresha uhamishaji yana faida ikilinganishwa na njia zingine za uwasilishaji wa jeni kama vile umeme, kwani inaweza kuchanganya unyenyekevu, ufanisi wa gharama, ujanibishaji wa uwasilishaji, ufanisi ulioongezeka, na muda mfupi wa kuachilia, na labda kipimo kidogo cha uhamishaji10. Hata hivyo, uwekaji na tabia ya chembe za sumaku katika njia za hewa chini ya ushawishi wa nguvu za sumaku za nje haujawahi kuelezewa, wala uwezekano wa njia hii haujaonyeshwa katika mwili ili kuongeza viwango vya usemi wa jeni katika njia za hewa zilizo hai zilizosalia.
Majaribio yetu ya PCXI ya synchrotron ya ndani ya vitro yalionyesha kuwa chembe zote tulizojaribu, isipokuwa polistyrene MP, zilionekana katika usanidi wa upigaji picha tulioutumia. Mbele ya uwanja wa sumaku, mbunge huunda nyuzi ambazo urefu wake unahusiana na aina ya chembe na nguvu ya uwanja wa sumaku (yaani ukaribu na mwendo wa sumaku). Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 10, nyuzi tunazoziona huundwa kutokana na kila chembe ya mtu binafsi kuwa na sumaku na kusababisha uwanja wake wa sumaku wa ndani. Sehemu hizi tofauti husababisha chembe zingine zinazofanana kukusanyika na kuungana, kwa mwendo kama wa nyuzi za kikundi kutokana na nguvu za ndani kutoka kwa nguvu za ndani za kuvutia na za kuchukiza za chembe zingine.
Kielelezo kinaonyesha (a,b) chembe zinazozalishwa ndani ya kapilari zilizojazwa umajimaji na (c,d) trachea iliyojazwa hewa. Kumbuka kwamba kapilari na trachea hazijachorwa kwa kiwango. Paneli (a) pia ina maelezo ya MP, ambayo ina chembe za Fe3O4 zilizopangwa katika nyuzi.
Sumaku ilipohamishwa juu ya kapilari, pembe ya kamba ya chembe ilifikia kizingiti muhimu cha MP3-5 iliyo na Fe3O4, baada ya hapo kamba ya chembe haikubaki tena katika nafasi ya awali, bali ilihamia kwenye uso hadi nafasi mpya. sumaku. Athari hii inawezekana kutokea kwa sababu uso wa kapilari ya kioo ni laini vya kutosha kuruhusu harakati hii kutokea. Cha kufurahisha ni kwamba, MP6 (CombiMag) haikufanya hivi, labda kwa sababu chembe zilikuwa ndogo, zilikuwa na mipako tofauti au chaji za uso, au umajimaji wa kubeba pekee uliathiri uwezo wao wa kusonga. Tofauti ya picha ya chembe za CombiMag pia ni dhaifu, ikidokeza kwamba umajimaji na chembe zinaweza kuwa na msongamano sawa na kwa hivyo hazisogei kwa urahisi kuelekea kila mmoja. Chembe pia zinaweza kukwama ikiwa sumaku inasonga haraka sana, ikionyesha kwamba nguvu ya uwanja wa sumaku haiwezi kushinda msuguano kati ya chembe kwenye umajimaji, ikidokeza kwamba labda haishangazi kwamba nguvu ya uwanja wa sumaku na umbali kati ya sumaku na eneo lengwa. Muhimu sana. Kwa pamoja, matokeo haya pia yanaonyesha kwamba, ingawa sumaku zinaweza kunasa MP nyingi zinazopita katika eneo lengwa, kuna uwezekano kwamba sumaku zinaweza kutegemewa. kuendelea kusogeza chembe za CombiMag kando ya uso wa trachea. Kwa hivyo, tunahitimisha kwamba tafiti za LV-MP katika mwili zinapaswa kutumia sehemu za sumaku tuli kulenga maeneo maalum ya mti wa njia ya hewa.
Chembe zinapotolewa mwilini, ni vigumu kuzitambua katika muktadha wa tishu tata za mwili zinazosonga, lakini uwezo wa kuzigundua uliimarishwa kwa kutafsiri sumaku kwa mlalo juu ya trachea ili "kuzungusha" nyuzi za MP. Ingawa upigaji picha wa moja kwa moja unawezekana, ni rahisi kutambua mwendo wa chembe mara tu mnyama atakapouawa kibinadamu. Viwango vya MP kwa ujumla vilikuwa vya juu zaidi katika eneo hili wakati sumaku ilikuwa imewekwa juu ya eneo la upigaji picha, ingawa baadhi ya chembe kwa kawaida zilipatikana zaidi kando ya trachea. Tofauti na masomo ya ndani ya vitro, chembe haziwezi kuvutwa kando ya trachea kwa kutafsiri sumaku. Ugunduzi huu unaendana na jinsi kamasi inayofunika uso wa trachea kwa kawaida inavyosindika chembe zilizovutwa, kuzinasa kwenye kamasi na baadaye kusafishwa na utaratibu wa kuondoa mucociliary.
Tulidhani kwamba matumizi ya sumaku kwa mvuto juu na chini ya trachea (Mchoro 3b) yanaweza kusababisha uwanja wa sumaku unaofanana zaidi, badala ya uwanja wa sumaku ambao umejilimbikizia sana wakati mmoja, na hivyo kusababisha usambazaji sawa wa chembe.Hata hivyo, utafiti wetu wa awali haukupata ushahidi dhahiri wa kuunga mkono dhana hii.Vile vile, kusanidi jozi ya sumaku ili kurudisha nyuma (Mchoro 3c) hakukusababisha uwekaji zaidi wa chembe katika eneo lililopigwa picha.Matokeo haya mawili yanaonyesha kwamba usanidi wa sumaku mbili hauboreshi kwa kiasi kikubwa udhibiti wa ndani wa kulenga MP, na kwamba nguvu kali za sumaku zinazotokana ni ngumu kusanidi, na kufanya mbinu hii isifanye kazi vizuri.Vile vile, kuelekeza sumaku hapo juu na kupitia trachea (Mchoro 3d) pia hakukuongeza idadi ya chembe zilizobaki katika eneo lililopigwa picha.Baadhi ya usanidi huu mbadala huenda usifanikiwe kwa sababu husababisha nguvu ndogo za uwanja wa sumaku ndani ya eneo lililopigwa picha.Kwa hivyo, usanidi mmoja wa sumaku wa pembe ya digrii 30 (Mchoro 3a) unachukuliwa kuwa njia rahisi na bora zaidi ya upimaji wa ndani.
Utafiti wa LV-MP ulionyesha kwamba wakati vekta za LV zilipounganishwa na CombiMag na kutolewa baada ya usumbufu wa kimwili mbele ya uwanja wa sumaku, viwango vya uhamishaji viliongezeka kwa kiasi kikubwa kwenye trachea ikilinganishwa na vidhibiti. Kulingana na masomo ya upigaji picha wa synchrotron na matokeo ya LacZ, uwanja wa sumaku ulionekana uliweza kuhifadhi LV ndani ya trachea na kupunguza idadi ya chembe za vekta ambazo zilipenya mara moja ndani ya mapafu. Maboresho hayo ya kulenga yanaweza kusababisha ufanisi mkubwa huku ikipunguza titers zilizotolewa, uhamishaji usiolengwa, athari za uchochezi na kinga, na gharama za wabebaji wa jeni. Muhimu, kulingana na mtengenezaji, CombiMag inaweza kutumika pamoja na mbinu zingine za uhamishaji wa jeni, ikiwa ni pamoja na vekta zingine za virusi (kama vile AAV) na asidi za kiini.