Nature.comにご訪問いただきありがとうございます。お使いのブラウザのバージョンはCSSのサポートが制限されています。最適な閲覧体験のために、最新のブラウザをご利用いただくか、Internet Explorerの互換表示モードをオフにすることをお勧めします。当面の間、継続的なサポートを確保するため、スタイルシートとJavaScriptを使用せずにサイトを表示いたします。
嚢胞性線維症肺疾患の治療のための遺伝子ベクターは、末梢肺への遺伝子導入では治療効果が得られないため、気道を標的とする必要があります。ウイルス形質導入効率は、ベクターの滞留時間に直接関係します。しかし、遺伝子キャリアなどの送達液は、吸気時に肺胞に自然に拡散し、あらゆる形態の治療粒子は粘液線毛輸送によって急速に除去されます。気道における遺伝子キャリアの滞留時間を延長することは重要ですが、達成は困難です。気道表面に誘導できる遺伝子キャリア結合磁性粒子は、局所的な標的化を改善できます。生体内可視化の課題のため、印加磁場の存在下での気道表面におけるこのような小さな磁性粒子の挙動は十分に理解されていません。本研究の目的は、シンクロトロンイメージングを使用して、麻酔ラットの気管内の一連の磁性粒子の生体内運動を可視化し、生体内における個々の粒子およびバルク粒子の挙動のダイナミクスとパターンを調べることでした。次に、レンチウイルス磁性粒子の送達が磁場の存在はラット気管における形質導入効率を高める。シンクロトロンX線イメージングにより、静止磁場および移動磁場における磁性粒子の挙動がin vitroおよびin vivoで明らかになる。粒子は磁石で生体気道の表面に沿って容易に引きずることはできないが、輸送中、沈着物は磁場が最も強い視野に集中する。レンチウイルス磁性粒子を磁場の存在下で投与した場合、形質導入効率も6倍に増加した。これらの結果を総合すると、レンチウイルス磁性粒子と磁場は、遺伝子ベクターのターゲティングを改善し、in vivoの伝導気道における形質導入レベルを高めるための有効なアプローチとなる可能性がある。
嚢胞性線維症（CF）は、CF膜貫通コンダクタンス調節因子（CFTR）と呼ばれる単一の遺伝子の変異によって引き起こされます。CFTRタンパク質は、CF病態形成の主要部位である気道を含む、体中の多くの上皮細胞に存在するイオンチャネルです。CFTRの欠陥は、異常な水分輸送を引き起こし、気道表面を脱水させ、気道表面液（ASL）層の深さを減少させます。これにより、気道から吸入された粒子や病原体を除去する粘液線毛輸送（MCT）システムの能力も損なわれます。私たちの目標は、CFTR遺伝子の正しいコピーを送達し、ASL、MCT、および肺の健康を改善するレンチウイルス（LV）遺伝子治療を開発し、これらのパラメーターをin vivoで測定できる新しい技術の開発を継続することです1。
LVベクターは、CF気道遺伝子治療の有力候補の一つです。これは主に、治療遺伝子を気道基底細胞（気道幹細胞）に永続的に組み込むことができるためです。これは、機能的な遺伝子修正されたCF関連気道表面細胞に分化することで、正常な水分補給と粘液クリアランスを回復させ、生涯にわたる利益をもたらすことができるため重要です。LVベクターは、CF肺疾患が始まる気道に向けられるべきです。ベクターを肺のより深いところに送達すると、肺胞形質導入が起こる可能性がありますが、CFでは治療上の利点はありません。しかし、遺伝子キャリアなどの液体は、送達後に吸気時に自然に肺胞に移動し3,4、治療粒子はMCTによって口腔内に迅速に除去されます。LV形質導入効率は、ベクターが標的細胞の隣に留まり、細胞への取り込みを可能にする時間、つまり「滞留時間」5に直接関係しており、これは典型的な局所気流、協調的な粒子粘液捕捉、およびMCTによって容易に短縮されます。CFの場合、気道内でのLVの滞留時間は、この領域で高いレベルの形質導入を達成するために重要であるが、これまで課題となっていた。
この障害を克服するために、LV磁性粒子（MP）が2つの相補的な方法で役立つ可能性があると我々は考えている。1つ目は、磁気誘導により気道表面に誘導され、ターゲティングを改善し、遺伝子キャリア粒子が目的の気道領域に留まるようにすること。2つ目は、ASL（気道表面液）を細胞層に移動させることである。6. MPは、抗体、化学療法薬、または細胞膜に付着するその他の小分子に結合し、または関連する細胞表面受容体に結合して静電気の存在下で腫瘍部位に蓄積する場合、標的薬物送達媒体として広く使用されている。がん治療における磁場 7. その他の「温熱療法」技術は、振動磁場に曝されたMPを加熱し、それによって腫瘍細胞を破壊することを目的としています。磁場をトランスフェクション剤として用いて細胞へのDNA導入を促進する磁気トランスフェクションの原理は、形質導入が困難な細胞株に対して、さまざまな非ウイルス性およびウイルス性遺伝子ベクターを用いてin vitroで一般的に使用されています。LV磁気トランスフェクションの有効性は確立されており、静磁場の存在下でヒト気管支上皮細胞株にLV-MPをin vitroで送達すると、LVベクター単独の場合と比較して形質導入効率が186倍に増加しました。LV-MPはin vitroのCFモデルにも適用されており、CF喀痰の存在下で気液界面培養におけるLV形質導入が磁気トランスフェクションによって20倍に増加しました10。しかし、臓器のin vivo磁気トランスフェクションは比較的注目されておらず、少数の動物でしか評価されていません。研究11,12,13,14,15、特に肺16,17。それにもかかわらず、CF肺治療における磁気トランスフェクションの可能性は明らかである。Tanら（2020）は、「効率的な磁性ナノ粒子の肺送達の概念実証研究は、CF患者の臨床転帰を改善するための将来のCFTR吸入戦略への道を開くだろう」と述べている6。
印加磁場下での気道表面上の小さな磁性粒子の挙動は、可視化や研究が難しく、そのため十分に理解されていません。他の研究では、ASL の深さ 18 および MCT の挙動 19,20 の微細な生体内変化を非侵襲的に可視化および定量化するためのシンクロトロン伝播ベースの位相コントラスト X 線イメージング (PB-PCXI) 法を開発し、ガス管表面の水和を直接測定し、治療効果の早期指標として使用しました。さらに、MCT 評価法では、アルミナまたは高屈折率ガラスで構成された 10～35 µm 径の粒子を PB-PCXI で可視化できる MCT マーカーとして使用しています 21。これらの技術はどちらも、MP を含むさまざまな粒子タイプの可視化に適しています。
空間的および時間的な分解能が高いため、PB-PCXI ベースの ASL および MCT 分析技術は、生体内での単一およびバルク粒子の挙動のダイナミクスとパターンを調べ、MP 遺伝子送達技術を理解して最適化するのに非常に適しています。ここで採用するアプローチは、SPring-8 BL20B2 ビームラインを使用した研究から派生したもので、マウスの鼻腔および肺気道への偽ベクター投与後の流体の動きを可視化し、遺伝子キャリア投与動物研究で観察された不均一な遺伝子発現パターンを説明するのに役立てました 3,4 。
この研究の目的は、シンクロトロンPB-PCXIを使用して、生きたラットの気管内の一連のMPの生体内運動を可視化することであった。これらのPB-PCXIイメージング研究は、MPの動きに対する影響を判断するために、さまざまなMP、磁場強度、および位置をテストするように設計された。外部から印加された磁場は、送達されたMPが標的領域に留まるか移動するのに役立つと仮説を立てた。これらの研究により、沈着後に気管内に保持される粒子の数を最大化する磁石構成を特定することもできた。2番目の研究シリーズでは、気道ターゲティングの状況でのLV-MPの送達がLVトランスダクション効率の向上につながるという仮定に基づいて、この最適な構成を使用して、ラットの気道へのLV-MPの生体内送達によって生じるトランスダクションパターンを実証しようとした。
すべての動物実験は、アデレード大学（M-2019-060およびM-2020-022）およびSPring-8シンクロトロン動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。実験はARRIVEガイドラインに従って実施されました。
すべてのX線イメージングは​​、日本のSPring-8シンクロトロンのBL20XUビームラインで、以前に説明したのと同様のセットアップを使用して実行されました21,22。簡単に説明すると、実験ボックスはシンクロトロン蓄積リングから245m離れた場所にありました。位相コントラスト効果を生成するために、粒子イメージング研究では0.6m、生体イメージング研究では0.3mのサンプル-検出器間距離が使用されました。25keVの単色ビームエネルギーが使用されました。画像は、sCMOS検出器に接続された高解像度X線コンバータ（SPring-8 BM3）を使用して取得されました。コンバータは、10µm厚のシンチレータ（Gd3Al2Ga3O12）を使用してX線を可視光に変換し、その後、×10顕微鏡対物レンズ（NA 0.3）を使用してsCMOSセンサーに導かれます。sCMOS検出器は、アレイサイズがOrca-Flash4.0（浜松ホトニクス、日本）でした。 2048 × 2048 ピクセル、生のピクセル サイズは 6.5 × 6.5 µm です。この設定により、実効等方性ピクセル サイズは 0.51 µm、視野は約 1.1 mm × 1.1 mm になります。呼吸による動きのアーチファクトを最小限に抑えつつ、気道内外の磁性粒子の信号対雑音比を最大化するために、露光時間は 100 ms に設定しました。生体内研究では、露光間の X 線ビームを遮断して放射線量を制限するために、高速 X 線シャッターを X 線経路に配置しました。
BL20XUイメージングチャンバーはバイオセーフティレベル2の認証を受けていないため、LVキャリアはSPring-8 PB-PCXIイメージング研究では使用されませんでした。代わりに、まず磁場がガラス毛細管内、次に生体気道内のMPの動きにどのように影響するかを理解するため、さまざまなサイズ、材質、鉄濃度、用途を網羅する、特性がよく分かっている2つの市販サプライヤーのMPを選択しました。表面に付着したMPのサイズは0.25～18μmで、さまざまな材料から作られています（表1参照）。ただし、MP内の磁性粒子のサイズを含む各サンプルの組成は不明です。広範なMCT研究19、20、21、23、24に基づき、例えば連続フレームを差し引くことでMPの動きの視認性を高めることにより、5μm程度の小さなMPでも気管気道表面で見ることができると予想されます。0.25μmサイズの単一のMPはイメージングデバイスの解像度よりも小さいですが、PB-PCXIは、沈着後に沈着した表面流体の体積コントラストと動きを検出すると予想されます。
表1に示す各MPのサンプルは、内径0.63 mmの20 μlガラスキャピラリー（Drummond Microcaps、ペンシルベニア州、米国）で調製した。微粒子は水に溶解されており、CombiMag粒子はメーカー独自の液体に溶解されている。各チューブに液体を半分（約11 μl）充填し、サンプルホルダーに置いた（図1参照）。ガラスキャピラリーはそれぞれイメージングボックス内のサンプルステージに水平に配置し、液体の端を所定の位置に合わせました。残留磁化1.17テスラの直径19 mm（長さ28 mm）のニッケルシェル希土類ネオジム鉄ホウ素（NdFeB）磁石（N35、カタログ番号LM1652、Jaycar Electronics、オーストラリア）を別の移動ステージに取り付け、イメージング中に遠隔操作で位置を変更できるようにした。X線画像の取得は、磁石がサンプルから約30 mm上に位置したときに開始され、画像は4フレームのレートで取得される。毎秒。画像撮影中、磁石をガラス毛細管に近づけ（約1mm離れたところ）、その後管に沿って移動させて、磁場強度と位置の影響を評価した。
試料XY移動ステージ上にガラスキャピラリー内のMP試料を含むin vitroイメージング装置。X線ビームの経路は赤い破線で示されている。
MPのin vitroでの可視性が確立された後、その一部が野生型雌アルビノWistarラット（約12週齢、約200g）でin vivo試験された。0.24 mg/kgのメデトミジン（Domitor®、Zenoaq、日本）、3.2 mg/kgのミダゾラム（Dormicum®、アステラス製薬、日本）、および4 mg/kgのブトルファノール（Vetorphale®、明治製菓）を腹腔内注射により投与し、ラットを麻酔した。麻酔後、気管周囲の毛を剃り、気管内チューブ（ET；16 Ga ivカニューラ、テルモBCT）を挿入し、体温を維持するための保温バッグを含む特注のイメージングプレート上に仰向けに固定して、イメージングの準備を行った22。イメージングプレートは、イメージングボックス内のサンプル移動ステージにわずかに角度をつけて取り付けられ、図2aに示すように、X線画像では気管が水平に写っている。
(a) SPring-8イメージングボックス内の生体イメージングセットアップ。X線ビームの経路は赤い破線で示されている。(b,c) 直交して取り付けられた2台のIPカメラを使用して、気管上の磁石の位置を遠隔で特定した。画面画像の左側には、頭部を保持するワイヤーループと、ETチューブ内に所定の位置にあるデリバリーカニューレが見える。
100 μl ガラスシリンジを使用した遠隔操作式シリンジポンプシステム (UMP2、World Precision Instruments、フロリダ州サラソタ) を、30 Ga 針を介して PE10 チューブ (外径 0.61 mm、内径 0.28 mm) に接続した。ET チューブを挿入する際に先端が気管内の正しい位置にあることを確認するために、チューブに印を付ける。マイクロポンプを使用して、チューブの先端を送達する MP サンプルに浸した状態でシリンジのプランジャーを引き抜く。次に、充填された送達チューブを気管内チューブに挿入し、先端を想定される印加磁場の最も強い部分に配置する。画像取得は、Arduino ベースのタイミングボックスに接続された呼吸検出器を使用して制御され、すべての信号 (温度、呼吸、シャッターの開閉、画像取得など) は Powerlab および LabChart (AD Instruments、オーストラリア、シドニー) を使用して記録された 22。 （パナソニックBB-SC382）は互いに約90°の位置に配置され、画像撮影中に気管に対する磁石の位置を監視するために使用されました（図2b、c）。動きによるアーチファクトを最小限に抑えるため、呼気終末流量プラトー中に1回の呼吸につき1枚の画像を取得しました。
イメージングハウジングの外部から遠隔操作できる第 2 段に磁石が取り付けられています。さまざまな磁石の位置と構成がテストされました。これには、気管の上約 30° の角度で取り付けられた構成 (図 2a および 3a に示す構成)、動物の上方に 1 つの磁石、下方にもう 1 つの磁石があり、極が引き合うように設定されている構成 (図 3b)、動物の上方に 1 つの磁石、下方にもう 1 つの磁石があり、極が反発するように設定されている構成 (図 3c)、気管の上方かつ気管に対して垂直な 1 つの磁石 (図 3d) が含まれます。動物と磁石が構成され、テスト対象の MP がシリンジポンプにロードされたら、画像を取得しながら 4 μl/sec の速度で 50 μl の投与量を注入します。次に、画像を取得し続けながら、磁石を気管に沿って前後または横方向に移動します。
生体イメージング用の磁石配置 (a) 気管の上に約 30° の角度で単一の磁石を配置、(b) 磁石を 2 つ引き付けるように設定、(c) 磁石を 2 つ反発するように設定、(d) 気管の上に垂直に単一の磁石を配置。観察者は気管を通して口から肺を見下ろし、X 線ビームはラットの左側を通過して右側から出ました。磁石は気道の長さに沿って移動するか、気管の上で X 線ビームの方向に左右に移動します。
また、呼吸や心臓の動きといった交絡要因がない状態で、気道内の粒子の視認性や挙動を判定することも目的とした。そのため、画像撮影期間終了後、動物はペントバルビタール過剰投与（ソムノペンチル、ピットマン・ムーア社、米国ワシントンクロッシング；約65 mg/kg腹腔内投与）により安楽死させた。一部の動物は画像撮影台上に残し、呼吸と心拍が停止したら、気道表面にMPが見られない場合はMPを追加投与して画像撮影を繰り返した。
取得した画像は、フラットフィールド補正とダークフィールド補正を行い、その後、MATLAB（R2020a、The Mathworks）で作成したカスタムスクリプトを使用して、動画（毎秒20フレーム、呼吸数に応じて通常の15～25倍の速度）に組み立てました。
すべてのLV遺伝子ベクター送達研究は、アデレード大学の実験動物研究施設で実施され、SPring-8実験の結果を利用して、磁場の存在下でのLV-MP送達が生体内での遺伝子導入を促進できるかどうかを評価することを目的としていました。MPと磁場の影響を評価するために、2つの動物群が治療されました。1つの群には磁石を置いた状態でLV-MPが投与され、もう1つの群には磁石のない状態でLV-MPを投与する対照群が与えられました。
LV遺伝子ベクターは、既述の方法25、26を用いて作製した。LacZベクターは、構成的MPSVプロモーター（LV-LacZ）によって駆動される核局在型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現し、形質導入細胞内で青色の反応生成物を生成し、肺組織切片および組織切片で観察できる。滴定は、血球計算盤を用いてLacZ陽性細胞数を手動でカウントし、TU/ml単位で力価を計算することにより、細胞培養で実施した。キャリアは-80℃で凍結保存し、使用前に解凍し、1:1の比率で混合して少なくとも30分間氷上でインキュベートすることにより、CombiMagに結合させてから投与する。
正常な Sprague Dawley ラット (n = 3/グループ、約 2～3 か月齢) に、0.4 mg/kg のメデトミジン (Domitor、Ilium、オーストラリア) と 60 mg/kg のケタミン (Ilium、オーストラリア) の混合液を腹腔内注射し、16 Ga の iv カニューレを使用して非外科的に経口カニューレを挿入した。気管気道組織が LV トランスダクションを受けることを確実にするため、気管気道表面をワイヤーバスケット (N-Circle、Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH、Cook Medical、米国) で軸方向に 30 秒間こする、我々が以前に説明した機械的摂動プロトコルを使用して気管気道を調整した。摂動後約 10 分後に、生物学的安全キャビネット内で LV-MP の気管投与を行った。
この実験で使用した磁場は、生体内X線画像研究と同様の方法で構成され、同じ磁石を蒸留ステントクリップを用いて気管上に保持した（図4）。50 μlのLV-MP（25 μlアリコート×2）を、前述のようにゲルチップ付きピペットを用いて気管内に投与した（n = 3匹）。対照群（n = 3匹）には、磁石を使用せずに同じLV-MPを投与した。注入が完了したら、カニューレを気管チューブから外し、動物を抜管する。磁石は10分間そのままにしておき、その後外す。ラットには、メロキシカム（1 ml/kg）（Ilium、オーストラリア）を皮下投与し、続いてアチパマゾール塩酸塩（Antisedan、Zoetis、オーストラリア）1 mg/kgを腹腔内注射して麻酔を解除した。ラットは保温し、完全に回復するまで観察した。麻酔からの回復。
生物学的安全キャビネット内のLV-MP送達装置。ETチューブの薄灰色のルアーハブが口から突き出ているのが見え、写真に示されているピペットのゲルチップはETチューブを通して気管内の所望の深さまで挿入される。
LV-MP投与手順の1週間後、動物は100% CO2吸入により人道的に安楽死させ、標準的なX-gal処理を用いてLacZ発現を評価した。気管内チューブ挿入による機械的損傷や体液貯留が解析に含まれないように、尾側の3つの軟骨輪を除去した。各気管を縦方向に切断して2つの半分に分け、シリコンゴム（Sylgard、Dow Inc）を含むシャーレにMinutien針（Fine Science Tools）を用いて固定し、内腔表面を可視化した。形質導入細胞の分布とパターンは、Nikon顕微鏡（SMZ1500）とDigiLiteカメラ、TCaptureソフトウェア（Tucsen Photonics、中国）を用いた正面撮影により確認した。画像は20倍の倍率（気管の全幅を捉える最高倍率を含む）で取得し、気管の全長を段階的に撮影し、各画像間に十分な重なりを確保した。画像の「スティッチング」を可能にする。次に、各気管からの画像を、平面モーションアルゴリズムを使用して Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) を使用して単一の合成画像に組み立てた。各動物の気管の合成画像における LacZ 発現領域は、以前に説明したように、0.35 < Hue < 0.58、Saturation > 0.15、および Value < 0.7 の設定を使用して、自動化された MATLAB スクリプト (R2020a、MathWorks) を使用して定量化した。組織の輪郭をトレースすることにより、組織領域を識別し、気管組織の外側からの誤検出を防ぐために、各合成画像に対して GIMP v2.10.24 でマスクを手動で生成した。各動物のすべての合成画像の染色領域を合計して、その動物の総染色領域を生成した。次に、染色領域を総マスク領域で割って、正規化された領域を生成した。
各気管をパラフィンに包埋し、5μmの切片を作製した。切片をニュートラルファストレッドで5分間対比染色し、ニコンEclipse E400顕微鏡、DS-Fi3カメラ、NISエレメントキャプチャソフトウェア（バージョン5.20.00）を使用して画像を取得した。
すべての統計解析はGraphPad Prism v9（GraphPad Software, Inc.）を用いて実施した。統計的有意水準はp ≤ 0.05とした。正規性はシャピロ・ウィルク検定を用いて検証し、LacZ染色における差異は対応のないt検定を用いて評価した。
表1に記載されている6種類のマイクロ粒子（MP）をPCXIを用いて検査し、その可視性を表2に示した。2種類のポリスチレン製MP（MP1およびMP2、それぞれ18μmおよび0.25μm）はPCXIでは見えなかったが、残りのサンプルは識別可能であった（例を図5に示す）。MP3およびMP4（10～15% Fe3O4、それぞれ0.25μmおよび0.9μm）はかすかに見える。試験した粒子の中で最も小さい粒子を含むにもかかわらず、MP5（98% Fe3O4、0.25μm）が最も顕著であった。CombiMag製品であるMP6は見つけにくい。いずれの場合も、磁石を毛細管と平行に前後に動かすことで、MPの検出能力が大幅に向上した。磁石が毛細管から離れると、粒子は長い糸状に伸びたが、磁石が近づき磁場強度が増加すると、粒子が移動するにつれて粒子の糸は短くなった。粒子は毛細管の上面に向かって移動し（補足ビデオS1：MP4を参照）、表面の粒子密度が増加します。逆に、磁石を毛細管から取り外すと、磁場強度が低下し、MPは毛細管の上面から伸びる長い紐状に再配置されます（補足ビデオS2：MP4を参照）。磁石の動きが止まった後も、粒子は平衡位置に達した後、しばらくの間動き続けます。MPが毛細管の上面に向かって移動したり、上面から離れたりすると、磁性粒子は通常、流体を通してデブリを引きずります。
PCXI 下での MP の視認性はサンプルによって大きく異なります。(a) MP3、(b) MP4、(c) MP5、(d) MP6。ここに示した画像はすべて、毛細管の真上約 10 mm の位置に磁石を配置して撮影したものです。大きな円は毛細管内に閉じ込められた気泡で、位相差イメージングの白黒のエッジの特徴がはっきりと示されています。赤い枠はコントラスト強調拡大を示しています。なお、すべての図の磁石の模式の直径は縮尺どおりではなく、表示されているものより約 100 倍大きくなっています。
磁石が毛細管の上部に沿って左右に移動すると、MPストリングの角度が磁石と一致するように変化し（図6参照）、磁力線が明確になります。MP3-5の場合、弦が閾値角度に達すると、粒子は毛細管の上面に沿って引きずられます。これにより、磁場が最も強い場所の近くでMPがより大きなグループに凝集することがよくあります（補足ビデオS3：MP5参照）。これは、毛細管の端の近くをイメージングする場合にも特に顕著で、MPが流体と空気の界面に凝集して集中します。MP3-5よりも識別が困難だったMP6の粒子は、磁石が毛細管に沿って移動しても引きずられませんでしたが、MPストリングが解離し、粒子が視野内に残りました（補足ビデオS4：MP6参照）。場合によっては、磁石をイメージング位置から大きく移動して印加磁場を減少させると、残ったMPはストリング内に留まったまま、重力によってチューブの底面にゆっくりと沈降しました（補足動画S5：MP3）。
磁石を毛細管の上で右方向に移動させると、MPストリングの角度が変わります。(a) MP3、(b) MP4、(c) MP5、(d) MP6。赤い枠はコントラスト強調拡大を示しています。補足ビデオは、これらの静止画像では視覚化できない重要な粒子構造と動的情報を明らかにするため、参考になります。
我々のテストでは、磁石を気管に沿ってゆっくりと前後に動かすことで、生体内での複雑な動きの中での MP の可視化が容易になることが示された。ポリスチレンビーズ (MP1 および MP2) が毛細管内で見えなかったため、生体内テストは実施されなかった。残りの 4 つの MP はそれぞれ、磁石の長軸を気管の上方に垂直に対して約 30° の角度で配置して生体内でテストされた (図 2b および 3a を参照)。これは、より長い MP チェーンをもたらし、終了した磁石構成よりも効果的であった。MP3、MP4、および MP6 は、どの生きた動物の気管でも検出されなかった。動物を人道的に殺した後、ラットの気道を画像化したとき、シリンジポンプを使用して追加の容量を追加しても、粒子は見えなかった。MP5 は酸化鉄含有量が最も高く、唯一見える粒子であったため、MP の生体内挙動を評価および特徴付けるために使用された。
MP 投与中に磁石を気管の上に置くと、視野内に多くの MP が集中したが、すべてではなかった。気管に入った粒子は、人道的に屠殺された動物で最もよく観察できる。図 7 および補足ビデオ S6: MP5 は、腹側気管表面での粒子の迅速な磁気捕捉と整列を示しており、MP を気管の目的の領域に誘導できることを示している。MP 投与後に気管に沿ってより遠位側を探索すると、一部の MP が気管分岐部に近い位置で見つかった。これは、流体プロセス中に磁場強度が最大となる領域を通って投与されたため、すべての MP を収集して保持するには磁場強度が不十分であったことを示唆している。それにもかかわらず、分娩後の MP 濃度は画像化された領域周辺で高く、多くの MP が印加された磁場強度が最も高い気道領域に残っていたことを示唆している。
（a）最近安楽死させたラットの気管にMP5を投与する前と（b）投与後の画像。磁石は画像領域の真上に配置されている。画像領域は2つの軟骨輪の間にある。MP投与前には気道内に液体が存在する。赤い枠はコントラスト強調拡大を示している。これらの画像は補足ビデオS6：MP5に示されているビデオからのものである。
生体内で気管に沿って磁石を移動させると、毛細血管で見られるのと同様の方法で、気道表面内の MP 鎖の角度が変化しました (図 8 および補足ビデオ S7:MP5 を参照)。ただし、本研究では、毛細血管の場合のように、生体気道の表面に沿って MP ​​を引きずることはできませんでした。場合によっては、磁石が左右に移動すると MP 鎖が長くなります。興味深いことに、磁石を気管に沿って縦方向に移動させると、粒子ストリングが表面流体層の深さを変化させ、磁石を真上に移動させて粒子ストリングを垂直位置に回転させると、粒子ストリングが拡張することもわかりました (補足ビデオ S7 を参照)。 : MP5、0:09、右下）。磁石を気管の上部を横方向に移動させたとき（つまり、気管の長さに沿ってではなく、動物の左右に移動させたとき）、特徴的な動きのパターンが変わりました。粒子は動いている間もはっきりと見えましたが、磁石を気管から取り除くと、粒子の列の先端が見えました（補足ビデオS8:MP5、0:08から参照）。これは、ガラス毛細管内で印加された磁場の下で観察されたMPの挙動と一致しています。
生きた麻酔ラットの気管内のMP5を示す例画像。(a) 磁石を使用して気管の上と左側の画像を取得し、(b) 磁石を右に移動した後。赤い枠はコントラスト強調拡大を示しています。これらの画像は、補足ビデオS7:MP5に示されているビデオからのものです。
2つの極を気管の上と下に南北方向に配置した場合（すなわち、引き合うように配置した場合、図3b）、MPコードはより長く見え、気管の背側表面ではなく側壁に位置していました（補足ビデオS9：MP5を参照）。しかし、通常シングルマグネットデバイスを使用した場合に見られるような、単一の場所（すなわち、気管の背側表面）での粒子の高濃度は、デュアルマグネットデバイスを使用した場合には、液体投与後には検出されませんでした。次に、一方の磁石を逆極性の反発力を持つように配置した場合（図3c）、投与後に視野内で見える粒子の数は増加しないように見えました。どちらのデュアルマグネット構成も、磁石をそれぞれ引き寄せたり押したりする高い磁場強度のため、セットアップが困難です。そこで、セットアップを、気道に平行だが気道を90度で通過するシングルマグネットに変更し、磁力線が気管壁を直交するようにしました。 （図3d）は、側壁上の粒子凝集が観察できるかどうかを判断するために設計された向きです。しかし、この構成では、MP蓄積の識別可能な動きや磁石の動きはありませんでした。これらの結果すべてに基づいて、単一磁石、30度の向きの構成（図3a）がin vivo遺伝子キャリア研究のために選択されました。
人道的な方法で動物を殺処分した直後に繰り返し画像撮影を行ったところ、組織の動きによる混乱がなかったため、軟骨間領域ではより細く短い粒子線が識別でき、磁石の並進運動に合わせて「揺れ」ながら観察された。しかしながら、MP6粒子の存在と動きを明確に確認することは依然としてできなかった。
LV-LacZの力価は1.8 × 108 TU/mlで、CombiMag MP（MP6）と1:1で混合した後、動物には9 × 107 TU/mlのLVビヒクル（すなわち4.5 × 106 TU/ラット）を50 μl気管内投与した。）これらの研究では、分娩中に磁石を移動させる代わりに、磁石を1つの位置に固定して、LV形質導入が（a）磁場がない場合のベクター送達と比較して改善できるか、および（b）集中できるかを調べた。気道細胞は、上気道の磁気標的領域に形質導入される。
磁石の存在と CombiMag と LV ベクターの組み合わせの使用は、標準的な LV ベクター送達プロトコルと同様に、動物の健康に悪影響を及ぼさないようでした。機械的摂動を受けた気管領域の正面画像 (補足図 1) は、磁石が存在する場合に LV-MP で処理された動物群で形質導入レベルが有意に高いことを示しました (図 9a)。対照群では、青色の LacZ 染色が少量しか見られませんでした (図 9b)。正規化された X-Gal 染色領域の定量化により、磁場の存在下で LV-MP を投与すると約 6 倍の改善が得られたことが示されました (図 9c)。
LV-MPによる気管内トランスダクションを示す合成画像の例。(a)磁場が存在する場合と(b)磁石が存在しない場合。(c)磁石を使用した場合、気管内の正規化されたLacZトランスダクション領域が統計的に有意に改善した（*p = 0.029、t検定、各グループn = 3、平均±SEM）。
ニュートラルファストレッドで染色した切片（補足図2に例を示す）では、LacZ染色された細胞が以前に報告されたものと同様のパターンと位置で存在していた。
気道遺伝子治療における重要な課題は、キャリア粒子を目的の領域に正確に局在させ、気流と活発な粘液除去が存在する動いている肺で高いレベルの形質導入効率を達成することである。CF気道疾患を治療するために設計されたLVキャリアの場合、伝導気道内でのキャリア粒子の滞留時間を長くすることは、これまで達成できなかった目標であった。Castellaniらが指摘したように、形質導入を改善するために磁場を使用することは、エレクトロポレーションなどの他の遺伝子送達方法と比較して、簡便性、費用対効果、送達の局在化、効率の向上、短いインキュベーション時間、そしておそらくより少ないキャリア投与量を組み合わせることができるという利点がある10。しかし、外部磁力の影響下での気道における磁性粒子の生体内沈着と挙動はこれまで記述されておらず、また、この方法が生体内の無傷の気道で遺伝子発現レベルを高めることができるという実現可能性も実際に実証されていない。
我々の試験管内シンクロトロンPCXI実験では、ポリスチレンMPを除く、試験したすべての粒子が、使用したイメージング装置で視認できることが示されました。磁場が存在すると、MPはストリングを形成し、その長さは粒子の種類と磁場強度（つまり磁石の近接度と動き）に関係します。図10に示すように、観察されるストリングは、個々の粒子が磁化され、独自の局所磁場を誘起することによって形成されます。これらの別々の磁場により、他の同様の粒子が凝集して接続され、他の粒子の局所的な引力と斥力による局所的な力によって、ストリング状のグループ運動が生じます。
（a、b）液体で満たされた毛細管内で生成された粒子列と（c、d）空気で満たされた気管内で生成された粒子列を示す模式図。毛細管と気管は縮尺どおりに描かれていないことに注意してください。（a）パネルには、紐状に配置されたFe3O4粒子を含むMPの説明も含まれています。
磁石を毛細管の上に移動させたとき、Fe3O4 を含む MP3-5 では粒子列の角度が臨界閾値に達し、その後、粒子列は元の位置にとどまらず、表面に沿って新しい位置に移動しました。この効果は、ガラス毛細管の表面が十分に滑らかであるため、このような移動が起こりやすいと考えられます。興味深いことに、MP6 (CombiMag) はこのようには振る舞いませんでした。これは、粒子が小さかった、コーティングや表面電荷が異なっていた、あるいは独自のキャリア液が粒子の移動能力に影響を与えたためと考えられます。CombiMag 粒子の画像コントラストも弱く、流体と粒子の密度が似ているため、互いに容易に移動しないことを示唆しています。磁石が速く動きすぎると粒子が引っかかることもあり、磁場強度が流体中の粒子間の摩擦を常に克服できるとは限らないことを示しています。磁場強度と磁石とターゲット領域間の距離が非常に重要であることは驚くべきことではないかもしれません。これらの結果を総合すると、磁石はターゲット領域を通過する多くの MP を捕捉できますが、磁石を使ってCombiMag粒子を気管の表面に沿って移動させることはまず不可能であると考えられる。したがって、生体内LV-MP研究では、静磁場を利用して気道樹の特定の領域を物理的に標的とすべきであると結論づける。
粒子が体内に送達されると、複雑に動く体組織の中では識別が困難ですが、気管の上で磁石を水平方向に移動させて MP ​​ストリングを「揺らす」ことで、粒子の検出能力が向上しました。ライブイメージングは​​可能ですが、動物を人道的に殺した後の方が粒子の動きを識別しやすくなっています。MP 濃度は、磁石をイメージング領域の上に配置したときにこの場所で一般的に最も高くなりましたが、一部の粒子は通常、気管のさらに奥で見つかりました。in vitro 研究とは対照的に、磁石を移動させても粒子を気管に沿って引きずることはできません。この発見は、気管の表面を覆う粘液が吸入された粒子を通常どのように処理し、粘液に捕捉して、その後粘液線毛クリアランス機構によって除去するかと一致しています。
気管の上下に磁石を用いて吸引することで（図3b）、一点に集中した磁場ではなく、より均一な磁場が得られ、粒子の分布がより均一になるのではないかと仮説を立てました。しかし、予備研究ではこの仮説を裏付ける明確な証拠は見つかりませんでした。同様に、一対の磁石を反発するように配置しても（図3c）、画像領域への粒子沈着は増加しませんでした。これらの2つの結果は、二重磁石構成ではMPターゲティングの局所制御が大幅に改善されないこと、また、結果として生じる強い磁力は構成が難しく、このアプローチは実用的ではないことを示しています。同様に、磁石を気管の上方および気管を貫通するように配置しても（図3d）、画像領域に保持される粒子数は増加しませんでした。これらの代替構成の中には、沈着領域内の磁場強度が低下するため、成功しないものがあると考えられます。したがって、単一の30度角度の磁石構成（図3a）が、最も簡単で効率的な方法であると考えられます。生体内試験。
LV-MP研究では、LVベクターをCombiMagと組み合わせて磁場の存在下で物理的摂動後に投与すると、対照群と比較して気管内の形質導入レベルが有意に増加することが示されました。シンクロトロンイメージング研究とLacZの結果に基づくと、磁場は気管内のLVを維持し、肺の奥深くにすぐに浸透するベクター粒子の数を減らすことができたようです。このようなターゲティングの改善により、投与される力価、オフターゲット形質導入、炎症および免疫副作用、遺伝子キャリアのコストを削減しながら、より高い有効性につながる可能性があります。重要なことに、製造元によると、CombiMagは他のウイルスベクター（AAVなど）や核酸を含む他の遺伝子導入方法と併用することができます。