Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu pre CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Génové vektory na liečbu cystickej fibrózy pľúc by sa mali zameriavať na vodivé dýchacie cesty, pretože periférna pľúcna transdukcia neposkytuje terapeutický úžitok. Účinnosť vírusovej transdukcie priamo súvisí s dobou zotrvania vektora. Avšak dodávacie tekutiny, ako sú nosiče génov, prirodzene difundujú do alveol počas nádychu a terapeutické častice akejkoľvek formy sa rýchlo odstraňujú mukociliárnym transportom. Predĺženie doby zotrvania nosičov génov v dýchacích cestách je dôležité, ale ťažko dosiahnuteľné. Magnetické častice konjugované s nosičom génov, ktoré je možné nasmerovať na povrch dýchacích ciest, môžu zlepšiť regionálne zacielenie. Vzhľadom na výzvy vizualizácie in vivo nie je správanie takýchto malých magnetických častíc na povrchu dýchacích ciest v prítomnosti aplikovaného magnetického poľa dostatočne pochopené. Cieľom tejto štúdie bolo použiť synchrotrónové zobrazovanie na vizualizáciu pohybu série magnetických častíc in vivo v priedušnici anestetizovaných potkanov s cieľom preskúmať dynamiku a vzorce správania individuálnych a objemových častíc in vivo. Potom sme tiež posúdili, či by dodávanie lentivírusových magnetických častíc v prítomnosti magnetického poľa zvýšilo účinnosť transdukcie v priedušnici potkanov. Syncrotrónové röntgenové zobrazovanie odhaľuje správanie magnetických častíc v stacionárnych a pohyblivých magnetických poliach in vitro a in vivo. Častice nemožno ľahko ťahať po povrchu živých dýchacích ciest magnetmi, ale počas transportu sa usadeniny koncentrujú v zornom poli, kde je magnetické pole najsilnejšie. Účinnosť transdukcie sa tiež šesťnásobne zvýšila, keď boli lentivírusové magnetické častice dodané v prítomnosti magnetického poľa. Tieto výsledky spoločne naznačujú, že lentivírusové magnetické častice a magnetické polia môžu byť cennými prístupmi k zlepšeniu zacielenia génových vektorov a zvýšeniu hladín transdukcie vo vodivých dýchacích cestách in vivo.
Cystická fibróza (CF) je spôsobená variáciou v jednom géne nazývanom transmembránový regulátor vodivosti CF (CFTR). Proteín CFTR je iónový kanál, ktorý je prítomný v mnohých epitelových bunkách v tele vrátane vodivých dýchacích ciest, ktoré sú hlavným miestom patogenézy CF. Poruchy CFTR vedú k abnormálnemu transportu vody, dehydratácii povrchu dýchacích ciest a znižovaniu hĺbky vrstvy kvapaliny na povrchu dýchacích ciest (ASL). To tiež zhoršuje schopnosť mukociliárneho transportného systému (MCT) odstraňovať vdýchnuté častice a patogény z dýchacích ciest. Naším cieľom je vyvinúť génovú terapiu lentivírusom (LV), ktorá by poskytla správnu kópiu génu CFTR a zlepšila zdravie ASL, MCT a pľúc, a pokračovať vo vývoji nových technológií schopných merať tieto parametre in vivo1.
Vektory ľavej komory (LV) sú jedným z hlavných kandidátov na génovú terapiu dýchacích ciest pri CF, najmä preto, že dokážu permanentne integrovať terapeutický gén do bazálnych buniek dýchacích ciest (kmeňových buniek dýchacích ciest). To je dôležité, pretože dokážu obnoviť normálnu hydratáciu a odstraňovanie hlienu diferenciáciou na funkčné povrchové bunky dýchacích ciest asociované s CF s korigovaným génom, čo vedie k celoživotným výhodám. Vektory LV by mali byť nasmerované proti vodivým dýchacím cestám, pretože práve tam začína ochorenie pľúc pri CF. Doručenie vektora hlbšie do pľúc môže viesť k alveolárnej transdukcii, ale to nemá pri CF žiadny terapeutický prínos. Tekutiny, ako sú nosiče génov, však prirodzene migrujú do alveol po inspirácii po dodaní3,4 a terapeutické častice sa rýchlo vyplavia do ústnej dutiny pomocou MCT. Účinnosť transdukcie LV priamo súvisí s dĺžkou času, počas ktorého vektor zostáva v blízkosti cieľových buniek, aby umožnil bunkové vychytávanie – „doba zotrvania“5 – ktorú možno ľahko znížiť typickým regionálnym prúdením vzduchu, ako aj koordinovaným zachytávaním hlienu časticami a MCT. Pri CF je schopnosť predĺžiť dobu zotrvania LV v dýchacích cestách dôležitá na dosiahnutie vysokej úrovne transdukcie v tejto oblasti, ale doteraz bola náročná.
Na prekonanie tejto prekážky navrhujeme, že magnetické častice (MP) ľavej komory (LV) môžu pomôcť dvoma komplementárnymi spôsobmi. Po prvé, môžu byť magneticky vedené na povrch dýchacích ciest, aby sa zlepšilo zacielenie a pomohlo časticiam nosičov génov zostať v požadovanej oblasti dýchacích ciest; a (ASL) sa presunúť do bunkovej vrstvy 6. MP sa široko používajú ako cielené vehikulá na dodávanie liekov, keď sa viažu na protilátky, chemoterapeutické liečivá alebo iné malé molekuly, ktoré sa viažu na bunkové membrány alebo na relevantné receptory na povrchu buniek a akumulujú sa v miestach nádoru v prítomnosti statickej elektriny. Magnetické polia na liečbu rakoviny 7. Ďalšie „hypertermálne“ techniky sa zameriavajú na zahrievanie MP, keď sú vystavené oscilujúcim magnetickým poliam, čím sa ničia nádorové bunky. Princíp magnetickej transfekcie, pri ktorom sa magnetické pole používa ako transfekčné činidlo na zvýšenie prenosu DNA do buniek, sa bežne používa in vitro s použitím radu nevírusových a vírusových génových vektorov pre ťažko transdukovateľné bunkové línie. Účinnosť LV magnetotransfekcie bola preukázaná, pričom in vitro dodávanie LV-MP do ľudskej bronchiálnej epitelovej bunkovej línie v prítomnosti statického magnetického poľa zvýšilo účinnosť transdukcie 186-násobne v porovnaní so samotným LV vektorom. LV-MP sa tiež aplikoval na in vitro model CF, kde magnetická transfekcia zvýšila LV transdukciu v kultúrach na rozhraní vzduch-kvapalina 20-násobne v prítomnosti CF spúta10. In vivo magnetotransfekcii orgánov sa však venovala relatívne malá pozornosť a bola hodnotená len v niekoľkých štúdiách na zvieratách11,12,13,14,15, najmä v pľúca16,17. Napriek tomu sú možnosti magnetickej transfekcie v liečbe pľúc s CF jasné. Tan a kol. (2020) uviedli, že „štúdia overenia konceptu účinného podávania magnetických nanočastíc do pľúc pripraví cestu pre budúce stratégie inhalácie CFTR na zlepšenie klinických výsledkov u pacientov s CF“6.
Správanie malých magnetických častíc na povrchu dýchacích ciest v prítomnosti aplikovaného magnetického poľa je ťažké vizualizovať a študovať, a preto je zle pochopené. V iných štúdiách sme vyvinuli metódu fázového kontrastu s röntgenovým zobrazovaním založenú na šírení synchrotrónov (PB-PCXI) na neinvazívnu vizualizáciu a kvantifikáciu nepatrných in vivo zmien v hĺbke ASL18 a správaní MCT19,20 na priame meranie hydratácie povrchu plynového kanála a použitie ako včasného indikátora účinnosti liečby. Naša metóda hodnotenia MCT navyše využíva častice s priemerom 10 – 35 µm zložené z oxidu hlinitého alebo skla s vysokým indexom lomu ako markery MCT viditeľné pomocou PB-PCXI21. Obe techniky sú vhodné na vizualizáciu rôznych typov častíc vrátane MP.
Vďaka vysokému priestorovému a časovému rozlíšeniu sú naše techniky analýzy ASL a MCT založené na PB-PCXI vhodné na skúmanie dynamiky a vzorcov správania jednotlivých a objemových častíc in vivo, čo nám pomáha pochopiť a optimalizovať techniky dodávania MP génov. Prístup, ktorý tu používame, vychádza z našich štúdií s použitím lúčovej línie SPring-8 BL20B2, v ktorej sme vizualizovali pohyb tekutiny po podaní simulovanej vektorovej dávky do nosových a pľúcnych dýchacích ciest myší, aby sme pomohli vysvetliť naše nejednotné vzorce génovej expresie pozorované v našich štúdiách s dávkami génových nosičov na zvieratách 3,4.
Cieľom tejto štúdie bolo použiť synchrotrón PB-PCXI na vizualizáciu pohybov série MP v priedušnici živých potkanov in vivo. Tieto zobrazovacie štúdie PB-PCXI boli navrhnuté na testovanie rôznych MP, intenzity magnetického poľa a umiestnenia s cieľom určiť ich vplyv na pohyb MP. Predpokladali sme, že externe aplikované magnetické pole by pomohlo dodanému MP zostať alebo sa presunúť do cieľovej oblasti. Tieto štúdie nám tiež umožnili identifikovať konfigurácie magnetov, ktoré maximalizujú počet častíc zadržaných v priedušnici po uložení. V druhej sérii štúdií sme sa snažili použiť túto optimálnu konfiguráciu na demonštráciu transdukčného vzoru vyplývajúceho z in vivo dodávania LV-MP do dýchacích ciest potkanov, na základe predpokladu, že dodávanie LV-MP v kontexte cielenia na dýchacie cesty by viedlo k zlepšeniu účinnosti transdukcie ľavej komory.
Všetky štúdie na zvieratách boli vykonané podľa protokolov schválených Univerzitou v Adelaide (M-2019-060 a M-2020-022) a etickou komisiou pre synchrotronové zvieratá SPring-8. Experimenty boli vykonané podľa smerníc ARRIVE.
Všetky röntgenové snímky sa vykonávali na lúčovej línii BL20XU na synchrotróne SPring-8 v Japonsku s použitím nastavenia podobného tomu, ktoré bolo opísané predtým21,22. Stručne povedané, experimentálna skrinka sa nachádzala 245 m od synchrotrónového úložného kruhu. Vzdialenosť medzi vzorkou a detektorom 0,6 m sa používa na štúdie zobrazovania častíc a 0,3 m na štúdie zobrazovania in vivo na generovanie efektov fázového kontrastu. Použila sa energia monochromatického lúča 25 keV. Snímky sa zachytili pomocou röntgenového konvertora s vysokým rozlíšením (SPring-8 BM3) spojeného s detektorom sCMOS. Konvertor prevádza röntgenové lúče na viditeľné svetlo pomocou scintilátora s hrúbkou 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), ktorý je potom nasmerovaný na senzor sCMOS pomocou mikroskopického objektívu × 10 (NA 0,3). Detektor sCMOS bol Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonsko) s veľkosťou poľa 2048 × 2048 pixelov a veľkosť pixelu v surovom stave 6,5 × 6,5 µm. Toto nastavenie poskytuje efektívnu izotropnú veľkosť pixelu 0,51 µm a zorné pole približne 1,1 mm × 1,1 mm. Expozičná dĺžka 100 ms bola zvolená na maximalizáciu pomeru signálu k šumu magnetických častíc vo vnútri a mimo dýchacích ciest a zároveň minimalizáciu artefaktov pohybu vyvolaných dýchaním. Pre štúdie in vivo bola do dráhy röntgenového žiarenia umiestnená rýchla röntgenová uzávierka na obmedzenie dávky žiarenia blokovaním röntgenového lúča medzi expozíciami.
Nosič LV nebol použitý v žiadnych zobrazovacích štúdiách SPring-8 PB-PCXI, pretože zobrazovacia komora BL20XU nie je certifikovaná podľa úrovne biologickej bezpečnosti 2. Namiesto toho sme vybrali rad dobre charakterizovaných mikroelektrónov (MP) od dvoch komerčných dodávateľov – pokrývajúcich rôzne veľkosti, materiály, koncentrácie železa a aplikácie – najprv aby sme pochopili, ako magnetické polia ovplyvňujú pohyb MP v sklenených kapilárach a potom v živých dýchacích cestách. na povrchu. Veľkosť MP sa pohybuje od 0,25 do 18 μm a sú vyrobené z rôznych materiálov (pozri tabuľku 1), ale zloženie každej vzorky vrátane veľkosti magnetických častíc v MP nie je známe. Na základe našich rozsiahlych štúdií MCT 19, 20, 21, 23, 24 očakávame, že na povrchu tracheálnych dýchacích ciest možno vidieť MP s veľkosťou už od 5 μm, napríklad odčítaním po sebe nasledujúcich snímok, aby sa dosiahla lepšia viditeľnosť pohybu MP. Jeden MP s veľkosťou 0,25 μm je menší ako rozlíšenie zobrazovacieho zariadenia, ale očakáva sa, že PB-PCXI detekuje ich objemový kontrast a pohyb povrchovej tekutiny, na ktorej sú po nanesení uložené.
Vzorky pre každý MP v tabuľke 1 boli pripravené v 20 μl sklenených kapilárach (Drummond Microcaps, PA, USA) s vnútorným priemerom 0,63 mm. Korpuskulárne častice sú dostupné vo vode, zatiaľ čo častice CombiMag sú dostupné v patentovanej kvapaline výrobcu. Každá skúmavka je do polovice naplnená kvapalinou (približne 11 μl) a umiestnená na držiaku vzorky (pozri obrázok 1). Sklenené kapiláry boli umiestnené horizontálne na stolíku na vzorku v zobrazovacej skrinke a umiestnené pozdĺž okrajov kvapaliny. Magnet s priemerom 19 mm (dĺžkou 28 mm) z niklového plášťa, kovu vzácnych zemín, neodýmu, železa, bóru (NdFeB) (N35, kat. č. LM1652, Jaycar Electronics, Austrália) s reziduálnou magnetizáciou 1,17 Tesla bol pripojený k samostatnému translačnému stolíku, aby sa dosiahla diaľková zmena jeho polohy počas zobrazovania. Získavanie röntgenového obrazu sa začína, keď je magnet umiestnený približne 30 mm nad vzorkou, a obrazy sa získavajú rýchlosťou 4 snímky za sekundu. Počas zobrazovania bol magnet priblížený k vzorke. sklenená kapilárna trubica (vzdialená približne 1 mm) a potom posunutá pozdĺž trubice, aby sa posúdili vplyvy intenzity poľa a polohy.
Zobrazovacie zariadenie in vitro obsahujúce vzorky MP v sklenených kapilárach na stupni xy translácie vzorky. Dráha röntgenového lúča je označená červenou prerušovanou čiarou.
Po stanovení viditeľnosti MP in vitro bola podskupina z nich testovaná in vivo na divokých samiciach albínskych potkanov Wistar (vo veku ~12 týždňov, ~200 g). Potkany boli anestetizované zmesou 0,24 mg/kg medetomidínu (Domitor®, Zenoaq, Japonsko), 3,2 mg/kg midazolamu (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonsko) a 4 mg/kg butorfanolu (Vetorphale®, Meiji Seika) intraperitoneálnou injekciou. Po anestézii boli pripravené na zobrazovanie odstránením srsti okolo priedušnice, zavedením endotracheálnej trubice (ET; 16 Ga iv kanyla, Terumo BCT) a ich imobilizáciou v polohe ležmo na chrbte na zobrazovacej platni vyrobenej na mieru obsahujúcej termo vak na udržanie telesnej teploty 22. Zobrazovacia platňa bola potom pripevnená k stolíku na posun vzorky v zobrazovacej skrinke pod miernym uhlom, aby sa priedušnica na röntgenovom snímku horizontálne zarovnala, ako je znázornené na obrázku. 2a.
(a) Zobrazovacie nastavenie in vivo v zobrazovacom boxe SPring-8, dráha röntgenového lúča je označená červenou prerušovanou čiarou. (b, c) Lokalizácia magnetu na trachee sa vykonala na diaľku pomocou dvoch ortogonálne umiestnených IP kamier. Na ľavej strane obrazu obrazovky je vidieť drôtenú slučku držiacu hlavu a zavádzaciu kanylu na mieste v ET trubici.
Diaľkovo ovládaný systém injekčnej pumpy (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) s použitím 100 μl sklenenej injekčnej striekačky bol pripojený k hadičke PE10 (vonkajší priemer 0,61 mm, vnútorný priemer 0,28 mm) pomocou ihly 30 Ga. Skúmavku označte, aby ste sa uistili, že hrot je pri zavádzaní endotracheálnej trubice v správnej polohe. Pomocou mikropumpy bol piest striekačky vytiahnutý, zatiaľ čo hrot trubice bol ponorený do vzorky MP, ktorá sa mala podať. Naplnená podávacia trubica bola potom vložená do endotracheálnej trubice, pričom hrot bol umiestnený do najsilnejšej časti nášho očakávaného aplikovaného magnetického poľa. Získanie obrazu bolo riadené pomocou detektora dýchania pripojeného k nášmu časovaču na báze Arduina a všetky signály (napr. teplota, dýchanie, otváranie/zatváranie uzávierky a získavanie obrazu) boli zaznamenávané pomocou Powerlab a LabChart (AD Instruments, Sydney, Austrália) 22. Pri zobrazovaní Keď bol kryt neprístupný, dve IP kamery (Panasonic BB-SC382) boli umiestnené približne v 90° uhle k sebe a boli použité na monitorovanie polohy magnetu relatívne. do priedušnice počas zobrazovania (obr. 2b, c). Aby sa minimalizovali artefakty pohybu, počas plató prietoku na konci prílivu sa získal jeden obraz na dych.
Magnet je pripevnený k druhému stupňu, ktorý môže byť umiestnený vzdialene zvonku zobrazovacieho puzdra. Boli testované rôzne polohy a konfigurácie magnetu, vrátane: montáž v uhle približne 30° nad priedušnicou (konfigurácie znázornené na obrázkoch 2a a 3a); jeden magnet nad zvieraťom a druhý pod ním, s pólmi nastavenými na priťahovanie (obrázok 3b); jeden magnet nad zvieraťom a druhý pod ním, s pólmi nastavenými na odpudzovanie (obrázok 3c); a jeden magnet nad a kolmo na priedušnicu (obrázok 3d). Keď sú zviera a magnet nakonfigurované a testovaný MP je vložený do injekčnej pumpy, podávajte dávku 50 μl rýchlosťou 4 μl/s počas snímania snímok. Magnet sa potom pohybuje tam a späť pozdĺž alebo laterálne cez priedušnicu, pričom pokračuje v snímaní snímok.
Konfigurácia magnetu pre zobrazovanie in vivo (a) jeden magnet nad priedušnicou v uhle približne 30°, (b) dva magnety nastavené na priťahovanie, (c) dva magnety nastavené na odpudzovanie, (d) jeden magnet nad priedušnicou a kolmo na ňu. Pozorovateľ sa pozeral dole od úst do pľúc cez priedušnicu a röntgenový lúč prechádzal ľavou stranou potkana a vychádzal na pravej strane. Magnet sa pohyboval buď pozdĺž dýchacích ciest, alebo doľava a doprava nad priedušnicou v smere röntgenového lúča.
Snažili sme sa tiež určiť viditeľnosť a správanie častíc v dýchacích cestách bez rušivého dýchania a srdcového pohybu. Preto boli na konci zobrazovacieho obdobia zvieratá humánne usmrtené kvôli predávkovaniu pentobarbitalom (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Niektoré zvieratá boli ponechané na zobrazovacej platforme a po zastavení dýchania a srdcovej činnosti sa zobrazovací proces opakoval, pričom sa pridala ďalšia dávka MP, ak na povrchu dýchacích ciest nebol viditeľný žiadny MP.
Získané snímky boli korigované na ploché a tmavé pole a potom zostavené do filmu (20 snímok za sekundu; 15 – 25 × normálna rýchlosť v závislosti od frekvencie dýchania) pomocou vlastného skriptu napísaného v MATLABe (R2020a, The Mathworks).
Všetky štúdie zamerané na podávanie LV génových vektorov boli vykonané v Laboratórnom výskumnom zariadení na zvieratách na Univerzite v Adelaide a ich cieľom bolo použiť výsledky experimentu SPring-8 na posúdenie, či podávanie LV-MP v prítomnosti magnetického poľa môže zvýšiť prenos génov in vivo. Na posúdenie účinkov MP a magnetického poľa boli liečené dve skupiny zvierat: jednej skupine bol podaný LV-MP s umiestneným magnetom a druhej skupine bol podaný kontrolný LV-MP bez magnetu.
Vektory génov LV boli vytvorené pomocou predtým opísaných metód 25, 26. Vektor LacZ exprimuje gén beta-galaktozidázy lokalizovaný v jadre, riadený konštitutívnym promótorom MPSV (LV-LacZ), ktorý produkuje modrý reakčný produkt v transdukovaných bunkách, viditeľný na predných stranách pľúcneho tkaniva a v tkanivových rezoch. Titrácia sa uskutočnila v bunkových kultúrach manuálnym spočítaním počtu LacZ pozitívnych buniek pomocou hemocytometra na výpočet titra v TU/ml. Nosiče sú kryokonzervované pri teplote -80 °C, pred použitím rozmrazené a naviazané na CombiMag zmiešaním v pomere 1:1 a inkubáciou na ľade najmenej 30 minút pred dodaním.
Normálne potkany kmeňa Sprague Dawley (n = 3/skupina, ~2-3) boli anestetizované intraperitoneálne zmesou 0,4 mg/kg medetomidínu (Domitor, Ilium, Austrália) a 60 mg/kg ketamínu (Ilium, Austrália) vo veku jeden mesiac (i.p.) a nechirurgickou orálnou kanyláciou s 16 Ga i.v. kanylou. Aby sa zabezpečilo, že tkanivo tracheálnych dýchacích ciest dostane ľavostrannú transdukciu, bolo kondicionované pomocou nášho predtým opísaného protokolu mechanickej perturbácie, v ktorom bol povrch tracheálnych dýchacích ciest axiálne trený drôteným košíkom (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Tracheálne podanie LV-MP sa potom uskutočnilo v biologicky bezpečnostnej skrini približne 10 minút po perturbácii.
Magnetické pole použité v tomto experimente bolo konfigurované podobným spôsobom ako v štúdii in vivo röntgenového zobrazovania, pričom rovnaké magnety boli držané nad priedušnicou pomocou destilačných stentových klipov (obrázok 4). Objem 50 μl (2 × 25 μl alikvotné podiely) LV-MP bol podaný do priedušnice (n = 3 zvieratá) pomocou pipety s gélovým hrotom, ako bolo opísané predtým. Kontrolná skupina (n = 3 zvieratá) dostala rovnaké LV-MP bez použitia magnetu. Po ukončení infúzie sa kanyla odstráni z ET trubice a zviera sa extubuje. Magnet zostáva na mieste 10 minút a potom sa odstráni. Potkany dostali subkutánnu dávku meloxikamu (1 ml/kg) (Ilium, Austrália), po ktorej nasledovalo zvrátenie anestézie ip injekciou 1 mg/kg atipamazol hydrochloridu (Antisedan, Zoetis, Austrália). Potkany boli udržiavané v teple a monitorované až do úplného zotavenia z anestézie.
Podávacie zariadenie LV-MP v biologicky bezpečnostnej skrinke. Svetlosivý Luerov náboj ET trubice je viditeľný vyčnievajúci z úst a gélový hrot pipety zobrazený na obrázku sa zavádza cez ET trubicu do požadovanej hĺbky do priedušnice.
Jeden týždeň po dávkovaní LV-MP boli zvieratá humánne usmrtené inhaláciou 100 % CO2 a expresia LacZ bola hodnotená pomocou našej štandardnej liečby X-gal. Tri kaudálne najviac chrupavkové prstence boli odstránené, aby sa zabezpečilo, že akékoľvek mechanické poškodenie alebo zadržiavanie tekutín z umiestnenia endotracheálnej trubice nebolo zahrnuté do analýzy. Každá trachea bola pozdĺžne rozrezaná, aby sa vytvorili dve polovice na analýzu, a boli umiestnené do misky obsahujúcej silikónovú gumu (Sylgard, Dow Inc) pomocou ihly Minutien (Fine Science Tools) na vizualizáciu luminálneho povrchu. Distribúcia a vzor transdukovaných buniek boli potvrdené frontálnou fotografiou pomocou mikroskopu Nikon (SMZ1500) s kamerou DigiLite a softvérom TCapture (Tucsen Photonics, Čína). Snímky boli získané pri 20-násobnom zväčšení (vrátane najvyššieho nastavenia pre celú šírku trachey), pričom celá dĺžka trachey bola zobrazená krok za krokom, pričom sa zabezpečilo dostatočné prekrytie medzi jednotlivými snímkami, aby sa umožnilo „zošitie“ snímok. Snímky z každej trachey boli potom zostavené do jednej. kompozitný obraz pomocou editora Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) s využitím algoritmu planárneho pohybu. Expresné oblasti LacZ v kompozitných obrazoch trachey z každého zvieraťa boli kvantifikované pomocou automatizovaného skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), ako bolo opísané predtým, s použitím nastavení 0,35 < Odtieň < 0,58, Sýtosť > 0,15 a Hodnota < 0,7. Sledovaním kontúr tkaniva bola v programe GIMP v2.10.24 manuálne vygenerovaná maska ​​pre každý kompozitný obraz, aby sa identifikovala oblasť tkaniva a zabránilo sa akýmkoľvek falošným detekciám zvonku tracheálneho tkaniva. Zafarbené oblasti zo všetkých kompozitných obrazov z každého zvieraťa boli sčítané, aby sa vygenerovala celková zafarbená plocha pre dané zviera. Zafarbená oblasť bola potom vydelená celkovou plochou masky, aby sa vygenerovala normalizovaná plocha.
Každá trachea bola zaliata do parafínu a boli z nej narezané 5 μm rezy. Rezy boli kontrastne farbené neutrálnou rýchlou červenou farbou počas 5 minút a snímky boli získané pomocou mikroskopu Nikon Eclipse E400, kamery DS-Fi3 a softvéru NIS element capture (verzia 5.20.00).
Všetky štatistické analýzy boli vykonané v programe GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Štatistická významnosť bola stanovená na p ≤ 0,05. Normalita bola overená pomocou Shapiro-Wilkovho testu a rozdiely vo farbení LacZ boli hodnotené pomocou nepárového t-testu.
Šesť MP opísaných v tabuľke 1 bolo skúmaných pomocou PCXI a ich viditeľnosť je opísaná v tabuľke 2. Dva polystyrénové MP (MP1 a MP2; 18 μm a 0,25 μm) neboli pod PCXI viditeľné, ale zvyšok vzoriek bol identifikovateľný (príklady sú znázornené na obrázku 5). MP3 a MP4 (10 – 15 % Fe3O4; 0,25 μm a 0,9 μm) sú slabo viditeľné. Hoci MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) obsahuje jedny z najmenších testovaných častíc, bol najvýraznejší. Produkt CombiMag MP6 je ťažké spozorovať. Vo všetkých prípadoch sa naša schopnosť detekovať MP výrazne zvýšila posunom magnetu tam a späť rovnobežne s kapilárou. Keď sa magnety vzdialili od kapiláry, častice sa predlžovali v dlhých šnúrach, ale ako sa magnety približovali a sila magnetického poľa sa zvyšovala, šnúry častíc sa skracovali, keď častice migrovali smerom k hornému povrchu kapiláry (pozri doplnkové video S1: MP4), čím sa zvyšovalo... Hustota častíc povrchu. Naopak, keď sa magnet odstráni z kapiláry, sila poľa sa zníži a mikročastice sa preskupia do dlhých reťazcov siahajúcich z horného povrchu kapiláry (pozri doplnkové video S2:MP4). Keď sa magnet prestane pohybovať, častice sa po dosiahnutí rovnovážnej polohy ešte krátky čas pohybujú. Keď sa mikročastica pohybuje smerom k hornému povrchu kapiláry a od neho, magnetické častice zvyčajne ťahajú nečistoty cez tekutinu.
Viditeľnosť MP pod PCXI sa medzi vzorkami výrazne líši. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6. Všetky zobrazené obrázky boli zhotovené s magnetom umiestneným približne 10 mm priamo nad kapilárou. Zdanlivé veľké kruhy sú vzduchové bubliny zachytené v kapilárach, ktoré jasne ukazujú čiernobiele okrajové prvky fázového kontrastu. Červený rámček obsahuje zväčšenie zvyšujúce kontrast. Upozorňujeme, že priemery schém magnetov na všetkých obrázkoch nie sú v mierke a sú približne 100-krát väčšie ako na obrázku.
Keď sa magnet posúva doľava a doprava pozdĺž hornej časti kapiláry, uhol MP struny sa mení tak, aby sa zarovnal s magnetom (pozri obrázok 6), čím sa vymedzujú čiary magnetického poľa. V prípade MP3-5, po dosiahnutí prahového uhla tetivy, sú častice ťahané pozdĺž horného povrchu kapiláry. To často vedie k zhlukovaniu MP do väčších skupín blízko miesta, kde je magnetické pole najsilnejšie (pozri doplnkové video S3:MP5). Toto je obzvlášť zrejmé pri zobrazovaní v blízkosti konca kapiláry, čo spôsobuje agregáciu a koncentráciu MP na rozhraní kvapalina-vzduch. Častice v MP6, ktoré bolo ťažšie rozoznať ako v MP3-5, neboli ťahané, keď sa magnet pohyboval pozdĺž kapiláry, ale MP struny sa disociovali a častice zostali v zornom poli (pozri doplnkové video S4:MP6). V niektorých prípadoch, keď sa aplikované magnetické pole znížilo presunutím magnetu do veľkej vzdialenosti od miesta zobrazovania, všetky zostávajúce MP pomaly klesali na spodný povrch trubice vplyvom gravitácie, pričom zostali v strune (pozri doplnkové video S5: MP3).
Uhol MP struny sa mení, keď sa magnet posúva doprava nad kapiláru. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6. Červený rámček obsahuje zväčšenie zvyšujúce kontrast. Upozorňujeme, že doplnkové videá sú informatívne, pretože odhaľujú dôležité informácie o štruktúre častíc a dynamické informácie, ktoré nie je možné vizualizovať na týchto statických obrázkoch.
Naše testy ukázali, že pomalý pohyb magnetu tam a späť pozdĺž priedušnice uľahčuje vizualizáciu MP v kontexte komplexného pohybu in vivo. Testovanie in vivo sa nevykonalo, pretože polystyrénové guľôčky (MP1 a MP2) neboli v kapiláre viditeľné. Každý zo zostávajúcich štyroch MP bol testovaný in vivo s dlhou osou magnetu konfigurovanou nad priedušnicou v uhle približne 30° k vertikále (pozri obrázky 2b a 3a), pretože to viedlo k dlhším reťazcom MP a bolo to účinnejšie ako konfigurácia ukončená magnetom. MP3, MP4 a MP6 neboli detegované v priedušnici žiadnych živých zvierat. Keď boli dýchacie cesty potkanov zobrazené po humánnom usmrtení zvierat, častice zostali neviditeľné, aj keď bol pridaný ďalší objem pomocou injekčnej pumpy. MP5 mal najvyšší obsah oxidu železa a bol jedinou viditeľnou časticou, a preto sa použil na posúdenie a charakterizáciu správania MP in vivo.
Umiestnenie magnetu nad priedušnicu počas podávania MP viedlo ku koncentrácii mnohých, ale nie všetkých, MP v zornom poli. Častice vstupujúce do priedušnice sa najlepšie pozorujú u humánne usmrtených zvierat. Obrázok 7 a doplnkové video S6: MP5 ukazuje rýchle magnetické zachytenie a usporiadanie častíc na povrchu ventrálnej priedušnice, čo naznačuje, že MP je možné nasmerovať do požadovaných oblastí priedušnice. Pri hľadaní distálnejšie pozdĺž priedušnice po podaní MP sa niektoré MP našli bližšie k karine, čo naznačuje, že sila magnetického poľa nebola dostatočná na zachytenie a udržanie všetkých MP, pretože boli počas procesu s tekutinou dodávané cez oblasť maximálnej sily magnetického poľa. Napriek tomu boli popôrodné koncentrácie MP vyššie okolo zobrazenej oblasti, čo naznačuje, že mnohé MP zostali v oblastiach dýchacích ciest, kde bola aplikovaná sila magnetického poľa najvyššia.
Obrázky z (a) pred a (b) po podaní MP5 do priedušnice nedávno utrateného potkana s magnetom umiestneným priamo nad zobrazovacou oblasťou. Zobrazená oblasť sa nachádza medzi dvoma chrupavkovými prstencami. Pred podaním MP je v dýchacích cestách tekutina. Červený rámček obsahuje zväčšenie zvyšujúce kontrast. Tieto obrázky pochádzajú z videa zobrazeného v doplnkovom videu S6:MP5.
Posúvanie magnetu pozdĺž priedušnice in vivo spôsobilo zmenu uhla reťazca častíc v povrchu dýchacích ciest podobným spôsobom, ako sa pozoruje v kapilárach (pozri obrázok 8 a doplnkové video S7:MP5). V našej štúdii však nebolo možné MP ťahať po povrchu živých dýchacích ciest tak, ako to bolo možné s kapilárami. V niektorých prípadoch sa reťazec častíc predlžuje, keď sa magnet pohybuje doľava a doprava. Je zaujímavé, že sme tiež zistili, že reťazec častíc mení hĺbku povrchovej vrstvy tekutiny, keď sa magnet pohybuje pozdĺžne pozdĺž priedušnice, a rozširuje sa, keď sa magnet pohybuje priamo nad hlavou a reťazec častíc sa otáča do vertikálnej polohy (pozri doplnkové video S7). : MP5 o 0:09, vpravo dole). Charakteristický vzorec pohybu sa zmenil, keď sa magnet posunul cez hornú časť priedušnice laterálne (t. j. doľava alebo doprava od zvieraťa, a nie pozdĺž dĺžky priedušnice). Častice boli stále jasne viditeľné, keď sa pohybovali, ale keď sa magnet odstránil z priedušnice, stali sa viditeľnými špičky reťazcov častíc (pozri doplnkové video S8:MP5, začínajúce od 0:08). To je v súlade so správaním MP, ktoré sme pozorovali pod pôsobením magnetického poľa v sklenenej kapiláre.
Príklady obrázkov zobrazujúcich MP5 v priedušnici živej anestetizovanej krysy. (a) Magnet sa používa na získanie obrázkov nad a naľavo od priedušnice, potom (b) po posunutí magnetu doprava. Červený rámček obsahuje zväčšenie zvyšujúce kontrast. Tieto obrázky pochádzajú z videa zobrazeného v doplnkovom videu S7:MP5.
Keď boli dva póly konfigurované v severojužnej orientácii nad a pod priedušnicou (t. j. priťahujúce sa; obr. 3b), akordy MP sa javili dlhšie a nachádzali sa na bočnej stene priedušnice, a nie na dorzálnom povrchu priedušnice (pozri doplnkové video S9:MP5). Vysoké koncentrácie častíc na jednom mieste (t. j. na dorzálnom povrchu priedušnice) však neboli po podaní tekutiny zistené pri použití zariadenia s dvoma magnetmi, čo sa zvyčajne vyskytuje pri použití zariadenia s jedným magnetom. Keď bol potom jeden magnet konfigurovaný na odpudzovanie obrátených pólov (obr. 3c), počet častíc viditeľných v zornom poli sa po podaní nezvýšil. Nastavenie oboch konfigurácií s dvoma magnetmi je náročné kvôli vysokým intenzitám magnetického poľa, ktoré magnety priťahuje alebo tlačí. Nastavenie sa potom zmenilo na jeden magnet rovnobežný s dýchacími cestami, ale prechádzajúci dýchacími cestami pod uhlom 90 stupňov, takže siločiary pretínali stenu priedušnice ortogonálne (obr. 3d), čo je orientácia navrhnutá na určenie, či je možné pozorovať agregáciu častíc na bočnej stene. V tejto konfigurácii však... Nebol zistený žiadny identifikovateľný pohyb akumulácie MP ani pohyb magnetu. Na základe všetkých týchto výsledkov bola pre štúdie génových nosičov in vivo zvolená konfigurácia s jedným magnetom a 30-stupňovou orientáciou (obrázok 3a).
Keď bolo zviera opakovane zobrazené bezprostredne po humánnom usmrtení, absencia rušivého pohybu tkaniva znamenala, že v jasnom interchondrálnom poli bolo možné rozoznať jemnejšie a kratšie čiary častíc, „kolísavé“ v súlade s translačným pohybom magnetu. Napriek tomu stále nie je možné jasne vidieť prítomnosť a pohyb častíc MP6.
Titer LV-LacZ bol 1,8 × 108 TU/ml a po zmiešaní s CombiMag MP (MP6) v pomere 1:1 dostali zvieratá 50 μl tracheálnu dávku 9 × 107 TU/ml LV vehikula (t. j. 4,5 × 106 TU/potkan). V týchto štúdiách sme namiesto posunu magnetu počas pôrodu fixovali magnet v jednej polohe, aby sme zistili, či by sa LV transdukcia (a) mohla zlepšiť v porovnaní s vektorovým podaním v neprítomnosti magnetického poľa a (b) či by sa dala zaostriť. Bunky dýchacích ciest sú transdukované do magnetických cieľových oblastí horných dýchacích ciest.
Prítomnosť magnetov a použitie CombiMag v kombinácii s LV vektormi sa nezdali mať nepriaznivé účinky na zdravie zvierat, rovnako ako náš štandardný protokol podávania LV vektorov. Čelné snímky tracheálnej oblasti vystavenej mechanickému rušeniu (doplnkový obrázok 1) naznačili, že v skupine zvierat liečených LV-MP boli signifikantne vyššie hladiny transdukcie, keď bol prítomný magnet (obr. 9a). V kontrolnej skupine bolo prítomné iba malé množstvo modrého farbenia LacZ (obr. 9b). Kvantifikácia normalizovaných oblastí farbených X-Gal ukázala, že podávanie LV-MP v prítomnosti magnetického poľa viedlo k približne 6-násobnému zlepšeniu (obr. 9c).
Príklad kompozitných obrázkov znázorňujúcich tracheálnu transdukciu pomocou LV-MP (a) v prítomnosti magnetického poľa a (b) v neprítomnosti magnetu. (c) Štatisticky významné zlepšenie normalizovanej plochy transdukcie LacZ v trachee pri použití magnetu (*p = 0,029, t-test, n = 3 na skupinu, priemer ± SEM).
Neutrálne rýchlo zafarbené rezy (príklad znázornený na doplnkovom obr. 2) ukázali, že bunky zafarbené LacZ sú prítomné v podobnom vzore a umiestnení, ako bolo uvedené predtým.
Kľúčovou výzvou pre génovú terapiu dýchacích ciest zostáva presná lokalizácia nosičových častíc do oblastí záujmu a dosiahnutie vysokej úrovne účinnosti transdukcie v pohybujúcich sa pľúcach za prítomnosti prúdenia vzduchu a aktívneho odstraňovania hlienu. Pre nosiče ľavej komory určené na liečbu ochorenia dýchacích ciest s cystickou fibrózou bolo predĺženie času zotrvania nosičových častíc vo vodivých dýchacích cestách doteraz nedosiahnuteľným cieľom. Ako zdôraznili Castellani a kol., použitie magnetických polí na zlepšenie transdukcie má výhody v porovnaní s inými metódami dodávania génov, ako je elektroporácia, pretože môže kombinovať jednoduchosť, nákladovú efektívnosť, lokalizáciu dodávania, zvýšenú účinnosť a kratšie inkubačné časy a prípadne aj menšiu dávku nosiča10. Avšak in vivo ukladanie a správanie magnetických častíc v dýchacích cestách pod vplyvom vonkajších magnetických síl nebolo nikdy opísané, ani nebola in vivo preukázaná uskutočniteľnosť tejto metódy na zvýšenie hladín génovej expresie v intaktných živých dýchacích cestách.
Naše synchrotrónové PCXI experimenty in vitro ukázali, že všetky testované častice, s výnimkou polystyrénu MP, boli viditeľné v použitom zobrazovacom nastavení. V prítomnosti magnetického poľa tvoria MP reťazce, ktorých dĺžky súvisia s typom častíc a silou magnetického poľa (t. j. blízkosť a pohyb magnetu). Ako je znázornené na obrázku 10, reťazce, ktoré pozorujeme, vznikajú v dôsledku zmagnetizovania každej jednotlivej častice a indukovania vlastného lokálneho magnetického poľa. Tieto samostatné polia spôsobujú agregáciu a spájanie iných podobných častíc so skupinovými pohybmi podobnými strunám v dôsledku lokálnych síl z lokálnych príťažlivých a odpudivých síl iných častíc.
Schematické znázornenie (a, b) vlakov častíc generovaných vo vnútri kapilár naplnených tekutinou a (c, d) priedušnice naplnenej vzduchom. Všimnite si, že kapiláry a priedušnica nie sú nakreslené v mierke. Panel (a) obsahuje aj popis MP, ktorý obsahuje častice Fe3O4 usporiadané do reťazcov.
Keď sa magnet presunul nad kapiláru, uhol reťazca častíc dosiahol kritickú prahovú hodnotu pre MP3-5 obsahujúci Fe3O4, po ktorej reťazec častíc už nezostal v pôvodnej polohe, ale presunul sa pozdĺž povrchu do novej polohy. magnet. Tento efekt pravdepodobne nastáva, pretože povrch sklenenej kapiláry je dostatočne hladký, aby umožnil tento pohyb. Je zaujímavé, že MP6 (CombiMag) sa takto nesprával, pravdepodobne preto, že častice boli menšie, mali rôzne povlaky alebo povrchové náboje, alebo ich schopnosť pohybu ovplyvnila patentovaná nosná kvapalina. Kontrast obrazu častíc CombiMag je tiež slabší, čo naznačuje, že kvapalina a častice môžu mať podobnú hustotu, a preto sa k sebe ľahko nepohybujú. Častice sa môžu tiež zaseknúť, ak sa magnet pohybuje príliš rýchlo, čo naznačuje, že sila magnetického poľa nedokáže vždy prekonať trenie medzi časticami v kvapaline, čo naznačuje, že možno nie je prekvapujúce, že sila magnetického poľa a vzdialenosť medzi magnetom a cieľovou oblasťou sú veľmi dôležité. Tieto výsledky spolu tiež naznačujú, že hoci magnety dokážu zachytiť mnoho MP, ktoré prúdia cieľovou oblasťou, je nepravdepodobné, že sa na magnety dá spoľahnúť, že sa budú pohybovať. Častice CombiMag pozdĺž povrchu priedušnice. Preto sme dospeli k záveru, že štúdie LV-MP in vivo by mali využívať statické magnetické polia na fyzické zacielenie špecifických oblastí dýchacích ciest.
Keď sa častice dostanú do tela, je ťažké ich identifikovať v kontexte komplexného pohybujúceho sa telesného tkaniva, ale schopnosť ich detekcie bola zlepšená horizontálnym posunutím magnetu nad priedušnicu, aby sa „pohybovali“ mikročastice. Hoci je živé zobrazovanie možné, je ľahšie rozpoznať pohyb častíc po humánnom usmrtení zvieraťa. Koncentrácie mikročastíc boli vo všeobecnosti najvyššie na tomto mieste, keď bol magnet umiestnený nad zobrazovacou oblasťou, hoci niektoré častice sa zvyčajne nachádzali ďalej pozdĺž priedušnice. Na rozdiel od štúdií in vitro, častice nemožno ťahať pozdĺž priedušnice posunutím magnetu. Toto zistenie je v súlade s tým, ako hlien, ktorý pokrýva povrch priedušnice, typicky spracováva vdýchnuté častice, zachytáva ich v hliene a následne sa vylučujú mechanizmom mukociliárneho klírensu.
Predpokladali sme, že použitie magnetov na priťahovanie nad a pod priedušnicou (obr. 3b) by mohlo viesť k rovnomernejšiemu magnetickému poľu, a nie k magnetickému poľu, ktoré je vysoko koncentrované v jednom bode, čo by potenciálne viedlo k rovnomernejšiemu rozloženiu častíc. Naša predbežná štúdia však nenašla jasné dôkazy na podporu tejto hypotézy. Podobne konfigurácia dvojice magnetov na odpudzovanie (obr. 3c) neviedla k väčšiemu ukladaniu častíc v zobrazenej oblasti. Tieto dve zistenia ukazujú, že nastavenie s dvoma magnetmi významne nezlepšuje lokálnu kontrolu cielenia MP a že výsledné silné magnetické sily je ťažké konfigurovať, čo robí tento prístup menej praktickým. Podobne ani orientácia magnetu nad a cez priedušnicu (obr. 3d) nezvýšila počet častíc zadržaných v zobrazenej oblasti. Niektoré z týchto alternatívnych konfigurácií nemusia byť úspešné, pretože vedú k nižším intenzitám magnetického poľa v oblasti ukladania. Preto sa konfigurácia s jedným 30-stupňovým magnetom (obrázok 3a) považuje za najjednoduchšiu a najefektívnejšiu metódu testovania in vivo.
Štúdia LV-MP ukázala, že keď boli LV vektory kombinované s CombiMagom a podané po fyzickej perturbácii v prítomnosti magnetického poľa, hladiny transdukcie sa v trachee významne zvýšili v porovnaní s kontrolami. Na základe synchrotrónových zobrazovacích štúdií a výsledkov LacZ bolo magnetické pole zjavne schopné zachovať LV v trachee a znížiť počet vektorových častíc, ktoré okamžite prenikli hlboko do pľúc. Takéto zlepšenia cielenia môžu viesť k vyššej účinnosti a zároveň k zníženiu podaných titrov, transdukcie mimo cieľa, zápalových a imunitných vedľajších účinkov a nákladov na génové nosiče. Dôležité je, že podľa výrobcu sa CombiMag môže používať v spojení s inými metódami prenosu génov, vrátane iných vírusových vektorov (ako napríklad AAV) a nukleových kyselín.