Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSSకు పరిమిత మద్దతు ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్‌డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను ఆఫ్ చేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, మద్దతు కొనసాగేలా చూసేందుకు, మేము ఈ సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా ప్రదర్శిస్తాము.
సిస్టిక్ ఫైబ్రోసిస్ ఊపిరితిత్తుల వ్యాధి చికిత్స కోసం ఉపయోగించే జన్యు వాహకాలు (జీన్ వెక్టర్స్) ప్రసరణ వాయుమార్గాలను లక్ష్యంగా చేసుకోవాలి, ఎందుకంటే పరిధీయ ఊపిరితిత్తుల ట్రాన్స్‌డక్షన్ చికిత్సా ప్రయోజనాన్ని అందించదు. వైరల్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యం వెక్టర్ నివాస సమయానికి నేరుగా సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. అయితే, జన్యు వాహకాల వంటి డెలివరీ ద్రవాలు శ్వాస పీల్చేటప్పుడు సహజంగా వాయుగోళాలలోకి వ్యాపిస్తాయి, మరియు ఏ రూపంలోనైనా ఉండే చికిత్సా కణాలు మ్యూకోసిలియరీ రవాణా ద్వారా వేగంగా తొలగించబడతాయి. వాయుమార్గాలలో జన్యు వాహకాల నివాస సమయాన్ని పొడిగించడం ముఖ్యం కానీ సాధించడం కష్టం. వాయుమార్గాల ఉపరితలం వైపు మళ్లించగల జన్యు వాహక-సంయుక్త అయస్కాంత కణాలు ప్రాంతీయ లక్ష్యీకరణను మెరుగుపరుస్తాయి. ఇన్ వివో విజువలైజేషన్ (జీవించి ఉన్నప్పుడు దృశ్యమానం చేయడం)లోని సవాళ్ల కారణంగా, ప్రయోగించిన అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో వాయుమార్గ ఉపరితలంపై అటువంటి చిన్న అయస్కాంత కణాల ప్రవర్తన గురించి సరిగా అర్థం కాలేదు. ఈ అధ్యయనం యొక్క లక్ష్యం, మత్తుమందు ఇచ్చిన ఎలుకల శ్వాసనాళంలో వరుస అయస్కాంత కణాల ఇన్ వివో కదలికను దృశ్యమానం చేయడానికి సింక్రోట్రాన్ ఇమేజింగ్‌ను ఉపయోగించడం, తద్వారా ఇన్ వివోలో వ్యక్తిగత మరియు సామూహిక కణాల ప్రవర్తన యొక్క గతిశీలత మరియు నమూనాలను పరిశీలించడం. ఆ తర్వాత, అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో లెంటివైరల్ అయస్కాంత కణాల డెలివరీ ఎలా ఉంటుందో కూడా మేము అంచనా వేశాము. ఎలుక శ్వాసనాళంలో ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యాన్ని పెంచడం. సింక్రోట్రాన్ ఎక్స్-రే ఇమేజింగ్, ఇన్ విట్రో మరియు ఇన్ వివోలలో స్థిర మరియు కదిలే అయస్కాంత క్షేత్రాలలో అయస్కాంత కణాల ప్రవర్తనను వెల్లడిస్తుంది. అయస్కాంతాలతో కణాలను సజీవ వాయుమార్గం యొక్క ఉపరితలం వెంబడి సులభంగా లాగలేము, కానీ రవాణా సమయంలో, అయస్కాంత క్షేత్రం అత్యంత బలంగా ఉన్న వీక్షణ క్షేత్రంలో నిక్షేపాలు కేంద్రీకృతమవుతాయి. అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో లెంటివైరల్ అయస్కాంత కణాలను అందించినప్పుడు ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యం ఆరు రెట్లు పెరిగింది. ఈ ఫలితాలన్నీ కలిసి, లెంటివైరల్ అయస్కాంత కణాలు మరియు అయస్కాంత క్షేత్రాలు, జీన్ వెక్టర్ టార్గెటింగ్‌ను మెరుగుపరచడానికి మరియు ఇన్ వివోలో వాహక వాయుమార్గాలలో ట్రాన్స్‌డక్షన్ స్థాయిలను పెంచడానికి విలువైన పద్ధతులుగా ఉండవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
సిస్టిక్ ఫైబ్రోసిస్ (CF) అనేది CF ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ కండక్టెన్స్ రెగ్యులేటర్ (CFTR) అనే ఒకే జన్యువులోని వైవిధ్యం వల్ల వస్తుంది. CFTR ప్రోటీన్ అనేది ఒక అయాన్ ఛానల్, ఇది శరీరమంతటా అనేక ఎపిథీలియల్ కణాలలో ఉంటుంది, వీటిలో CF వ్యాధిజననానికి ప్రధాన కేంద్రమైన వాహక వాయుమార్గాలు కూడా ఉన్నాయి. CFTR లోపాలు అసాధారణ నీటి రవాణాకు దారితీస్తాయి, దీనివల్ల వాయుమార్గ ఉపరితలం నిర్జలీకరణం చెంది, వాయుమార్గ ఉపరితల ద్రవ (ASL) పొర యొక్క లోతు తగ్గుతుంది. ఇది వాయుమార్గాల నుండి పీల్చిన కణాలు మరియు వ్యాధికారకాలను తొలగించే మ్యూకోసిలియరీ ట్రాన్స్‌పోర్ట్ (MCT) వ్యవస్థ యొక్క సామర్థ్యాన్ని కూడా దెబ్బతీస్తుంది. CFTR జన్యువు యొక్క సరైన ప్రతిని అందించడానికి మరియు ASL, MCT, మరియు ఊపిరితిత్తుల ఆరోగ్యాన్ని మెరుగుపరచడానికి ఒక లెంటివైరల్ (LV) జన్యు చికిత్సను అభివృద్ధి చేయడం, మరియు ఈ పారామితులను ఇన్ వివోలో కొలవగల కొత్త సాంకేతికతలను అభివృద్ధి చేయడాన్ని కొనసాగించడం మా లక్ష్యం¹.
సిస్టిక్ ఫైబ్రోసిస్ (CF) వాయుమార్గ జన్యు చికిత్స కోసం LV వెక్టర్లు ప్రముఖ అభ్యర్థులలో ఒకటిగా ఉన్నాయి, ప్రధానంగా ఎందుకంటే అవి చికిత్సా జన్యువును వాయుమార్గ బేసల్ కణాలలో (వాయుమార్గ మూల కణాలు) శాశ్వతంగా ఏకీకృతం చేయగలవు. ఇది చాలా ముఖ్యం, ఎందుకంటే అవి క్రియాత్మక జన్యు-సరిదిద్దబడిన CF-సంబంధిత వాయుమార్గ ఉపరితల కణాలుగా రూపాంతరం చెందడం ద్వారా సాధారణ హైడ్రేషన్ మరియు శ్లేష్మ నిర్మూలనను పునరుద్ధరించగలవు, ఫలితంగా జీవితకాల ప్రయోజనాలు కలుగుతాయి. LV వెక్టర్లను వాహక వాయుమార్గం వైపుగా నిర్దేశించాలి, ఎందుకంటే CF ఊపిరితిత్తుల వ్యాధి అక్కడే మొదలవుతుంది. వెక్టర్‌ను ఊపిరితిత్తులలోకి మరింత లోతుగా పంపడం వలన అల్వియోలార్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ జరగవచ్చు, కానీ CFలో దీనికి ఎటువంటి చికిత్సా ప్రయోజనం లేదు. అయితే, జన్యు వాహకాల వంటి ద్రవాలు, పంపిన తర్వాత శ్వాస పీల్చినప్పుడు సహజంగానే అల్వియోలీకి వలస వెళ్తాయి3,4 మరియు చికిత్సా కణాలు MCT ద్వారా వేగంగా నోటి కుహరంలోకి తొలగించబడతాయి. LV ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యం అనేది, కణాల ద్వారా గ్రహించబడటానికి వెక్టర్ లక్ష్య కణాల పక్కన ఉండే సమయ నిడివికి నేరుగా సంబంధం కలిగి ఉంటుంది – దీనిని "నివాస సమయం"5 అంటారు – ఇది సాధారణ ప్రాంతీయ గాలి ప్రవాహం, అలాగే సమన్వయంతో కూడిన కణ శ్లేష్మ సంగ్రహణ మరియు MCT ద్వారా సులభంగా తగ్గిపోతుంది. CF కోసం, LV యొక్క నివాస సమయాన్ని పొడిగించే సామర్థ్యం చాలా ముఖ్యం. ఈ ప్రాంతంలో అధిక స్థాయిలో ట్రాన్స్‌డక్షన్ సాధించడానికి వాయుమార్గం ముఖ్యం, కానీ ఇప్పటివరకు ఇది సవాలుగా ఉంది.
ఈ అడ్డంకిని అధిగమించడానికి, LV అయస్కాంత కణాలు (MPs) రెండు పరిపూరక మార్గాలలో సహాయపడగలవని మేము సూచిస్తున్నాము. మొదటిది, లక్ష్య నిర్దేశాన్ని మెరుగుపరచడానికి మరియు జన్యు వాహక కణాలు కావలసిన వాయుమార్గ ప్రాంతంలో నివసించడానికి సహాయపడటానికి వాటిని అయస్కాంతంగా వాయుమార్గ ఉపరితలం వైపుకు నడిపించవచ్చు; మరియు రెండవది, కణ పొర 6కు కదలడానికి వాటిని ASL (యాంటీబాడీ-అసిటైల్ స్ఫింక్టర్) వైపుకు నడిపించవచ్చు. MPs అనేవి యాంటీబాడీలు, కీమోథెరపీ మందులు, లేదా కణ త్వచాలకు అంటుకునే లేదా సంబంధిత కణ ఉపరితల గ్రాహకాలకు బంధించే ఇతర చిన్న అణువులతో బంధించినప్పుడు, స్థిర విద్యుత్ సమక్షంలో కణితి ప్రదేశాలలో పేరుకుపోయి, లక్షిత ఔషధ పంపిణీ వాహనాలుగా విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతున్నాయి. క్యాన్సర్ చికిత్స కోసం అయస్కాంత క్షేత్రాలు 7. ఇతర “హైపర్‌థర్మల్” పద్ధతులు MPలను డోలనం చేసే అయస్కాంత క్షేత్రాలకు గురిచేసినప్పుడు వాటిని వేడి చేయడం, తద్వారా కణితి కణాలను నాశనం చేయడం లక్ష్యంగా పెట్టుకుంటాయి. అయస్కాంత ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ సూత్రం, దీనిలో కణాలకు DNA బదిలీని మెరుగుపరచడానికి అయస్కాంత క్షేత్రాన్ని ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ ఏజెంట్‌గా ఉపయోగిస్తారు, ఇది ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయడానికి కష్టంగా ఉండే సెల్ లైన్‌ల కోసం అనేక రకాల నాన్-వైరల్ మరియు వైరల్ జన్యు వెక్టర్లను ఉపయోగించి ఇన్ విట్రోలో సాధారణంగా ఉపయోగించబడుతుంది. LV మాగ్నెటోట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ యొక్క ప్రభావం నిరూపించబడింది, స్థిర అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో మానవ శ్వాసనాళ ఎపిథీలియల్ సెల్ లైన్‌కు LV-MPలను ఇన్ విట్రోలో అందించినప్పుడు, కేవలం LV వెక్టర్‌తో పోలిస్తే ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యం 186 రెట్లు పెరిగింది. LV-MPని ఇన్ విట్రో CF మోడల్‌కు కూడా అప్లై చేశారు, ఇక్కడ CF కఫం సమక్షంలో గాలి-ద్రవ ఇంటర్‌ఫేస్ కల్చర్‌లలో అయస్కాంత ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ LV ట్రాన్స్‌డక్షన్‌ను 20 రెట్లు పెంచింది10. అయితే, అవయవాల ఇన్ వివో మాగ్నెటోట్రాన్స్‌ఫెక్షన్‌కు సాపేక్షంగా తక్కువ శ్రద్ధ లభించింది మరియు కొన్ని జంతువులలో మాత్రమే మూల్యాంకనం చేయబడింది. అధ్యయనాలు11,12,13,14,15, ముఖ్యంగా ఊపిరితిత్తులలో16,17. అయినప్పటికీ, CF ఊపిరితిత్తుల చికిత్సలో మాగ్నెటిక్ ట్రాన్స్‌ఫెక్షన్ కోసం అవకాశాలు స్పష్టంగా ఉన్నాయి. టాన్ మరియు ఇతరులు (2020) ఇలా పేర్కొన్నారు, “సమర్థవంతమైన మాగ్నెటిక్ నానోపార్టికల్ పల్మనరీ డెలివరీ యొక్క ప్రూఫ్-ఆఫ్-కాన్సెప్ట్ అధ్యయనం, CF రోగులలో క్లినికల్ ఫలితాలను మెరుగుపరచడానికి భవిష్యత్ CFTR ఇన్హలేషన్ వ్యూహాలకు మార్గం సుగమం చేస్తుంది”6.
ప్రయోగించిన అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో వాయుమార్గ ఉపరితలాలపై చిన్న అయస్కాంత కణాల ప్రవర్తనను దృశ్యమానం చేయడం మరియు అధ్యయనం చేయడం కష్టం, అందువల్ల దాని గురించి సరిగా అర్థం కాలేదు. ఇతర అధ్యయనాలలో, మేము ASL లోతులో సూక్ష్మమైన ఇన్ వివో మార్పులను¹⁸ మరియు MCT ప్రవర్తనను¹⁹,²⁰ అనాక్రమణ పద్ధతిలో దృశ్యమానం చేయడానికి మరియు పరిమాణీకరించడానికి, గ్యాస్ కెనాల్ ఉపరితల ఆర్ద్రీకరణను నేరుగా కొలవడానికి మరియు చికిత్స సామర్థ్యానికి ప్రారంభ సూచికగా ఉపయోగించడానికి ఒక సింక్రోట్రాన్-ప్రొపగేషన్-ఆధారిత ఫేజ్-కాంట్రాస్ట్ ఎక్స్-రే ఇమేజింగ్ (PB-PCXI) పద్ధతిని అభివృద్ధి చేశాము. అదనంగా, మా MCT మూల్యాంకన పద్ధతి, PB-PCXI²¹ ఉపయోగించి కనిపించే MCT మార్కర్‌లుగా అల్యూమినా లేదా అధిక వక్రీభవన సూచిక గల గాజుతో కూడిన 10–35 µm వ్యాసం గల కణాలను ఉపయోగిస్తుంది. ఈ రెండు పద్ధతులు MPతో సహా అనేక రకాల కణాలను దృశ్యమానం చేయడానికి అనుకూలంగా ఉంటాయి.
దాని అధిక ప్రాదేశిక మరియు తాత్కాలిక రిజల్యూషన్ కారణంగా, MP జన్యు బదిలీ పద్ధతులను అర్థం చేసుకోవడానికి మరియు ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి మాకు సహాయపడటానికి, ఇన్ వివోలో ఏక మరియు సామూహిక కణ ప్రవర్తన యొక్క గతిశీలత మరియు నమూనాలను పరిశీలించడానికి మా PB-PCXI-ఆధారిత ASL మరియు MCT విశ్లేషణ పద్ధతులు బాగా సరిపోతాయి. మేము ఇక్కడ ఉపయోగించే విధానం SPring-8 BL20B2 బీమ్‌లైన్‌ను ఉపయోగించి చేసిన మా అధ్యయనాల నుండి ఉద్భవించింది, దీనిలో మా జన్యు వాహక మోతాదు జంతు అధ్యయనాలలో 3,4 గమనించిన ఏకరీతి కాని జన్యు వ్యక్తీకరణ నమూనాలను వివరించడంలో సహాయపడటానికి, ఎలుకల నాసికా మరియు ఊపిరితిత్తుల వాయుమార్గాలలోకి షామ్ వెక్టర్ మోతాదును అందించిన తర్వాత ద్రవ కదలికను మేము దృశ్యమానం చేసాము.
జీవించి ఉన్న ఎలుకల శ్వాసనాళంలో వరుస MPల యొక్క ఇన్ వివో కదలికలను దృశ్యమానం చేయడానికి సింక్రోట్రాన్ PB-PCXIని ఉపయోగించడమే ఈ అధ్యయనం యొక్క లక్ష్యం. MP కదలికపై వాటి ప్రభావాన్ని నిర్ధారించడానికి, వివిధ రకాల MPలు, అయస్కాంత క్షేత్ర బలాలు మరియు ప్రదేశాలను పరీక్షించడానికి ఈ PB-PCXI ఇమేజింగ్ అధ్యయనాలు రూపొందించబడ్డాయి. బాహ్యంగా ప్రయోగించిన అయస్కాంత క్షేత్రం, పంపిణీ చేయబడిన MP లక్షిత ప్రాంతంలో ఉండటానికి లేదా కదలడానికి సహాయపడుతుందని మేము ఊహించాము. ఈ అధ్యయనాలు, నిక్షేపణ తర్వాత శ్వాసనాళంలో నిలిచిపోయే కణాల సంఖ్యను గరిష్ఠం చేసే అయస్కాంత ఆకృతీకరణలను గుర్తించడానికి కూడా మాకు వీలు కల్పించాయి. రెండవ శ్రేణి అధ్యయనాలలో, వాయుమార్గ లక్ష్య సందర్భంలో LV-MPల పంపిణీ మెరుగైన LV ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యానికి దారితీస్తుందనే ఊహ ఆధారంగా, ఎలుక వాయుమార్గంలోకి LV-MPలను ఇన్ వివో పద్ధతిలో పంపిణీ చేయడం వల్ల ఏర్పడే ట్రాన్స్‌డక్షన్ నమూనాను ప్రదర్శించడానికి ఈ ఉత్తమ ఆకృతీకరణను ఉపయోగించాలని మేము ప్రయత్నించాము.
అన్ని జంతు అధ్యయనాలు అడిలైడ్ విశ్వవిద్యాలయం (M-2019-060 మరియు M-2020-022) మరియు SPring-8 సింక్రోట్రాన్ జంతు నైతిక కమిటీ ఆమోదించిన ప్రోటోకాల్‌ల ప్రకారం నిర్వహించబడ్డాయి. ప్రయోగాలు ARRIVE మార్గదర్శకాల ప్రకారం నిర్వహించబడ్డాయి.
జపాన్‌లోని SPring-8 సింక్రోట్రాన్‌లోని BL20XU బీమ్‌లైన్‌లో, ఇంతకు ముందు వివరించినటువంటి అమరికను ఉపయోగించి అన్ని ఎక్స్-రే ఇమేజింగ్ నిర్వహించబడింది21,22. క్లుప్తంగా, ప్రయోగాత్మక పెట్టె సింక్రోట్రాన్ స్టోరేజ్ రింగ్ నుండి 245 మీటర్ల దూరంలో ఉంది. ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ ప్రభావాలను సృష్టించడానికి, పార్టికల్ ఇమేజింగ్ అధ్యయనాల కోసం 0.6 మీటర్ల నమూనా-డిటెక్టర్ దూరం మరియు ఇన్ వివో ఇమేజింగ్ అధ్యయనాల కోసం 0.3 మీటర్ల దూరం ఉపయోగించబడింది. 25 keV ఏకవర్ణ కిరణ శక్తిని ఉపయోగించారు. sCMOS డిటెక్టర్‌కు అనుసంధానించబడిన అధిక-రిజల్యూషన్ ఎక్స్-రే కన్వర్టర్ (SPring-8 BM3) ఉపయోగించి చిత్రాలను సంగ్రహించారు. ఈ కన్వర్టర్ 10 µm మందం గల స్కింటిలేటర్ (Gd3Al2Ga3O12)ను ఉపయోగించి ఎక్స్-రేలను దృశ్య కాంతిగా మారుస్తుంది, ఆ తర్వాత దానిని × 10 మైక్రోస్కోప్ ఆబ్జెక్టివ్ (NA 0.3) ఉపయోగించి sCMOS సెన్సార్ వైపు మళ్లిస్తుంది. sCMOS డిటెక్టర్ Orca-Flash4.0 (హమామాట్సు ఫోటోనిక్స్, జపాన్) 2048 × 2048 పిక్సెల్‌ల శ్రేణి పరిమాణం మరియు 6.5 × 6.5 µm ముడి పిక్సెల్ పరిమాణంతో, ఈ అమరిక 0.51 µm ప్రభావవంతమైన ఐసోట్రోపిక్ పిక్సెల్ పరిమాణాన్ని మరియు సుమారుగా 1.1 mm × 1.1 mm వీక్షణ క్షేత్రాన్ని అందిస్తుంది. శ్వాసక్రియ వలన కలిగే చలన లోపాలను తగ్గిస్తూ, వాయుమార్గం లోపల మరియు వెలుపల ఉన్న అయస్కాంత కణాల సిగ్నల్-టు-నాయిస్ నిష్పత్తిని గరిష్ఠం చేయడానికి 100 ms ఎక్స్‌పోజర్ నిడివిని ఎంచుకున్నారు. ఇన్ వివో అధ్యయనాల కోసం, ఎక్స్‌పోజర్‌ల మధ్య ఎక్స్-రే కిరణాన్ని నిరోధించడం ద్వారా రేడియేషన్ మోతాదును పరిమితం చేయడానికి, ఎక్స్-రే మార్గంలో ఒక వేగవంతమైన ఎక్స్-రే షట్టర్‌ను ఉంచారు.
BL20XU ఇమేజింగ్ ఛాంబర్ బయోసేఫ్టీ లెవెల్ 2 ధృవీకరణ పొందని కారణంగా, ఏ SPring-8 PB-PCXI ఇమేజింగ్ అధ్యయనాలలోనూ LV క్యారియర్‌ను ఉపయోగించలేదు. దానికి బదులుగా, మొదట గాజు కేశనాళికలలో, ఆపై సజీవ వాయుమార్గాలలో అయస్కాంత క్షేత్రాలు MP కదలికను ఎలా ప్రభావితం చేస్తాయో అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము రెండు వాణిజ్య సరఫరాదారుల నుండి వివిధ పరిమాణాలు, పదార్థాలు, ఇనుము సాంద్రతలు మరియు అనువర్తనాలను కలిగి ఉన్న, చక్కగా వర్గీకరించబడిన MPల శ్రేణిని ఎంచుకున్నాము. ఉపరితలంపై. MPలు 0.25 నుండి 18 μm పరిమాణంలో ఉంటాయి మరియు వివిధ రకాల పదార్థాలతో తయారు చేయబడతాయి (పట్టిక 1 చూడండి), కానీ MPలోని అయస్కాంత కణాల పరిమాణంతో సహా ప్రతి నమూనా యొక్క కూర్పు తెలియదు. మా విస్తృతమైన MCT అధ్యయనాల 19, 20, 21, 23, 24 ఆధారంగా, MP కదలిక యొక్క మెరుగైన దృశ్యమానతను చూడటానికి వరుస ఫ్రేమ్‌లను తీసివేయడం ద్వారా, 5 μm అంత చిన్న MPలను కూడా శ్వాసనాళ వాయుమార్గ ఉపరితలంపై చూడవచ్చని మేము ఆశిస్తున్నాము. ఒకే 0.25 μm-పరిమాణ MP ఇమేజింగ్ పరికరం యొక్క రిజల్యూషన్ కంటే చిన్నది, కానీ PB-PCXI వాటి వాల్యూమ్ కాంట్రాస్ట్‌ను మరియు అవి నిక్షేపించబడిన తర్వాత ఆ ఉపరితల ద్రవం యొక్క కదలికను గుర్తించగలదని భావిస్తున్నారు.
పట్టిక 1లోని ప్రతి MP కోసం నమూనాలను 0.63 mm లోపలి వ్యాసం గల 20 μl గాజు కేశనాళికలలో (డ్రమ్మండ్ మైక్రోక్యాప్స్, PA, USA) తయారు చేశారు. కార్పస్కులర్ కణాలు నీటిలో లభిస్తాయి, అయితే కాంబిమాగ్ కణాలు తయారీదారు యొక్క యాజమాన్య ద్రవంలో లభిస్తాయి. ప్రతి ట్యూబ్‌ను ద్రవంతో సగం (సుమారు 11 μl) నింపి, నమూనా హోల్డర్‌పై ఉంచారు (మూర్తి 1 చూడండి). గాజు కేశనాళికలను ఇమేజింగ్ బాక్స్‌లోని నమూనా వేదికపై అడ్డంగా ఉంచి, ద్రవం అంచుల వద్ద అమర్చారు. ఇమేజింగ్ సమయంలో దాని స్థానాన్ని రిమోట్‌గా మార్చడానికి, 1.17 టెస్లా అవశేష అయస్కాంతీకరణ కలిగిన 19 mm వ్యాసం (28 mm పొడవు) గల నికెల్ షెల్ రేర్ ఎర్త్ నియోడైమియం ఐరన్ బోరాన్ (NdFeB) అయస్కాంతాన్ని (N35, క్యాట్. నం. LM1652, జేకర్ ఎలక్ట్రానిక్స్, ఆస్ట్రేలియా) ఒక ప్రత్యేక ట్రాన్స్‌లేషన్ స్టేజ్‌కు జత చేశారు. అయస్కాంతాన్ని నమూనాకు సుమారు 30 mm పైన ఉంచినప్పుడు ఎక్స్-రే ఇమేజ్ సేకరణ ప్రారంభమవుతుంది మరియు చిత్రాలను ఒక రేటుతో సేకరిస్తారు. సెకనుకు 4 ఫ్రేమ్‌ల చొప్పున. ఇమేజింగ్ సమయంలో, క్షేత్ర బలం మరియు స్థానం యొక్క ప్రభావాలను అంచనా వేయడానికి అయస్కాంతాన్ని గాజు కేశనాళిక గొట్టానికి దగ్గరగా (సుమారు 1 మిమీ దూరంలో) తీసుకువచ్చి, ఆపై గొట్టం వెంబడి కదిలించారు.
శాంపిల్ xy ట్రాన్స్‌లేషన్ స్టేజ్‌పై గాజు కేశనాళికలలో MP నమూనాలను కలిగి ఉన్న ఇన్ విట్రో ఇమేజింగ్ సెటప్. ఎక్స్-రే కిరణపుంజం యొక్క మార్గం ఎరుపు చుక్కల గీతతో గుర్తించబడింది.
MPల ఇన్ విట్రో దృశ్యమానతను నిర్ధారించిన తర్వాత, వాటిలో కొన్నింటిని వైల్డ్-టైప్ ఆడ ఆల్బినో విస్టార్ ఎలుకలలో (~12 వారాల వయస్సు, ~200 గ్రా) ఇన్ వివో పద్ధతిలో పరీక్షించారు. 0.24 mg/kg మెడెటోమిడిన్ (డోమిటర్®, జెనోక్, జపాన్), 3.2 mg/kg మిడాజోలామ్ (డోర్మికమ్®, ఆస్టెల్లాస్ ఫార్మా, జపాన్) మరియు 4 mg/kg బ్యూటోర్ఫనాల్ (వెటోర్ఫేల్®, మెయిజి సీకా) మిశ్రమాన్ని ఎలుకలకు ఇంట్రాపెరిటోనియల్ ఇంజెక్షన్ ద్వారా ఇచ్చి మత్తు కలిగించారు. మత్తు ఇచ్చిన తర్వాత, శ్వాసనాళం చుట్టూ ఉన్న బొచ్చును తొలగించి, ఎండోట్రాకియల్ ట్యూబ్ (ET; 16 Ga iv కాన్యులా, టెరుమో BCT)ను చొప్పించి, శరీర ఉష్ణోగ్రతను 22 వద్ద స్థిరంగా ఉంచడానికి థర్మల్ బ్యాగ్ ఉన్న ప్రత్యేకంగా తయారు చేసిన ఇమేజింగ్ ప్లేట్‌పై వాటిని వెల్లకిలా పడుకోబెట్టి కదలకుండా స్థిరపరిచి ఇమేజింగ్ కోసం సిద్ధం చేశారు. ఆ తర్వాత, ఎక్స్-రేలో శ్వాసనాళాన్ని అడ్డంగా అమర్చడానికి ఇమేజింగ్ ప్లేట్‌ను ఇమేజింగ్ బాక్స్‌లోని శాంపిల్ ట్రాన్స్‌లేషన్ స్టేజ్‌కు కొద్ది కోణంలో అమర్చారు. చిత్రం, చిత్రం 2aలో చూపిన విధంగా.
(ఎ) SPring-8 ఇమేజింగ్ బాక్స్‌లో ఇన్ వివో ఇమేజింగ్ సెటప్, ఎక్స్-రే కిరణపుంజం యొక్క మార్గం ఎరుపు చుక్కల గీతతో గుర్తించబడింది. (బి, సి) ఒకదానికొకటి లంబంగా అమర్చిన రెండు IP కెమెరాలను ఉపయోగించి శ్వాసనాళంపై అయస్కాంత స్థాన నిర్ధారణను రిమోట్‌గా నిర్వహించారు. స్క్రీన్ ఇమేజ్ యొక్క ఎడమ వైపున, తలను పట్టుకున్న వైర్ లూప్ మరియు ET ట్యూబ్ లోపల అమర్చిన డెలివరీ కాన్యులా కనిపిస్తాయి.
100 μl గాజు సిరంజిని ఉపయోగించే రిమోట్-నియంత్రిత సిరంజి పంప్ సిస్టమ్ (UMP2, వరల్డ్ ప్రెసిషన్ ఇన్‌స్ట్రుమెంట్స్, సరసోటా, FL)ను 30 Ga సూది ద్వారా PE10 ట్యూబింగ్ (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm)కు అనుసంధానించారు. ET ట్యూబ్‌ను చొప్పించేటప్పుడు, ట్యూబ్ కొన శ్వాసనాళంలో సరైన స్థానంలో ఉందని నిర్ధారించుకోవడానికి ట్యూబ్‌పై గుర్తు పెట్టండి. మైక్రోపంప్‌ను ఉపయోగించి, పంపిణీ చేయవలసిన MP నమూనాలో ట్యూబ్ కొన మునిగి ఉన్నప్పుడు సిరంజి ప్లంగర్‌ను వెనక్కి లాగారు. ఆ తర్వాత, లోడ్ చేయబడిన డెలివరీ ట్యూబ్‌ను ఎండోట్రాకియల్ ట్యూబ్‌లోకి చొప్పించి, దాని కొనను మనం ఊహించిన ప్రయోగించిన అయస్కాంత క్షేత్రం యొక్క అత్యంత బలమైన భాగంలో ఉంచారు. మా ఆర్డుయినో ఆధారిత టైమింగ్ బాక్స్‌కు అనుసంధానించబడిన శ్వాస డిటెక్టర్‌ను ఉపయోగించి ఇమేజ్ సేకరణను నియంత్రించారు, మరియు అన్ని సంకేతాలు (ఉదా. ఉష్ణోగ్రత, శ్వాస, షట్టర్ తెరవడం/మూయడం మరియు ఇమేజ్ సేకరణ) పవర్‌ల్యాబ్ మరియు ల్యాబ్‌చార్ట్ (AD ఇన్‌స్ట్రుమెంట్స్, సిడ్నీ, ఆస్ట్రేలియా) 22 ఉపయోగించి రికార్డ్ చేయబడ్డాయి. ఎన్‌క్లోజర్ అందుబాటులో లేనప్పుడు ఇమేజింగ్ చేసేటప్పుడు, రెండు IP కెమెరాలు (పానాసోనిక్ BB-SC382) ఒకదానికొకటి సుమారుగా 90° కోణంలో ఉంచబడ్డాయి మరియు ఇమేజింగ్ సమయంలో శ్వాసనాళానికి సంబంధించి అయస్కాంతం యొక్క స్థానాన్ని పర్యవేక్షించడానికి ఉపయోగించబడ్డాయి (Fig. 2b,c). కదలిక లోపాలను తగ్గించడానికి, ఎండ్-టైడల్ ఫ్లో ప్లాటో సమయంలో ప్రతి శ్వాసకు ఒక చిత్రం తీయబడింది.
ఇమేజింగ్ హౌసింగ్ వెలుపల నుండి సుదూరంగా ఉంచగలిగే రెండవ దశకు ఒక అయస్కాంతం జత చేయబడుతుంది. వివిధ అయస్కాంత స్థానాలు మరియు ఆకృతీకరణలు పరీక్షించబడ్డాయి, వాటిలో ఇవి ఉన్నాయి: శ్వాసనాళం పైన సుమారు 30° కోణంలో అమర్చడం (పటాలు 2a మరియు 3aలో చూపిన ఆకృతీకరణలు); ఒక అయస్కాంతం జంతువు పైన మరియు మరొకటి క్రింద, ధ్రువాలు ఆకర్షించేలా అమర్చడం (పటం 3b); ఒక అయస్కాంతం జంతువు పైన మరియు మరొకటి క్రింద, ధ్రువాలు వికర్షించేలా అమర్చడం (పటం 3c); మరియు ఒక అయస్కాంతం శ్వాసనాళం పైన మరియు దానికి లంబంగా అమర్చడం (పటం 3d). జంతువు మరియు అయస్కాంతం ఆకృతీకరించబడిన తర్వాత మరియు పరీక్షించవలసిన MPని సిరంజి పంప్‌లోకి లోడ్ చేసిన తర్వాత, చిత్రాలను తీస్తూ 4 μl/sec రేటుతో 50 μl మోతాదును అందించాలి. ఆ తర్వాత చిత్రాలను తీస్తూనే అయస్కాంతాన్ని శ్వాసనాళం వెంబడి లేదా అడ్డంగా ముందుకు వెనుకకు కదపాలి.
ఇన్ వివో ఇమేజింగ్ కోసం అయస్కాంత అమరిక (ఎ) శ్వాసనాళం పైన సుమారు 30° కోణంలో ఒకే అయస్కాంతం, (బి) ఆకర్షించేలా అమర్చిన రెండు అయస్కాంతాలు, (సి) వికర్షించేలా అమర్చిన రెండు అయస్కాంతాలు, (డి) శ్వాసనాళం పైన మరియు దానికి లంబంగా ఒకే అయస్కాంతం. పరిశీలకుడు నోటి నుండి ఊపిరితిత్తుల వైపు శ్వాసనాళం ద్వారా క్రిందికి చూశాడు, మరియు ఎక్స్-రే కిరణపుంజం ఎలుక యొక్క ఎడమ వైపు గుండా ప్రయాణించి కుడి వైపు నుండి బయటకు వచ్చింది. అయస్కాంతాన్ని శ్వాసమార్గం పొడవునా గానీ లేదా ఎక్స్-రే కిరణపుంజం దిశలో శ్వాసనాళం పైన ఎడమ మరియు కుడి వైపులకు గానీ కదిలిస్తారు.
శ్వాస మరియు గుండె కదలికల వంటి గందరగోళ పరిస్థితులు లేనప్పుడు, శ్వాస మార్గాలలో కణాల దృశ్యమానతను మరియు ప్రవర్తనను కూడా మేము నిర్ధారించాలనుకున్నాము. అందువల్ల, ఇమేజింగ్ కాలం ముగింపులో, పెంటోబార్బిటాల్ (సోమ్నోపెంటిల్, పిట్‌మన్-మూర్, వాషింగ్టన్ క్రాసింగ్, USA; ~65 mg/kg ip) అధిక మోతాదు కారణంగా జంతువులను మానవతా దృక్పథంతో చంపడం జరిగింది. కొన్ని జంతువులను ఇమేజింగ్ ప్లాట్‌ఫారమ్‌పైనే వదిలివేశారు, మరియు శ్వాస, గుండె కొట్టుకోవడం ఆగిపోయిన తర్వాత, శ్వాస మార్గం ఉపరితలంపై MP కనిపించకపోతే, అదనపు MP మోతాదును జోడిస్తూ ఇమేజింగ్ ప్రక్రియను పునరావృతం చేశారు.
సేకరించిన చిత్రాలను ఫ్లాట్-ఫీల్డ్ మరియు డార్క్-ఫీల్డ్ సరిదిద్ది, ఆపై MATLAB (R2020a, The Mathworks) లో వ్రాసిన ఒక కస్టమ్ స్క్రిప్ట్‌ను ఉపయోగించి ఒక చలన చిత్రంగా (సెకనుకు 20 ఫ్రేములు; శ్వాస రేటును బట్టి సాధారణ వేగం కంటే 15-25 రెట్లు) సమీకరించారు.
అడిలైడ్ విశ్వవిద్యాలయంలోని ప్రయోగశాల జంతు పరిశోధనా కేంద్రంలో అన్ని LV జన్యు వెక్టర్ డెలివరీ అధ్యయనాలు నిర్వహించబడ్డాయి. అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో LV-MP డెలివరీ, ఇన్ వివోలో జన్యు బదిలీని మెరుగుపరుస్తుందో లేదో అంచనా వేయడానికి SPring-8 ప్రయోగ ఫలితాలను ఉపయోగించుకోవడమే వీటి లక్ష్యం. MP మరియు అయస్కాంత క్షేత్రం యొక్క ప్రభావాలను అంచనా వేయడానికి, రెండు జంతు సమూహాలకు చికిత్స అందించబడింది: ఒక సమూహానికి అయస్కాంతం ఉంచి LV-MP ఇవ్వగా, రెండవ సమూహానికి అయస్కాంతం లేకుండా LV-MP ఇచ్చి నియంత్రణ సమూహంగా పరిగణించారు.
గతంలో వివరించిన పద్ధతులు 25, 26 ఉపయోగించి LV జన్యు వెక్టర్లను ఉత్పత్తి చేశారు. LacZ వెక్టర్, కాన్‌స్టిట్యూటివ్ MPSV ప్రమోటర్ (LV-LacZ) ద్వారా నడపబడే న్యూక్లియర్-లోకలైజ్డ్ బీటా-గాలక్టోసిడేస్ జన్యువును వ్యక్తపరుస్తుంది, ఇది ట్రాన్స్‌డ్యూస్డ్ కణాలలో నీలి రంగు రియాక్షన్ ఉత్పత్తిని ఇస్తుంది, ఇది ఊపిరితిత్తుల కణజాలం ఫ్రంట్‌లు మరియు కణజాల విభాగాలలో కనిపిస్తుంది. TU/mlలో టైటర్‌ను లెక్కించడానికి, హెమోసైటోమీటర్‌తో LacZ పాజిటివ్ కణాల సంఖ్యను మాన్యువల్‌గా లెక్కించడం ద్వారా కణ సంస్కృతులలో టైట్రేషన్ నిర్వహించబడింది. క్యారియర్‌లను -80 °C వద్ద క్రయోప్రిజర్వ్ చేస్తారు, ఉపయోగించడానికి ముందు డీఫ్రాస్ట్ చేస్తారు, మరియు డెలివరీకి కనీసం 30 నిమిషాల ముందు 1:1 నిష్పత్తిలో కలిపి ఐస్‌పై ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా కాంబిమ్యాగ్‌కు బంధిస్తారు.
సాధారణ స్ప్రేగ్ డావ్లీ ఎలుకలకు (n = 3/సమూహం, సుమారు 2-3 నెలల వయస్సు గలవి) 0.4 mg/kg మెడెటోమిడిన్ (డోమిటర్, ఇలియం, ఆస్ట్రేలియా) మరియు 60 mg/kg కెటమైన్ (ఇలియం, ఆస్ట్రేలియా) మిశ్రమంతో ఇంట్రాపెరిటోనియల్‌గా (ip) ఇంజెక్షన్ ఇచ్చి, 16 Ga iv కాన్యులాతో శస్త్రచికిత్స రహిత ఓరల్ కాన్యులేషన్ ద్వారా మత్తుమందు ఇచ్చారు. శ్వాసనాళ వాయుమార్గ కణజాలం LV ట్రాన్స్‌డక్షన్‌ను అందుకుంటుందని నిర్ధారించుకోవడానికి, మేము ముందుగా వివరించిన మెకానికల్ పెర్టర్బేషన్ ప్రోటోకాల్‌ను ఉపయోగించి దానిని కండిషన్ చేసాము, దీనిలో శ్వాసనాళ వాయుమార్గ ఉపరితలాన్ని ఒక వైర్ బాస్కెట్ (N-సర్కిల్, నైటినాల్ టిప్‌లెస్ స్టోన్ ఎక్స్‌ట్రాక్టర్ NTSE-022115) -UDH, కుక్ మెడికల్, USA) తో అక్షాంశంగా 30 సెకన్ల పాటు రుద్దారు. ఆ తర్వాత, పెర్టర్బేషన్ జరిగిన సుమారు 10 నిమిషాల తర్వాత, ఒక బయోలాజికల్ సేఫ్టీ క్యాబినెట్‌లో LV-MPని శ్వాసనాళంలోకి ప్రవేశపెట్టారు.
ఈ ప్రయోగంలో ఉపయోగించిన అయస్కాంత క్షేత్రాన్ని, ఇన్ వివో ఎక్స్-రే ఇమేజింగ్ అధ్యయనంలో మాదిరిగానే అమర్చారు, డిస్టిలేషన్ స్టెంట్ క్లిప్‌లను ఉపయోగించి అవే అయస్కాంతాలను శ్వాసనాళం పైన ఉంచారు (పటం 4). ముందుగా వివరించిన విధంగా, జెల్ టిప్ ఉన్న పైపెట్‌ను ఉపయోగించి 50 μl పరిమాణంలో (2 × 25 μl చొప్పున) LV-MPని శ్వాసనాళంలోకి పంపారు (n = 3 జంతువులు). ఒక నియంత్రణ సమూహానికి (n = 3 జంతువులు) అయస్కాంతం ఉపయోగించకుండా అవే LV-MPలను అందించారు. ఇన్ఫ్యూజన్ పూర్తయిన తర్వాత, ET ట్యూబ్ నుండి కాన్యులాను తీసివేసి, జంతువుకు ఎక్స్‌ట్యూబేషన్ చేశారు. అయస్కాంతం 10 నిమిషాల పాటు అక్కడే ఉంచి, ఆ తర్వాత దానిని తీసివేశారు. ఎలుకలకు చర్మం కింద మెలోక్సికామ్ (1 ml/kg) (ఇలియం, ఆస్ట్రేలియా) మోతాదు ఇచ్చి, ఆ తర్వాత 1 mg/kg అటిపమాజోల్ హైడ్రోక్లోరైడ్ (యాంటిసెడాన్, జోయిటిస్, ఆస్ట్రేలియా) ఇంట్రాపెరిటోనియల్ ఇంజెక్షన్ ద్వారా మత్తుమందును విపర్యయం చేశారు. ఎలుకలు పూర్తిగా కోలుకునే వరకు వాటిని వెచ్చగా ఉంచి పర్యవేక్షించారు. అనస్థీషియా.
బయోలాజికల్ సేఫ్టీ క్యాబినెట్‌లో LV-MP డెలివరీ పరికరం. ET ట్యూబ్ యొక్క లేత బూడిద రంగు లూయర్ హబ్ నోటి నుండి బయటకు పొడుచుకుని రావడం చూడవచ్చు మరియు చిత్రంలో చూపిన పైపెట్ యొక్క జెల్ కొనను ET ట్యూబ్ ద్వారా శ్వాసనాళంలోకి కావలసిన లోతు వరకు చొప్పించబడుతుంది.
LV-MP డోసింగ్ ప్రక్రియ జరిగిన ఒక వారం తర్వాత, జంతువులను 100% CO2 పీల్చడం ద్వారా మానవతా దృక్పథంతో చంపారు మరియు మా ప్రామాణిక X-gal చికిత్సను ఉపయోగించి LacZ వ్యక్తీకరణను అంచనా వేశారు. ఎండోట్రాకియల్ ట్యూబ్ అమర్చడం వల్ల కలిగే ఏవైనా యాంత్రిక నష్టం లేదా ద్రవ నిలుపుదల విశ్లేషణలో చేర్చబడలేదని నిర్ధారించుకోవడానికి, తోక చివరన ఉన్న మూడు మృదులాస్థి వలయాలను తొలగించారు. విశ్లేషణ కోసం ప్రతి శ్వాసనాళాన్ని నిలువుగా రెండు భాగాలుగా కత్తిరించారు, మరియు లోపలి ఉపరితలాన్ని చూడటానికి వాటిని మినూటియన్ సూది (ఫైన్ సైన్స్ టూల్స్) ఉపయోగించి సిలికాన్ రబ్బరు (సిల్గార్డ్, డౌ ఇంక్) ఉన్న ఒక డిష్‌లో అమర్చారు. ట్రాన్స్‌డ్యూస్ చేయబడిన కణాల పంపిణీ మరియు నమూనాను డిజిలైట్ కెమెరా మరియు TCapture సాఫ్ట్‌వేర్ (టక్సెన్ ఫోటోనిక్స్, చైనా)తో కూడిన నికాన్ మైక్రోస్కోప్ (SMZ1500) ఉపయోగించి ఫ్రంటల్ ఫోటోగ్రఫీ ద్వారా నిర్ధారించారు. చిత్రాలను 20x మాగ్నిఫికేషన్ వద్ద (శ్వాసనాళం యొక్క పూర్తి వెడల్పు కోసం అత్యధిక సెట్టింగ్‌తో సహా) సేకరించారు, శ్వాసనాళం యొక్క మొత్తం పొడవును దశలవారీగా చిత్రీకరించారు, ప్రతి చిత్రం మధ్య తగినంత అతివ్యాప్తి ఉండేలా చూసుకున్నారు. చిత్రాలను "కుట్టడం" కోసం, ప్రతి శ్వాసనాళం నుండి వచ్చిన చిత్రాలను ప్లేనార్ మోషన్ అల్గోరిథంను ఉపయోగించి ఇమేజ్ కాంపోజిట్ ఎడిటర్ v2.0.3 (మైక్రోసాఫ్ట్ రీసెర్చ్) ద్వారా ఒకే మిశ్రమ చిత్రంగా సమీకరించారు. ప్రతి జంతువు యొక్క శ్వాసనాళం యొక్క మిశ్రమ చిత్రాలలో LacZ వ్యక్తీకరణ ప్రాంతాలను, ముందుగా వివరించిన విధంగా, 0.35 < హ్యూ < 0.58, శాచురేషన్ > 0.15, మరియు వాల్యూ < 0.7 సెట్టింగ్‌లను ఉపయోగించి, ఆటోమేటెడ్ MATLAB స్క్రిప్ట్ (R2020a, మాత్‌వర్క్స్) ద్వారా పరిమాణీకరించారు. కణజాలం యొక్క ఆకృతులను ట్రేస్ చేయడం ద్వారా, కణజాల ప్రాంతాన్ని గుర్తించడానికి మరియు శ్వాసనాళ కణజాలం వెలుపల నుండి వచ్చే ఏవైనా తప్పుడు గుర్తింపులను నివారించడానికి, ప్రతి మిశ్రమ చిత్రం కోసం GIMP v2.10.24లో మాన్యువల్‌గా ఒక మాస్క్‌ను రూపొందించారు. ప్రతి జంతువు యొక్క అన్ని మిశ్రమ చిత్రాల నుండి రంగు వేయబడిన ప్రాంతాలను కలిపి ఆ జంతువు యొక్క మొత్తం రంగు వేయబడిన ప్రాంతాన్ని రూపొందించారు. ఆ తర్వాత సాధారణీకరించిన ప్రాంతాన్ని రూపొందించడానికి, రంగు వేయబడిన ప్రాంతాన్ని మొత్తం మాస్క్ ప్రాంతంతో భాగించారు.
ప్రతి శ్వాసనాళాన్ని పారాఫిన్‌లో పొదిగి, 5 μm సెక్షన్‌లను కత్తిరించారు. సెక్షన్‌లకు 5 నిమిషాల పాటు న్యూట్రల్ ఫాస్ట్ రెడ్‌తో కౌంటర్‌స్టెయిన్ చేసి, నికాన్ ఎక్లిప్స్ E400 మైక్రోస్కోప్, DS-Fi3 కెమెరా మరియు NIS ఎలిమెంట్ క్యాప్చర్ సాఫ్ట్‌వేర్ (వెర్షన్ 5.20.00) ఉపయోగించి చిత్రాలను తీశారు.
అన్ని గణాంక విశ్లేషణలు గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ ప్రిజం v9 (గ్రాఫ్‌ప్యాడ్ సాఫ్ట్‌వేర్, ఇంక్.)లో నిర్వహించబడ్డాయి. గణాంక ప్రాముఖ్యత p ≤ 0.05 వద్ద సెట్ చేయబడింది. షాపిరో-విల్క్ పరీక్షను ఉపయోగించి సాధారణత ధృవీకరించబడింది మరియు జతకాని t-పరీక్షను ఉపయోగించి LacZ స్టెయినింగ్‌లోని తేడాలు అంచనా వేయబడ్డాయి.
పట్టిక 1లో వివరించిన ఆరు MPలను PCXI ఉపయోగించి పరిశీలించారు, మరియు వాటి దృశ్యమానతను పట్టిక 2లో వివరించారు. రెండు పాలీస్టైరీన్ MPలు (MP1 మరియు MP2; వరుసగా 18 μm మరియు 0.25 μm) PCXI కింద కనిపించలేదు, కానీ మిగిలిన నమూనాలను గుర్తించగలిగారు (ఉదాహరణలు చిత్రం 5లో చూపబడ్డాయి). MP3 మరియు MP4 (10-15% Fe3O4; వరుసగా 0.25 μm మరియు 0.9 μm) మసకగా కనిపిస్తున్నాయి. పరీక్షించిన వాటిలో కొన్ని అతి చిన్న కణాలను కలిగి ఉన్నప్పటికీ, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) అత్యంత స్పష్టంగా కనిపించింది. కాంబిమ్యాగ్ ఉత్పత్తి అయిన MP6ను గుర్తించడం కష్టం. అన్ని సందర్భాల్లో, కేశనాళికకు సమాంతరంగా అయస్కాంతాన్ని ముందుకు వెనుకకు కదపడం ద్వారా MPని గుర్తించే మా సామర్థ్యం గణనీయంగా మెరుగుపడింది. అయస్కాంతాలు కేశనాళిక నుండి దూరంగా కదిలినప్పుడు, కణాలు పొడవైన తీగల వలె విస్తరించాయి, కానీ అయస్కాంతాలు దగ్గరకు వచ్చి అయస్కాంత క్షేత్ర బలం పెరిగేకొద్దీ, కణం కణాలు కేశనాళిక యొక్క పై ఉపరితలం వైపు వలస వెళ్ళే కొద్దీ తీగలు పొట్టిగా మారాయి (అనుబంధ వీడియో S1: MP4 చూడండి), దీనివల్ల ఉపరితలంపై కణ సాంద్రత పెరిగింది. దీనికి విరుద్ధంగా, కేశనాళిక నుండి అయస్కాంతాన్ని తీసివేసినప్పుడు, క్షేత్ర బలం తగ్గి, MPలు కేశనాళిక యొక్క పై ఉపరితలం నుండి విస్తరించి ఉన్న పొడవైన తీగలుగా పునఃఅమర్చబడతాయి (అనుబంధ వీడియో S2:MP4 చూడండి). అయస్కాంతం కదలడం ఆగిపోయిన తర్వాత, కణాలు సమతాస్థితికి చేరుకున్నాక కొద్దిసేపు కదలడం కొనసాగిస్తాయి. MP కేశనాళిక యొక్క పై ఉపరితలం వైపు మరియు దానికి దూరంగా కదులుతున్నప్పుడు, అయస్కాంత కణాలు సాధారణంగా శిథిలాలను ద్రవం గుండా లాగుతాయి.
PCXI కింద MP యొక్క దృశ్యమానత నమూనాల మధ్య గణనీయంగా మారుతుంది.(ఎ) MP3, (బి) MP4, (సి) MP5 మరియు (డి) MP6. ఇక్కడ చూపిన అన్ని చిత్రాలు కేశనాళికకు సుమారుగా 10 మి.మీ. నేరుగా పైన ఉన్న అయస్కాంతంతో తీయబడ్డాయి. కనిపించే పెద్ద వృత్తాలు కేశనాళికలలో చిక్కుకున్న గాలి బుడగలు, ఇవి ఫేజ్ కాంట్రాస్ట్ ఇమేజింగ్ యొక్క నలుపు మరియు తెలుపు అంచు లక్షణాలను స్పష్టంగా చూపుతాయి. ఎరుపు పెట్టెలో కాంట్రాస్ట్-పెంచే మాగ్నిఫికేషన్ ఉంటుంది. అన్ని చిత్రాలలో అయస్కాంత రేఖాచిత్రాల వ్యాసాలు స్కేల్‌కు అనుగుణంగా లేవని మరియు చూపిన దాని కంటే సుమారుగా 100 రెట్లు పెద్దవిగా ఉన్నాయని గమనించండి.
కేశనాళిక పైభాగం వెంబడి అయస్కాంతాన్ని ఎడమ, కుడి వైపులకు కదిపినప్పుడు, MP తీగ యొక్క కోణం అయస్కాంతంతో సమలేఖనం కావడానికి మారుతుంది (పటం 6 చూడండి), తద్వారా అయస్కాంత క్షేత్ర రేఖలను స్పష్టంగా చూపిస్తుంది. MP3-5 విషయంలో, తీగ ఒక నిర్దిష్ట కోణానికి చేరుకున్న తర్వాత, కణాలు కేశనాళిక పై ఉపరితలం వెంబడి లాగబడతాయి. దీని ఫలితంగా, అయస్కాంత క్షేత్రం అత్యంత బలంగా ఉన్న ప్రదేశానికి దగ్గరగా MPలు పెద్ద సమూహాలుగా ఏర్పడతాయి (అనుబంధ వీడియో S3:MP5 చూడండి). కేశనాళిక చివర దగ్గర చిత్రీకరణ చేస్తున్నప్పుడు కూడా ఇది ప్రత్యేకంగా స్పష్టంగా కనిపిస్తుంది, దీనివల్ల MPలు ద్రవ-గాలి అంతరముఖం వద్ద గుమికూడి కేంద్రీకృతమవుతాయి. MP3-5 కంటే గుర్తించడం మరింత కష్టంగా ఉన్న MP6లోని కణాలు, అయస్కాంతం కేశనాళిక వెంబడి కదిలినప్పుడు లాగబడలేదు, కానీ MP తీగలు విడిపోయి, కణాలను వీక్షణ క్షేత్రంలో వదిలివేశాయి (అనుబంధ వీడియో S4:MP6 చూడండి). కొన్ని సందర్భాల్లో, చిత్రీకరణ ప్రదేశం నుండి అయస్కాంతాన్ని చాలా దూరం జరపడం ద్వారా ప్రయోగించిన అయస్కాంత క్షేత్రాన్ని తగ్గించినప్పుడు, మిగిలి ఉన్న ఏవైనా MPలు తీగలోనే ఉంటూ గురుత్వాకర్షణ శక్తి వల్ల నెమ్మదిగా గొట్టం అడుగు భాగానికి దిగిపోయాయి (అనుబంధ వీడియో చూడండి). S5: MP3).
కేశనాళిక పైన అయస్కాంతాన్ని కుడివైపుకు జరిపినప్పుడు MP స్ట్రింగ్ యొక్క కోణం మారుతుంది. (ఎ) MP3, (బి) MP4, (సి) MP5 మరియు (డి) MP6. ఎరుపు పెట్టెలో కాంట్రాస్ట్-పెంచే మాగ్నిఫికేషన్ ఉంటుంది. ఈ స్థిర చిత్రాలలో చూడలేని ముఖ్యమైన కణ నిర్మాణం మరియు గతిశీల సమాచారాన్ని అనుబంధ వీడియోలు వెల్లడిస్తాయి కాబట్టి అవి విజ్ఞానదాయకంగా ఉంటాయని గమనించండి.
శ్వాసనాళం వెంబడి అయస్కాంతాన్ని నెమ్మదిగా ముందుకు వెనుకకు కదిలించడం, జీవించి ఉన్న జీవిలో (in vivo) సంక్లిష్టమైన కదలికల సందర్భంలో MPని దృశ్యమానం చేయడానికి సులభతరం చేస్తుందని మా పరీక్షలు చూపించాయి. పాలీస్టైరిన్ పూసలు (MP1 మరియు MP2) కేశనాళికలో కనిపించనందున, జీవించి ఉన్న జీవిలో (in vivo) పరీక్ష నిర్వహించబడలేదు. మిగిలిన నాలుగు MPలలో ప్రతిదానిని, అయస్కాంతం యొక్క దీర్ఘ అక్షాన్ని శ్వాసనాళానికి పైన నిలువుగా సుమారు 30° కోణంలో అమర్చి జీవించి ఉన్న జీవిలో (in vivo) పరీక్షించడం జరిగింది (పటాలు 2b మరియు 3a చూడండి), ఎందుకంటే ఇది పొడవైన MP గొలుసులకు దారితీసింది మరియు అయస్కాంతం యొక్క నిలువు అమరిక కంటే ఇది మరింత ప్రభావవంతంగా ఉంది. MP3, MP4 మరియు MP6 ఏ జీవించి ఉన్న జంతువుల శ్వాసనాళంలోనూ గుర్తించబడలేదు. జంతువులను మానవతా దృక్పథంతో చంపిన తర్వాత ఎలుకల వాయుమార్గాలను చిత్రీకరించినప్పుడు, సిరంజి పంప్‌ను ఉపయోగించి అదనపు పరిమాణాన్ని జోడించినప్పటికీ కణాలు కనిపించకుండానే ఉన్నాయి. MP5లో అత్యధిక ఐరన్ ఆక్సైడ్ పరిమాణం ఉంది మరియు ఇది మాత్రమే కనిపించిన కణం, అందువల్ల జీవించి ఉన్న జీవిలో (in vivo) MP ప్రవర్తనను అంచనా వేయడానికి మరియు వర్గీకరించడానికి దీనిని ఉపయోగించారు.
MP డెలివరీ సమయంలో శ్వాసనాళంపై అయస్కాంతాన్ని ఉంచడం వల్ల, చాలా MPలు, కానీ అన్నీ కాకుండా, వీక్షణ క్షేత్రంలో కేంద్రీకృతమయ్యాయి. శ్వాసనాళంలోకి ప్రవేశించే కణాలను మానవతా దృక్పథంతో బలిచ్చిన జంతువులలో ఉత్తమంగా గమనించవచ్చు. చిత్రం 7 మరియు అనుబంధ వీడియో S6: MP5, ఉదర శ్వాసనాళం యొక్క ఉపరితలంపై కణాలను వేగంగా అయస్కాంతం పట్టుకోవడం మరియు అమర్చడాన్ని చూపిస్తుంది, ఇది MPలను శ్వాసనాళంలోని కావలసిన ప్రాంతాలకు మళ్లించవచ్చని సూచిస్తుంది. MP డెలివరీ తర్వాత శ్వాసనాళం వెంబడి మరింత దూరంగా శోధించినప్పుడు, కొన్ని MPలు కారినాకు దగ్గరగా కనుగొనబడ్డాయి, ఇది ద్రవ ప్రక్రియ సమయంలో గరిష్ట అయస్కాంత క్షేత్ర బలం ఉన్న ప్రాంతం గుండా అవి పంపిణీ చేయబడినందున, అన్ని MPలను సేకరించి నిలుపుకోవడానికి అయస్కాంత క్షేత్ర బలం సరిపోలేదని సూచిస్తుంది. అయినప్పటికీ, చిత్రీకరించిన ప్రాంతం చుట్టూ ప్రసవానంతర MP సాంద్రతలు ఎక్కువగా ఉన్నాయి, ఇది చాలా MPలు ప్రయోగించిన అయస్కాంత క్షేత్ర బలం అత్యధికంగా ఉన్న వాయుమార్గ ప్రాంతాలలోనే ఉండిపోయాయని సూచిస్తుంది.
ఇటీవల కారుణ్య మరణం పొందిన ఎలుక యొక్క శ్వాసనాళంలోకి MP5ను ప్రవేశపెట్టడానికి (ఎ) ముందు మరియు (బి) తర్వాత తీసిన చిత్రాలు. ఇమేజింగ్ ప్రాంతానికి సరిగ్గా పైన అయస్కాంతం ఉంచబడింది. చిత్రీకరించబడిన ప్రాంతం రెండు మృదులాస్థి వలయాల మధ్య ఉంది. MP ప్రవేశపెట్టడానికి ముందు, శ్వాసమార్గంలో కొంత ద్రవం ఉంది. ఎరుపు పెట్టెలో కాంట్రాస్ట్-పెంచే మాగ్నిఫికేషన్ ఉంది. ఈ చిత్రాలు సప్లిమెంటరీ వీడియో S6:MP5లో చూపిన వీడియో నుండి తీసుకోబడ్డాయి.
జీవించి ఉన్న జీవిలో శ్వాసనాళం వెంబడి అయస్కాంతాన్ని కదిలించడం వల్ల, కేశనాళికలలో కనిపించే విధంగానే MP గొలుసు వాయుమార్గ ఉపరితలం లోపల కోణాన్ని మార్చుకుంది (పటం 8 మరియు అనుబంధ వీడియో S7:MP5 చూడండి). అయితే, మా అధ్యయనంలో, కేశనాళికలలో లాగా MPలను జీవించి ఉన్న వాయుమార్గ ఉపరితలం వెంబడి లాగడం సాధ్యపడలేదు. కొన్ని సందర్భాల్లో, అయస్కాంతం ఎడమ, కుడి వైపులకు కదిలినప్పుడు MP గొలుసు పొడవుగా అవుతుంది. ఆసక్తికరంగా, అయస్కాంతాన్ని శ్వాసనాళం వెంబడి నిలువుగా కదిపినప్పుడు కణాల వరుస ఉపరితల ద్రవ పొర యొక్క లోతును మార్చినట్లు మరియు అయస్కాంతాన్ని నేరుగా పైకి కదిపి, కణాల వరుసను నిలువు స్థానానికి తిప్పినప్పుడు అది విస్తరించినట్లు కూడా మేము కనుగొన్నాము (అనుబంధ వీడియో S7 చూడండి). : MP5 లో 0:09 వద్ద, కుడి దిగువన). అయస్కాంతాన్ని శ్వాసనాళం పొడవునా కాకుండా, దాని పైభాగంలో అడ్డంగా (అంటే, జంతువుకు ఎడమ లేదా కుడి వైపుకు) జరిపినప్పుడు, చలనంలోని లక్షణ నమూనా మారింది. కణాలు కదులుతున్నప్పుడు కూడా స్పష్టంగా కనిపించాయి, కానీ అయస్కాంతాన్ని శ్వాసనాళం నుండి తీసివేసినప్పుడు, కణాల తీగల కొనలు కనిపించాయి (అనుబంధ వీడియో S8:MP5, 0:08 నుండి చూడండి). ఇది ఒక గాజు కేశనాళికలో ప్రయోగించిన అయస్కాంత క్షేత్రం కింద మేము గమనించిన MP ప్రవర్తనకు అనుగుణంగా ఉంది.
సజీవంగా, మత్తుమందు ఇచ్చిన ఎలుక యొక్క శ్వాసనాళంలో MP5ను చూపిస్తున్న ఉదాహరణ చిత్రాలు. (ఎ) శ్వాసనాళానికి పైన మరియు ఎడమ వైపున చిత్రాలను తీయడానికి అయస్కాంతాన్ని ఉపయోగించారు, ఆ తర్వాత (బి) అయస్కాంతాన్ని కుడి వైపుకు జరిపిన తర్వాత. ఎరుపు పెట్టెలో కాంట్రాస్ట్-పెంచే మాగ్నిఫికేషన్ ఉంది. ఈ చిత్రాలు సప్లిమెంటరీ వీడియో S7:MP5లో చూపిన వీడియో నుండి తీసుకోబడ్డాయి.
రెండు ధ్రువాలను శ్వాసనాళానికి పైన మరియు కింద ఉత్తర-దక్షిణ దిశలో (అంటే ఆకర్షించే విధంగా; పటం 3b) అమర్చినప్పుడు, MP కార్డ్‌లు పొడవుగా కనిపించాయి మరియు శ్వాసనాళం యొక్క పృష్ఠ ఉపరితలంపై కాకుండా దాని ప్రక్కగోడపై ఉన్నాయి (అనుబంధ వీడియో S9:MP5 చూడండి). అయితే, ద్వంద్వ-అయస్కాంత పరికరాన్ని ఉపయోగించినప్పుడు ద్రవాన్ని అందించిన తర్వాత ఒకే ప్రదేశంలో (అంటే, శ్వాసనాళం యొక్క పృష్ఠ ఉపరితలంపై) కణాల అధిక సాంద్రతలు గుర్తించబడలేదు, ఇది సాధారణంగా ఏక-అయస్కాంత పరికరాన్ని ఉపయోగించినప్పుడు జరుగుతుంది. ఆ తర్వాత, ధ్రువాలను తిరగేసి ఒక అయస్కాంతాన్ని వికర్షించే విధంగా అమర్చినప్పుడు (పటం 3c), ద్రవాన్ని అందించిన తర్వాత వీక్షణ క్షేత్రంలో కనిపించే కణాల సంఖ్య పెరిగినట్లు కనిపించలేదు. అయస్కాంతాలను వరుసగా లాగే లేదా నెట్టే అధిక అయస్కాంత క్షేత్ర బలాల కారణంగా, ఈ రెండు ద్వంద్వ-అయస్కాంత అమరికల ఏర్పాటు సవాలుతో కూడుకున్నది. ఆ తర్వాత, క్షేత్ర రేఖలు శ్వాసనాళ గోడను లంబంగా దాటేలా (పటం 3d), వాయుమార్గానికి సమాంతరంగా కానీ వాయుమార్గం గుండా 90 డిగ్రీల కోణంలో వెళ్లేలా ఒకే అయస్కాంతానికి ఈ అమరికను మార్చారు. పక్క గోడపై కణాల సమూహాన్ని గమనించవచ్చో లేదో నిర్ధారించడానికి ఇది రూపొందించబడింది. అయితే, ఈ ఆకృతీకరణలో, MP సంచయనం లేదా అయస్కాంత కదలిక యొక్క గుర్తించదగిన కదలిక ఏదీ లేదు. ఈ ఫలితాలన్నింటి ఆధారంగా, ఇన్ వివో జన్యు వాహక అధ్యయనాల కోసం ఒకే-అయస్కాంతం, 30-డిగ్రీల ధోరణి ఆకృతీకరణ (పటం 3a) ఎంపిక చేయబడింది.
జంతువును మానవతా దృక్పథంతో చంపిన వెంటనే పదేపదే చిత్రీకరించినప్పుడు, గందరగోళానికి గురిచేసే కణజాల కదలిక లేకపోవడం వల్ల, అయస్కాంతం యొక్క అనువాద చలనానికి అనుగుణంగా "అటూ ఇటూ ఊగుతూ" ఉన్న సూక్ష్మమైన మరియు పొట్టి కణాల వరుసలను స్పష్టమైన ఇంటర్‌కాండ్రల్ క్షేత్రంలో గుర్తించగలిగారు. అయినప్పటికీ, MP6 కణాల ఉనికిని మరియు చలనాన్ని ఇప్పటికీ స్పష్టంగా చూడలేకపోతున్నాము.
LV-LacZ టైటర్ 1.8 × 108 TU/mlగా ఉంది, మరియు CombiMag MP (MP6)తో 1:1 నిష్పత్తిలో కలిపిన తర్వాత, జంతువులకు 9 × 107 TU/ml LV వెహికల్ (అంటే 4.5 × 106 TU/ఎలుక) యొక్క 50 μl శ్వాసనాళ మోతాదును అందించారు. ఈ అధ్యయనాలలో, ప్రసవ సమయంలో అయస్కాంతాన్ని కదిలించడానికి బదులుగా, మేము అయస్కాంతాన్ని ఒకే స్థానంలో స్థిరంగా ఉంచాము, తద్వారా (ఎ) అయస్కాంత క్షేత్రం లేనప్పుడు వెక్టర్ డెలివరీతో పోలిస్తే LV ట్రాన్స్‌డక్షన్‌ను మెరుగుపరచవచ్చా, మరియు (బి) వాయుమార్గ కణాలను ఎగువ వాయుమార్గంలోని అయస్కాంత లక్ష్య ప్రాంతాలకు కేంద్రీకరించవచ్చా అని నిర్ధారించాము.
మా ప్రామాణిక LV వెక్టర్ డెలివరీ ప్రోటోకాల్ మాదిరిగానే, అయస్కాంతాల ఉనికి మరియు LV వెక్టర్లతో కలిపి కాంబిమ్యాగ్ వాడకం జంతువుల ఆరోగ్యంపై ప్రతికూల ప్రభావాలను చూపినట్లు కనిపించలేదు. యాంత్రిక అంతరాయానికి గురైన శ్వాసనాళ ప్రాంతం యొక్క ఫ్రంటల్ చిత్రాలు (అనుబంధ చిత్రం 1), అయస్కాంతం ఉన్నప్పుడు LV-MP తో చికిత్స పొందిన జంతువుల సమూహంలో ట్రాన్స్‌డక్షన్ స్థాయిలు గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉన్నాయని సూచించాయి (చిత్రం 9a). నియంత్రణ సమూహంలో కేవలం కొద్ది మొత్తంలో నీలిరంగు LacZ స్టెయినింగ్ మాత్రమే ఉంది (చిత్రం 9b). సాధారణీకరించిన X-Gal స్టెయిన్డ్ ప్రాంతాల పరిమాణీకరణ, అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో LV-MP ఇవ్వడం వల్ల సుమారుగా 6 రెట్లు మెరుగుదల కనిపించిందని చూపించింది (చిత్రం 9c).
(ఎ) అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో మరియు (బి) అయస్కాంతం లేనప్పుడు LV-MP ద్వారా శ్వాసనాళ ట్రాన్స్‌డక్షన్‌ను చూపే ఉదాహరణ మిశ్రమ చిత్రాలు. (సి) అయస్కాంతాన్ని ఉపయోగించినప్పుడు శ్వాసనాళంలోని సాధారణీకరించిన LacZ ట్రాన్స్‌డక్షన్ ప్రాంతంలో గణాంకపరంగా గణనీయమైన మెరుగుదల (*p = 0.029, t-పరీక్ష, ప్రతి సమూహానికి n = 3, సగటు ± SEM).
న్యూట్రల్ ఫాస్ట్ రెడ్ రంగు వేసిన సెక్షన్లలో (ఉదాహరణ అనుబంధ చిత్రం 2లో చూపబడింది), గతంలో నివేదించిన విధంగానే LacZ- రంగు వేసిన కణాలు ఒకే నమూనాలో మరియు ప్రదేశంలో ఉన్నట్లు చూపించాయి.
వాయుమార్గ జన్యు చికిత్సకు ఒక ముఖ్యమైన సవాలు ఏమిటంటే, వాహక కణాలను ఆసక్తి ఉన్న ప్రాంతాలకు కచ్చితంగా చేర్చడం మరియు గాలి ప్రవాహం, చురుకైన శ్లేష్మ నిర్మూలన సమక్షంలో కదులుతున్న ఊపిరితిత్తులలో అధిక స్థాయి ట్రాన్స్‌డక్షన్ సామర్థ్యాన్ని సాధించడం. సిస్టిక్ ఫైబ్రోసిస్ (CF) వాయుమార్గ వ్యాధికి చికిత్స చేయడానికి రూపొందించిన LV వాహకాల విషయంలో, వాహక కణాల నివాస సమయాన్ని పెంచడం అనేది ఇప్పటివరకు సాధించలేని లక్ష్యంగా ఉంది. కాస్టెల్లానీ మరియు ఇతరులు సూచించినట్లుగా, ట్రాన్స్‌డక్షన్‌ను మెరుగుపరచడానికి అయస్కాంత క్షేత్రాలను ఉపయోగించడం వల్ల, ఎలక్ట్రోపోరేషన్ వంటి ఇతర జన్యు పంపిణీ పద్ధతులతో పోలిస్తే ప్రయోజనాలు ఉన్నాయి, ఎందుకంటే ఇది సరళత, తక్కువ ఖర్చు, పంపిణీ స్థానికీకరణ, పెరిగిన సామర్థ్యం, ​​తక్కువ ఇంక్యుబేషన్ సమయాలు మరియు బహుశా తక్కువ వాహక మోతాదును మిళితం చేయగలదు¹⁰. అయినప్పటికీ, బాహ్య అయస్కాంత శక్తుల ప్రభావంతో వాయుమార్గాలలో అయస్కాంత కణాల ఇన్ వివో నిక్షేపణ మరియు ప్రవర్తన ఎప్పుడూ వర్ణించబడలేదు, అలాగే చెక్కుచెదరని సజీవ వాయుమార్గాలలో జన్యు వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను పెంచడానికి ఈ పద్ధతి యొక్క సాధ్యత ఇన్ వివోలో వాస్తవంగా ప్రదర్శించబడలేదు.
మా ఇన్ విట్రో సింక్రోట్రాన్ PCXI ప్రయోగాలలో, పాలీస్టైరిన్ MP మినహా, మేము పరీక్షించిన అన్ని కణాలు మేము ఉపయోగించిన ఇమేజింగ్ సెటప్‌లో కనిపించాయని తేలింది. అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో, MPలు తీగలను ఏర్పరుస్తాయి, వాటి పొడవులు కణం రకం మరియు అయస్కాంత క్షేత్ర బలం (అంటే అయస్కాంతం యొక్క సామీప్యత మరియు చలనం)పై ఆధారపడి ఉంటాయి. పటం 10లో చూపినట్లుగా, మనం గమనించే తీగలు ప్రతి ఒక్క కణం అయస్కాంతీకరించబడి, దాని స్వంత స్థానిక అయస్కాంత క్షేత్రాన్ని ప్రేరేపించడం వల్ల ఏర్పడతాయి. ఈ వేర్వేరు క్షేత్రాలు ఇతర సారూప్య కణాలను ఒకచోట చేరి, అనుసంధానం అయ్యేలా చేస్తాయి. ఇతర కణాల స్థానిక ఆకర్షణ మరియు వికర్షణ బలాల వల్ల ఏర్పడే స్థానిక శక్తుల కారణంగా ఈ అనుసంధానంలో సమూహ తీగల వంటి చలనాలు ఏర్పడతాయి.
(ఎ,బి) ద్రవంతో నిండిన కేశనాళికల లోపల ఏర్పడిన కణ శ్రేణులు మరియు (సి,డి) గాలితో నిండిన శ్వాసనాళాన్ని చూపే రేఖాచిత్రం. కేశనాళికలు మరియు శ్వాసనాళం వాస్తవ కొలతలకు అనుగుణంగా గీయబడలేదని గమనించండి. ప్యానెల్ (ఎ)లో MP యొక్క వివరణ కూడా ఉంది, ఇందులో తీగల వలె అమర్చబడిన Fe3O4 కణాలు ఉంటాయి.
అయస్కాంతాన్ని కేశనాళిక పైన కదిపినప్పుడు, Fe3O4 కలిగిన MP3-5 విషయంలో కణాల వరుస కోణం ఒక క్లిష్టమైన పరిమితికి చేరుకుంది, ఆ తర్వాత కణాల వరుస దాని అసలు స్థానంలో ఉండకుండా, ఉపరితలం వెంబడి కదిలి ఒక కొత్త స్థానానికి చేరుకుంది. గాజు కేశనాళిక ఉపరితలం ఈ కదలిక జరగడానికి వీలు కల్పించేంత నునుపుగా ఉండటం వల్ల ఈ ప్రభావం సంభవించే అవకాశం ఉంది. ఆసక్తికరంగా, MP6 (కాంబిమ్యాగ్) ఈ విధంగా ప్రవర్తించలేదు, బహుశా దానిలోని కణాలు చిన్నవిగా ఉండటం, విభిన్న పూతలు లేదా ఉపరితల ఆవేశాలు కలిగి ఉండటం, లేదా ఒక యాజమాన్య వాహక ద్రవం వాటి కదిలే సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేయడం దీనికి కారణం కావచ్చు. కాంబిమ్యాగ్ కణాల ఇమేజ్ కాంట్రాస్ట్ కూడా బలహీనంగా ఉంది, ఇది ద్రవం మరియు కణాలు సారూప్య సాంద్రతలను కలిగి ఉండవచ్చని మరియు అందువల్ల ఒకదానికొకటి సులభంగా కదలలేవని సూచిస్తుంది. అయస్కాంతం చాలా వేగంగా కదిలితే కణాలు చిక్కుకుపోవచ్చు, ఇది ద్రవంలోని కణాల మధ్య ఉన్న ఘర్షణను అయస్కాంత క్షేత్ర బలం ఎల్లప్పుడూ అధిగమించలేదని సూచిస్తుంది, కాబట్టి అయస్కాంత క్షేత్ర బలం మరియు అయస్కాంతానికి, లక్ష్య ప్రాంతానికి మధ్య ఉన్న దూరం చాలా ముఖ్యమైనవి అనడంలో ఆశ్చర్యం లేదు. ఈ ఫలితాలన్నీ కలిపి చూస్తే, అయస్కాంతాలు లక్ష్య ప్రాంతం గుండా ప్రవహించే అనేక MPలను పట్టుకోగలిగినప్పటికీ, శ్వాసనాళం ఉపరితలం వెంబడి కాంబిమ్యాగ్ కణాలను కదిలించడానికి అయస్కాంతాలపై ఆధారపడటం సాధ్యం కాకపోవచ్చు. అందువల్ల, శ్వాసమార్గంలోని నిర్దిష్ట ప్రాంతాలను భౌతికంగా లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి, ఇన్ వివో LV-MP అధ్యయనాలు స్థిర అయస్కాంత క్షేత్రాలను ఉపయోగించాలని మేము నిర్ధారిస్తున్నాము.
శరీరంలోకి కణాలు ప్రవేశించినప్పుడు, సంక్లిష్టంగా కదులుతున్న శరీర కణజాలం నేపథ్యంలో వాటిని గుర్తించడం కష్టం. అయితే, MP తీగలను "కదిలించడానికి" శ్వాసనాళం పైన అయస్కాంతాన్ని అడ్డంగా జరపడం ద్వారా వాటిని గుర్తించే సామర్థ్యం మెరుగుపడింది. ప్రత్యక్ష చిత్రీకరణ సాధ్యమైనప్పటికీ, జంతువును మానవతా దృక్పథంతో చంపిన తర్వాత కణాల కదలికను గుర్తించడం సులభం. అయస్కాంతాన్ని చిత్రీకరణ ప్రాంతం పైన ఉంచినప్పుడు, ఈ ప్రదేశంలో MP సాంద్రతలు సాధారణంగా అత్యధికంగా ఉన్నాయి, అయినప్పటికీ కొన్ని కణాలు సాధారణంగా శ్వాసనాళంలో మరింత ముందుకు కనిపించాయి. ఇన్ విట్రో అధ్యయనాలకు విరుద్ధంగా, అయస్కాంతాన్ని జరపడం ద్వారా కణాలను శ్వాసనాళం వెంట లాగడం సాధ్యం కాదు. ఈ పరిశోధన, శ్వాసనాళం ఉపరితలాన్ని కప్పి ఉంచే శ్లేష్మం సాధారణంగా పీల్చిన కణాలను ఎలా ప్రాసెస్ చేస్తుందో, వాటిని శ్లేష్మంలో బంధించి, ఆ తర్వాత మ్యూకోసిలియరీ క్లియరెన్స్ యంత్రాంగం ద్వారా ఎలా తొలగిస్తుందో అనే దానికి అనుగుణంగా ఉంది.
శ్వాసనాళానికి పైన మరియు కింద ఆకర్షణ కోసం అయస్కాంతాలను ఉపయోగించడం (పటం 3బి) వల్ల, ఒకే బిందువు వద్ద అధికంగా కేంద్రీకృతమయ్యే అయస్కాంత క్షేత్రానికి బదులుగా, మరింత ఏకరీతి అయస్కాంత క్షేత్రం ఏర్పడి, తద్వారా కణాల పంపిణీ మరింత ఏకరీతిగా జరిగే అవకాశం ఉందని మేము ఊహించాము. అయితే, మా ప్రాథమిక అధ్యయనంలో ఈ ఊహకు మద్దతు ఇచ్చే స్పష్టమైన ఆధారాలు లభించలేదు. అదేవిధంగా, ఒక జత అయస్కాంతాలను వికర్షించేలా అమర్చడం (పటం 3సి) వల్ల చిత్రీకరించిన ప్రాంతంలో ఎక్కువ కణాలు నిక్షేపించబడలేదు. ఈ రెండు ఫలితాలు, రెండు అయస్కాంతాల అమరిక MP లక్ష్యీకరణ యొక్క స్థానిక నియంత్రణను గణనీయంగా మెరుగుపరచదని, మరియు దాని ఫలితంగా ఏర్పడే బలమైన అయస్కాంత శక్తులను అమర్చడం కష్టమని, అందువల్ల ఈ విధానం ఆచరణ సాధ్యం కాదని నిరూపిస్తున్నాయి. అదేవిధంగా, అయస్కాంతాన్ని శ్వాసనాళానికి పైన మరియు దాని గుండా అమర్చడం (పటం 3డి) కూడా చిత్రీకరించిన ప్రాంతంలో నిలిచిపోయిన కణాల సంఖ్యను పెంచలేదు. ఈ ప్రత్యామ్నాయ అమరికలలో కొన్ని విజయవంతం కాకపోవచ్చు, ఎందుకంటే అవి నిక్షేపణ ప్రాంతంలో తక్కువ అయస్కాంత క్షేత్ర బలాలకు దారితీస్తాయి. అందువల్ల, ఒకే 30-డిగ్రీల కోణ అయస్కాంత అమరిక (పటం 3ఎ) ఇన్ వివో పరీక్షకు అత్యంత సులభమైన మరియు సమర్థవంతమైన పద్ధతిగా పరిగణించబడుతుంది.
LV-MP అధ్యయనం ప్రకారం, LV వెక్టర్లను కాంబిమ్యాగ్‌తో కలిపి, అయస్కాంత క్షేత్రం సమక్షంలో భౌతిక అంతరాయం తర్వాత అందించినప్పుడు, నియంత్రణలతో పోలిస్తే శ్వాసనాళంలో ట్రాన్స్‌డక్షన్ స్థాయిలు గణనీయంగా పెరిగాయి. సింక్రోట్రాన్ ఇమేజింగ్ అధ్యయనాలు మరియు LacZ ఫలితాల ఆధారంగా, అయస్కాంత క్షేత్రం శ్వాసనాళంలో LVని సంరక్షించగలదని మరియు ఊపిరితిత్తులలోకి లోతుగా చొచ్చుకుపోయే వెక్టర్ కణాల సంఖ్యను తగ్గించగలదని స్పష్టమైంది. ఇటువంటి లక్ష్య నిర్దేశ మెరుగుదలలు, అందించబడిన టైటర్లు, ఆఫ్-టార్గెట్ ట్రాన్స్‌డక్షన్, శోథ మరియు రోగనిరోధక దుష్ప్రభావాలు, మరియు జన్యు వాహక ఖర్చులను తగ్గిస్తూనే అధిక సామర్థ్యానికి దారితీయవచ్చు. ముఖ్యంగా, తయారీదారు ప్రకారం, కాంబిమ్యాగ్‌ను ఇతర వైరల్ వెక్టర్లు (AAV వంటివి) మరియు న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలతో సహా ఇతర జన్యు బదిలీ పద్ధతులతో కలిపి ఉపయోగించవచ్చు.