Nature.com にアクセスいただきありがとうございます。ご利用のブラウザ バージョンでは、CSS のサポートが制限されています。最適なエクスペリエンスを得るには、更新されたブラウザを使用する (または Internet Explorer の互換モードをオフにする) ことをお勧めします。その間、継続的なサポートを確保するため、スタイルと JavaScript なしでサイトを表示します。
嚢胞性線維症性肺疾患の治療に使用される遺伝子ベクターは、末梢肺への導入では治療効果がないため、伝導気道を標的とすべきである。ウイルス導入効率はベクターの滞留時間に直接関係している。しかし、遺伝子キャリアなどの送達液は吸気時に自然に肺胞に拡散し、あらゆる形態の治療粒子は粘膜繊毛輸送によって急速に消失する。遺伝子キャリアの気道内滞留時間を延長することは重要であるが、達成は困難である。気道表面に誘導できる遺伝子キャリア結合磁性粒子は、局所的な標的化を改善することができる。生体内での可視化には課題があるため、印加磁場下でのこのような小さな磁性粒子の気道表面における挙動は十分に理解されていない。本研究の目的は、シンクロトロンイメージングを用いて麻酔ラットの気管内における一連の磁性粒子の生体内での動きを可視化し、生体内での個々の粒子およびバルク粒子の挙動のダイナミクスとパターンを調べることであった。さらに、レンチウイルス磁性粒子の送達がレンチウイルス磁性粒子を磁場の存在下で送達すると、ラットの気管内での伝達効率が向上すると考えられます。シンクロトロンX線画像により、生体外および生体内での静止磁場および移動磁場内での磁性粒子の挙動が明らかになりました。磁石を使用しても粒子は生体の気道表面に沿って簡単に引きずられるわけではありませんが、輸送中は、堆積物は磁場が最も強い視野に集中します。レンチウイルス磁性粒子を磁場の存在下で送達した場合、伝達効率も6倍に向上しました。これらの結果を合わせると、レンチウイルス磁性粒子と磁場は、遺伝子ベクターの標的化を改善し、生体内での伝導気道における伝達レベルを高めるための貴重なアプローチとなる可能性があることが示唆されます。
嚢胞性線維症（CF）は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）と呼ばれる単一遺伝子の変異によって引き起こされます。CFTRタンパク質は、CFの主要病原部位である伝導気道を含む、体中の多くの上皮細胞に存在するイオンチャネルです。CFTRの欠陥により、異常な水分輸送が起こり、気道表面が脱水し、気道表面液体層（ASL）の深さが減少します。また、これにより、吸入された粒子や病原体を気道から排除する粘液繊毛輸送（MCT）システムの能力も低下します。私たちの目標は、レンチウイルス（LV）遺伝子治療を開発してCFTR遺伝子の正しいコピーを送達し、ASL、MCT、および肺の健康を改善すること、そしてこれらのパラメータを生体内で測定できる新技術の開発を継続することです。
LVベクターは、主に気道基底細胞（気道幹細胞）に治療遺伝子を恒久的に組み込むことができるため、CF気道遺伝子治療の有力候補の一つです。これは、機能的な遺伝子修正されたCF関連気道表面細胞に分化することで正常な水分補給と粘液クリアランスを回復させ、生涯にわたる効果をもたらすため重要です。LVベクターは、CF肺疾患の発症部位である伝導気道に向けるべきです。ベクターを肺のより深部に送達すると肺胞への導入が起こり得ますが、CFにおいては治療効果はありません。しかし、遺伝子キャリアなどの体液は送達後、吸気時に自然に肺胞へ移行し3,4、治療粒子はMCTによって口腔内に速やかに排出されます。LV導入効率は、細胞への取り込みを可能にするためにベクターが標的細胞の近くに留まる時間の長さ、すなわち「滞留時間」5に直接関係しており、これは典型的な局所的な気流や協調的な粒子粘液捕捉およびMCTによって容易に短縮されます。CFの場合、気道内でのLVの滞留時間を延長することは、この領域で高いレベルの伝達を達成する上で重要ですが、これまでのところ困難でした。
この障害を克服するために、我々はLV磁性粒子（MP）が2つの相補的な方法で役立つかもしれないと提案する。まず、磁性粒子を磁気的に気道表面に誘導して標的化を改善し、遺伝子キャリア粒子が目的の気道領域に存在するのを助けることができる。そしてASL（末梢循環調節受容体）が細胞層6に移動するのを助ける。MPは、静電気の存在下で細胞膜に付着するか関連する細胞表面受容体に結合して腫瘍部位に蓄積する抗体、化学療法薬、またはその他の小分子に結合する場合、標的薬物送達媒体として広く使用されている。がん治療のための磁場 7. その他の「ハイパーサーマル」技術は、MPを振動磁場にさらすことで加熱し、腫瘍細胞を破壊することを目的としています。磁場をトランスフェクション剤として使用してDNAの細胞への導入を促進する磁気トランスフェクションの原理は、導入が困難な細胞株に対して、様々な非ウイルス性およびウイルス性遺伝子ベクターを用いたin vitro実験で広く用いられています。LV磁気トランスフェクションの有効性は確立されており、静磁場存在下でヒト気管支上皮細胞株にLV-MPをin vitroで送達したところ、LVベクター単独と比較して導入効率が186倍に増加しました。LV-MPはin vitroのCFモデルにも適用されており、磁気トランスフェクションによってCF喀痰存在下で気液界面培養におけるLV導入が20倍に増加しました10。しかし、臓器のin vivo磁気トランスフェクションは比較的注目されておらず、限られた範囲でしか評価されていません。動物実験はほとんど行われておらず11,12,13,14,15、特に肺においては16,17、その数は少ない。それにもかかわらず、CF肺治療における磁気トランスフェクションの機会は明らかである。Tanら(2020)は、「効率的な磁性ナノ粒子の肺送達の概念実証研究は、CF患者の臨床転帰を改善するための将来のCFTR吸入戦略への道を開くであろう」6と述べている。
磁場を印加した状態での気道表面上の小さな磁性粒子の挙動は、視覚化や研究が難しく、十分に理解されていません。他の研究では、気道表面の水分補給を直接測定し、治療効果の早期指標として使用するために、ASL深度18とMCT挙動19,20の生体内の微細な変化を非侵襲的に視覚化および定量化するシンクロトロン伝播ベース位相コントラストX線画像化（PB-PCXI）法を開発しました。また、MCT評価法では、PB-PCXI21を使用して視認できるMCTマーカーとして、アルミナまたは高屈折率ガラスで構成された直径10～35µmの粒子を使用します。両方の技術は、MPを含むさまざまな粒子タイプの視覚化に適しています。
PB-PCXI ベースの ASL および MCT 分析技術は、その高い空間および時間分解能により、in vivo での単一およびバルク粒子の挙動のダイナミクスとパターンの調査に最適であり、MP 遺伝子送達技術を理解し最適化するのに役立ちます。ここで採用しているアプローチは、SPring-8 BL20B2 ビームラインを使用した研究から派生したもので、マウスの鼻腔および肺気道への模擬ベクター投与後の流体の動きを視覚化し、遺伝子キャリア投与動物研究 3,4 で観察された不均一な遺伝子発現パターンの説明に役立てています。
この研究の目的は、シンクロトロン PB-PCXI を使用して、生きたラットの気管内における一連の MP の体内での動きを可視化することでした。これらの PB-PCXI イメージング研究は、さまざまな MP、磁場の強度、および場所をテストして、それらが MP の動きに及ぼす影響を調べるように設計されました。外部から適用した磁場により、送達された MP が標的領域に留まるか移動するという仮説を立てました。また、これらの研究により、沈着後に気管内に保持される粒子の数を最大化する磁石の構成を特定することもできました。2 番目の一連の研究では、気道標的化のコンテキストでの LV-MP の送達により LV 変換効率が向上するという仮定に基づいて、この最適な構成を使用して、ラットの気道への LV-MP の体内送達から生じる変換パターンを実証しようとしました。
すべての動物実験は、アデレード大学（M-2019-060 および M-2020-022）および SPring-8 シンクロトロン動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。実験は ARRIVE ガイドラインに従って実施されました。
すべてのX線イメージングは​​、日本のSPring-8シンクロトロンのBL20XUビームラインで、以前に説明したものと同様のセットアップを使用して実施されました21,22。簡単に言うと、実験ボックスはシンクロトロンストレージリングから245メートル離れた場所に設置されました。粒子イメージング研究ではサンプルと検出器の距離を0.6メートル、位相コントラスト効果を生成するために生体内イメージング研究では0.3メートルにしました。25keVの単色ビームエネルギーを使用しました。画像は、sCMOS検出器に接続された高解像度X線コンバータ（SPring-8 BM3）を使用して取得されました。コンバータは、10µm厚のシンチレータ（Gd3Al2Ga3O12）を使用してX線を可視光に変換し、それを×10顕微鏡対物レンズ（NA 0.3）を使用してsCMOSセンサーに導きます。sCMOS検出器は、アレイ サイズは 2048 × 2048 ピクセル、生のピクセル サイズは 6.5 × 6.5 µm です。この設定により、有効な等方性ピクセル サイズは 0.51 µm、視野は約 1.1 mm × 1.1 mm になります。呼吸による動きのアーティファクトを最小限に抑えながら、気道内外の磁性粒子の信号対雑音比を最大化するために、露出時間を 100 ms に選択しました。生体内研究では、露出間で X 線ビームを遮断して放射線量を制限するために、X 線経路に高速 X 線シャッターを配置しました。
BL20XU イメージングチャンバーはバイオセーフティレベル 2 認定を受けていないため、LV キャリアは SPring-8 PB-PCXI イメージング研究では使用されませんでした。その代わりに、私たちは 2 つの商用サプライヤーから、さまざまなサイズ、材質、鉄濃度、用途をカバーする、特性評価済みのさまざまな MP を選択しました。これは、最初に磁場がガラス毛細血管内の MP の動きにどのように影響するかを理解し、次に生体の気道内で MP の動きにどのように影響するかを理解するためです。表面には、MP の大きさが 0.25 ～ 18 μm の範囲でさまざまな材料からできています (表 1 を参照)。ただし、MP 内の磁性粒子の大きさなど、各サンプルの組成は不明です。当社の広範な MCT 研究 19, 20, 21, 23, 24 に基づいて、たとえば連続するフレームを減算して MP ​​の動きの可視性を高めることによって、5 μm ほどの小さな MP が気管気道表面で確認できると予想されます。0.25 μm サイズの MP 1 個はイメージング デバイスの解像度よりも小さいですが、PB-PCXI は、沈着後に沈着した表面流体の体積コントラストと動きを検出できると予想されます。
表1の各MPのサンプルは、内径0.63 mmの20 μlガラスキャピラリー（Drummond Microcaps、ペンシルベニア州、米国）で調製されました。粒子状粒子は水中で入手可能ですが、CombiMag粒子は製造元の独自の液体で入手可能です。各チューブは液体（約11 μl）で半分満たされ、サンプルホルダーに配置されます（図1を参照）。ガラスキャピラリーは、それぞれイメージングボックスのサンプルステージに水平に配置され、液体の端が配置されました。1.17テスラの残留磁化を持つ直径19 mm（長さ28 mm）のニッケルシェル希土類ネオジム鉄ボロン（NdFeB）磁石（N35、カタログ番号LM1652、Jaycar Electronics、オーストラリア）は、別の移動ステージに取り付けられ、イメージング中にリモートで位置を変更できるようにしました。X線画像の取得は、磁石がサンプルの約30 mm上に配置されると開始され、毎秒 4 フレーム。撮影中、磁石はガラス毛細管に近づけられ (約 1 mm 離して)、その後管に沿って移動され、磁場の強度と位置の影響を評価しました。
サンプル xy 移動ステージ上のガラス毛細管に MP サンプルが入った in vitro イメージング セットアップ。X 線ビームのパスは赤い破線でマークされています。
MPのin vitroでの可視性が確立されると、そのサブセットは、野生型の雌性アルビノWistarラット（約12週齢、約200g）でin vivoでテストされました。0.24 mg/kgメデトミジン（ドミトール®、ゼノアック、日本）、3.2 mg/kgミダゾラム（ドルミカム®、アステラス製薬、日本）、および4 mg/kgブトルファノール（ベトルファレ®、明治製菓）を腹腔内注射でラットに投与して麻酔しました。麻酔後、気管周囲の毛を取り除き、気管内チューブ（ET; 16 Ga ivカニューレ、テルモBCT）を挿入し、体温を維持するための保温バッグを備えた特注のイメージングプレートに仰向けに固定することで、イメージングの準備が整いました22。次に、イメージングプレートをイメージングボックス内のサンプル移動ステージに少し角度をつけて取り付け、図2aに示すように、X線画像では気管が水平に見えます。
(a) SPring-8 イメージング ボックス内の生体内イメージング セットアップ。X 線ビームの経路は赤い破線で示されています。(b、c) 気管上の磁石の位置特定は、直交して取り付けられた 2 台の IP カメラを使用してリモートで実行されました。画面画像の左側には、頭部を保持するワイヤー ループと、ET チューブ内の所定の位置にあるデリバリー カニューレが見えます。
100 μlガラスシリンジを使用した遠隔制御シリンジポンプシステム（UMP2、World Precision Instruments、フロリダ州サラソタ）を、30 Ga針を介してPE10チューブ（外径0.61 mm、内径0.28 mm）に接続しました。ETチューブを挿入するときに、先端が気管内の正しい位置にあることを確認するためにチューブに印を付けます。マイクロポンプを使用して、チューブの先端を送達するMPサンプルに浸した状態でシリンジプランジャーを引き抜きました。次に、ロードされた送達チューブを気管内チューブに挿入し、先端を予想される印加磁場の最も強い部分に配置しました。画像取得は、Arduinoベースのタイミングボックスに接続された呼吸検出器を使用して制御され、すべての信号（温度、呼吸、シャッターの開閉、画像取得など）は、PowerlabおよびLabChart（AD Instruments、オーストラリアシドニー）を使用して記録されました22。 2台のIPカメラ（パナソニックBB-SC382）を互いに約90°の角度で配置し、撮影中に気管に対する磁石の位置を監視するために使用しました（図2b、c）。モーションアーティファクトを最小限に抑えるために、終末呼気流量プラトー中に呼吸ごとに1枚の画像を取得しました。
磁石は、イメージング ハウジングの外側から離れた場所に配置できる第 2 ステージに取り付けられています。さまざまな磁石の位置と構成がテストされました。これには、気管の上約 30 度の角度で取り付ける (構成は図 2a と 3a に示されています)、動物の上に 1 つの磁石、下にもう 1 つの磁石を配置し、極を吸引するように設定 (図 3b)、動物の上に 1 つの磁石、下にもう 1 つの磁石を配置し、極を反発するように設定 (図 3c)、および気管の上方に垂直に 1 つの磁石を配置 (図 3d) が含まれます。動物と磁石の構成が完了し、テストする MP がシリンジ ポンプにロードされたら、画像を取得しながら 4 μl/秒の速度で 50 μl の投与量を送達します。次に、画像の取得を継続しながら、磁石を気管に沿ってまたは横方向に前後に動かします。
生体内画像化のための磁石の構成。(a) 気管の上に約 30° の角度で配置された単一の磁石、(b) 引き付けるように設定された 2 つの磁石、(c) 反発するように設定された 2 つの磁石、(d) 気管の上に垂直に配置された単一の磁石。観察者は口から気管を通して肺を見下ろし、X 線ビームはラットの左側を通過して右側から出ました。磁石は、気道の長さに沿って移動するか、X 線ビームの方向に気管の上で左右に移動します。
また、呼吸や心臓の動きを妨げない状態での気道内の粒子の可視性と挙動も調べようとしました。そのため、イメージング期間の終了時に、ペントバルビタール（ソムノペンチル、ピットマン・ムーア、ワシントン・クロッシング、米国、腹腔内投与で約 65 mg/kg）過剰投与のため、動物を人道的に殺処分しました。一部の動物はイメージングプラットフォーム上に残し、呼吸と心拍が停止したらイメージングプロセスを繰り返し、気道表面に MP が見えない場合は MP を追加投与しました。
取得した画像はフラットフィールドおよびダークフィールド補正され、MATLAB (R2020a、The Mathworks) で作成されたカスタム スクリプトを使用してムービー (1 秒あたり 20 フレーム、呼吸数に応じて通常速度の 15 ～ 25 倍) に組み立てられました。
すべての LV 遺伝子ベクター送達研究は、アデレード大学の実験動物研究施設で実施され、SPring-8 実験の結果を使用して、磁場の存在下での LV-MP 送達が体内での遺伝子移入を強化できるかどうかを評価することを目的としていました。MP と磁場の効果を評価するために、2 つの動物グループが治療されました。1 つのグループには磁石を配置した LV-MP が投与され、もう 1 つのグループには磁石を配置しない LV-MP を含むコントロール グループが投与されました。
LV 遺伝子ベクターは、以前説明した方法 25、26 を使用して生成されました。LacZ ベクターは、恒常的 MPSV プロモーター (LV-LacZ) によって駆動される核局在化ベータ ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し、これが形質導入細胞で青色の反応産物を生成し、肺組織の前面と組織切片で確認できます。細胞培養での滴定は、血球計算板を使用して LacZ 陽性細胞の数を手動でカウントし、TU/ml で力価を計算することで実施しました。キャリアは -80 °C で凍結保存され、使用前に解凍され、1:1 の比率で混合して CombiMag に結合し、配送前に少なくとも 30 分間氷上でインキュベートします。
正常な Sprague Dawley ラット (n = 3/群、約 2-3 か月齢) に、0.4 mg/kg のメデトミジン (Domitor、Ilium、オーストラリア) と 60 mg/kg のケタミン (Ilium、オーストラリア) の混合物を腹腔内注射して麻酔し、16 Ga iv カニューレで非外科的経口カニューレ挿入を行った。気管気道組織が LV 変換を確実に受け取るように、以前説明した機械的摂動プロトコルを使用して調整した。このプロトコルでは、気管気道表面をワイヤー バスケット (N-Circle、ニチノール チップレス ストーン エクストラクター NTSE-022115) -UDH、Cook Medical、米国) で軸方向に擦った。その後、摂動の約 10 分後に生物学的安全キャビネット内で LV-MP の気管投与を行った。
この実験で使用した磁場は、生体X線画像研究と同様の方法で構成され、蒸留ステントクリップを使用して同じ磁石が気管上に保持されました（図4）。50μl量（2×25μlアリコート）のLV-MPが、前述のようにゲルチップ付きのピペットを使用して気管（n = 3匹）に注入されました。対照群（n = 3匹）には、磁石を使用せずに同じLV-MPが投与されました。注入が完了したら、カニューレをETチューブから取り外し、動物を抜管します。磁石は10分間そのままにしてから取り外します。ラットにメロキシカム（1ml/kg）（Ilium、オーストラリア）を皮下投与し、続いてアチパマゾール塩酸塩（Antisedan、Zoetis、オーストラリア）を腹腔内注射して麻酔を解除しました。ラットは暖かく保たれ、麻酔から完全に回復するまで監視されます。
生物学的安全キャビネット内の LV-MP デリバリーデバイス。ET チューブの明るい灰色の Luer ハブが口から突き出ており、写真に示されているピペットのゲル チップが ET チューブを通して気管の必要な深さまで挿入されています。
LV-MP投与手順の1週間後、動物は100％CO2吸入により人道的に屠殺され、LacZ発現は当社の標準的なX-gal処理法を用いて評価されました。気管内チューブの配置による機械的損傷や体液貯留が分析に含まれないようにするため、尾側の最も軟骨性の3つの輪は除去されました。各気管は分析用に縦方向に切断され、シリコーンゴム（Sylgard、Dow Inc）を含む皿に、Minutien針（Fine Science Tools）を使用してマウントされ、管腔表面が視覚化されました。形質導入された細胞の分布とパターンは、DigiLiteカメラとTCaptureソフトウェア（Tucsen Photonics、中国）を備えたNikon顕微鏡（SMZ1500）を使用して正面撮影によって確認されました。画像は20倍の倍率（気管の全幅に対応する最高設定を含む）で取得され、気管の全長が段階的に画像化され、各画像から、画像の「つなぎ合わせ」ができるように各気管を分割しました。次に、各気管からの画像は、平面モーション アルゴリズムを利用する Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) を使用して 1 つの合成画像に組み立てられました。各動物の気管の合成画像における LacZ 発現領域は、前述のとおり、自動化された MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して、0.35 < 色相 < 0.58、彩度 > 0.15、明度 < 0.7 の設定で定量化されました。組織の輪郭をトレースして、組織領域を識別し、気管組織外からの誤検出を防ぐために、各合成画像に対して GIMP v2.10.24 でマスクを手動で生成しました。各動物のすべての合成画像の染色領域を合計して、その動物の合計染色領域を生成しました。次に、染色領域を合計マスク領域で割って、正規化領域を生成しました。
各気管はパラフィンに包埋され、5 μm の切片が作られました。切片は 5 分間ニュートラル ファスト レッドで対比染色され、Nikon Eclipse E400 顕微鏡、DS-Fi3 カメラ、および NIS 要素キャプチャ ソフトウェア (バージョン 5.20.00) を使用して画像が取得されました。
すべての統計分析は GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) で実行されました。統計的有意性は p ≤ 0.05 に設定されました。正規性は Shapiro-Wilk 検定を使用して検証され、LacZ 染色の差は無対 t 検定を使用して評価されました。
表1に記載されている6つのMPはPCXIを使用して検査され、その可視性は表2に示されています。2つのポリスチレンMP（MP1とMP2、それぞれ18μmと0.25μm）はPCXIでは見えませんでしたが、残りのサンプルは識別できました（例は図5に示されています）。MP3とMP4（10-15% Fe3O4、それぞれ0.25μmと0.9μm）はかすかに見えます。テストされた中で最も小さな粒子がいくつか含まれていますが、MP5（98% Fe3O4、0.25μm）が最も顕著でした。CombiMag製品のMP6は見つけるのが困難です。すべてのケースで、磁石をキャピラリーと平行に前後に移動させることにより、MPの検出能力が大幅に向上しました。磁石がキャピラリーから遠ざかると、粒子は長い紐状に伸びますが、磁石が近づき磁場の強度が増加すると、粒子の紐は短くなりました。粒子は毛細管の上面に向かって移動し（補足ビデオS1: MP4を参照）、表面の粒子密度が増加します。逆に、磁石を毛細管から取り外すと、磁場の強度が低下し、MPは毛細管の上面から伸びる長い紐状に再配置されます（補足ビデオS2: MP4を参照）。磁石の動きが止まった後も、粒子は平衡位置に達した後、しばらく動き続けます。MPが毛細管の上面に近づいたり離れたりすると、磁性粒子は通常、流体を通じて破片を引きずります。
PCXI 下の MP の視認性はサンプル間で大きく異なります。(a) MP3、(b) MP4、(c) MP5、(d) MP6。ここに表示されているすべての画像は、磁石を毛細管の真上約 10 mm に配置して撮影したものです。大きな円として見える部分は毛細管に閉じ込められた気泡で、位相コントラスト画像の白黒のエッジ特徴が明確に示されています。赤いボックスには、コントラストを強調した拡大図が表示されています。すべての図の磁石の図の直径は縮尺どおりではなく、表示されているものの約 100 倍の大きさであることに注意してください。
磁石がキャピラリー上面に沿って左右に移動すると、MPストリングの角度が磁石と一致するように変化し（図6参照）、磁力線が描かれます。MP3-5の場合、弦が閾値角度に達すると、粒子はキャピラリー上面に沿って引きずられます。その結果、多くの場合、MPは磁場が最も強い場所の近くで大きなグループに集まります（補足ビデオS3：MP5参照）。これは、キャピラリーの端近くで画像化した場合に特に顕著で、MPは流体と空気の界面で凝集して集中します。MP3-5よりも識別が困難だったMP6の粒子は、磁石がキャピラリーに沿って移動しても引きずられることなく、MPストリングが解離し、粒子が視野内に残りました（補足ビデオS4：MP6参照）。場合によっては、磁石を画像化位置から大きく移動させることで印加磁場を減少させた場合、残りのMPはチューブ内に留まりながら重力によってチューブの底面へとゆっくりと下降しました。文字列（補足ビデオS5：MP3を参照）。
磁石が毛細管の真上に移動すると、MP ストリングスの角度が変化します。(a) MP3、(b) MP4、(c) MP5、(d) MP6。赤いボックスにはコントラストを強調した拡大図が含まれています。補足ビデオは、これらの静止画像では視覚化できない重要な粒子構造と動的情報を明らかにするため、参考になります。
私たちのテストでは、磁石を気管に沿ってゆっくりと前後に動かすと、生体内での複雑な動きの中で MP を視覚化しやすいことが示されました。ポリスチレン ビーズ (MP1 および MP2) は毛細血管内で見えなかったため、生体内テストは実施されませんでした。残りの 4 つの MP はそれぞれ、磁石の長軸を垂直に対して約 30° の角度で気管の上に配置して生体内でテストしました (図 2b および 3a を参照)。これにより MP チェーンが長くなり、磁石の構成が終端されているよりも効果的でした。MP3、MP4、および MP6 は、どの生きた動物の気管でも検出されませんでした。動物を人道的に殺した後にラットの気道を画像化したときは、シリンジ ポンプを使用して追加容量を加えても粒子は見えませんでした。MP5 は酸化鉄含有量が最も高く、唯一目に見える粒子であったため、MP の生体内挙動を評価および特徴付けるために使用されました。
MP 送達中に磁石を気管上に置くと、すべての MP ではなく多くの MP が視野内に集中しました。気管に入る粒子は、人道的に犠牲になった動物で最もよく観察されます。図 7 および補足ビデオ S6: MP5 は、腹側気管の表面で粒子が急速に磁気的に捕捉されて整列する様子を示しており、MP を気管の目的の領域に導くことができることを示しています。MP 送達後に気管に沿ってさらに遠位に検索すると、一部の MP が気管分岐部の近くに見つかりました。これは、流体プロセス中に最大磁場強度の領域を通って MP ​​が送達されたため、すべての MP を収集して保持するには磁場強度が不十分であったことを示しています。それでも、分娩後の MP 濃度は画像化された領域周辺で高く、多くの MP が、適用された磁場強度が最も高かった気道領域に残ったことを示しています。
磁石をイメージング領域の真上に配置して、最近安楽死させたラットの気管に MP5 を注入する前 (a) と注入後の (b) の画像。イメージング領域は 2 つの軟骨リングの間にあります。MP を注入する前は、気道内にいくらかの液体があります。赤いボックスには、コントラストを強調した拡大図が表示されています。これらの画像は、補足ビデオ S6: MP5 に表示されているビデオからのものです。
生体内で磁石を気管に沿って移動させると、毛細血管の場合と同様に、MP チェーンの角度が気道表面内で変化しました (図 8 および補足ビデオ S7:MP5 を参照)。ただし、私たちの研究では、MP は毛細血管の場合のように生体の気道の表面に沿って引きずられることはありませんでした。磁石が左右に動くと、MP チェーンが長くなる場合があります。興味深いことに、磁石を気管に沿って縦方向に動かすと粒子ストリングによって表面流体層の深さが変化するように見え、磁石を真上に動かして粒子ストリングを垂直位置に回転させると粒子ストリングが拡張することもわかりました (補足ビデオ S7 を参照)。 : MP5 の 0:09、右下)。磁石を気管の上部で横方向に (つまり、気管の長さに沿うのではなく、動物の左または右に) 移動させたときに、特徴的な動きのパターンが変化しました。粒子は移動しながらもはっきりと見えましたが、磁石を気管から取り除くと、粒子の紐の先端が見えるようになりました (補足ビデオ S8:MP5、0:08 から始まる部分を参照)。これは、ガラス毛細管に磁場を印加した状態で観察した MP の挙動と一致しています。
麻酔をかけた生きたラットの気管内の MP5 を示す画像例。(a) 磁石を使用して気管の上部と左側の画像を取得し、次に (b) 磁石を右側に移動した後の画像です。赤いボックスにはコントラストを強調した拡大画像が含まれています。これらの画像は、補足ビデオ S7: MP5 に表示されているビデオからのものです。
2 つの極が気管の上下で南北方向に設定されている場合（つまり、引き合う、図 3b）、MP コードはより長く表示され、気管の背側表面ではなく気管の側壁に位置していました（補足ビデオ S9:MP5 を参照）。しかし、デュアルマグネットデバイスを使用した場合、液体送達後に単一の場所（つまり、気管の背側表面）に高濃度の粒子が検出されませんでした。これは通常、単一磁石デバイスを使用した場合に発生します。次に、1 つの磁石を反対の極に反発するように設定した場合（図 3c）、送達後に視野内に見える粒子の数は増加していないように見えました。両方のデュアルマグネット構成のセットアップは、磁石を引っ張ったり押したりする高い磁場強度のために困難です。その後、セットアップは、磁力線が気管壁を横切るように、気道と平行で気道を 90 度で通過する単一の磁石に変更されました。直交方向（図3d）、側壁での粒子の凝集が観察できるかどうかを判断できるように設計された方向。ただし、この構成では、MP蓄積または磁石の動きが識別できませんでした。これらすべての結果に基づいて、in vivo遺伝子キャリア研究には、単一磁石の30度の方向構成（図3a）が選択されました。
人道的に屠殺した直後の動物を繰り返し撮影したところ、交絡因子となる組織の動きが見られなかったため、軟骨間の明瞭な視野において、磁石の並進運動に合わせて「揺れ動く」、より細く短い粒子線が識別できました。しかしながら、MP6粒子の存在と動きをはっきりと確認することはできませんでした。
LV-LacZ力価は1.8 × 108 TU/mlであり、CombiMag MP（MP6）と1：1で混合した後、動物に9 × 107 TU/ml LV媒体（つまり4.5 × 106 TU/ラット）の50μlの気管内投与を実施した。 ）。これらの研究では、分娩中に磁石を移動させる代わりに、磁石を1つの位置に固定して、LV伝達が（a）磁場がない場合のベクター送達と比較して改善されるか、および（b）気道細胞が上気道の磁性標的領域に伝達されるかどうかを判断した。
磁石の存在と、LVベクターと組み合わせたCombiMagの使用は、当社の標準的なLVベクター送達プロトコルと同様に、動物の健康に悪影響を及ぼさないようでした。機械的摂動を受けた気管領域の正面画像（補足図1）は、磁石が存在する場合、LV-MPで治療した動物群で有意に高いレベルの伝達があったことを示しています（図9a）。コントロール群では、わずかな量の青色LacZ染色のみが存在しました（図9b）。正規化されたX-Gal染色領域の定量化により、磁場の存在下でのLV-MPの投与により、約6倍の改善が得られました（図9c）。
LV-MP による気管内伝達を示す合成画像の例 (a) 磁場がある場合と (b) 磁石がない場合。(c) 磁石を使用した場合の気管内の正規化された LacZ 伝達領域の統計的に有意な改善 (*p = 0.029、t テスト、グループあたり n = 3、平均 ± SEM)。
ニュートラルファストレッド染色切片（補足図 2 に例を示す）では、以前に報告されたものと同様のパターンと位置で LacZ 染色細胞が存在していることが示されている。
気道遺伝子治療における重要な課題は、気流と能動的な粘液クリアランスがある動く肺において、キャリア粒子を目的の領域に正確に局在させ、高いレベルの導入効率を達成することです。CF気道疾患の治療用に設計されたLVキャリアにとって、伝導気道内でのキャリア粒子の滞留時間を延長することは、これまで困難な目標でした。Castellaniらが指摘したように、磁場を使用して導入を改善する方法は、電気穿孔法などの他の遺伝子送達方法と比較して、単純さ、費用対効果、送達の局所性、効率性の向上、インキュベーション時間の短縮、およびおそらくキャリア用量の低減を組み合わせることができるため、利点があります10。ただし、外部磁力の影響下にある磁性粒子の気道内での生体内沈着および挙動はこれまで説明されておらず、この方法が損傷を受けていない生体気道で遺伝子発現レベルを高めるために生体内で実現可能であることも実際に実証されていません。
私たちの in vitro シンクロトロン PCXI 実験では、ポリスチレン MP を除くテストしたすべての粒子が、使用した画像化セットアップで見えることが示されました。磁場が存在すると、MP は、粒子の種類と磁場の強度 (つまり、磁石の近接性と動き) に関連する長さのストリングを形成します。図 10 に示すように、私たちが観察したストリングは、各個別の粒子が磁化され、独自の局所磁場を誘導することによって形成されます。これらの個別の磁場により、他の同様の粒子が凝集して接続され、他の粒子の局所的な引力と反発力による局所的な力により、グループのストリングのような動きが発生します。
(a、b) 液体で満たされた毛細血管内で生成された粒子列と (c、d) 空気で満たされた気管を示す模式図。毛細血管と気管は縮尺どおりに描かれていないことに注意してください。パネル (a) には、Fe3O4 粒子がひも状に配置された MP の説明も含まれています。
磁石をキャピラリー上空に移動させると、Fe3O4を含むMP3-5の粒子列の角度が臨界閾値に達し、その後、粒子列は元の位置を保たず、表面に沿って新しい位置に移動しました。この効果は、ガラスキャピラリー表面が滑らかであるため、この動きが許容されると考えられます。興味深いことに、MP6（CombiMag）はこのような挙動を示しませんでした。これは、粒子が小さかった、コーティングや表面電荷が異なっていた、あるいは独自のキャリア流体が粒子の移動能力に影響を与えたためと考えられます。CombiMag粒子の画像コントラストも弱く、流体と粒子の密度が同程度であるため、互いに容易に移動できない可能性を示唆しています。磁石の動きが速すぎると粒子が引っかかることもあり、磁場強度が流体中の粒子間の摩擦を常に克服できるわけではないことを示しています。これは、磁場強度と磁石とターゲット領域間の距離が、おそらく驚くべきことではないことを示唆しています。非常に重要です。これらの結果を総合すると、磁石はターゲットを通過する多くのMPを捕捉できる一方で、この領域では、磁石を使用して CombiMag 粒子を気管の表面に沿って移動させることは難しいと考えられます。したがって、生体内の LV-MP 研究では、静磁場を利用して気道樹の特定の領域を物理的にターゲットとする必要があるという結論に達しました。
粒子が体内に送り込まれると、複雑に動く体組織の中で識別するのは困難ですが、磁石を気管上で水平に移動させて MP ​​ストリングを「揺らす」ことで検出能力が向上しました。生きた状態でのイメージングは​​可能ですが、動物を人道的に殺処分すると、粒子の動きをより簡単に識別できます。磁石をイメージング領域の上に配置した場合、この位置で MP 濃度が一般的に最も高くなりますが、一部の粒子は通常、気管に沿ってさらに進んだところで見つかります。in vitro 研究とは対照的に、磁石を移動させることで粒子が気管に沿って引きずられることはありません。この発見は、気管の表面を覆う粘液が通常、吸入された粒子を処理し、それらを粘液中に捕捉し、その後粘液繊毛クリアランス機構によって排除する方法と一致しています。
気管の上下に磁石を吸引する（図3b）ことで、磁場が一点に集中するのではなく、より均一な磁場が得られ、粒子の分布がより均一になる可能性があるという仮説を立てました。しかし、予備研究ではこの仮説を裏付ける明確な証拠は得られませんでした。同様に、一対の磁石を反発するように構成しても（図3c）、撮像領域への粒子沈着量は増加しませんでした。これらの2つの結果は、デュアルマグネット構成ではMP標的の局所制御が大幅に改善されず、結果として生じる強力な磁力の設定が困難であるため、このアプローチは実用的ではないことを示しています。同様に、磁石を気管の上部および気管を貫通するように配置しても（図3d）、撮像領域に保持される粒子数は増加しませんでした。これらの代替構成の中には、沈着領域内の磁場強度が低下するため、成功しないものもあります。したがって、30度の角度を持つ単一の磁石構成（図3a）が最も容易かつ効率的であると考えられます。生体内試験法。
LV-MP 研究では、LV ベクターを CombiMag と組み合わせて磁場の存在下で物理的摂動を与えた後に送達すると、コントロールと比較して気管内での導入レベルが大幅に増加することが示されました。シンクロトロン画像研究と LacZ の結果に基づくと、磁場によって LV が気管内に保持され、肺の奥深くまで直ちに浸透するベクター粒子の数を減らすことができたようです。このような標的化の改善により、送達された力価、オフターゲット導入、炎症および免疫の副作用、遺伝子キャリアのコストを削減しながら、有効性が向上する可能性があります。重要なのは、製造元によると、CombiMag は他のウイルスベクター (AAV など) や核酸を含む他の遺伝子導入方法と組み合わせて使用​​できることです。