Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Genski vektori za liječenje cistične fibroze pluća trebali bi ciljati provodne dišne ​​putove jer periferna plućna transdukcija ne pruža terapijsku korist. Učinkovitost virusne transdukcije izravno je povezana s vremenom zadržavanja vektora. Međutim, tekućine za dostavu poput nosača gena prirodno difundiraju u alveole tijekom udisaja, a terapijske čestice bilo kojeg oblika brzo se uklanjaju mukocilijarnim transportom. Produljenje vremena zadržavanja nosača gena u dišnim putovima važno je, ali teško postići. Magnetske čestice konjugirane s nosačem gena koje se mogu usmjeriti na površinu dišnih putova mogu poboljšati regionalno ciljanje. Zbog izazova vizualizacije in vivo, ponašanje takvih malih magnetskih čestica na površini dišnih putova u prisutnosti primijenjenog magnetskog polja slabo je shvaćeno. Cilj ove studije bio je koristiti sinkrotronsko snimanje za vizualizaciju in vivo kretanja niza magnetskih čestica u dušniku anesteziranih štakora kako bi se ispitala dinamika i obrasci ponašanja pojedinačnih i skupnih čestica in vivo. Zatim smo također procijenili hoće li dostava lentivirusnih magnetskih čestica u prisutnosti magnetskog polja povećati učinkovitost transdukcije u dušniku štakora. Sinkrotronsko rendgensko snimanje otkriva Ponašanje magnetskih čestica u stacionarnim i pokretnim magnetskim poljima in vitro i in vivo. Čestice se ne mogu lako povući po površini živih dišnih putova magnetima, ali tijekom transporta, naslage se koncentriraju u vidnom polju gdje je magnetsko polje najjače. Učinkovitost transdukcije također je povećana šest puta kada su lentivirusne magnetske čestice isporučene u prisutnosti magnetskog polja. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da lentivirusne magnetske čestice i magnetska polja mogu biti vrijedni pristupi za poboljšanje ciljanja genskih vektora i povećanje razine transdukcije u provodljivim dišnim putovima in vivo.
Cistična fibroza (CF) uzrokovana je varijacijom u jednom genu koji se naziva CF transmembranski regulator vodljivosti (CFTR). CFTR protein je ionski kanal koji je prisutan u mnogim epitelnim stanicama u cijelom tijelu, uključujući provodne dišne ​​putove, glavno mjesto patogeneze CF. CFTR defekti dovode do abnormalnog transporta vode, dehidracije površine dišnih putova i smanjenja dubine sloja tekućine na površini dišnih putova (ASL). To također narušava sposobnost mukocilijarnog transportnog sustava (MCT) da ukloni udahnute čestice i patogene iz dišnih putova. Naš je cilj razviti lentivirusnu (LV) gensku terapiju kako bi se isporučila ispravna kopija CFTR gena i poboljšalo zdravlje ASL-a, MCT-a i pluća te nastaviti razvijati nove tehnologije sposobne za mjerenje ovih parametara in vivo1.
LV vektori su jedan od vodećih kandidata za gensku terapiju CF dišnih putova, uglavnom zato što mogu trajno integrirati terapijski gen u bazalne stanice dišnih putova (matične stanice dišnih putova). To je važno jer mogu vratiti normalnu hidrataciju i čišćenje sluzi diferencijacijom u funkcionalne genski korigirane stanice površine dišnih putova povezane s CF-om, što rezultira doživotnim koristima. LV vektori trebaju biti usmjereni protiv provodnog dišnog puta, jer tu počinje CF bolest pluća. Isporuka vektora dublje u pluća može rezultirati alveolarnom transdukcijom, ali to nema terapijsku korist kod CF-a. Međutim, tekućine poput nosača gena prirodno migriraju u alveole nakon udisaja3,4, a terapijske čestice se brzo uklanjaju u usnu šupljinu pomoću MCT-a. Učinkovitost LV transdukcije izravno je povezana s duljinom vremena koje vektor ostaje pored ciljnih stanica kako bi se omogućio stanični unos – „vrijeme boravka“5 – koje se lako smanjuje tipičnim regionalnim protokom zraka, kao i koordiniranim hvatanjem čestica sluzi i MCT-om. Za CF je sposobnost produljenja vremena zadržavanja LV unutar dišnih putova važna za postizanje visoke razine transdukcije u ovoj regiji, ali do sada je bila izazovna.
Kako bi se prevladala ova prepreka, pretpostavljamo da magnetske čestice (MP) LV mogu pomoći na dva komplementarna načina. Prvo, mogu se magnetski voditi do površine dišnih putova kako bi se poboljšalo ciljanje i pomoglo česticama nosačima gena da se zadrže u željenom području dišnih putova; i (ASL) kako bi se premjestile u stanični sloj 6. MP se široko koriste kao ciljana sredstva za dostavu lijekova kada se vežu na antitijela, kemoterapijske lijekove ili druge male molekule koje se vežu na stanične membrane ili se vežu na relevantne receptore na površini stanica i akumuliraju na mjestima tumora u prisutnosti statičkog elektriciteta. Magnetska polja za liječenje raka 7. Druge „hipertermalne“ tehnike imaju za cilj zagrijavanje MP-ova kada su izloženi oscilirajućim magnetskim poljima, čime se uništavaju tumorske stanice. Princip magnetske transfekcije, u kojem se magnetsko polje koristi kao transfekcijsko sredstvo za poboljšanje prijenosa DNA u stanice, obično se koristi in vitro korištenjem niza nevirusnih i virusnih genskih vektora za stanične linije koje je teško transducirati. Učinkovitost LV magnetotransfekcije je utvrđena, s in vitro isporukom LV-MP-ova u staničnu liniju ljudskog bronhijalnog epitela u prisutnosti statičkog magnetskog polja, povećavajući učinkovitost transdukcije za 186 puta u usporedbi sa samim LV vektorom. LV-MP je također primijenjen na in vitro CF model, gdje je magnetska transfekcija povećala LV transdukciju u kulturama na granici zrak-tekućina za 20 puta u prisutnosti CF sputuma10. Međutim, in vivo magnetotransfekcija organa dobila je relativno malo pažnje i procijenjena je samo u nekoliko studija na životinjama11,12,13,14,15, posebno u pluća16,17. Ipak, mogućnosti magnetske transfekcije u terapiji pluća za cističnu fibrozu su jasne. Tan i sur. (2020.) izjavili su da će „studija dokaza koncepta učinkovite plućne isporuke magnetskih nanočestica utrti put budućim strategijama inhalacije CFTR-a za poboljšanje kliničkih ishoda kod pacijenata s cističnom fibrozom“6.
Ponašanje malih magnetskih čestica na površinama dišnih putova u prisutnosti primijenjenog magnetskog polja teško je vizualizirati i proučavati, te je stoga slabo razumljivo. U drugim studijama razvili smo metodu fazno-kontrastnog rendgenskog snimanja temeljenu na sinkrotronskom širenju (PB-PCXI) za neinvazivnu vizualizaciju i kvantificiranje malih in vivo promjena u dubini ASL-a18 i ponašanju MCT-a19,20 kako bismo izravno izmjerili hidrataciju površine plinskog kanala i koristili je kao rani pokazatelj učinkovitosti liječenja. Osim toga, naša metoda procjene MCT-a koristi čestice promjera 10–35 µm sastavljene od aluminijevog oksida ili stakla visokog indeksa loma kao MCT markere vidljive pomoću PB-PCXI21. Obje tehnike su prikladne za vizualizaciju niza vrsta čestica, uključujući MP.
Zbog visoke prostorne i vremenske rezolucije, naše tehnike analize ASL i MCT temeljene na PB-PCXI vrlo su prikladne za ispitivanje dinamike i obrazaca ponašanja pojedinačnih i skupnih čestica in vivo kako bi nam pomogle razumjeti i optimizirati tehnike isporuke MP gena. Pristup koji ovdje koristimo proizlazi iz naših studija korištenjem SPring-8 BL20B2 snopa, u kojem smo vizualizirali kretanje tekućine nakon isporuke lažne vektorske doze u nosne i plućne dišne ​​putove miševa kako bismo objasnili naše neujednačene obrasce ekspresije gena uočene u našim studijama na životinjama s dozama nosača gena 3,4.
Cilj ove studije bio je koristiti sinkrotronski PB-PCXI za vizualizaciju in vivo kretanja niza MP u dušniku živih štakora. Ove PB-PCXI slikovne studije osmišljene su za testiranje niza MP, jakosti magnetskog polja i lokacija kako bi se odredio njihov učinak na kretanje MP. Pretpostavili smo da bi vanjsko primijenjeno magnetsko polje pomoglo isporučenom MP da ostane ili se pomakne prema ciljanom području. Ove studije također su nam omogućile da identificiramo konfiguracije magneta koje maksimiziraju broj čestica zadržanih u dušniku nakon taloženja. U drugoj seriji studija nastojali smo koristiti ovu optimalnu konfiguraciju kako bismo demonstrirali obrazac transdukcije koji proizlazi iz in vivo isporuke LV-MP u dišne ​​​​putove štakora, na temelju pretpostavke da bi isporuka LV-MP u kontekstu ciljanja dišnih putova rezultirala poboljšanom učinkovitošću LV transdukcije.
Sve studije na životinjama provedene su prema protokolima koje je odobrilo Sveučilište u Adelaideu (M-2019-060 i M-2020-022) i Odbor za etiku sinhrotrona za životinje SPring-8. Eksperimenti su provedeni prema smjernicama ARRIVE-a.
Sva rendgenska snimanja provedena su na liniji snopa BL20XU na sinkrotronu SPring-8 u Japanu, korištenjem postavke slične onoj opisanoj prethodno21,22. Ukratko, eksperimentalna kutija nalazila se 245 m od prstena za pohranu sinkrotrona. Udaljenost uzorka i detektora od 0,6 m koristi se za studije snimanja čestica, a 0,3 m za in vivo studije snimanja kako bi se generirali efekti faznog kontrasta. Korištena je energija monokromatskog snopa od 25 keV. Slike su snimljene pomoću pretvarača rendgenskih zraka visoke rezolucije (SPring-8 BM3) spojenog na sCMOS detektor. Pretvarač pretvara rendgenske zrake u vidljivu svjetlost pomoću scintilatora (Gd3Al2Ga3O12) debljine 10 µm, koji se zatim usmjerava na sCMOS senzor pomoću mikroskopskog objektiva × 10 (NA 0,3). sCMOS detektor bio je Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) s veličinom niza od 2048 × 2048 piksela i sirova veličina piksela od 6,5 × 6,5 µm. Ova postavka daje efektivnu izotropnu veličinu piksela od 0,51 µm i vidno polje od približno 1,1 mm × 1,1 mm. Odabrana je duljina ekspozicije od 100 ms kako bi se maksimizirao omjer signala i šuma magnetskih čestica unutar i izvan dišnih putova, a istovremeno smanjili artefakti kretanja izazvani disanjem. Za in vivo studije, brzi rendgenski zatvarač postavljen je u putanju rendgenskih zraka kako bi se ograničila doza zračenja blokiranjem rendgenskog snopa između ekspozicija.
Nosač LV nije korišten ni u jednoj SPring-8 PB-PCXI studiji snimanja jer komora za snimanje BL20XU nije certificirana za biološku sigurnost razine 2. Umjesto toga, odabrali smo niz dobro karakteriziranih mikroplastika od dva komercijalna dobavljača - koji pokrivaju niz veličina, materijala, koncentracija željeza i primjena - prvo kako bismo razumjeli kako magnetska polja utječu na kretanje mikroplastike unutar staklenih kapilara, a zatim i u živim dišnim putovima. na površini. MP-ovi se kreću u veličini od 0,25 do 18 μm i izrađeni su od raznih materijala (vidi Tablicu 1), ali sastav svakog uzorka, uključujući veličinu magnetskih čestica unutar MP-a, nije poznat. Na temelju naših opsežnih MCT studija 19, 20, 21, 23, 24, očekujemo da se MP-ovi veličine i do 5 μm mogu vidjeti na površini trahealnih dišnih putova, na primjer oduzimanjem uzastopnih kadrova kako bi se vidjela poboljšana vidljivost gibanja MP-a. Pojedinačni MP veličine 0,25 μm manji je od rezolucije uređaja za snimanje, ali se očekuje da će PB-PCXI detektirati njihov volumenski kontrast i gibanje površinske tekućine na koju su naneseni nakon nanošenja.
Uzorci za svaki MP u Tablici 1 pripremljeni su u staklenim kapilarama od 20 μl (Drummond Microcaps, PA, SAD) s unutarnjim promjerom od 0,63 mm. Korpuskularne čestice dostupne su u vodi, dok su CombiMag čestice dostupne u proizvođačevoj vlasničkoj tekućini. Svaka epruveta je do pola napunjena tekućinom (približno 11 μl) i postavljena na držač uzorka (vidi Sliku 1). Staklene kapilare postavljene su vodoravno na postolje uzorka u kutiji za snimanje, a rubovi su im pozicionirani na rubovima tekućine. Magnet promjera 19 mm (duljine 28 mm) od nikla, neodimija, željeza, bora (NdFeB) (N35, kat. br. LM1652, Jaycar Electronics, Australija) s rezidualnom magnetizacijom od 1,17 Tesla pričvršćen je na zasebno postolje za translaciju kako bi se postigla daljinska promjena položaja tijekom snimanja. Snimanje rendgenskih slika započinje kada se magnet postavi približno 30 mm iznad uzorka, a slike se snimaju brzinom od 4 sličice u sekundi. Tijekom snimanja, magnet je približen... staklenu kapilarnu cijev (udaljenu oko 1 mm) i zatim translirano duž cijevi kako bi se procijenili učinci jakosti polja i položaja.
In vitro postavka za snimanje koja sadrži MP uzorke u staklenim kapilarama na postolju za xy translaciju uzorka. Put snopa X-zraka označen je crvenom isprekidanom linijom.
Nakon što je utvrđena in vitro vidljivost mikroplastike (MP), podskupina njih testirana je in vivo na ženkama albino Wistar štakora divljeg tipa (starosti ~12 tjedana, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolama (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) i 4 mg/kg butorfanola (Vetorphale®, Meiji Seika). Štakori su anestezirani mješavinom (Pharma), Japan) intraperitonealnom injekcijom. Nakon anestezije, pripremljeni su za snimanje uklanjanjem dlake oko dušnika, umetanjem endotrahealne cijevi (ET; 16 Ga iv kanila, Terumo BCT) i imobilizacijom u ležećem položaju na prilagođenoj ploči za snimanje koja sadrži termalnu vrećicu za održavanje tjelesne temperature 22. Ploča za snimanje zatim je pričvršćena na postolje za translaciju uzorka u kutiji za snimanje pod blagim kutom kako bi se dušnik vodoravno poravnao na rendgenskoj snimci, kao što je prikazano na slici. 2a.
(a) Postavka za in vivo snimanje u SPring-8 slikovnom uređaju, put rendgenskog snopa označen je crvenom isprekidanom linijom. (b, c) Lokalizacija magneta na dušniku izvršena je daljinski pomoću dvije ortogonalno postavljene IP kamere. Na lijevoj strani slike zaslona vidi se žičana petlja koja drži glavu i dovodna kanila na mjestu unutar ET cijevi.
Sustav pumpe za štrcaljke s daljinskim upravljanjem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) koji je koristio staklenu štrcaljku od 100 μl spojen je na PE10 cijev (vanjski promjer 0,61 mm, unutarnji promjer 0,28 mm) putem igle od 30 Ga. Označite cijev kako biste osigurali da je vrh u ispravnom položaju u dušniku prilikom umetanja ET cijevi. Pomoću mikropumpe, klip štrcaljke je izvučen dok je vrh cijevi bio uronjen u MP uzorak koji treba dati. Napunjena cijev za davanje zatim je umetnuta u endotrahealnu cijev, postavljajući vrh unutar najjačeg dijela našeg očekivanog primijenjenog magnetskog polja. Snimanje slike kontrolirano je pomoću detektora disanja spojenog na našu kutiju za mjerenje vremena temeljenu na Arduinu, a svi signali (npr. temperatura, disanje, otvaranje/zatvaranje zatvarača i snimanje slike) snimljeni su pomoću Powerlaba i LabCharta (AD Instruments, Sydney, Australija) 22. Prilikom snimanja Kada kućište nije bilo dostupno, dvije IP kamere (Panasonic BB-SC382) postavljene su pod kutom od približno 90° jedna prema drugoj i korištene su za praćenje položaja magneta u odnosu na... do dušnika tijekom snimanja (slika 2b,c). Kako bi se smanjili artefakti kretanja, snimljena je jedna slika po udahu tijekom platoa protoka na kraju plime i oseke.
Magnet je pričvršćen na drugi stupanj koji se može postaviti udaljeno izvan kućišta za snimanje. Testirani su različiti položaji i konfiguracije magneta, uključujući: Postavljen pod kutom od približno 30° iznad dušnika (konfiguracije prikazane na slikama 2a i 3a); jedan magnet iznad životinje, a drugi ispod, s polovima postavljenim na privlačenje (slika 3b); jedan magnet iznad životinje, a drugi ispod, s polovima postavljenim na odbijanje (slika 3c); i jedan magnet iznad i okomito na dušnik (slika 3d). Nakon što su životinja i magnet konfigurirani i MP koji se testira stavljen u pumpu štrcaljke, dajte dozu od 50 μl brzinom od 4 μl/s dok snimate slike. Magnet se zatim pomiče naprijed-natrag ili bočno preko dušnika dok se nastavlja snimati slike.
Konfiguracija magneta za in vivo snimanje (a) jedan magnet iznad dušnika pod kutom od približno 30°, (b) dva magneta postavljena na privlačenje, (c) dva magneta postavljena na odbijanje, (d) jedan magnet iznad i okomito u dušniku. Promatrač je gledao dolje od usta do pluća kroz dušnik, a snop X-zraka prolazio je kroz lijevu stranu štakora i izlazio na desnoj strani. Magnet se ili pomiče duž dišnog puta ili lijevo i desno iznad dušnika u smjeru snopa X-zraka.
Također smo nastojali utvrditi vidljivost i ponašanje čestica u dišnim putovima u odsutnosti ometajućeg disanja i srčanog ritma. Stoga su na kraju razdoblja snimanja životinje humano usmrćene zbog predoziranja pentobarbitalom (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, SAD; ~65 mg/kg ip). Neke su životinje ostavljene na platformi za snimanje, a nakon što su disanje i otkucaji srca prestali, postupak snimanja je ponovljen, dodajući dodatnu dozu MP-a ako MP nije bio vidljiv na površini dišnih putova.
Dobivene slike su korigirane u ravnom i tamnom polju, a zatim su sastavljene u film (20 sličica u sekundi; 15-25 × normalna brzina ovisno o frekvenciji disanja) korištenjem prilagođenog skripta napisanog u MATLAB-u (R2020a, The Mathworks).
Sve studije o primjeni LV genskog vektora provedene su u Istraživačkom centru za laboratorijske životinje Sveučilišta u Adelaideu s ciljem korištenja rezultata SPring-8 eksperimenta za procjenu može li primjena LV-MP u prisutnosti magnetskog polja poboljšati prijenos gena in vivo. Kako bi se procijenili učinci MP-a i magnetskog polja, tretirane su dvije skupine životinja: jednoj skupini dan je LV-MP s postavljenim magnetom, a drugoj skupini kontrolna je skupina primila LV-MP bez magneta.
LV genski vektori generirani su korištenjem prethodno opisanih metoda 25, 26. LacZ vektor eksprimira nuklearno lokalizirani gen beta-galaktozidaze vođen konstitutivnim MPSV promotorom (LV-LacZ), koji proizvodi plavi reakcijski produkt u transduciranim stanicama, vidljiv u frontama plućnog tkiva i presjecima tkiva. Titracija je provedena u staničnim kulturama ručnim brojanjem broja LacZ pozitivnih stanica hemocitometrom za izračun titra u TU/ml. Nosači su krioprezervirani na -80 °C, odmrznuti prije upotrebe i vezani na CombiMag miješanjem u omjeru 1:1 i inkubacijom na ledu najmanje 30 minuta prije isporuke.
Normalni štakori Sprague Dawley (n = 3/skupini, ~2-3) anestezirani su intraperitonealno smjesom od 0,4 mg/kg medetomidina (Domitor, Ilium, Australija) i 60 mg/kg ketamina (Ilium, Australija) u dobi od jednog mjeseca (ip) i nekirurškom oralnom kanilacijom s 16 Ga iv kanilom. Kako bi se osiguralo da tkivo trahealnih dišnih putova primi LV transdukciju, kondicionirano je korištenjem našeg prethodno opisanog protokola mehaničke perturbacije, u kojem je površina trahealnih dišnih putova aksijalno trljana žičanom košarom (N-Circle, Nitinol bezglavi ekstraktor kamenca NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, SAD) 30 s28. Trahealna primjena LV-MP zatim je provedena u biološki sigurnosnom ormaru otprilike 10 minuta nakon perturbacije.
Magnetsko polje korišteno u ovom eksperimentu konfigurirano je na sličan način kao i u studiji rendgenskog snimanja in vivo, s istim magnetima držanim iznad dušnika pomoću destilacijskih stent kopči (Slika 4). Volumen od 50 μl (2 × 25 μl alikvota) LV-MP-a ubrizgan je u dušnik (n = 3 životinje) pomoću pipete s gel vrhom kao što je prethodno opisano. Kontrolna skupina (n = 3 životinje) primila je iste LV-MP-ove bez upotrebe magneta. Nakon što je infuzija završena, kanila se uklanja iz ET cijevi i životinja se ekstubira. Magnet ostaje na mjestu 10 minuta, a zatim se uklanja. Štakori su primili potkožnu dozu meloksikama (1 ml/kg) (Ilium, Australija), nakon čega je uslijedila reverzibilna anestezija ip injekcijom 1 mg/kg atipamazol hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Australija). Štakori su držani na toplom i praćeni do potpunog oporavka od anestezije.
Uređaj za isporuku LV-MP u biološki sigurnosnom ormariću. Svijetlosivi Luer nastavak ET cijevi vidi se kako viri iz usta, a gel vrh pipete prikazan na slici umetnut je kroz ET cijev do željene dubine u dušnik.
Tjedan dana nakon postupka doziranja LV-MP, životinje su humano ubijene udisanjem 100% CO2, a ekspresija LacZ-a procijenjena je korištenjem našeg standardnog X-gal tretmana. Tri kaudalna najhrskavičnija prstena uklonjena su kako bi se osiguralo da bilo kakvo mehaničko oštećenje ili zadržavanje tekućine od postavljanja endotrahealne cijevi nije uključeno u analizu. Svaka traheja je uzdužno prerezana kako bi se stvorile dvije polovice za analizu, te su postavljene u posudu koja sadrži silikonsku gumu (Sylgard, Dow Inc) pomoću Minutien igle (Fine Science Tools) za vizualizaciju luminalne površine. Raspodjela i uzorak transduciranih stanica potvrđeni su frontalnom fotografijom pomoću Nikon mikroskopa (SMZ1500) s DigiLite kamerom i TCapture softverom (Tucsen Photonics, Kina). Slike su snimljene pri 20x povećanju (uključujući najvišu postavku za punu širinu traheje), pri čemu je cijela duljina traheje snimljena korak po korak, osiguravajući dovoljno preklapanje između svake slike kako bi se omogućilo "spajanje" slike. Slike iz svake traheje zatim su sastavljene u jednu. kompozitna slika pomoću programa Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) koji koristi algoritam planarnog gibanja. Područja ekspresije LacZ u kompozitnim slikama dušnika svake životinje kvantificirana su pomoću automatiziranog MATLAB skripta (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano, koristeći postavke od 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 i Value < 0,7. Praćenjem kontura tkiva, maska ​​je ručno generirana u GIMP v2.10.24 za svaku kompozitnu sliku kako bi se identificiralo područje tkiva i spriječile bilo kakve lažne detekcije izvan tkiva dušnika. Obojena područja sa svih kompozitnih slika svake životinje zbrajana su kako bi se generiralo ukupno obojeno područje za tu životinju. Obojeno područje zatim je podijeljeno s ukupnim područjem maske kako bi se generiralo normalizirano područje.
Svaka traheja je ugrađena u parafin i izrezani su rezovi od 5 μm. Rezovi su kontrastno obojeni neutralno brzom crvenom bojom tijekom 5 minuta, a slike su snimljene pomoću mikroskopa Nikon Eclipse E400, DS-Fi3 kamere i NIS softvera za snimanje elemenata (verzija 5.20.00).
Sve statističke analize provedene su u GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistička značajnost postavljena je na p ≤ 0,05. Normalnost je provjerena Shapiro-Wilkovim testom, a razlike u LacZ bojenju procijenjene su neparnim t-testom.
Šest MP opisanih u Tablici 1 ispitano je pomoću PCXI, a vidljivost je opisana u Tablici 2. Dva polistirenska MP (MP1 i MP2; 18 μm i 0,25 μm) nisu bila vidljiva pod PCXI, ali ostatak uzoraka bio je prepoznatljiv (primjeri su prikazani na Slici 5). MP3 i MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm i 0,9 μm) slabo su vidljivi. Iako sadrži neke od najmanjih testiranih čestica, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) bio je najizraženiji. CombiMag proizvod MP6 teško je uočiti. U svim slučajevima, naša sposobnost detekcije MP značajno je poboljšana pomicanjem magneta naprijed-natrag paralelno s kapilarom. Kada su se magneti udaljavali od kapilare, čestice su se protezale u dugim nizovima, ali kako su se magneti približavali i jakost magnetskog polja povećavala, nizovi čestica su se skraćivali kako su čestice migrirale prema gornjoj površini kapilare (vidi Dodatni video S1: MP4), povećavajući... Gustoća čestica površine. Suprotno tome, kada se magnet ukloni iz kapilare, jakost polja se smanjuje i mikročestice se preuređuju u duge niti koje se protežu od gornje površine kapilare (vidi Dodatni video S2:MP4). Nakon što se magnet prestane kretati, čestice se nastavljaju kretati kratko vrijeme nakon što dostignu ravnotežni položaj. Kako se mikročestica pomiče prema gornjoj površini kapilare i od nje, magnetske čestice obično vuku ostatke kroz tekućinu.
Vidljivost MP pod PCXI značajno varira između uzoraka. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6. Sve ovdje prikazane slike snimljene su magnetom smještenim otprilike 10 mm izravno iznad kapilare. Prividni veliki krugovi su mjehurići zraka zarobljeni u kapilarama, jasno pokazujući crno-bijele rubne značajke faznokontrastnog snimanja. Crveni okvir sadrži povećanje koje pojačava kontrast. Imajte na umu da promjeri shema magneta na svim slikama nisu u mjerilu i otprilike su 100 puta veći od prikazanog.
Kako se magnet pomiče lijevo i desno duž vrha kapilare, kut MP strune se mijenja kako bi se poravnao s magnetom (vidi sliku 6), čime se ocrtavaju linije magnetskog polja. Kod MP3-5, nakon što tetiva dosegne granični kut, čestice se povlače duž gornje površine kapilare. To često rezultira grupiranjem MP-ova u veće skupine blizu mjesta gdje je magnetsko polje najjače (vidi dodatni video S3:MP5). To je također posebno vidljivo prilikom snimanja blizu kraja kapilare, što uzrokuje agregaciju i koncentraciju MP-ova na granici tekućina-zrak. Čestice u MP6, koje je bilo teže razaznati nego u MP3-5, nisu bile povučene dok se magnet kretao duž kapilare, ali su se MP strune disocirale, ostavljajući čestice u vidnom polju (vidi dodatni video S4:MP6). U nekim slučajevima, kada je primijenjeno magnetsko polje smanjeno pomicanjem magneta na veliku udaljenost od mjesta snimanja, svi preostali MP-ovi polako su se spuštali na donju površinu cijevi gravitacijom, dok su ostali u struni (vidi dodatni video S5: MP3).
Kut MP niti mijenja se kako se magnet pomiče udesno iznad kapilare. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6. Crveni okvir sadrži uvećanje za pojačavanje kontrasta. Imajte na umu da su dodatni videozapisi informativni jer otkrivaju važne informacije o strukturi čestica i dinamici koje se ne mogu vizualizirati na ovim statičkim slikama.
Naši testovi su pokazali da sporo pomicanje magneta naprijed-natrag duž dušnika olakšava vizualizaciju MP-a u kontekstu složenog kretanja in vivo. In vivo testiranje nije provedeno jer polistirenske kuglice (MP1 i MP2) nisu bile vidljive u kapilari. Svaki od preostala četiri MP-a testiran je in vivo s dugom osi magneta konfiguriranom iznad dušnika pod kutom od oko 30° prema vertikali (vidi slike 2b i 3a), jer je to rezultiralo duljim MP lancima i bilo je učinkovitije od konfiguracije s prekinutim magnetom. MP3, MP4 i MP6 nisu otkriveni u dušniku nijedne žive životinje. Kada su dišni putovi štakora snimljeni nakon što su životinje humano usmrćene, čestice su ostale nevidljive čak i kada je dodan dodatni volumen pomoću štrcaljke. MP5 je imao najveći sadržaj željezovog oksida i bio je jedina vidljiva čestica te je stoga korišten za procjenu i karakterizaciju in vivo ponašanja MP-a.
Postavljanje magneta preko dušnika tijekom isporuke MP-a rezultiralo je koncentracijom mnogih, ali ne svih, MP-ova u vidnom polju. Čestice koje ulaze u dušnik najbolje se opažaju kod humano žrtvovanih životinja. Slika 7 i dodatni video S6: MP5 pokazuje brzo magnetsko hvatanje i poravnanje čestica na površini ventralne dušnika, što ukazuje na to da se MP-ovi mogu usmjeriti u željena područja dušnika. Prilikom pretraživanja distalnije duž dušnika nakon isporuke MP-a, neki MP-ovi pronađeni su bliže karini, što sugerira da jakost magnetskog polja nije bila dovoljna za prikupljanje i zadržavanje svih MP-ova, budući da su isporučeni kroz područje maksimalne jakosti magnetskog polja tijekom procesa s tekućinom. Ipak, postpartalne koncentracije MP-a bile su veće oko snimljenog područja, što sugerira da su mnogi MP-ovi ostali u područjima dišnih putova gdje je primijenjena jakost magnetskog polja bila najveća.
Slike iz (a) prije i (b) nakon uvođenja MP5 u dušnik nedavno eutanaziranog štakora s magnetom postavljenim neposredno iznad područja snimanja. Snimljeno područje nalazi se između dva hrskavična prstena. Prije uvođenja MP-a, u dišnim putovima nalazi se nešto tekućine. Crveni okvir sadrži uvećanje za pojačavanje kontrasta. Ove slike su iz videa prikazanog u Dodatnom videu S6:MP5.
Pomicanje magneta duž dušnika in vivo uzrokovalo je promjenu kuta MP lanca unutar površine dišnih putova na način sličan onome koji se vidi u kapilarama (vidi sliku 8 i dodatni video S7:MP5). Međutim, u našoj studiji, MP-ovi se nisu mogli povući duž površine živih dišnih putova kao što su to mogli s kapilarama. U nekim slučajevima, MP lanac će se produžiti kako se magnet pomiče lijevo i desno. Zanimljivo je da smo također otkrili da niz čestica mijenja dubinu površinskog sloja tekućine kada se magnet pomiče uzdužno duž dušnika, a širi se kada se magnet pomiče izravno iznad glave, a niz čestica se rotira u vertikalni položaj (vidi dodatni video S7). : MP5 u 0:09, dolje desno). Karakteristični obrazac gibanja promijenio se kada se magnet pomicao preko vrha dušnika lateralno (tj. lijevo ili desno od životinje, a ne duž duljine dušnika). Čestice su i dalje bile jasno vidljive dok su se kretale, ali kada je magnet uklonjen iz dušnika, vrhovi nizova čestica postali su vidljivi (vidi Dodatni video S8:MP5, počevši od 0:08). To je u skladu s ponašanjem MP-a koje smo primijetili pod primijenjenim magnetskim poljem u staklenoj kapilari.
Primjeri slika koje prikazuju MP5 u dušniku živog anesteziranog štakora. (a) Magnet se koristi za snimanje slika iznad i lijevo od dušnika, zatim (b) nakon što se magnet pomakne udesno. Crveni okvir sadrži uvećanje za pojačavanje kontrasta. Ove slike su iz videa prikazanog u Dodatnom videu S7:MP5.
Kada su dva pola bila konfigurirana u orijentaciji sjever-jug iznad i ispod traheje (tj. privlačeći se; slika 3b), MP akordi su izgledali dulje i nalazili su se na bočnoj stijenci traheje, a ne na dorzalnoj površini traheje (vidi Dodatni video S9:MP5). Međutim, visoke koncentracije čestica na jednom mjestu (tj. dorzalnoj površini traheje) nisu otkrivene nakon isporuke tekućine kada je korišten uređaj s dva magneta, što se obično događa kada se koristi uređaj s jednim magnetom. Zatim, kada je jedan magnet konfiguriran da odbija obrnuto okrenute polove (slika 3c), broj čestica vidljivih u vidnom polju nije se činio povećanim nakon isporuke. Postavljanje obje konfiguracije s dva magneta je izazovno zbog visokih jakosti magnetskog polja koje vuku odnosno guraju magnete. Postavljanje je zatim promijenjeno na jedan magnet paralelan dišnim putem, ali prolazi kroz dišni put pod kutom od 90 stupnjeva tako da linije polja ortogonalno prelaze stijenku traheje (slika 3d), orijentacija osmišljena kako bi se utvrdilo može li se uočiti agregacija čestica na bočnoj stijenci. Međutim, u ovoj konfiguraciji, Nije bilo vidljivog kretanja akumulacije MP ili kretanja magneta. Na temelju svih ovih rezultata, za in vivo studije nosača gena odabrana je konfiguracija s jednim magnetom i orijentacijom od 30 stupnjeva (slika 3a).
Kada je životinja više puta snimana neposredno nakon humanog usmrćivanja, odsutnost zbunjujućeg kretanja tkiva značila je da su se u jasnom interhondralnom polju mogle razaznati finije i kraće linije čestica, „klimave“ u skladu s translacijskim kretanjem magneta. Ipak, još uvijek se ne može jasno vidjeti prisutnost i kretanje MP6 čestica.
Titar LV-LacZ bio je 1,8 × 10⁻ TU/ml, a nakon miješanja u omjeru 1:1 s CombiMag MP (MP6), životinje su primile 50 μl trahealne doze od 9 × 10⁻ TU/ml LV nosača (tj. 4,5 × 10⁻ TU/štakor). U tim smo studijama, umjesto pomicanja magneta tijekom poroda, fiksirali magnet u jednom položaju kako bismo utvrdili može li se LV transdukcija (a) poboljšati u usporedbi s vektorskom dostavom u odsutnosti magnetskog polja i (b) može li se fokusirati. Stanice dišnih putova transduciraju se u magnetska ciljna područja gornjih dišnih putova.
Prisutnost magneta i korištenje CombiMaga u kombinaciji s LV vektorima nisu imali štetne učinke na zdravlje životinja, kao ni naš standardni protokol isporuke LV vektora. Frontalne slike trahealne regije podvrgnute mehaničkim perturbacijama (Dopunska slika 1) pokazale su da su postojale značajno više razine transdukcije u skupini životinja tretiranih LV-MP kada je magnet bio prisutan (Slika 9a). U kontrolnoj skupini bila je prisutna samo mala količina plavog LacZ bojenja (Slika 9b). Kvantifikacija normaliziranih područja obojenih X-Gal pokazala je da je primjena LV-MP u prisutnosti magnetskog polja proizvela približno 6 puta veće poboljšanje (Slika 9c).
Primjer kompozitnih slika koje prikazuju trahealnu transdukciju pomoću LV-MP (a) u prisutnosti magnetskog polja i (b) u odsutnosti magneta. (c) Statistički značajno poboljšanje normaliziranog područja LacZ transdukcije unutar traheje pri korištenju magneta (*p = 0,029, t-test, n = 3 po skupini, srednja vrijednost ± SEM).
Neutralno brzo crveno obojeni rezovi (primjer prikazan na Dodatnoj slici 2) pokazali su stanice obojene LacZ-om prisutne u sličnom uzorku i na sličnom mjestu kao što je prethodno opisano.
Ključni izazov za gensku terapiju dišnih putova ostaje točna lokalizacija čestica nosača u područja interesa i postizanje visoke razine učinkovitosti transdukcije u pokretnom pluću u prisutnosti protoka zraka i aktivnog uklanjanja sluzi. Za LV nosače dizajnirane za liječenje cistične fibroze dišnih putova, povećanje vremena zadržavanja čestica nosača unutar provodljivih dišnih putova do sada je bio nedostižan cilj. Kao što su istaknuli Castellani i sur., korištenje magnetskih polja za poboljšanje transdukcije ima prednosti u usporedbi s drugim metodama isporuke gena poput elektroporacije, jer može kombinirati jednostavnost, isplativost, lokalizaciju isporuke, povećanu učinkovitost i kraća vremena inkubacije, a moguće i manju dozu nosača10. Međutim, in vivo taloženje i ponašanje magnetskih čestica u dišnim putovima pod utjecajem vanjskih magnetskih sila nikada nije opisano, niti je zapravo dokazana izvedivost ove metode in vivo za povećanje razine ekspresije gena u intaktnim živim dišnim putovima.
Naši in vitro sinkrotronski PCXI eksperimenti pokazali su da su sve čestice koje smo testirali, s izuzetkom polistirenskog MP-a, bile vidljive u postavci snimanja koju smo koristili. U prisutnosti magnetskog polja, MP-ovi tvore strune čije su duljine povezane s vrstom čestice i jakošću magnetskog polja (tj. blizinom i gibanjem magneta). Kao što je prikazano na slici 10, strune koje promatramo nastaju zbog magnetizacije svake pojedinačne čestice i induciranja vlastitog lokalnog magnetskog polja. Ova odvojena polja uzrokuju agregaciju i povezivanje drugih sličnih čestica, s grupnim gibanjima sličnim strunama zbog lokalnih sila od lokalnih privlačnih i odbojnih sila drugih čestica.
Shematski prikaz (a, b) nizova čestica generiranih unutar kapilara ispunjenih tekućinom i (c, d) dušnika ispunjenog zrakom. Imajte na umu da kapilare i dušnik nisu nacrtani u mjerilu. Ploča (a) također sadrži opis MP-a, koji sadrži čestice Fe3O4 raspoređene u nizove.
Kada se magnet pomaknuo iznad kapilare, kut niza čestica dosegao je kritični prag za MP3-5 koji sadrži Fe3O4, nakon čega niz čestica više nije ostao u izvornom položaju, već se pomicao duž površine u novi položaj. magnet. Ovaj se učinak vjerojatno događa jer je površina staklene kapilare dovoljno glatka da omogući ovo kretanje. Zanimljivo je da se MP6 (CombiMag) nije ponašao na ovaj način, moguće zato što su čestice bile manje, imale su različite premaze ili površinske naboje ili je vlasnička tekućina nosač utjecala na njihovu sposobnost kretanja. Kontrast slike CombiMag čestica također je slabiji, što sugerira da tekućina i čestice mogu imati slične gustoće i stoga se ne kreću lako jedna prema drugoj. Čestice se također mogu zaglaviti ako se magnet kreće prebrzo, što ukazuje na to da jakost magnetskog polja ne može uvijek prevladati trenje između čestica u tekućini, što sugerira da možda nije iznenađujuće da su jakost magnetskog polja i udaljenost između magneta i ciljanog područja vrlo važne. Uzeti zajedno, ovi rezultati također sugeriraju da, iako magneti mogu uhvatiti mnoge MP-ove koji teku kroz ciljano područje, malo je vjerojatno da se na magnete može osloniti za kretanje. CombiMag čestice duž površine dušnika. Stoga zaključujemo da bi in vivo LV-MP studije trebale koristiti statička magnetska polja za fizičko ciljanje specifičnih područja dišnih putova.
Kada se čestice unesu u tijelo, teško ih je identificirati u kontekstu složenog tjelesnog tkiva u pokretu, ali sposobnost njihovog otkrivanja poboljšana je horizontalnim pomicanjem magneta iznad dušnika kako bi se "pomicale" niti mikroplastike (MP). Iako je snimanje uživo moguće, lakše je uočiti kretanje čestica nakon što je životinja humano ubijena. Koncentracije MP-a općenito su bile najviše na ovom mjestu kada je magnet bio postavljen iznad područja snimanja, iako su se neke čestice obično nalazile dalje duž dušnika. Za razliku od in vitro studija, čestice se ne mogu povući duž dušnika pomicanjem magneta. Ovaj nalaz je u skladu s načinom na koji sluz koja prekriva površinu dušnika obično obrađuje udahnute čestice, hvatajući ih u sluzi i potom uklanjajući mehanizmom mukocilijarnog čišćenja.
Pretpostavili smo da bi korištenje magneta za privlačenje iznad i ispod dušnika (slika 3b) moglo rezultirati ujednačenijim magnetskim poljem, umjesto magnetskog polja koje je visoko koncentrirano u jednoj točki, što potencijalno dovodi do ujednačenije raspodjele čestica. Međutim, naša preliminarna studija nije pronašla jasne dokaze koji bi podržali ovu hipotezu. Slično tome, konfiguriranje para magneta za odbijanje (slika 3c) nije rezultiralo većim taloženjem čestica u snimljenom području. Ova dva nalaza pokazuju da postavka s dva magneta ne poboljšava značajno lokalnu kontrolu ciljanja MP-a i da je rezultirajuće jake magnetske sile teško konfigurirati, što ovaj pristup čini manje praktičnim. Slično tome, usmjeravanje magneta iznad i kroz dušnik (slika 3d) također nije povećalo broj čestica zadržanih u snimljenom području. Neke od ovih alternativnih konfiguracija možda neće biti uspješne jer rezultiraju nižim jakostima magnetskog polja unutar područja taloženja. Stoga se konfiguracija s jednim magnetom pod kutom od 30 stupnjeva (slika 3a) smatra najlakšom i najučinkovitijom metodom za in vivo testiranje.
Studija LV-MP pokazala je da kada su LV vektori kombinirani s CombiMagom i isporučeni nakon fizičke perturbacije u prisutnosti magnetskog polja, razine transdukcije su značajno povećane u dušniku u usporedbi s kontrolama. Na temelju studija sinkrotronskog snimanja i rezultata LacZ-a, magnetsko polje je očito bilo u stanju sačuvati LV unutar dušnika i smanjiti broj vektorskih čestica koje su odmah prodrle duboko u pluća. Takva poboljšanja ciljanja mogu dovesti do veće učinkovitosti uz smanjenje isporučenih titara, transdukcije izvan cilja, upalnih i imunoloških nuspojava te troškova nositelja gena. Važno je da se, prema proizvođaču, CombiMag može koristiti zajedno s drugim metodama prijenosa gena, uključujući druge virusne vektore (kao što je AAV) i nukleinske kiseline.