Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан серепчи версиясы CSS үчүн чектелген колдоого ээ. Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, колдоо үзгүлтүксүз болушу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Өпкөнүн муковисцидоз оорусун дарылоо үчүн ген векторлору өткөрүүчү аба жолдоруна багытталышы керек, анткени өпкөнүн перифериялык трансдукциясы терапиялык пайда бербейт. Вирустук трансдукциянын эффективдүүлүгү вектордун жашоо убактысына түздөн-түз байланыштуу. Бирок, ген ташыгычтар сыяктуу жеткирүүчү суюктуктар дем алуу учурунда альвеолдорго табигый түрдө диффузияланат жана былжырлуу бөлүкчөлөр тез тарайт. транспорт.Аба жолдорунда ген алып жүрүүчүлөрдүн жашоо убактысын узартуу маанилүү, бирок ага жетишүү кыйын. Дем алуу жолдорунун бетине багытталышы мүмкүн болгон ген ташуучу-конъюгацияланган магниттик бөлүкчөлөр аймактык максаттуулугун жакшыртышы мүмкүн. In vivo визуализациясынын кыйынчылыктарынан улам, аба жолдорунун бетиндеги мындай кичинекей магниттик бөлүкчөлөрдүн жүрүм-туруму магниттик талаанын катышуусунда начар колдонулган. анестезияланган келемиштердин трахеясындагы бир катар магниттик бөлүкчөлөрдүн in vivo кыймылын визуализациялоо үчүн синхротрондук визуализация in vivo жеке жана жапырт бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумунун динамикасын жана үлгүлөрүн изилдөө үчүн. Андан кийин биз лентивирустук магниттик бөлүкчөлөрдүн магнит талаасынын катышуусунда трансдукциянын трахеясынын эффективдүүлүгүн жогорулатууга баа бердик. in vitro жана in vivo стационардык жана кыймылдуу магниттик талаалардагы магниттик бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумун ачып берет. Бөлүкчөлөрдү магниттер менен тирүү аба жолунун бети боюнча оңой сүйрөп чыгууга болбойт, бирок ташуу учурунда кендер магнит талаасы эң күчтүү болгон көрүү талаасында топтолот. Өткөрүштүн эффективдүүлүгү да лентивирустук бөлүкчөлөрдүн магниттик талаасында магниттик талаага жеткирилгенде алты эсеге жогорулаган. бул натыйжалар lentiviral магниттик бөлүкчөлөр жана магниттик талаалар ген векторунун максаттуулугун жакшыртуу жана аба жолдорун in vivo өткөрүүдө трансдукция деңгээлин жогорулатуу үчүн баалуу ыкмалар болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Муковистикалык фиброз (CF) CF трансмембраналык өткөргүчтүк жөнгө салуучу (CFTR) деп аталган бир гендеги вариациядан улам келип чыгат. CFTR протеин денедеги көптөгөн эпителий клеткаларында, анын ичинде өткөрүүчү аба жолдорунда, CF патогенезинин негизги жери болгон ион каналы болуп саналат. (ASL) катмары. Бул ошондой эле мукоцилиардык транспорттун (MCT) системасынын дем алган бөлүкчөлөрдү жана патогендерди аба жолдорунан тазалоо мүмкүнчүлүгүн начарлатат. Биздин максат - CFTR генинин туура көчүрмөсүн жеткирүү жана ASL, MCT жана өпкөнүн ден соолугун жакшыртуу үчүн lentiviral (LV) ген терапиясын иштеп чыгуу жана бул жаңы технологияларды иштеп чыгууну улантуу.
LV векторлору CF аба ген терапиясы үчүн негизги талапкерлердин бири болуп саналат, негизинен, алар туруктуу аба базалык клеткалары (аба өзөк клеткалары) менен дарылоо генин бириктире алат, анткени. Бул маанилүү, анткени алар функционалдык ген-түзөтүлгөн CF-байланыштуу клиренсин калыбына келтирүү менен нормалдуу гидратацияны жана былжыр клиренсин калыбына келтире алат. дем алуу жолдорунда, анткени бул жерде CF өпкө оорусу башталат. Вектордун өпкөгө тереңирээк жеткирилиши альвеолярдык трансдукцияга алып келиши мүмкүн, бирок бул CF үчүн терапиялык пайдасы жок. Бирок, ген ташыгычтар сыяктуу суюктуктар табигый түрдө төрөттөн кийин дем алгандан кийин альвеолаларга миграцияланат3,4 жана терапевтикалык ачык бөлүкчөлөр MLV аркылуу тез өтүшөт. эффективдүүлүгү түздөн-түз вектордун клетканы кабыл алууга мүмкүндүк берүү үчүн максаттуу клеткалардын жанында кала турган убакыттын узактыгына түздөн-түз байланыштуу - "жашоо убактысы"5 - бул типтүү аймактык аба агымы, ошондой эле макулдашылган бөлүкчөлөрдүн былжыр кармалышы жана MCT менен оңой кыскартылат.
Бул тоскоолдукту жоюу үчүн, биз LV магниттик бөлүкчөлөр (МП) эки кошумча жолдор менен жардам бере алат деп сунуштайбыз. Биринчиден, алар гендик ташуучу бөлүкчөлөр каалаган аба аймагында жашаган максаттуу жакшыртуу үчүн аба бетине магниттик жетектелиши мүмкүн; жана ASL) клетка катмарына өтүү үчүн 6.MPs антителолорго, химиотерапевтиктерге же башка кичинекей молекулаларга байланганда дары-дармектерди жеткирүүчү каражаттар катары кеңири колдонулуп, алар клетка мембранасына жабышып же тиешелүү клетка бетинин рецепторлоруна байланып, статикалык электрдин катышуусунда шишик жерлеринде чогулат. Ракты дарылоо үчүн магниттик талаалар 7. Башка "гипертермалдык" ыкмалар термелүүчү магнит талаасынын таасири астында МПларды ысытууну максат кылат, ошону менен шишик клеткаларын жок кылат. Магниттик трансфекция принциби, бул жерде магнит талаасы ДНКнын клеткаларга өтүшүн күчөтүү үчүн трансфекция агенти катары колдонулат, көбүнчө in vitrovir жана вектордук эмес диапазондор үчүн колдонулат. кыйын трансдукциялоочу клетка линиялары. LV магнитотрансфекциясынын эффективдүүлүгү аныкталды, статикалык магнит талаасынын катышуусунда LV-MPs адамдын бронх эпителийинин клетка линиясына in vitro жеткирүү менен, LV векторуна салыштырмалуу трансдукциянын эффективдүүлүгү 186 эсеге жогорулады. LV-MP да in vitroV трансфекциясына LV in vitroV трансфекциясынын көбөйгөн моделине колдонулду. CF какырыгынын катышуусунда аба-суюктук интерфейси маданияттарын 20 эсеге көбөйтөт.10.Бирок, органдардын in vivo magnetotransfection салыштырмалуу аз көңүл бурган жана бир нече жаныбарлардын изилдөөлөрүндө гана бааланган 11,12,13,14,15, айрыкча өпкөдө16,17.Ошого карабастан, CF transfection үчүн ачык-айкын мүмкүнчүлүктөр. al.(2020) "эффективдүү магниттик нанобөлүкчөлөр өпкө жеткирүүнүн бир далили-түшүнүгүн изилдөө CF бейтаптарда клиникалык натыйжаларды жакшыртуу үчүн келечектеги CFTR дем алуу стратегияларына жол ачат"6 деп билдирди.
Колдонулган магнит талаасынын катышуусунда аба жолдорунун беттериндеги кичинекей магниттик бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумун элестетүү жана изилдөө кыйын, ошондуктан начар түшүнүлөт. Башка изилдөөлөрдө биз синхротрондук-пропагацияга негизделген фаза-контрасттык рентгендик сүрөт тартуу (PB-PCXI) ыкмасын иштеп чыктык. газ Канал бетинин гидратациясын өлчөө жана дарылоонун эффективдүүлүгүнүн алгачкы индикатору катары колдонулат. Мындан тышкары, биздин MCT баалоо методубуз PB-PCXI21.Both ыкмаларын колдонуу менен көрүнгөн MCT маркерлери катары глиноземден же жогорку сынуу индексинен турган 10-35 мкм диаметрдеги бөлүкчөлөрдү колдонот.
Анын жогорку мейкиндик жана убакыттык резолюциясына байланыштуу, биздин PB-PCXI негизиндеги ASL жана MCT талдоо ыкмаларыбыз бир жана жапырт бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумунун динамикасын жана моделдерин in vivo изилдөө үчүн абдан ылайыктуу, бул бизге MP ген жеткирүү ыкмаларын түшүнүүгө жана оптималдаштырууга жардам берет. Бул жерде биз колдонгон мамиле SPring-8 BL20B2 аркылуу биздин изилдөөлөрдөн келип чыгат, биз төмөнкү вектордук суюктуктун визуалдык кыймылына жана визуалдык кыймылга келтиребиз. чычкандардын өпкө аба жолдору биздин ген ташуучу дозасы жаныбарлардын изилдөөлөрүндө байкалган бирдиктүү эмес ген экспрессия үлгүлөрүн түшүндүрүүгө жардам берүү үчүн 3,4.
Бул изилдөөнүн максаты тирүү келемиштердин трахеясындагы бир катар депутаттардын in vivo кыймылдарын визуализациялоо үчүн PB-PCXI синхротронун колдонуу болгон. Бул PB-PCXI сүрөт изилдөөлөрү бир катар депутаттарды, магниттик талаанын күчтүүлүгүн жана алардын МП кыймылына таасирин аныктоо үчүн жайгашкан жерлерди текшерүү үчүн иштелип чыккан. Бул изилдөөлөр ошондой эле трахеяда сакталган бөлүкчөлөрдүн санын максималдуу көбөйтүүгө мүмкүндүк берген магнит конфигурацияларын аныктоого мүмкүндүк берди. Изилдөөлөрдүн экинчи сериясында биз бул оптималдуу конфигурацияны LV-MPтин келемиштердин аба жолуна жеткирүүнүн in vivo натыйжасында келип чыккан трансдукция үлгүсүн көрсөтүүгө аракет кылдык. трансдукциянын эффективдүүлүгү.
Бардык жаныбарларды изилдөө Аделаида университети (M-2019-060 жана M-2020-022) жана SPring-8 Synchrotron Жаныбарлардын этика комитети тарабынан бекитилген протоколдорго ылайык аткарылган. Эксперименттер ARRIVE көрсөтмөлөрүнө ылайык аткарылган.
Бардык рентгендик сүрөттөр Жапониядагы SPring-8 синхротрондо BL20XU нур сызыгында, мурда21,22 сүрөттөлгөндөй орнотууну колдонуу менен аткарылган. Кыскача, эксперименталдык куту синхротрон сактоо шакегинен 245 м алыстыкта ​​жайгашкан. Үлгүдөн детекторго чейинки аралык 0,6 м бөлүкчөлөрдү изилдөө үчүн колдонулат жана vivom0 үчүн колдонулат. фазалык контраст эффекттерин жаратуу үчүн. 25 кВ монохроматтык нурдун энергиясы колдонулган. Сүрөттөр sCMOS детекторуна кошулган жогорку резолюциядагы рентген конвертеринин (SPring-8 BM3) жардамы менен тартылган. Конвертер 10 мкм калыңдыктагы сцинтиллятордун (Gd3Al2G) жардамы менен рентген нурларын көзгө көрүнгөн жарыкка айлантат. × 10 микроскоптун объектиси (NA 0.3). sCMOS детектору массивдин өлчөмү 2048 × 2048 пиксел жана чийки пиксел өлчөмү 6,5 × 6,5 мкм болгон Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) болгон. болжол менен 1,1 мм × 1,1 мм. Экспозициянын узундугу 100 мс. Дем алуу жолунун ичиндеги жана сыртындагы магниттик бөлүкчөлөрдүн сигнал-ызы-чуу катышын максимумдаштыруу жана дем алуудан пайда болгон кыймыл артефакттарын азайтуу үчүн тандалган. In vivo изилдөөлөр үчүн, рентген нурларынын ортосундагы радиацияны чектөө үчүн тез рентген жапкыч орнотулган.
LV алып жүрүүчүсү SPring-8 PB-PCXI сүрөттөө изилдөөлөрүндө колдонулган эмес, анткени BL20XU сүрөт камерасы Биологиялык коопсуздуктун 2-деңгээли тастыкталган эмес. Анын ордуна биз эки коммерциялык камсыздоочудан жакшы мүнөздөлгөн депутаттарды тандап алдык — бир катар өлчөмдөрдү, материалдарды, темирдин концентрациясын жана колдонууну камтыган - биринчи айнектин ичиндеги магниттик талаага жана колдонууга кандай таасир тийгизерин түшүнүү. тирүү аба жолдорунда. бетинде.МПтин өлчөмү 0,25тен 18 мкмге чейин өзгөрөт жана ар кандай материалдардан жасалган (1-таблицаны караңыз), бирок ар бир үлгүнүн курамы, анын ичинде МПнын ичиндеги магниттик бөлүкчөлөрдүн өлчөмү белгисиз. Биздин кеңири MCT изилдөөлөрүбүздүн негизинде 19, 20, 21, 23, 24, биз MP5 трамплиндери абада кичинекей деп күтөбүз. бетинде, мисалы, MP кыймылынын жакшыртылган көрүнүшүн көрүү үчүн ырааттуу рамкаларды кемитүү жолу менен. Бир 0,25 мкм өлчөмүндөгү МП сүрөт тартуу аппаратынын чечүүчүлүгүнөн кичине, бирок PB-PCXI алардын көлөмүнүн контрастын жана тундурмалангандан кийин сакталган беттик суюктуктун кыймылын аныктайт деп күтүлүүдө.
1-таблицадагы ар бир МП үчүн үлгүлөр ички диаметри 0,63 мм болгон 20 мкл айнек капиллярларда (Drummond Microcaps, PA, АКШ) даярдалган. Корпускулярдык бөлүкчөлөр сууда, ал эми CombiMag бөлүкчөлөрү өндүрүүчүнүн менчигиндеги суюктукта бар. Ар бир түтүк жарым-жартылай суюктук менен толтурулат жана үлгүнү кармоочу 1 мкл орнотулган. (1-сүрөттү караңыз). Айнек капиллярлар, тиешелүүлүгүнө жараша, сүрөт тартуу кутучасындагы үлгү баскычына туурасынан жайгаштырылып, суюктуктун четтери жайгаштырылды. Диаметри 19 мм (28 мм) никелден жасалган сейрек кездешүүчү жер неодим темир бор (NdFeB) магнити (N35, кат. №. LM1652, Australiaycar amagnetization, электроника менен кайра магниттештирүү) 1.17 Тесла өзүнчө котормо баскычына тиркелген. Сүрөт тартуу учурунда анын абалын алыстан өзгөртүүгө жетишүү. Рентген сүрөтүн алуу магнит үлгүдөн болжол менен 30 мм жогору жайгашканда башталат жана сүрөттөр секундасына 4 кадр ылдамдыгы менен алынат. Сүрөткө тартуу учурунда магнит айнек капиллярдык түтүктүн жанына жакындатылды жана андан кийин түтүктүн позициясынын күчүн мм аралыкта баалайт.
Үлгү xy которуу стадиясында айнек капиллярларда МП үлгүлөрүн камтыган in vitro сүрөт орнотуу. Рентген нурунун жолу кызыл сызык менен белгиленген.
Депутаттардын in vitro көрүнүшү белгиленгенден кийин, алардын бир бөлүгү жапайы түрдөгү ургаачы альбинос Wistar келемиштерде (~ 12 жумалык, ~ 200 г) in vivo сыналган. 0,24 мг/кг медетомидин (Domitor®, Zenoaq, Япония), 3,2 мг/кг мидазолам (Dormicum®, Япония, Астелластор) жана (Vetorphale®, Meiji Seika) Келемиштерге Pharma аралашмасы менен наркоз берилди, Япония) ичке сайма аркылуу. Анестезиядан кийин, алар трахеянын айланасындагы жүндү алып салуу, эндотрахеалдык түтүктү (ET; 16 Ga ivmobilizing cannula жана BKC) киргизүү аркылуу сүрөт тартууга даярдалган. дене температурасын кармап туруу үчүн жылуулук баштык камтыган табак 22 .Сүрөттөө пластина андан кийин сүрөт 2a сүрөттө көрсөтүлгөндөй, рентген сүрөтүндө трахеяны туурасынан тегиздөө үчүн сүрөттөө кутучасындагы үлгү которуу стадиясына бир аз бурч менен тиркелген.
(a) SPring-8 сүрөттөө кутучасында In vivo сүрөт орнотуу, рентген нурунун жолу кызыл чекит сызык менен белгиленген. (b,c) трахеядагы магнит локализациясы ортогоналдуу орнотулган эки IP cameras.On экрандын сүрөттөлүшүнүн сол тарабында алыстан аткарылган, башты кармап турган зым илмек көрүнүп, ETтин ичинде жеткирүү түтүгүн көрүүгө болот.
100 мкл айнек шприцти колдонгон алыстан башкарылуучу шприц насос системасы (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) PE10 түтүкчөсүнө (OD 0,61 мм, ID 0,28 мм) 30 Ga ийне аркылуу туташтырылган. Түтүктүн учу жеткириле турган МП үлгүсүнө чөмүлдүрүлүп жатканда шприц поршень чыгарылды. Жүктөлгөн жеткирүү түтүгү эндотрахеалдык түтүккө киргизилип, учу биздин күтүлгөн колдонулуучу магнит талаасынын эң күчтүү бөлүгүнө жайгаштырылды. Сүрөттү алуу биздин Arduino кутучасына туташкан дем алуу детекторунун жардамы менен көзөмөлдөндү, температура жана бардык убакыттар, сигналдар ачуу/жабуу жана сүрөттү алуу) Powerlab жана LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) аркылуу жазылган 22. Сүрөткө тартууда Корпуга жеткиликсиз болгондо, эки IP камера (Panasonic BB-SC382) бири-бирине болжол менен 90° жайгаштырылган жана алар magnetic. кыймыл артефакттары, акырындагы толкун агымы платосунда дем алуу үчүн бир сүрөттөлүш алынган.
Магнит экинчи баскычка тиркелет, ал сүрөт тартуу корпусунун сыртынан алыстан жайгаштырылат. Ар түрдүү магниттик позициялар жана конфигурациялар сыналган, анын ичинде: Трахеянын үстүндө болжол менен 30° бурчка орнотулган (конфигурациялар 2a жана 3a-сүрөттөрүндө көрсөтүлгөн); бир магнит жаныбардын үстүндө, экинчиси ылдыйда, уюлдарды тартуу үчүн орнотулган (сүрөт 3б); бир магнит жаныбардын үстүндө, экинчиси ылдыйда, уюлдарды кайтаруу үчүн орнотулган (сүрөт 3c); жана трахеяга перпендикуляр болгон бир магнит (3d-сүрөт). Жаныбар жана магнит конфигурациялангандан кийин жана текшерилүүчү МП шприц насосуна жүктөлгөндөн кийин, сүрөттөрдү алууда 50 мкл дозасын 4 мкл/сек ылдамдыкта жеткириңиз.
In vivo сүрөттөө үчүн магнит конфигурациясы (a) трахеянын үстүндө болжол менен 30° бурчта турган бир магнит, (б) тартуу үчүн коюлган эки магнит, (в) эки магнит түртүүгө коюлган, (г) жогоруда жана трахеяда перпендикуляр болгон бир магнит. Байкоочу оозунан өпкөлөрдү карап, трахеянын сол капталынан өтүп, рентген аркылуу өттү. оң тараптан чыкты. Магнит дем алуу жолунун узундугу боюнча же рентген нурунун багыты боюнча трахеянын үстүндө солго жана оңго жылдырылат.
Биз, ошондой эле башаламан дем жана жүрөк кыймылы жок аба жолдорунда бөлүкчөлөрдүн көрүнүшүн жана жүрүм-турумун аныктоо үчүн аракет кылышкан.Ошондуктан, сүрөттөлүш мезгилдин аягында, жаныбарлар пентобарбитал ашыкча дозасы үчүн адам өлтүрүлгөн (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, АКШ; жана ~ 65 мг / кг дем аянтчасында калган. жүрөктүн согушу токтоп, сүрөт тартуу процесси кайталанып, дем алуу жолдорунун бетинде бир да депутат көрүнбөсө, кошумча МП дозасын кошуу.
Алынган сүрөттөр жалпак талаа жана караңгы талаа оңдолуп, андан кийин MATLAB (R2020a, The Mathworks) программасында жазылган ыңгайлаштырылган сценарийдин жардамы менен киного (секундасына 20 кадр; дем алуу ылдамдыгына жараша 15-25 × нормалдуу ылдамдык) чогултулган.
Бардык LV ген векторун жеткирүү боюнча изилдөөлөр Аделаида университетинин лабораториялык жаныбарларды изилдөө мекемесинде жүргүзүлдү жана SPring-8 экспериментинин натыйжаларын магнит талаасынын катышуусунда LV-MP жеткирүү гендин трансферин in vivo күчөтө алаар-албасын баалоо үчүн колдонууга багытталган. МП жана магнит талаасынын таасирин баалоо үчүн жаныбарлардын эки тобу дарыланды: бир топко LV- орнотулган V тобу менен магниттик башкаруу тобу берилди, экинчи тобуна LV-MP тобу менен магниттик орнотулган V тобу берилди. магнитсиз.
LV ген векторлору мурда сүрөттөлгөн ыкмаларды колдонуу менен түзүлгөн 25, 26 . LacZ вектору түзүүчү MPSV промотеру (LV-LacZ) менен шартталган ядролук-локализацияланган бета-галактозидаза генин билдирет, ал трансдукцияланган клеткаларда көк реакция продуктуну пайда кылат, өпкө тканынын фронтторунда көрүнүп турат жана ткань бөлүмдөрүн кол менен санап, клетканын культурасын кол менен эсептөө менен аткарылган. ТУ/мл менен титрди эсептөө үчүн гемоцитометр менен LacZ оң клеткалары. Ташуучулар -80 °C температурада криоконсервацияланат, колдонуудан мурун эритүү жана 1:1 катышында аралаштыруу жана жеткирүүгө чейин 30 мүнөттөн кем эмес музда инкубациялоо жолу менен CombiMag менен байланышкан.
Кадимки Sprague Dawley келемиштерге (n = 3/топ, ~2-3) 0,4 мг/кг медетомидиндин (Домитор, Илиум, Австралия) жана 60 мг/кг кетаминдин (Ilium, Австралия) аралашмасы менен ичтин ичине наркоз берилди) инъекция жана хирургиялык эмес оозеки трассаны камсыздай алат. Дем алуу жолдорунун кыртышы LV трансдукциясын алат, ал биздин мурда сүрөттөлгөн механикалык бузулуу протоколунун жардамы менен шартталган, мында трахеянын аба жолдорунун бети зым себет менен октук сүртүлгөн (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28 cabinet менен биологиялык башкарууда аткарылган. 10 мүнөттөн кийин.
Бул экспериментте колдонулган магнит талаасы in vivo рентгендик сүрөттөө изилдөөсүнө окшош конфигурацияланган, ошол эле магниттер трахеянын үстүндө дистилляциялык стент клиптерин (Figure 4) кармап турган. LV-МПнын 50 мкл көлөмү (2 × 25 мкл аликвоттар) трахеяга жеткирилген (n = A трубаны колдонуу менен 3 мкл. тобу (n = 3 жаныбар) магнит колдонбостон эле LV-МПти алышты. Инфузия аяктагандан кийин каннула ET түтүкчөсүнөн чыгарылат жана жаныбар экстубацияланат. Магнит 10 мүнөт бою ордунда турат, андан кийин ал чыгарылат. Келемиштерге мелоксикамдын тери астына дозасын (1 мл/кг) кабыл алышты. 1 мг/кг атимазол гидрохлоридинин (Антиседан, Зоетис, Австралия). Келемиштер анестезиядан толук айыгып кеткенге чейин жылуу кармалып, көзөмөлгө алынган.
LV-MP жеткирүү аппараты биологиялык коопсуздук кабинетинде. ET түтүкчөсүнүн ачык боз Luer түйүнүнүн оозунан чыгып турганын көрүүгө болот жана сүрөттө көрсөтүлгөн пипетка гел учу ET түтүгү аркылуу трахеяга керектүү тереңдикке киргизилет.
LV-MP дозалоо процедурасынан бир жума өткөндөн кийин, жаныбарлар 100% СО2 менен дем алуу жолу менен өлтүрүлдү жана LacZ экспрессиясы биздин стандарттуу X-gal дарылоо аркылуу бааланды. Эндотрахеалдык түтүктү жайгаштырууда механикалык зыян же суюктуктун кармалышы анализге кирбеши үчүн үч каудалдык эң кемирчек шакекчелер алынып салынды. Камтыган силикон резина (Sylgard, Dow Inc) люминалдык бетти элестетүү үчүн Minutien ийнеси (Fine Science Tools) аркылуу. Трансдукцияланган клеткалардын бөлүштүрүлүшү жана үлгүсү DigiLite камерасы жана TCapture программасы (Tucsen Photonics, accluinding the China) менен Nikon микроскобу (SMZ1500) аркылуу фронталдык сүрөткө тартуу менен тастыкталды. трахеянын толук туурасы үчүн эң жогорку параметр), трахеянын бүт узундугу этап-этабы менен сүрөттөлүп, ар бир сүрөттөлүштүн ортосундагы жетишерлик дал келүүнү камсыз кылып, сүрөттүн “тигишине” мүмкүнчүлүк берет. Андан кийин ар бир трахеядан алынган сүрөттөр Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) аркылуу бирдиктүү композиттик сүрөткө чогултулду. Ар бир жаныбардын трахеясы 0,35 < Реңк < 0,58, Каныккандык > 0,15 жана Маани < 0,7 орнотууларды колдонуу менен, мурда сүрөттөлгөндөй автоматташтырылган MATLAB скрипти (R2020a, MathWorks) аркылуу сандык бааланган. кыртыш аймагын аныктоо жана трахеялык кыртыштын сыртынан кандайдыр бир жалган аныктоону болтурбоо. Ар бир жаныбардын бардык курама сүрөттөрүнүн боёлгон жерлери ошол жаныбар үчүн жалпы боёгон аймакты түзүү үчүн чогулду. Андан кийин нормалдаштырылган аймакты түзүү үчүн боёлгон аймак жалпы маска аянтына бөлүндү.
Ар бир трахея парафинге салынып, 5 мкм бөлүктөрү кесилген. Бөлүмдөр 5 мүнөткө нейтралдуу тез кызыл түскө боёлуп, сүрөттөр Nikon Eclipse E400 микроскобу, DS-Fi3 камерасы жана NIS элементин тартуу программасы (5.20.00 версиясы) аркылуу алынган.
Бардык статистикалык анализдер GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) ичинде аткарылган. Статистикалык маани p ≤ 0.05 деңгээлинде коюлган. Нормалдуулук Шапиро-Уилк тестинин жардамы менен текшерилген жана LacZ боёгундагы айырмачылыктар жупташтырылбаган t-тесттин жардамы менен бааланган.
1-таблицада сүрөттөлгөн алты депутат PCXI жардамы менен изилденди, ал эми көрүнүү 2-таблицада сүрөттөлгөн. Эки полистирол МП (MP1 жана MP2; 18 мкм жана 0,25 мкм, тиешелүүлүгүнө жараша) PCXI астында көрүнгөн эмес, бирок калган үлгүлөр идентификацияланган (мисалы, MP5MP1-сүрөттө көрсөтүлгөн). Fe3O4; тиешелүүлүгүнө жараша 0,25 мкм жана 0,9 мкм) анча көрүнбөйт. Сыналган эң кичинекей бөлүкчөлөрдү камтыганына карабастан, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) эң айкын болгон. CombiMag продуктусу MP6 болгон. капиллярга параллелдүү. Магниттер капиллярдан алыстаганда, бөлүкчөлөр узун жиптерге созулган, бирок магниттер жакындаган сайын жана магнит талаасынын күчү жогорулаган сайын, бөлүкчөлөр капиллярдын үстүнкү бетине көчкөндүктөн, бөлүкчөлөрдүн саптары кыскарган (Кошумча видеону караңыз S1: MP4), бөлүкчөлөр капиллярдан ажыратылганда, бөлүкчөлөрдүн саптары кыскарган. капилляр, талаа күчү төмөндөйт жана депутаттар капиллярдын үстүнкү бетинен созулган узун жиптерге кайра тизилип (Кошумча Video S2 карагыла: MP4).Магнит кыймылын токтоткондон кийин, бөлүкчөлөр тең салмактуулук абалына жеткенден кийин кыска убакытка кыймылын улантат.МП көздөй жана алыска жылган сайын капиллярдык суюктуктун үстүнкү бети аркылуу капиллярдык magnetrys деп мүнөздөлөт.
PCXI астында MP көрүнөө үлгүлөрүнүн ортосунда олуттуу айырмаланат.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 жана (г) MP6. Бул жерде көрсөтүлгөн бардык сүрөттөр капиллярдын үстүндө болжол менен 10 мм жогору жайгашкан магнит менен тартылган. Көрүнүп турган чоң чөйрөлөр капиллярларда камалып калган аба көбүкчөлөрү болуп саналат. чоңойтуу. Бардык фигуралардагы магнит схемаларынын диаметрлери масштабдуу эмес жана көрсөтүлгөндөн болжол менен 100 эсе чоң экенин эске алыңыз.
Магнит капиллярдын үстүн бойлой солго жана оңго которулгандыктан, MP саптын бурчу магнитке тегиздөө үчүн өзгөрөт (6-сүрөттү караңыз), ошону менен магнит талаасынын сызыктары аныкталат. MP3-5 үчүн, аккорд босого бурчка жеткенден кийин, бөлүкчөлөр капиллярдын үстүнкү бети боюнча сүйрөлөт. эң күчтүү (Кошумча Video S3: MP5 караңыз). Бул өзгөчө капиллярдын учуна жакын сүрөткө тартууда айкын көрүнүп турат, бул депутаттардын суюктук-аба интерфейсинде топтолушуна жана топтолушуна алып келет. MP3-5ке караганда айырмалоо кыйыныраак болгон MP6 бөлүкчөлөрү магнит MP3-5ке караганда сүйрөлгөн жок, бирок магниттик капиллярлардын бөлүкчөлөрү чыгып кеткендиктен, сүйрөлгөн жок. (Кошумча Video S4: MP6 караңыз). Кээ бир учурларда, колдонулган магнит талаасы магнитти сүрөттөө жайгашкан жерден бир топ аралыкка жылдыруу менен азайганда, калган депутаттар жипте калып, тартылуу күчү менен түтүктүн ылдыйкы бетине акырындык менен түшөт (Кошумча Video S5: MP3 караңыз).
Магнит капиллярдын үстүндө оңго которулганда MP сапынын бурчу өзгөрөт.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 жана (г) MP6. Кызыл кутуда контрастты күчөтүүчү чоңойтуу бар. Кошумча видеолор маалыматтык экенин эске алыңыз, анткени алар маанилүү бөлүкчөлөрдүн түзүлүшүн жана бул статикалык сүрөттөрдө элестетүү мүмкүн эмес динамикалык маалыматты ачып берет.
Биздин тестирлөөлөр көрсөткөндөй, магнитти трахея боюнча алдыга жана артка жай жылдыруу in vivo татаал кыймылдын контекстинде МПнын визуализациясын жеңилдетет. In vivo тестирлөө жүргүзүлгөн эмес, анткени полистирол мончоктору (MP1 жана MP2) капиллярда көрүнбөйт. Калган төрт МПнын ар бири трахеянын 3 градуска жакын конфигурацияланган магнити менен in vivo сыналган. вертикалдуу (2b жана 3a-сүрөттөрдү караңыз), анткени бул MP чынжырчаларынын узунураак болушуна алып келди жана магнит конфигурациясы токтотулганга караганда натыйжалуураак болду. MP3, MP4 жана MP6 бир дагы тирүү жаныбарлардын трахеясында аныкталган жок. Жаныбарлар адам өлтүрүлгөндөн кийин келемиштердин аба жолдору тартылганда, бөлүкчөлөр МП5 оксидинин кошумча көлөмү кошулганда да көрүнбөй кала берген. бир гана көрүнгөн бөлүкчө, ошондуктан МПнын in vivo жүрүм-турумун баалоо жана мүнөздөө үчүн колдонулган.
МП жеткирүү учурунда трахеянын үстүнө магнитти жайгаштыруу көптөгөн депутаттардын көрүү тармагында топтолушуна алып келди, бирок баары эмес, трахеяга кирген бөлүкчөлөр адамдык курмандыкка чалынган жаныбарларда эң жакшы байкалат. trachea.МП жеткирилгенден кийин трахеяны бойлото дисталдан издегенде, кээ бир депутаттар каринага жакыныраак табылды, бул магнит талаасынын күчү бардык депутаттарды чогултуу жана кармап туруу үчүн жетишсиз экенин, анткени алар суюктук процессинде максималдуу магниттик талаа күчүнүн аймагы аркылуу жеткирилген. Ошого карабастан, төрөттөн кийинки МП концентрациясы сүрөттөлгөн аба жолунун айланасында магниттик талаанын көп колдонулган аймактарында жогору болгондугун көрсөтүп турат. эң жогорку болгон.
Сүрөттөр (a) чейин жана (б) жакында эвтанизацияланган келемиштин трахеясына MP5 жеткирилгенден кийин, магнити түздөн-түз сүрөттөө аймагынын үстүндө жайгашкан. Сүрөттөлгөн аймак эки кемирчек шакекченин ортосунда жайгашкан. МП жеткирүүдөн мурун аба жолунда бир аз суюктук бар. Кызыл кутучада контрастты күчөтүүчү чоңойтуу бар. Бул сүрөттөр S6MP видеосунда көрсөтүлгөн.
Трахеяны бойлото магнитти in vivo которуу MP чынжырынын аба жолунун бетинин ичиндеги бурчтун капиллярларда көрүнгөндөй өзгөрүшүнө алып келди (8-сүрөттү жана S7-кошумча видеону караңыз: MP5). Бирок, биздин изилдөөбүздө депутаттарды тирүү аба жолунун бети боюнча сүйрөп чыгуу мүмкүн эмес, алар капиллярлар менен болушу мүмкүн. биз ошондой эле магнит трахеяны бойлой узунунан жылдырганда бөлүкчөлөрдүн жиптери беттик суюктук катмарынын тереңдигин өзгөртө тургандай көрүнөрүн, ал эми магнит түздөн-түз үстүңкү жылдырылып, бөлүкчөлөрдүн сабы вертикалдуу абалга айланганда кеңейерин байкадык (Кошумча Video S7 караңыз). : MP5 at 0:09, ылдыйкы оң). Магнит трахеянын үстү жагына каптал жактан которулганда (башкача айтканда, трахеянын узундугу боюнча эмес, жаныбардын сол же оң тарабына) которулганда кыймылдын мүнөздүү үлгүсү өзгөргөн. Бөлүкчөлөр кыймылдап жатканда дагы даана көрүнүп турушкан, бирок магнит трахеядан алынып салынганда, бөлүкчөлөрдүн учтары тартылып калган. S8: MP5, 0:08ден башталат). Бул биз айнек капиллярдагы колдонулган магнит талаасынын астында байкаган депутат жүрүм-турумуна дал келет.
Тирүү анестезияланган келемиштин трахеясында MP5ти көрсөткөн мисалдар.(a) Магнит трахеянын үстүндө жана сол жагында сүрөттөрдү алуу үчүн колдонулат, андан кийин (b) магнит оңго жылдырылат. Кызыл кутуда контрастты күчөтүүчү чоңойтуу бар. Бул сүрөттөр S7:MP5 кошумча видеосунда көрсөтүлгөн видеодон алынган.
Эки уюл трахеянын үстүндө жана астында түндүк-түштүк багытында конфигурацияланганда (б.а. тартуу; 3b-сүрөт), МП аккорддору узунураак пайда болуп, трахеянын арка бетинде эмес, трахеянын капталында жайгашкан (Кошумча видео S9: MP5 караңыз). Бирок, бөлүкчөлөрдүн жогорку концентрациясы (б.а. трахеянын бетинде, трахеянын бетинде аныкталган эмес) суюктук жеткирилгенден кийин, адатта, бир магниттик түзүлүш колдонулганда пайда болот. Андан кийин бир магнит тескери бурулган уюлдарды түртүүгө конфигурацияланганда (3c-сүрөт), көрүү талаасында көрүнгөн бөлүкчөлөрдүн саны жеткирилгенден кийин көбөйгөн жок. Эки магниттик конфигурациянын тең орнотулушу магниттик күчтүн жогорулугуна байланыштуу кыйынчылык жаратат. орнотуу андан кийин аба жолуна параллелдүү, бирок аба жолу аркылуу 90 градуска өтүп, талаа сызыктары трахеянын дубалын ортогоналдуу кесип өтүүчү бир магнитке өзгөртүлдү (3d-сүрөт), ориентация каптал дубалдагы бөлүкчөлөрдүн агрегациясынын байкалышы мүмкүн экендигин аныктоо үчүн иштелип чыккан .Бирок, бул конфигурацияда, бул конфигурацияда эч кандай аныкталуучу кыймыл жок же бардык магниттик кыймылдар болгон эмес. бир магниттик, 30 градустук багыт конфигурациясы (Figure 3a) in vivo ген ташуучу изилдөөлөр үчүн тандалган.
Жаныбарды адамдык түрдө өлтүргөндөн кийин дароо эле кайра-кайра сүрөткө тартканда, ткандардын чаташтыргыч кыймылынын жоктугу, бөлүкчөлөрдүн майда жана кыскараак сызыктарын магниттин котормо кыймылына ылайык, так интерхондрал талаасында “солкулдап” билүүгө мүмкүндүк берген. Ошентсе да, дагы эле так MP6 бөлүкчөлөрүнүн болушун жана кыймылын көрө албайт.
LV-LacZ титери 1,8 × 108 TU / мл болгон жана 1: 1 CombiMag MP (MP6) менен аралаштыргандан кийин, жаныбарлар 9 × 107 TU / мл LV унаасынын 50 мкл трахеалдык дозасын алышты (б.а. 4,5 × 106 TU / келемиш). ).Бул изилдөөлөрдө, эмгек учурунда магнит которуунун ордуна, биз LV өткөрүү (а) магнит талаасы жок вектор жеткирүүгө салыштырмалуу жакшыртылган болушу мүмкүн экенин аныктоо үчүн бир абалда магнит белгиленген, жана (б) багытталган Airway клеткалары жогорку дем магниттик максаттуу аймактарына которулат.
Магниттердин болушу жана CombiMagтин LV векторлору менен айкалыштырылышы жаныбарлардын ден соолугуна терс таасирин тийгизген жок, ошондой эле биздин стандарттык LV вектор жеткирүү протоколубуз. Механикалык бузулууга дуушар болгон трахея аймагынын фронталдык сүрөттөрү (Кошумча 1-сүрөт) жаныбарлардын тобунда трансдукциянын кыйла жогору болгондугун көрсөттү. контролдоо тобунда бир аз көлөмдөгү көк LacZ боёгу болгон (сүрөт 9b). Нормалдаштырылган X-Gal боелгон аймактардын сандык көрсөткүчү LV-MPтин магнит талаасынын катышуусунда башкаруу болжол менен 6 эсе жакшырганын көрсөттү (сүрөт 9c).
LV-MP (а) магнит талаасынын алдында жана (б) магнит жок болгон учурда трахея өткөрүүнү көрсөткөн Мисал курама сүрөттөрү. (c) магнитти колдонууда трахеянын ичинде нормалдаштырылган LacZ өткөрүү аймагында статистикалык жактан маанилүү жакшыртуу (* p = 0.029, т-тест, n = ± EM тобуна орточо).
Нейтралдуу тез кызыл түскө боёлгон бөлүктөр (мисалы, кошумча 2-сүрөттө көрсөтүлгөн) мурда билдирилгендей окшош калыпта жана жерде жайгашкан LacZ менен боёлгон клеткаларды көрсөттү.
Дем алуу жолдорунун ген терапиясы үчүн негизги көйгөй болуп, ташуучу бөлүкчөлөрдү кызыктырган аймактарга так локализациялоо жана аба агымы жана активдүү былжыр клиренси болгон учурда кыймылдуу өпкөдөгү трансдукциянын эффективдүүлүгүнүн жогорку деңгээлине жетишүү бойдон калууда. CF аба жолдорунун ооруларын дарылоо үчүн иштелип чыккан LV ташыгычтары үчүн, өткөрүүчү аба жолдорунун ичинде ташуучу бөлүкчөлөрдүн болуу убактысын көбөйтүү, Castella et al. трансдукцияны жакшыртуу үчүн магниттик талааларды колдонуу электропорация сыяктуу ген жеткирүүнүн башка ыкмаларына салыштырмалуу артыкчылыктарга ээ, анткени ал жөнөкөйлүктү, экономикалык эффективдүүлүктү, жеткирүү локализациясын, эффективдүүлүктү жогорулатууну жана инкубациялоонун кыска мөөнөттөрүн жана, балким, азыраак ташуучу дозаны айкалыштыра алат. же чындыгында бул ыкманын ишке ашуусу in vivo бузулбаган тирүү аба жолдорунда ген экспрессия деңгээлин жогорулатуу үчүн көрсөтүлгөн эмес.
Биздин in vitro синхротрондук PCXI эксперименттерибиз көрсөткөндөй, биз сынаган бардык бөлүкчөлөр, полистирол МПны кошпогондо, биз колдонгон сүрөт орнотууда көрүнүп турат. Магниттик талаа болгондо, МПлар саптарды түзүшөт, алардын узундугу бөлүкчөлөрдүн түрүнө жана магнит талаасынын күчүнө (б.а. магнит талаасынын жакындыгы жана кыймылы сапта көрсөтүлгөндөй) байланыштуу. ар бир жеке бөлүкчө магниттелүүдө жана өзүнүн жергиликтүү магнит талаасын индукциялайт. Бул өзүнчө талаалар башка бөлүкчөлөрдүн жергиликтүү тартуу жана түртүүчү күчтөрүнүн жергиликтүү күчтөрүнөн улам топтук жип сымал кыймылдар менен башка окшош бөлүкчөлөрдүн биригишине жана биригишине себеп болот.
Суюктукка толгон капиллярлардын жана (c,d) аба толтурулган трахеянын ичинде пайда болгон бөлүкчөлөрдүн поезддерин схемалык көрсөтүү. Капиллярлар жана трахеялар масштабга тартылбаганына көңүл буруңуз. Панелде (а) ошондой эле саптарга тизилген Fe3O4 бөлүкчөлөрүн камтыган МПнын сүрөттөлүшү камтылган.
Магнит капиллярдан жогору жылдырылганда, бөлүкчөлөрдүн сабынын бурчу Fe3O4 камтыган MP3-5 үчүн критикалык чекке жеткен, андан кийин бөлүкчөлөрдүн сабы баштапкы абалында калбай, бетти бойлоп жаңы позицияга жылып кеткен. бөлүкчөлөр кичирээк болгондуктан, ар кандай каптоолорго же беттик заряддарга ээ болгон же менчик алып жүрүүчү суюктук алардын кыймылдоо жөндөмдүүлүгүнө таасир эткен. CombiMag бөлүкчөлөрүнүн сүрөт контрасты да алсызыраак, бул суюктук менен бөлүкчөлөрдүн тыгыздыгы окшош болушу мүмкүн жана ошондуктан бири-бирине оңой жыла алышпайт. суюктуктун бөлүкчөлөрүнүн ортосундагы сүрүлүүнү жеңүү, балким, магнит талаасынын күчү жана магнит менен максаттуу аймактын ортосундагы аралык абдан маанилүү экендиги таң калыштуу эмес. Бул жыйынтыктар чогуу алганда, магниттер максаттуу аймактан агып өткөн көптөгөн депутаттарды кармай алат, бирок биз трассанын бөлүкчөлөрү үчүн магниттерге таянуу мүмкүн эмес экенин көрсөтүп турат. in vivo LV-MP изилдөөлөр аба дарагынын белгилүү бир аймактарын физикалык бутага алуу үчүн статикалык магниттик талааларды колдонуу керек деген жыйынтыкка келиңиз.
Бөлүкчөлөр денеге жеткирилгенде, аларды татаал кыймылдуу дене кыртышынын контекстинде аныктоо кыйынга турат, бирок аларды аныктоо жөндөмдүүлүгү трахеянын үстүндөгү магнитти горизонталдуу которуп, MP саптарын "кыбырлатып" күчөтүлгөн. Жандуу сүрөткө тартуу мүмкүн болсо да, бөлүкчөлөрдүн кыймылын байкап көрүү оңой болот. аянты, кээ бир бөлүкчөлөр адатта трахеянын боюнда табылган. In vitro изилдөөлөрдөн айырмаланып, бөлүкчөлөрдү магнитти которуу менен трахеяны бойлото сүйрөп жүрүүгө болбойт. Бул табылга трахеянын бетин каптаган былжыр адатта дем алган бөлүкчөлөрдү кантип иштетип, аларды былжырда кармап, кийинчерээк тазаланган былжырлуу механизмдер менен шайкеш келет.
Биз трахеянын үстүндө жана ылдыйда тартылуу үчүн магниттерди колдонуу (3б-сүрөт) бир чекитте жогорку концентрацияланган магнит талаасына эмес, бир калыпта магнит талаасына алып келиши мүмкүн деп божомолдодук. Бирок, биздин алдын ала изилдөөбүз бул гипотезаны колдоо үчүн так далилдерди таба алган жок. 3c) сүрөттөлгөн аймакта бөлүкчөлөрдүн көбүрөөк чөктүрүлүшүнө алып келген жок. Бул эки жыйынтык кош магниттик орнотуу МП бутага алуунун локалдык көзөмөлүн олуттуу жакшырта албасын жана натыйжада пайда болгон күчтүү магниттик күчтөрдү конфигурациялоо кыйын экенин көрсөтүп турат, бул ыкманы практикалык жактан азыраак кылат. Ошо сыяктуу эле, магнитти жогору жана трахея аркылуу багыттоо (сүрөт. Бул альтернативалуу конфигурациялардын кээ бирлери ийгиликтүү болбошу мүмкүн, анткени алар чөккөн аймактагы магнит талаасынын күчүн төмөндөтөт. Ошондуктан, жалгыз 30 градустук бурч магнит конфигурациясы (3a-сүрөт) in vivo сыноо үчүн эң оңой жана эң эффективдүү ыкма болуп эсептелет.
LV-MP изилдөөсү LV векторлору CombiMag менен айкалышканда жана магнит талаасынын катышуусунда физикалык бузулуудан кийин жеткирилгенде трахеядагы трансдукция деңгээли башкарууга салыштырмалуу бир кыйла жогорулаганын көрсөттү. Синхротрондук сүрөттөө изилдөөлөрүнүн жана LacZ натыйжаларынын негизинде, магнит талаасы, сыягы, LV векторлорунун тереңдиктеги бөлүкчөлөрүнүн трахеясынын санын дароо сактап калууга жөндөмдүү болгон. lung.Мындай максаттуу жакшыртуулар жеткирилген титрлерди, максаттан тышкаркы трансдукцияны, сезгенүү жана иммундук терс таасирлерди жана ген ташуучу чыгымдарды азайтып, эффективдүүлүктү жогорулатууга алып келиши мүмкүн. Маанилүү нерсе, өндүрүүчүнүн айтымында, CombiMag башка ген өткөрүү ыкмалары менен бирге колдонулушу мүмкүн, анын ичинде башка вирустук векторлор (мисалы, nucleic AAV жана) менен.