Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta para sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ipakita ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Ang mga gene vector para sa pagtambal sa cystic fibrosis lung disease kinahanglan nga mo-target sa conducting airways tungod kay ang peripheral lung transduction wala maghatag og therapeutic benefit. Ang viral transduction efficiency direktang may kalabutan sa vector residence time. Bisan pa, ang mga delivery fluid sama sa gene carriers natural nga mo-diffuse sa alveoli atol sa inspiration, ug ang therapeutic particles sa bisan unsang porma dali nga malimpyohan pinaagi sa mucociliary transport. Ang pagpalugway sa residence time sa mga gene carriers sa airways importante apan lisod makab-ot. Ang gene carrier-conjugated magnetic particles nga mahimong idirekta sa surface sa airways makapauswag sa regional targeting. Tungod sa mga hagit sa in vivo visualization, ang kinaiya sa ingon ka gagmay nga magnetic particles sa airway surface sa presensya sa usa ka applied magnetic field dili kaayo masabtan. Ang tumong niini nga pagtuon mao ang paggamit sa synchrotron imaging aron ma-visualize ang in vivo motion sa usa ka serye sa magnetic particles sa trachea sa mga anesthetized nga ilaga aron susihon ang dynamics ug patterns sa indibidwal ug bulk particle behavior in vivo. Gisusi usab namo kung ang paghatud sa lentiviral magnetic particles sa presensya sa usa ka magnetic field makadugang ba sa transduction efficiency sa rat trachea. Synchrotron X-ray Ang imaging nagpadayag sa kinaiya sa mga magnetic particle sa wala naglihok ug naglihok nga mga magnetic field in vitro ug in vivo. Ang mga particle dili dali nga madala sa ibabaw sa buhing agianan sa hangin gamit ang mga magnet, apan atol sa transportasyon, ang mga deposito gikonsentrar sa natad sa panan-aw diin ang magnetic field labing kusog. Ang kahusayan sa transduction nadugangan usab og unom ka pilo sa dihang ang mga lentiviral magnetic particle gihatud sa presensya sa usa ka magnetic field. Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang mga lentiviral magnetic particle ug magnetic field mahimong bililhon nga mga pamaagi aron mapauswag ang pag-target sa gene vector ug madugangan ang lebel sa transduction sa pag-conduct sa mga agianan sa hangin in vivo.
Ang cystic fibrosis (CF) gipahinabo sa pagkalainlain sa usa ka gene nga gitawag og CF transmembrane conductance regulator (CFTR). Ang protina sa CFTR usa ka ion channel nga anaa sa daghang epithelial cells sa tibuok lawas, lakip na ang conducting airways, usa ka mayor nga lugar sa pathogenesis sa CF. Ang mga depekto sa CFTR mosangpot sa abnormal nga transportasyon sa tubig, nga makapauga sa nawong sa agianan sa hangin ug makapakunhod sa giladmon sa airway surface liquid (ASL) layer. Kini makadaot usab sa abilidad sa mucociliary transport (MCT) system sa paghawan sa mga partikulo nga giginhawa ug mga pathogen gikan sa mga agianan sa hangin. Ang among tumong mao ang pagpalambo sa usa ka lentiviral (LV) gene therapy aron mahatag ang husto nga kopya sa CFTR gene ug mapaayo ang ASL, MCT, ug kahimsog sa baga, ug ipadayon ang pagpalambo sa mga bag-ong teknolohiya nga makahimo sa pagsukod niini nga mga parameter in vivo1.
Ang mga LV vector usa sa mga nag-unang kandidato para sa CF airway gene therapy, tungod kay permanente nilang ma-integrate ang therapeutic gene ngadto sa airway basal cells (airway stem cells). Importante kini tungod kay mabalik nila ang normal nga hydration ug mucus clearance pinaagi sa pag-differentiate ngadto sa functional gene-corrected CF-associated airway surface cells, nga moresulta sa tibuok kinabuhi nga mga benepisyo. Ang mga LV vector kinahanglan nga idirekta batok sa conducting airway, tungod kay dinhi magsugod ang sakit sa baga sa CF. Ang paghatud sa vector nga mas lawom sa baga mahimong moresulta sa alveolar transduction, apan kini walay therapeutic benefit sa CF. Bisan pa, ang mga pluwido sama sa mga gene carrier natural nga mobalhin ngadto sa alveoli sa pagginhawa human sa pagpanganak3,4 ug ang mga therapeutic particle dali nga malimpyohan ngadto sa oral cavity pinaagi sa MCT. Ang LV transduction efficiency direktang may kalabutan sa gidugayon sa panahon nga ang vector magpabilin tupad sa mga target cell aron tugotan ang cellular uptake - ang "residence time"5 - nga dali nga mapakunhod pinaagi sa tipikal nga regional airflow ingon man ang coordinated particle mucus capture ug MCT. Para sa CF, ang abilidad sa pagpalugway sa residence time sa LV sulod sa airway importante aron makab-ot ang taas nga lebel sa transduction niini nga rehiyon, apan hangtod karon mahagiton.
Aron malampasan kini nga babag, among gisugyot nga ang mga LV magnetic particle (MP) makatabang sa duha ka komplementaryong paagi. Una, mahimo kini nga magiyahan sa magnet ngadto sa ibabaw sa agianan sa hangin aron mapaayo ang pag-target ug matabangan ang mga partikulo sa gene carrier nga magpabilin sa gitinguha nga rehiyon sa agianan sa hangin; ug ASL) nga mobalhin ngadto sa cell layer 6. Ang mga MP kaylap nga gigamit isip mga target nga sakyanan sa paghatud sa tambal kung kini motapot sa mga antibodies, chemotherapeutic nga tambal, o uban pang gagmay nga mga molekula nga motapot sa mga lamad sa selula o motapot sa mga may kalabutan nga receptor sa ibabaw sa selula ug magtapok sa mga lugar sa tumor sa presensya sa static nga kuryente. Mga Magnetic Field para sa Pagtambal sa Kanser 7. Ang ubang mga teknik nga "hyperthermal" nagtumong sa pagpainit sa mga MP kung kini maladlad sa nag-oscillate nga mga magnetic field, sa ingon makaguba sa mga selula sa tumor. Ang prinsipyo sa magnetic transfection, diin ang usa ka magnetic field gigamit isip usa ka ahente sa transfection aron mapalambo ang pagbalhin sa DNA ngadto sa mga selula, kasagarang gigamit in vitro gamit ang lain-laing mga non-viral ug viral gene vectors para sa mga lisod i-transduce nga mga linya sa cell. Ang kaepektibo sa LV magnetotransfection natukod na, uban ang in vitro nga paghatud sa LV-MPs ngadto sa usa ka linya sa epithelial cell sa bronchial sa tawo sa presensya sa usa ka static nga magnetic field, nga nagdugang sa transduction efficiency sa 186 ka pilo kon itandi sa LV vector lamang. Ang LV-MP gigamit usab sa usa ka in vitro CF model, diin ang magnetic transfection nagdugang sa LV transduction sa mga kultura sa air-liquid interface sa 20 ka pilo sa presensya sa CF sputum10. Bisan pa, ang in vivo magnetotransfection sa mga organo nakadawat og gamay nga atensyon ug gisusi lamang sa pipila ka mga pagtuon sa hayop11,12,13,14,15, labi na sa baga16,17. Bisan pa niana, klaro ang mga oportunidad alang sa magnetic transfection sa CF lung therapy. Si Tan et al.(2020) nag-ingon nga "ang usa ka proof-of-concept nga pagtuon sa episyente nga magnetic nanoparticle pulmonary delivery magbukas sa dalan alang sa umaabot nga mga estratehiya sa CFTR inhalation aron mapaayo ang mga klinikal nga resulta sa mga pasyente sa CF"6.
Ang kinaiya sa gagmay nga mga magnetic particle sa mga airway surfaces sa presensya sa usa ka applied magnetic field lisod mahanduraw ug matun-an, ug busa dili kaayo masabtan. Sa ubang mga pagtuon, nakahimo kami og synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) nga pamaagi aron dili invasive nga mahanduraw ug masukod ang minuto nga in vivo nga mga pagbag-o sa ASL depth18 ug MCT behavior19,20 aron direktang masukod ang gas Canal surface hydration ug gigamit isip sayo nga timailhan sa kaepektibo sa pagtambal. Dugang pa, ang among MCT evaluation method naggamit og 10–35 µm diameter nga mga particle nga gilangkoban sa alumina o high refractive index glass isip MCT markers nga makita gamit ang PB-PCXI21. Ang duha ka teknik angay alang sa visualization sa lain-laing mga tipo sa particle, lakip ang MP.
Tungod sa taas nga spatial ug temporal resolution niini, ang among PB-PCXI-based ASL ug MCT analysis techniques angayan kaayo alang sa pagsusi sa dynamics ug patterns sa single ug bulk particle behavior in vivo aron matabangan kami nga masabtan ug ma-optimize ang MP gene delivery techniques. Ang pamaagi nga among gigamit dinhi naggikan sa among mga pagtuon gamit ang SPring-8 BL20B2 beamline, diin among gi-visualize ang fluid movement human sa sham vector dose delivery ngadto sa nasal ug pulmonary airways sa mga ilaga aron matabangan nga ipasabut ang among Non-uniform gene expression patterns nga naobserbahan sa among gene carrier dose animal studies 3,4.
Ang tumong niini nga pagtuon mao ang paggamit sa synchrotron PB-PCXI aron ma-visualize ang in vivo nga mga paglihok sa usa ka serye sa mga MP sa trachea sa mga buhing ilaga. Kini nga mga PB-PCXI imaging studies gidisenyo aron sulayan ang lain-laing mga MP, kusog sa magnetic field, ug mga lokasyon aron mahibal-an ang ilang epekto sa paglihok sa MP. Among gi-hypothesize nga ang usa ka externally applied magnetic field makatabang sa gihatud nga MP nga magpabilin o mobalhin sa target area. Kini nga mga pagtuon nagtugot usab kanamo sa pag-ila sa mga magnet configuration nga makapadako sa gidaghanon sa mga partikulo nga nahabilin sa trachea pagkahuman sa deposition. Sa ikaduhang serye sa mga pagtuon, among gitinguha nga gamiton kini nga optimal configuration aron ipakita ang transduction pattern nga resulta sa in vivo nga paghatud sa LV-MPs ngadto sa airway sa ilaga, base sa pangagpas nga ang paghatud sa LV-MPs sa konteksto sa airway targeting moresulta sa gipauswag nga LV transduction efficiency.
Ang tanang pagtuon sa hayop gihimo sumala sa mga protocol nga giaprobahan sa University of Adelaide (M-2019-060 ug M-2020-022) ug sa SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Ang mga eksperimento gihimo sumala sa mga giya sa ARRIVE.
Ang tanang X-ray imaging gihimo sa BL20XU beamline sa SPring-8 synchrotron sa Japan, gamit ang setup nga susama sa gihulagway kaniadto21,22. Sa laktod nga pagkasulti, ang experimental box nahimutang 245 m gikan sa synchrotron storage ring. Usa ka sample-to-detector distance nga 0.6 m ang gigamit para sa particle imaging studies ug 0.3 m para sa in vivo imaging studies aron makamugna og phase contrast effects. Usa ka monochromatic beam energy nga 25 keV ang gigamit. Ang mga imahe nakuha gamit ang high-resolution X-ray converter (SPring-8 BM3) nga konektado sa sCMOS detector. Ang converter nag-convert sa X-rays ngadto sa visible light gamit ang 10 µm thick scintillator (Gd3Al2Ga3O12), nga dayon gi-direct sa sCMOS sensor gamit ang × 10 microscope objective (NA 0.3). Ang sCMOS detector mao ang Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) nga adunay array size nga 2048 × 2048 ka pixel ug usa ka hilaw nga gidak-on sa pixel nga 6.5 × 6.5 µm. Kini nga setup naghatag og epektibo nga isotropic pixel nga gidak-on nga 0.51 µm ug usa ka field of view nga gibana-bana nga 1.1 mm × 1.1 mm. Usa ka exposure length nga 100 ms ang gipili aron mapadako ang signal-to-noise ratio sa mga magnetic particle sa sulod ug gawas sa agianan sa hangin samtang gipakunhod ang mga motion artifact nga gipahinabo sa pagginhawa. Alang sa mga in vivo nga pagtuon, usa ka paspas nga X-ray shutter ang gibutang sa X-ray path aron limitahan ang radiation dose pinaagi sa pag-block sa X-ray beam taliwala sa mga exposure.
Ang LV carrier wala gigamit sa bisan unsang SPring-8 PB-PCXI imaging studies tungod kay ang BL20XU imaging chamber wala’y sertipikasyon sa Biosafety Level 2. Hinuon, mipili kami og lain-laing mga MP nga nailhan pag-ayo gikan sa duha ka komersyal nga supplier—nga naglangkob sa lain-laing mga gidak-on, materyales, konsentrasyon sa iron, ug aplikasyon—una aron masabtan kung giunsa makaapekto ang magnetic fields sa paglihok sa MP sulod sa mga glass capillaries, ug dayon sa mga buhing agianan sa hangin. sa ibabaw. Ang mga MP adunay gidak-on gikan sa 0.25 hangtod 18 μm ug gihimo gikan sa lainlaing mga materyales (tan-awa ang Talaan 1), apan ang komposisyon sa matag sample, lakip ang gidak-on sa mga magnetic particle sulod sa MP, wala mahibal-i. Base sa among halapad nga mga pagtuon sa MCT 19, 20, 21, 23, 24, among gilauman nga ang mga MP nga gamay sama sa 5 μm makita sa ibabaw sa tracheal airway, pananglitan pinaagi sa pag-iban sa sunod-sunod nga mga frame aron makita ang gipauswag nga pagkakita sa paglihok sa MP. Ang usa ka MP nga gidak-on nga 0.25 μm mas gamay kaysa sa resolusyon sa imaging device, apan ang PB-PCXI gilauman nga makamatikod sa ilang volume contrast ug sa paglihok sa surface fluid diin kini gideposito pagkahuman sa deposition.
Ang mga sample para sa matag MP sa Table 1 giandam sa 20 μl nga glass capillaries (Drummond Microcaps, PA, USA) nga adunay inner diameter nga 0.63 mm. Ang mga corpuscular particle anaa sa tubig, samtang ang mga CombiMag particle anaa sa proprietary fluid sa tiggama. Ang matag tubo napuno sa katunga sa likido (gibana-bana nga 11 μl) ug gibutang sa sample holder (tan-awa ang Figure 1). Ang mga glass capillary gibutang nga pinahigda sa sample stage sa imaging box, matag usa, ug gibutang ang mga ngilit sa fluid. Usa ka 19 mm nga diametro (28 mm ang gitas-on) nga nickel shell rare earth neodymium iron boron (NdFeB) magnet (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) nga adunay residual magnetization nga 1.17 Tesla ang gilakip sa usa ka lahi nga translation stage aron makab-ot ang Pag-usab sa posisyon niini sa layo atol sa imaging. Ang pagkuha sa X-ray image magsugod kung ang magnet naa sa posisyon nga gibana-bana nga 30 mm ibabaw sa sample, ug ang mga imahe makuha sa rate nga 4 ka frame matag segundo. Atol sa imaging, ang magnet gidala duol sa glass capillary tube. (mga 1 mm ang gilay-on) ug dayon gihubad subay sa tubo aron masusi ang mga epekto sa kusog ug posisyon sa natad.
In vitro imaging setup nga adunay mga MP sample sa mga glass capillary sa sample xy translation stage. Ang agianan sa X-ray beam gimarkahan og pula nga linya nga putol-putol.
Sa dihang natukod na ang in vitro visibility sa mga MP, usa ka subset niini ang gisulayan in vivo sa wild-type nga babaye nga albino nga Wistar nga mga ilaga (~12 ka semana ang edad, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) ug 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Ang mga ilaga gi-anesthesia gamit ang sagol nga Pharma), Japan) pinaagi sa intraperitoneal injection. Human sa anesthesia, giandam sila alang sa imaging pinaagi sa pagtangtang sa balhibo sa palibot sa trachea, pagsal-ot sa endotracheal tube (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) ug pag-immobilize kanila nga naghigda sa usa ka custom-made imaging plate nga adunay thermal bag aron mapadayon ang temperatura sa lawas 22. Ang imaging plate gilakip dayon sa sample translation stage sa imaging box sa gamay nga anggulo aron i-align ang trachea nga pinahigda sa X-ray image, sama sa gipakita sa Hulagway 2a.
(a) In vivo imaging setup sa SPring-8 imaging box, ang agianan sa X-ray beam gimarkahan og pula nga linya nga putol-putol.(b,c) Ang magnet localization sa trachea gihimo sa layo gamit ang duha ka orthogonally mounted IP camera. Sa wala nga bahin sa imahe sa screen, makita ang wire loop nga nagkupot sa ulo, ug ang delivery cannula naa sa lugar sulod sa ET tube.
Usa ka remote-controlled syringe pump system (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gamit ang 100 μl nga bildo nga syringe ang gikonektar sa PE10 tubing (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) pinaagi sa 30 Ga nga dagom. Markahi ang tubo aron masiguro nga ang tumoy naa sa saktong posisyon sa trachea kung isulod ang ET tube. Gamit ang micropump, ang syringe plunger gikuha samtang ang tumoy sa tubo gilubog sa MP sample nga ihatud. Ang gikarga nga delivery tube gisulod dayon sa endotracheal tube, gibutang ang tumoy sulod sa pinakakusog nga bahin sa among gilauman nga gigamit nga magnetic field. Ang pagkuha sa imahe gikontrol gamit ang respiration detector nga konektado sa among Arduino based timing box, ug ang tanan nga mga signal (pananglitan temperatura, respiration, pag-abli/pagsira sa shutter ug pagkuha sa imahe) girekord gamit ang Powerlab ug LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Kung mag-imaging Kung ang enclosure dili ma-access, duha ka IP camera (Panasonic BB-SC382) ang gibutang sa gibana-bana nga 90° sa usag usa ug gigamit aron mabantayan ang posisyon. sa magnet relatibo sa trachea atol sa pag-imaging (Fig. 2b,c). Aron maminusan ang mga artifact sa paglihok, usa ka imahe ang nakuha matag gininhawa atol sa end-tidal flow plateau.
Usa ka magnet ang gilakip sa ikaduhang yugto nga mahimong ibutang sa layo gikan sa gawas sa imaging housing. Gisulayan ang lain-laing mga posisyon ug mga configuration sa magnet, lakip ang: Gi-mount sa anggulo nga gibana-bana nga 30° ibabaw sa trachea (mga configuration nga gipakita sa Figures 2a ug 3a); usa ka magnet ibabaw sa hayop ug ang lain sa ubos, nga adunay mga pole nga gitakda aron modani (Figure 3b); usa ka magnet ibabaw sa hayop ug ang lain sa ubos, nga ang mga pole gitakda aron mosibog (Figure 3c); ug usa ka magnet sa ibabaw ug perpendicular sa trachea (Figure 3d). Kung na-configure na ang hayop ug magnet ug ang MP nga sulayan gikarga na sa syringe pump, paghatag og 50 μl nga dosis sa rate nga 4 μl/sec samtang nagkuha og mga imahe. Ang magnet dayon ibalhin balik-balik o lateral tabok sa trachea samtang nagpadayon sa pagkuha og mga imahe.
Pagkaporma sa magnet para sa in vivo imaging (a) usa ka magnet ibabaw sa trachea sa anggulo nga gibana-bana nga 30°, (b) duha ka magnet nga gitakda aron modani, (c) duha ka magnet nga gitakda aron mosibog, (d) usa ka magnet ibabaw ug perpendikular sa trachea. Ang tigpaniid mitan-aw gikan sa baba ngadto sa baga agi sa trachea, ug ang X-ray beam miagi sa wala nga kilid sa ilaga ug migawas sa tuo nga kilid. Ang magnet gibalhin ubay sa gitas-on sa agianan sa hangin o wala ug tuo ibabaw sa trachea sa direksyon sa X-ray beam.
Gitinguha usab namo nga mahibal-an ang pagkakita ug pamatasan sa mga partikulo sa mga agianan sa hangin nga walay makalibog nga pagginhawa ug paglihok sa kasingkasing. Busa, sa katapusan sa panahon sa pag-imaging, ang mga hayop gipatay sa tawhanong paagi tungod sa pentobarbital overdose (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Ang ubang mga hayop gibiyaan sa plataporma sa pag-imaging, ug sa dihang mihunong na ang pagginhawa ug pagpitik sa kasingkasing, ang proseso sa pag-imaging gisubli, nga nagdugang og dugang nga dosis sa MP kung walay MP nga makita sa ibabaw sa agianan sa hangin.
Ang nakuha nga mga imahe gi-flat-field ug gi-dark-field corrected ug dayon gi-assemble ngadto sa usa ka salida (20 frames per second; 15-25 × normal speed depende sa respiratory rate) gamit ang custom script nga gisulat sa MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ang tanang mga pagtuon sa paghatud sa LV gene vector gihimo sa Laboratory Animal Research Facility sa University of Adelaide ug nagtumong sa paggamit sa mga resulta sa eksperimento sa SPring-8 aron masusi kung ang paghatud sa LV-MP sa presensya sa magnetic field makapauswag ba sa pagbalhin sa gene in vivo. Aron masusi ang mga epekto sa MP ug magnetic field, duha ka grupo sa mga hayop ang gitambalan: usa ka grupo gihatagan og LV-MP nga adunay magnet nga gibutang, ug ang pikas grupo nakadawat og control group nga adunay LV-MP nga walay magnet.
Ang mga vector sa LV gene gihimo gamit ang mga pamaagi nga gihulagway kaniadto 25, 26. Ang LacZ vector nagpahayag sa nuclear-localized beta-galactosidase gene nga gimaneho sa constitutive MPSV promoter (LV-LacZ), nga nagpatunghag asul nga produkto sa reaksyon sa mga transduced cells, nga makita sa mga atubangan sa tisyu sa baga ug mga seksyon sa tisyu. Ang titration gihimo sa mga cell culture pinaagi sa mano-manong pag-ihap sa gidaghanon sa mga LacZ positive cells gamit ang hemocytometer aron makalkulo ang titer sa TU/ml. Ang mga carrier gi-cryopreserve sa -80 °C, gitunaw sa dili pa gamiton, ug gihigot sa CombiMag pinaagi sa pagsagol sa 1:1 ratio ug pag-incubate sa yelo sulod sa labing menos 30 minutos sa dili pa ihatud.
Ang normal nga mga ilaga nga Sprague Dawley (n = 3/grupo, ~2-3 gi-anesthesia intraperitoneally gamit ang sagol nga 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) ug 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) nga usa ka bulan ang edad) ip) injection ug non-surgical oral cannulation gamit ang 16 Ga iv cannula. Aron masiguro nga ang tracheal airway tissue makadawat og LV transduction, kini gi-condition gamit ang among gihulagway kaniadto nga mechanical perturbation protocol, diin ang tracheal airway surface gikuskos sa axial nga direksyon gamit ang wire basket (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Ang paghatag og LV-MP sa tracheal gihimo dayon sa usa ka biological safety cabinet mga 10 minutos human sa perturbation.
Ang magnetic field nga gigamit niini nga eksperimento gi-configure sa susamang paagi sa in vivo X-ray imaging study, nga ang parehas nga mga magnet gihuptan sa ibabaw sa trachea gamit ang distillation stent clips (Figure 4). Usa ka 50 μl nga volume (2 × 25 μl aliquots) sa LV-MP ang gihatud sa trachea (n = 3 ka mga hayop) gamit ang usa ka pipette nga adunay gel tip sama sa gihulagway kaniadto. Usa ka control group (n = 3 ka mga hayop) ang nakadawat sa parehas nga LV-MP nga wala gigamit ang magnet. Human makompleto ang infusion, ang cannula gikuha gikan sa ET tube ug ang hayop gi-extubate. Ang magnet nagpabilin sa lugar sulod sa 10 ka minuto, dayon kini gikuha. Ang mga ilaga nakadawat og subcutaneous dose sa meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) gisundan sa pagbalit-ad sa anesthesia pinaagi sa ip injection nga 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). Ang mga ilaga gipadayon nga mainit ug gimonitor hangtod sa hingpit nga pagkaayo gikan sa anesthesia.
LV-MP delivery device sulod sa usa ka biological safety cabinet. Ang light grey Luer hub sa ET tube makita nga nagtuybo gikan sa baba ug ang gel tip sa pipette nga gipakita sa hulagway gisulod pinaagi sa ET tube hangtod sa gitinguha nga giladmon ngadto sa trachea.
Usa ka semana human sa pamaagi sa pag-dose sa LV-MP, ang mga hayop gipatay nga tawhanon pinaagi sa 100% nga paglanghap sa CO2 ug ang ekspresyon sa LacZ gisusi gamit ang among standard nga X-gal nga pagtambal. Ang tulo ka caudal nga pinaka-cartilaginous nga singsing gikuha aron masiguro nga ang bisan unsang mekanikal nga kadaot o pagpabilin sa pluwido gikan sa pagbutang sa endotracheal tube wala gilakip sa pag-analisar. Ang matag trachea giputol nga longitudinally aron makahimo og duha ka bahin alang sa pag-analisar, ug kini gibutang sa usa ka pinggan nga adunay silicone rubber (Sylgard, Dow Inc) gamit ang Minutien needle (Fine Science Tools) aron makita ang luminal surface. Ang distribusyon ug sumbanan sa mga transduced cell gikumpirma pinaagi sa frontal photography gamit ang Nikon microscope (SMZ1500) nga adunay DigiLite camera ug TCapture software (Tucsen Photonics, China). Ang mga imahe nakuha sa 20x magnification (lakip ang labing taas nga setting alang sa tibuuk nga gilapdon sa trachea), diin ang tibuuk nga gitas-on sa trachea gi-imahe matag lakang, nga nagsiguro sa igo nga pagsapaw tali sa matag imahe aron tugotan ang "pagtahi" sa imahe. Ang mga imahe gikan sa matag trachea unya gi-assemble ngadto sa usa ka composite image gamit ang Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) gamit ang planar motion algorithm. Ang mga LacZ expression area sa composite images sa trachea gikan sa matag hayop gi-quantify gamit ang automated MATLAB script (R2020a, MathWorks) sama sa gihulagway kaniadto, gamit ang mga setting nga 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, ug Value < 0.7. Pinaagi sa pagsubay sa contours sa tissue, usa ka mask ang mano-mano nga gihimo sa GIMP v2.10.24 para sa matag composite image aron mailhan ang tissue area ug mapugngan ang bisan unsang sayop nga detection gikan sa gawas sa tracheal tissue. Ang mga stained area gikan sa tanang composite images gikan sa matag hayop gisuma aron makamugna sa total stained area para sa maong hayop. Ang stained area gibahin dayon sa total mask area aron makamugna sa normalized area.
Ang matag trachea gisulod sa paraffin ug ang 5 μm nga mga seksyon giputol. Ang mga seksyon gipintalan og neutral fast red sulod sa 5 ka minuto ug ang mga imahe nakuha gamit ang Nikon Eclipse E400 microscope, DS-Fi3 camera ug NIS element capture software (bersyon 5.20.00).
Ang tanang estadistikal nga pag-analisa gihimo sa GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Ang statistical significance gibutang sa p ≤ 0.05. Ang normality gipamatud-an gamit ang Shapiro-Wilk test, ug ang mga kalainan sa LacZ staining gisusi gamit ang unpaired t-test.
Ang unom ka MP nga gihulagway sa Talaan 1 gisusi gamit ang PCXI, ug ang visibility gihulagway sa Talaan 2. Duha ka polystyrene MP (MP1 ug MP2; 18 μm ug 0.25 μm, matag usa) dili makita ubos sa PCXI, apan ang nahabilin nga mga sample mailhan (ang mga pananglitan gipakita sa Figure 5). Ang MP3 ug MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm ug 0.9 μm, matag usa) hanap nga makita. Bisan kung adunay pipila sa pinakagamay nga mga partikulo nga gisulayan, ang MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) mao ang labing klaro. Ang produkto sa CombiMag nga MP6 lisud makita. Sa tanan nga mga kaso, ang among abilidad sa pag-detect sa MP labi nga napalambo pinaagi sa paghubad sa magnet balik-balik nga parallel sa capillary. Sa dihang ang mga magnet mibalhin gikan sa capillary, ang mga partikulo milugway sa taas nga mga kuwerdas, apan samtang ang mga magnet nagkaduol ug ang kusog sa magnetic field misaka, ang mga kuwerdas sa partikulo mimubo samtang ang mga partikulo mibalhin padulong sa ibabaw nga nawong sa capillary (tan-awa ang Supplementary Video S1: MP4), nga nagdugang sa The Ang densidad sa partikulo sa nawong. Sa laing bahin, kung ang magnet tangtangon gikan sa capillary, ang kusog sa field mokunhod ug ang mga MP mausab ngadto sa taas nga mga kuwerdas nga naggikan sa ibabaw nga nawong sa capillary (tan-awa ang Supplementary Video S2:MP4). Human mohunong sa paglihok ang magnet, ang mga partikulo magpadayon sa paglihok sulod sa mubo nga panahon human makaabot sa posisyon sa equilibrium. Samtang ang MP molihok padulong ug palayo gikan sa ibabaw nga nawong sa capillary, ang mga magnetic particle kasagarang moguyod sa mga debris agi sa pluwido.
Ang pagkakita sa MP ubos sa PCXI managlahi kaayo tali sa mga sample.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ug (d) MP6. Ang tanang mga imahe nga gipakita dinhi gikuha gamit ang magnet nga nahimutang gibana-bana nga 10 mm direkta sa ibabaw sa capillary. Ang dayag nga dagkong mga lingin mga bula sa hangin nga natanggong sa mga capillary, nga klaro nga nagpakita sa itom ug puti nga mga bahin sa ngilit sa phase contrast imaging. Ang pula nga kahon adunay sulud nga contrast-enhancing magnification. Timan-i nga ang mga diametro sa magnet schematics sa tanang mga numero dili sumala sa sukod ug gibana-bana nga 100 ka pilo nga mas dako kaysa gipakita.
Samtang ang magnet gibalhin sa wala ug tuo sa ibabaw sa capillary, ang anggulo sa MP string mausab aron mohaom sa magnet (tan-awa ang Figure 6), sa ingon naghulagway sa mga linya sa magnetic field. Alang sa MP3-5, human ang chord makaabot sa usa ka threshold angle, ang mga partikulo giguyod ubay sa ibabaw nga nawong sa capillary. Kasagaran kini moresulta sa mga MP nga magtapok ngadto sa mas dagkong mga grupo duol sa diin ang magnetic field labing kusog (tan-awa ang Supplementary Video S3:MP5). Kini labi usab nga makita kung ang pag-imaging duol sa tumoy sa capillary, nga hinungdan nga ang mga MP magtapok ug mag-concentrate sa fluid-air interface. Ang mga partikulo sa MP6, nga mas lisud mailhan kaysa MP3-5, wala giguyod samtang ang magnet naglihok ubay sa capillary, apan ang mga MP string nabulag, nga gibiyaan ang mga partikulo sa natad sa panan-aw (tan-awa ang Supplementary Video S4:MP6). Sa pipila ka mga kaso, kung ang gigamit nga magnetic field gipakunhod pinaagi sa pagbalhin sa magnet sa usa ka layo nga distansya gikan sa lokasyon sa imaging, ang bisan unsang nahabilin nga mga MP hinay nga manaog sa ilawom nga nawong sa tubo pinaagi sa grabidad samtang nagpabilin sa pisi (tan-awa ang Supplementary Video S5: MP3).
Ang anggulo sa MP string mausab samtang ang magnet ibalhin sa tuo ibabaw sa capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ug (d) MP6. Ang pula nga kahon adunay contrast-enhancing magnification. Timan-i nga ang mga supplementary video impormatibo tungod kay kini nagpadayag sa importanteng istruktura sa partikulo ug dinamikong impormasyon nga dili makita niining mga static nga imahe.
Ang among mga pagsulay nagpakita nga ang hinay nga paglihok sa magnet balik-balik subay sa trachea nagpadali sa pagtan-aw sa MP sa konteksto sa komplikado nga paglihok in vivo. Ang pagsulay sa in vivo wala gihimo tungod kay ang mga polystyrene beads (MP1 ug MP2) dili makita sa capillary. Ang matag usa sa nahabilin nga upat ka MP gisulayan in vivo nga ang magnet nga taas nga axis gi-configure sa ibabaw sa trachea sa usa ka anggulo nga mga 30° hangtod sa bertikal (tan-awa ang Mga Hulagway 2b ug 3a), tungod kay kini miresulta sa mas taas nga mga kadena sa MP ug mas epektibo kaysa sa natapos nga pag-configure sa magnet. Ang MP3, MP4 ug MP6 wala makit-i sa trachea sa bisan unsang buhing mga hayop. Sa dihang ang mga agianan sa hangin sa ilaga gi-imahe human ang mga hayop gipatay sa tawhanong paagi, ang mga partikulo nagpabilin nga dili makita bisan kung gidugang ang dugang nga volume gamit ang syringe pump. Ang MP5 adunay labing taas nga sulud sa iron oxide ug mao ra ang makita nga partikulo, ug busa gigamit aron masusi ug mailhan ang in vivo nga pamatasan sa MP.
Ang pagbutang sa magnet ibabaw sa trachea atol sa paghatud sa MP miresulta sa daghan, apan dili tanan, nga mga MP nga nakonsentrar sa natad sa panan-aw. Ang mga partikulo nga mosulod sa trachea labing maayo nga naobserbahan sa mga hayop nga gihalad sa tawhanong paagi. Figure 7 ug Supplementary Video S6: Ang MP5 nagpakita sa paspas nga magnetic capture ug alignment sa mga partikulo sa ibabaw sa ventral trachea, nga nagpakita nga ang mga MP mahimong idirekta sa gitinguha nga mga rehiyon sa trachea. Sa pagpangita nga mas distal ubay sa trachea pagkahuman sa paghatud sa MP, ang pipila ka mga MP nakit-an nga mas duol sa carina, nga nagsugyot nga ang kusog sa magnetic field dili igo aron makolekta ug mapadayon ang tanan nga mga MP, tungod kay kini gihatud pinaagi sa rehiyon nga adunay labing taas nga kusog sa magnetic field atol sa proseso sa pluwido. Bisan pa, ang mga konsentrasyon sa postpartum MP mas taas sa palibot sa gi-imahe nga lugar, nga nagsugyot nga daghang mga MP ang nagpabilin sa mga rehiyon sa agianan sa hangin diin ang gigamit nga kusog sa magnetic field labing taas.
Mga hulagway gikan sa (a) sa wala pa ug (b) pagkahuman sa paghatud sa MP5 ngadto sa trachea sa usa ka bag-o lang gi-euthanize nga ilaga nga ang magnet gibutang direkta sa ibabaw sa imaging area. Ang imaged area nahimutang taliwala sa duha ka cartilage rings. Sa wala pa ang paghatud sa MP, adunay pipila ka pluwido sa agianan sa hangin. Ang pula nga kahon adunay sulud nga contrast-enhancing magnification. Kini nga mga hulagway gikan sa video nga gipakita sa Supplementary Video S6:MP5.
Ang pag-translate sa magnet subay sa trachea in vivo hinungdan nga ang MP chain nag-usab sa anggulo sulod sa airway surface sa paagi nga susama sa nakita sa mga capillary (tan-awa ang Figure 8 ug Supplementary Video S7:MP5). Bisan pa, sa among pagtuon, ang mga MP dili madala subay sa surface sa buhing airway sama sa ilang mahimo sa mga capillary. Sa pipila ka mga kaso, ang MP chain motaas samtang ang magnet molihok sa wala ug tuo. Makapainteres, among nakita usab nga ang particle string daw nag-usab sa giladmon sa surface fluid layer kung ang magnet gibalhin sa longitudinally subay sa trachea, ug molapad kung ang magnet gibalhin direkta sa ibabaw ug ang particle string gituyok sa usa ka bertikal nga posisyon (tan-awa ang Supplementary Video S7). : MP5 sa 0:09, ubos nga tuo). Ang kinaiya nga sumbanan sa paglihok nausab sa dihang ang magnet gibalhin tabok sa ibabaw sa trachea sa kilid (kana mao, sa wala o tuo sa hayop imbes nga ubay sa gitas-on sa trachea). Ang mga partikulo klaro gihapon nga makita samtang kini naglihok, apan sa dihang gikuha ang magnet gikan sa trachea, ang mga tumoy sa mga kuwerdas sa partikulo nahimong makita (tan-awa ang Supplementary Video S8:MP5, sugod sa 0:08). Kini nahiuyon sa pamatasan sa MP nga among naobserbahan ubos sa usa ka gigamit nga magnetic field sa usa ka glass capillary.
Mga ehemplo sa mga hulagway nga nagpakita sa MP5 sa trachea sa usa ka buhing gi-anestesya nga ilaga. (a) Ang magnet gigamit sa pagkuha og mga hulagway sa ibabaw ug sa wala sa trachea, dayon (b) human ang magnet ibalhin sa tuo. Ang pula nga kahon adunay sulod nga contrast-enhancing magnification. Kini nga mga hulagway gikan sa video nga gipakita sa Supplementary Video S7:MP5.
Sa dihang ang duha ka poste gi-configure sa amihanan-habagatan nga oryentasyon sa ibabaw ug sa ubos sa trachea (ie attracting; Fig. 3b), ang MP chords mas taas ug nahimutang sa sidewall sa trachea imbes sa dorsal tracheal surface (tan-awa ang Supplementary Video S9:MP5). Bisan pa, ang taas nga konsentrasyon sa mga partikulo sa usa ka lokasyon (ie, ang dorsal surface sa trachea) wala makit-i pagkahuman sa paghatud sa pluwido sa dihang gigamit ang dual-magnet device, nga kasagaran mahitabo kung gigamit ang single-magnet device. Dayon sa dihang ang usa ka magnet gi-configure aron isalikway ang mga poste nga nabaliktad (Fig. 3c), ang gidaghanon sa mga partikulo nga makita sa field of view daw wala modaghan human sa paghatud. Ang setup sa duha ka dual-magnet configurations mahagiton tungod sa taas nga kusog sa magnetic field nga nagbira o nagduso sa mga magnet, matag usa. Ang setup giusab dayon ngadto sa usa ka magnet nga parallel sa airway apan moagi sa airway sa 90 degrees aron ang mga field lines motabok sa tracheal wall orthogonally (Fig. 3d), usa ka orientation nga gidisenyo aron mahibal-an kung ang particle aggregation sa side wall maobserbahan. Bisan pa, sa niini nga konfigurasyon, walay mailhan nga paglihok sa akumulasyon sa MP o paglihok sa magnet. Base sa tanan niini nga mga resulta, usa ka single-magnet, 30-degree orientation configuration (Figure 3a) ang gipili alang sa in vivo gene carrier studies.
Sa dihang balik-balik nga gikuhaan og hulagway ang hayop human dayon sa tawhanong pagpatay, ang kawalay makalibog nga paglihok sa tisyu nagpasabot nga mas pino ug mas mubo nga mga linya sa partikulo ang makita sa klaro nga interchondral field, nga "nagkurog" subay sa translational motion sa magnet. Bisan pa niana, dili gihapon klaro nga makita ang presensya ug paglihok sa mga partikulo sa MP6.
Ang LV-LacZ titer kay 1.8 × 108 TU/ml, ug human sa 1:1 nga pagsagol sa CombiMag MP (MP6), ang mga hayop nakadawat og 50 μl tracheal dose nga 9 × 107 TU/ml LV vehicle (ie 4.5 × 106 TU/ilaga). Niini nga mga pagtuon, imbes nga i-translate ang magnet atol sa pagpanganak, among gipahimutang ang magnet sa usa ka posisyon aron mahibal-an kung ang LV transduction (a) mahimong mouswag kon itandi sa vector delivery kung walay magnetic field, ug (b) mahimong ma-focus. Ang mga airway cell gi-transduce ngadto sa magnetic target nga mga rehiyon sa ibabaw nga agianan sa hangin.
Ang presensya sa mga magnet ug ang paggamit sa CombiMag inubanan sa mga LV vector daw walay daotang epekto sa panglawas sa hayop, sama sa among standard LV vector delivery protocol. Ang mga frontal nga hulagway sa rehiyon sa tracheal nga gipailalom sa mechanical perturbation (Supplementary Fig. 1) nagpakita nga adunay mas taas nga lebel sa transduction sa grupo sa mga hayop nga gitambalan og LV-MP sa dihang naa ang magnet (Fig. 9a). Gamay ra nga kantidad sa asul nga LacZ staining ang naa sa control group (Fig. 9b). Ang kwantipikasyon sa normalized X-Gal stained areas nagpakita nga ang administrasyon sa LV-MP sa presensya sa magnetic field nakamugna og gibana-bana nga 6 ka pilo nga kalamboan (Fig. 9c).
Mga ehemplo sa mga composite nga hulagway nga nagpakita sa tracheal transduction pinaagi sa LV-MP (a) sa presensya sa magnetic field ug (b) sa kawalay magnet.(c) Mahinungdanong pag-uswag sa istatistika sa normalized LacZ transduction area sulod sa trachea kung gamiton ang magnet (*p = 0.029, t-test, n = 3 matag grupo, mean ± SEM).
Ang mga neutral fast red-stained nga seksyon (pananglitan gipakita sa Supplementary Fig. 2) nagpakita sa mga selula nga adunay LacZ nga anaa sa parehas nga sumbanan ug lokasyon sama sa gitaho kaniadto.
Usa ka dakong hagit alang sa airway gene therapy mao ang tukma nga pag-localize sa mga carrier particle ngadto sa mga rehiyon nga interesado ug pagkab-ot sa taas nga lebel sa transduction efficiency sa naglihok nga baga sa presensya sa airflow ug aktibo nga mucus clearance. Alang sa mga LV carrier nga gidisenyo aron matambalan ang sakit sa CF airway, ang pagdugang sa residence time sa mga carrier particle sulod sa conducting airways usa ka lisod nga tumong hangtod karon. Sama sa gipunting ni Castellani et al., ang paggamit sa magnetic fields aron mapaayo ang transduction adunay mga bentaha kon itandi sa ubang mga pamaagi sa paghatud sa gene sama sa electroporation, tungod kay kini makahiusa sa kasayon, cost-effectiveness, delivery localization, dugang nga efficiency, ug mas mubo nga incubation times, ug posible nga mas gamay nga carrier dose10. Bisan pa, ang in vivo deposition ug kinaiya sa magnetic particles sa mga airways ubos sa impluwensya sa external magnetic forces wala pa gyud mahulagway, ni ang aktuwal nga posibilidad niini nga pamaagi napamatud-an in vivo aron mapalambo ang lebel sa gene expression sa wala madaot nga buhing mga airways.
Ang among in vitro synchrotron PCXI nga mga eksperimento nagpakita nga ang tanan nga mga partikulo nga among gisulayan, gawas sa polystyrene MP, makita sa imaging setup nga among gigamit. Sa presensya sa usa ka magnetic field, ang mga MP nagporma og mga string kansang gitas-on may kalabutan sa tipo sa partikulo ug kusog sa magnetic field (ie kaduol ug paglihok sa magnet). Sama sa gipakita sa Figure 10, ang mga string nga among naobserbahan naporma tungod sa matag indibidwal nga partikulo nga na-magnetize ug nag-induce sa kaugalingon nga lokal nga magnetic field. Kini nga managlahing mga field hinungdan sa ubang parehas nga mga partikulo nga mag-ipon ug magkonektar, nga adunay mga paglihok nga sama sa string sa grupo tungod sa lokal nga pwersa gikan sa lokal nga madanihon ug masalikway nga pwersa sa ubang mga partikulo.
Eskematikong nagpakita sa (a,b) mga tren sa partikulo nga namugna sulod sa mga capillary nga puno sa pluwido ug (c,d) trachea nga puno sa hangin. Timan-i nga ang mga capillary ug trachea wala gidrowing sa sukod. Ang panel (a) adunay usab paghulagway sa MP, nga adunay mga partikulo sa Fe3O4 nga gihan-ay sa mga kuwerdas.
Sa dihang ang magnet gibalhin ibabaw sa capillary, ang anggulo sa particle string nakaabot sa kritikal nga threshold para sa MP3-5 nga adunay Fe3O4, pagkahuman niini ang particle string wala na magpabilin sa orihinal nga posisyon, apan mibalhin subay sa nawong ngadto sa usa ka bag-ong posisyon. magnet. Kini nga epekto lagmit mahitabo tungod kay ang nawong sa glass capillary igo nga hamis aron tugotan kini nga paglihok nga mahitabo. Makapainteres, ang MP6 (CombiMag) wala molihok niini nga paagi, posible tungod kay ang mga partikulo mas gagmay, adunay lainlaing mga coatings o surface charges, o ang usa ka proprietary carrier fluid nakaapekto sa ilang abilidad sa paglihok. Ang image contrast sa mga partikulo sa CombiMag mas huyang usab, nga nagsugyot nga ang fluid ug mga partikulo mahimong adunay parehas nga densidad ug busa dili dali nga molihok padulong sa usag usa. Ang mga partikulo mahimo usab nga ma-stuck kung ang magnet molihok nga paspas kaayo, nga nagpakita nga ang kusog sa magnetic field dili kanunay makabuntog sa friction tali sa mga partikulo sa fluid, nga nagsugyot nga tingali dili ikatingala nga ang kusog sa magnetic field ug ang gilay-on tali sa magnet ug sa target area hinungdanon kaayo. Kung tan-awon sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsugyot usab nga, samtang ang mga magnet makadakop sa daghang mga MP nga nagaagos sa target area, dili tingali nga ang mga magnet masaligan. aron ibalhin ang mga partikulo sa CombiMag ubay sa nawong sa trachea. Busa, among nahinapos nga ang mga pagtuon sa LV-MP nga in vivo kinahanglan mogamit ug static magnetic fields aron pisikal nga ma-target ang piho nga mga rehiyon sa punoan sa agianan sa hangin.
Kon ang mga partikulo ipadala sa lawas, kini lisod mailhan sa konteksto sa komplikado nga naglihok nga tisyu sa lawas, apan ang abilidad sa pag-ila niini gipalambo pinaagi sa paghubad sa magnet nga pinahigda ibabaw sa trachea aron "i-uyog" ang mga MP string. Bisan tuod posible ang live imaging, mas sayon ​​​​ang pag-ila sa paglihok sa partikulo kung ang hayop gipatay na sa tawhanong paagi. Ang mga konsentrasyon sa MP kasagaran labing taas niini nga lokasyon kung ang magnet gibutang sa ibabaw sa imaging area, bisan kung ang pipila ka mga partikulo kasagarang makita sa unahan sa trachea. Sukwahi sa mga pagtuon sa in vitro, ang mga partikulo dili madala subay sa trachea pinaagi sa paghubad sa magnet. Kini nga nakaplagan nahiuyon sa kung giunsa ang mucus nga nagtabon sa nawong sa trachea kasagarang nagproseso sa mga partikulo nga giginhawa, nga nag-trap niini sa mucus ug pagkahuman nalimpyohan pinaagi sa mekanismo sa mucociliary clearance.
Among gihipotesis nga ang paggamit sa mga magnet para sa atraksyon sa ibabaw ug sa ubos sa trachea (Fig. 3b) mahimong moresulta sa mas uniporme nga magnetic field, imbes nga usa ka magnetic field nga taas og konsentrasyon sa usa ka punto, nga posibleng mosangpot sa mas uniporme nga distribusyon sa mga partikulo. Bisan pa, ang among pasiunang pagtuon wala makakita og klaro nga ebidensya aron suportahan kini nga hypothesis. Ingon man usab, ang pag-configure sa usa ka pares sa mga magnet aron molikay (Fig. 3c) wala moresulta sa dugang nga pagdeposito sa partikulo sa gi-imahe nga lugar. Kini nga duha ka mga nahibal-an nagpakita nga ang dual-magnet setup wala kaayo makapauswag sa lokal nga pagkontrol sa MP targeting, ug nga ang resulta nga kusog nga magnetic forces lisud i-configure, nga naghimo niini nga pamaagi nga dili kaayo praktikal. Sa susama, ang pag-orient sa magnet sa ibabaw ug agi sa trachea (Fig. 3d) wala usab nagdugang sa gidaghanon sa mga partikulo nga natipigan sa gi-imahe nga lugar. Ang uban niini nga mga alternatibong configuration mahimong dili malampuson tungod kay kini moresulta sa mas ubos nga kusog sa magnetic field sulod sa deposition area. Busa, ang single 30-degree angle magnet configuration (Figure 3a) giisip nga labing kadali ug labing episyente nga pamaagi para sa in vivo testing.
Ang pagtuon sa LV-MP nagpakita nga sa dihang ang mga LV vector gihiusa sa CombiMag ug gihatud human sa pisikal nga pagkabalda sa presensya sa magnetic field, ang lebel sa transduction miusbaw pag-ayo sa trachea kon itandi sa mga kontrol. Base sa mga pagtuon sa synchrotron imaging ug mga resulta sa LacZ, ang magnetic field daw nakahimo sa pagpreserbar sa LV sulod sa trachea ug pagpakunhod sa gidaghanon sa mga partikulo sa vector nga dayon nga nakasulod sa baga. Ang ingon nga mga pag-uswag sa pag-target mahimong mosangpot sa mas taas nga kaepektibo samtang nagpamenos sa gihatud nga mga titer, off-target transduction, mga epekto sa panghubag ug resistensya, ug mga gasto sa gene carrier. Importante, sumala sa tiggama, ang CombiMag magamit kauban sa ubang mga pamaagi sa pagbalhin sa gene, lakip ang ubang mga viral vector (sama sa AAV) ug mga nucleic acid.