Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Муковисцидоздук өпкө оорусун дарылоо үчүн ген векторлору өткөрүүчү дем ​​алуу жолдоруна багытталышы керек, анткени перифериялык өпкө трансдукциясы терапиялык пайда алып келбейт. Вирустук трансдукциянын натыйжалуулугу вектордун жашоо убактысына түздөн-түз байланыштуу. Бирок, ген алып жүрүүчүлөр сыяктуу жеткирүүчү суюктуктар дем алуу учурунда альвеолаларга табигый түрдө жайылат жана ар кандай формадагы терапиялык бөлүкчөлөр мукоцилиардык транспорт менен тез тазаланат. Дем алуу жолдорунда ген алып жүрүүчүлөрдүн жашоо убактысын узартуу маанилүү, бирок ага жетүү кыйын. Дем алуу жолдорунун бетине багыттала турган ген алып жүрүүчү менен конъюгацияланган магниттик бөлүкчөлөр аймактык бутага алууну жакшырта алат. In vivo визуализациянын кыйынчылыктарынан улам, колдонулган магнит талаасынын катышуусунда дем алуу жолдорунун бетиндеги мындай кичинекей магниттик бөлүкчөлөрдүн жүрүм-туруму начар түшүнүктүү. Бул изилдөөнүн максаты анестезияланган келемиштердин трахеясындагы бир катар магниттик бөлүкчөлөрдүн in vivo кыймылын визуализациялоо үчүн синхротрондук сүрөткө тартууну колдонуу, in vivo жеке жана көлөмдүү бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумунун динамикасын жана үлгүлөрүн изилдөө болгон. Андан кийин биз магнит талаасынын катышуусунда лентивирустук магниттик бөлүкчөлөрдү жеткирүү келемиште трансдукциянын натыйжалуулугун жогорулатабы же жокпу, бааладык. трахея. Синхротрондук рентген сүрөтү магниттик бөлүкчөлөрдүн стационардык жана кыймылдуу магнит талааларындагы in vitro жана in vivo жүрүм-турумун көрсөтөт. Бөлүкчөлөрдү магниттер менен тирүү аба жолдорунун бети боюнча оңой сүйрөө мүмкүн эмес, бирок ташуу учурунда чөкмөлөр магнит талаасы эң күчтүү болгон көрүү талаасында топтолгон. Лентивирустук магниттик бөлүкчөлөр магнит талаасынын катышуусунда жеткирилгенде, трансдукциянын натыйжалуулугу алты эсеге жогорулаган. Бул жыйынтыктар биргелешип, лентивирустук магниттик бөлүкчөлөр жана магнит талаалары ген векторун бутага алууну жакшыртуу жана in vivo өткөрүүчү аба жолдорунда трансдукция деңгээлин жогорулатуу үчүн баалуу ыкмалар болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Муковисцидоз (КФ) CF трансмембраналык өткөргүчтүк жөнгө салуучу (CFTR) деп аталган бир гендин өзгөрүшүнөн келип чыгат. CFTR белогу - бул денедеги көптөгөн эпителий клеткаларында, анын ичинде КФ патогенезинин негизги жери болгон өткөргүч аба жолдорунда жайгашкан ион каналы. CFTR кемчиликтери суу ташуунун анормалдуу болушуна, аба жолдорунун бетинин кургашына жана аба жолдорунун бетиндеги суюктуктун (ASL) катмарынын тереңдигинин азайышына алып келет. Бул ошондой эле мукоцилиардык транспорт (MCT) системасынын дем алуу жолдорунан дем алган бөлүкчөлөрдү жана патогендерди тазалоо жөндөмүн начарлатат. Биздин максатыбыз - CFTR генинин туура көчүрмөсүн жеткирүү жана ASL, MCT жана өпкөнүн ден соолугун жакшыртуу үчүн лентивирустук (LV) ген терапиясын иштеп чыгуу, ошондой эле бул параметрлерди in vivo1 өлчөөгө жөндөмдүү жаңы технологияларды иштеп чыгууну улантуу.
Сол карынчанын векторлору CF дем алуу жолдорунун ген терапиясынын алдыңкы талапкерлеринин бири болуп саналат, анткени алар терапиялык генди дем алуу жолдорунун базальдык клеткаларына (дем алуу жолдорунун өзөк клеткаларына) туруктуу интеграциялай алышат. Бул маанилүү, анткени алар функционалдык ген менен коррекцияланган CF менен байланышкан дем алуу жолдорунун бетиндеги клеткаларга дифференциациялануу менен кадимки гидратацияны жана былжырды тазалоону калыбына келтире алышат, натыйжада өмүр бою пайда алышат. Сол карынчанын векторлору өткөрүүчү дем ​​алуу жолуна каршы багытталышы керек, анткени CF өпкө оорусу дал ушул жерден башталат. Вектордун өпкөгө тереңирээк жеткирилиши альвеолярдык трансдукцияга алып келиши мүмкүн, бирок мунун CFде терапиялык пайдасы жок. Бирок, ген алып жүрүүчүлөр сыяктуу суюктуктар төрөттөн кийин дем алганда альвеолаларга табигый түрдө миграцияланат3,4 жана терапиялык бөлүкчөлөр MCT аркылуу ооз көңдөйүнө тездик менен тазаланат. Сол карынчанын трансдукциясынын натыйжалуулугу вектордун клеткалык сиңирүүгө мүмкүндүк берүү үчүн максаттуу клеткалардын жанында калуу убактысынын узактыгына түздөн-түз байланыштуу - "жашаган убактысы"5 - ал типтүү аймактык аба агымы, ошондой эле координацияланган бөлүкчөлөрдүн былжырды кармоосу жана MCT менен оңой кыскарат. CF үчүн, сол карынчанын дем алуу жолдорунда жашоо убактысын узартуу мүмкүнчүлүгү бул аймакта трансдукциянын жогорку деңгээлине жетүү үчүн маанилүү, бирок... алда канча кыйын болду.
Бул тоскоолдукту жеңүү үчүн, биз сол карынчанын магниттик бөлүкчөлөрү (СМ) эки кошумча жол менен жардам бере алат деп божомолдойбуз. Биринчиден, аларды магниттик жол менен дем алуу жолдорунун бетине багыттап, бутага алууну жакшыртууга жана ген алып жүрүүчү бөлүкчөлөрдүн каалаган дем алуу жолу аймагында жайгашуусуна жардам берүүгө болот; жана ASL) клетка катмарына 6 жылууга мүмкүндүк берет. СМлар антителолорго, химиотерапиялык дары-дармектерге же клетка мембраналарына жабышкан же тиешелүү клетка бетинин рецепторлоруна жабышкан жана статикалык электрдин катышуусунда шишик жерлеринде топтолгон башка кичинекей молекулаларга байланышканда дары-дармектерди максаттуу жеткирүү каражаттары катары кеңири колдонулган. Ракты дарылоо үчүн магниттик талаалар 7. Башка "гипертермикалык" ыкмалар термелүүчү магниттик талааларга дуушар болгондо MPлерди ысытууга, ошону менен шишик клеткаларын жок кылууга багытталган. ДНКны клеткаларга өткөрүүнү күчөтүү үчүн магниттик талаа трансфекция агенти катары колдонулган магниттик трансфекция принциби көбүнчө трансдукциясы кыйын клетка линиялары үчүн вирустук эмес жана вирустук ген векторлорунун диапазонун колдонуу менен in vitro колдонулат. Сол карынчанын магнитотрансфекциясынын эффективдүүлүгү аныкталды, статикалык магниттик талаанын катышуусунда LV-MPлерди адамдын бронхиалдык эпителий клетка линиясына in vitro жеткирүү менен, трансдукциянын эффективдүүлүгүн бир гана сол карынчанын векторуна салыштырмалуу 186 эсеге жогорулатты. Сол карынчанын магнитотрансфекциясы ошондой эле in vitro CF моделине колдонулган, анда магниттик трансфекция CF какырыгынын катышуусунда аба-суюктук интерфейсинин культураларында сол карынчанын трансдукциясын 20 эсеге жогорулаткан10. Бирок, органдардын in vivo магнитотрансфекциясы салыштырмалуу аз көңүл бурулган жана бир нече жаныбарларда гана бааланган. изилдөөлөр11,12,13,14,15, айрыкча өпкөдө16,17. Ошого карабастан, CF өпкө терапиясында магниттик трансфекциянын мүмкүнчүлүктөрү айдан ачык. Тан жана башкалар (2020) "магниттик нанобөлүкчөлөрдүн өпкө аркылуу натыйжалуу жеткирилишинин концепциясын далилдөө CFTR ингаляциялык стратегияларынын келечектеги CFTR менен ооруган бейтаптарда клиникалык натыйжаларды жакшыртууга жол ачат" деп билдиришкен6.
Колдонулган магнит талаасынын катышуусунда дем алуу жолдорунун беттериндеги кичинекей магниттик бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумун элестетүү жана изилдөө кыйын, ошондуктан ал начар түшүнүлөт. Башка изилдөөлөрдө биз синхротрон-таралууга негизделген фазалык-контрасттуу рентген сүрөтүн тартуу (PB-PCXI) ыкмасын иштеп чыктык, ал ASL тереңдигиндеги18 жана MCT жүрүм-турумундагы19,20 майда өзгөрүүлөрдү инвазивдүү эмес түрдө элестетүү жана сандык жактан аныктоо үчүн газ каналынын бетинин гидратациясын түздөн-түз өлчөө үчүн колдонулган жана дарылоонун натыйжалуулугунун алгачкы көрсөткүчү катары колдонулган. Мындан тышкары, биздин MCT баалоо ыкмабыз PB-PCXI21ди колдонуу менен көрүнгөн MCT маркерлери катары алюминий кычкылынан же жогорку сынуу көрсөткүчтүү айнектен турган 10–35 мкм диаметрдеги бөлүкчөлөрдү колдонот. Эки ыкма тең MPди кошо алганда, ар кандай бөлүкчө түрлөрүн визуалдаштыруу үчүн ылайыктуу.
Мейкиндик жана убакыттык жогорку чечилишинен улам, биздин PB-PCXI негизиндеги ASL жана MCT анализ ыкмаларыбыз MP генин жеткирүү ыкмаларын түшүнүүгө жана оптималдаштырууга жардам берүү үчүн in vivo шартында бир жана көлөмдүү бөлүкчөлөрдүн жүрүм-турумунун динамикасын жана үлгүлөрүн изилдөөгө абдан ылайыктуу. Бул жерде биз колдонгон ыкма SPring-8 BL20B2 нур линиясын колдонуу менен жүргүзүлгөн изилдөөлөрүбүздөн келип чыгат, анда биз ген алып жүрүүчү дозалуу жаныбарларды изилдөөдө байкалган бирдей эмес ген экспрессиясынын үлгүлөрүн түшүндүрүүгө жардам берүү үчүн чычкандардын мурун жана өпкө аба жолдоруна жасалма вектордук дозаны жеткирүүдөн кийинки суюктуктун кыймылын элестеттик 3,4.
Бул изилдөөнүн максаты тирүү келемиштердин трахеясындагы бир катар MPлердин in vivo кыймылын визуалдаштыруу үчүн синхротрон PB-PCXI колдонуу болгон. Бул PB-PCXI сүрөткө тартуу изилдөөлөрү MP кыймылына тийгизген таасирин аныктоо үчүн бир катар MPлерди, магнит талаасынын күчүн жана жайгашкан жерлерин текшерүү үчүн иштелип чыккан. Биз сырттан колдонулган магнит талаасы жеткирилген MPнин максаттуу аймакта калышына же жылышына жардам берет деген гипотезаны койдук. Бул изилдөөлөр ошондой эле бизге чөкмөдөн кийин трахеяда кармалып калган бөлүкчөлөрдүн санын максималдуу түрдө көбөйткөн магнит конфигурацияларын аныктоого мүмкүндүк берди. Изилдөөлөрдүн экинчи сериясында биз бул оптималдуу конфигурацияны келемиштердин дем алуу жолуна in vivo жеткирүүдөн келип чыккан трансдукция схемасын көрсөтүү үчүн колдонууга аракет кылдык, бул LV-MPлерди дем алуу жолдорун бутага алуу контекстинде жеткирүү сол карынчанын трансдукциясынын натыйжалуулугун жогорулатат деген божомолго негизделген.
Бардык жаныбарларды изилдөө Аделаида университети (M-2019-060 жана M-2020-022) жана SPring-8 Синхротрон Жаныбарлардын Этикасы боюнча комитети тарабынан бекитилген протоколдорго ылайык жүргүзүлдү. Эксперименттер ARRIVE көрсөтмөлөрүнө ылайык жүргүзүлдү.
Бардык рентгендик сүрөткө тартуулар Япониядагы SPring-8 синхротронундагы BL20XU нур линиясында мурда сүрөттөлгөнгө окшош орнотууну колдонуу менен жүргүзүлдү21,22. Кыскача айтканда, эксперименталдык куту синхротрон сактоочу шакекчеден 245 м аралыкта жайгашкан. Фазалык контраст эффекттерин түзүү үчүн бөлүкчөлөрдү сүрөткө тартуу изилдөөлөрү үчүн 0,6 м жана in vivo сүрөткө тартуу изилдөөлөрү үчүн 0,3 м аралык колдонулат. 25 кэВ монохроматикалык нур энергиясы колдонулган. Сүрөттөр sCMOS детекторуна туташтырылган жогорку чечилиштеги рентген конвертери (SPring-8 BM3) аркылуу тартылган. Конвертер рентген нурларын 10 мкм калыңдыктагы сцинтиллятор (Gd3Al2Ga3O12) аркылуу көрүнүүчү жарыкка айландырат, андан кийин ал × 10 микроскоптук объективди (NA 0.3) колдонуп sCMOS сенсоруна багытталат. sCMOS детектору Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) болгон, анын массивинин өлчөмү... 2048 × 2048 пиксел жана чийки пикселдин өлчөмү 6,5 × 6,5 мкм. Бул орнотуу 0,51 мкм эффективдүү изотроптук пиксел өлчөмүн жана болжол менен 1,1 мм × 1,1 мм көрүү талаасын берет. Дем алуу менен шартталган кыймыл артефакттарын минималдаштыруу менен бирге дем алуу жолдорунун ичиндеги жана сыртындагы магниттик бөлүкчөлөрдүн сигнал-ызы-чуу катышын максималдаштыруу үчүн 100 мс экспозиция узундугу тандалып алынган. In vivo изилдөөлөрү үчүн, экспозициялардын ортосундагы рентген нурун бөгөттөө менен нурлануу дозасын чектөө үчүн рентген жолуна тез рентген жапкыч орнотулган.
Сол карынчанын алып жүрүүчүсү SPring-8 PB-PCXI сүрөткө тартуу изилдөөлөрүндө колдонулган эмес, анткени BL20XU сүрөткө тартуу камерасы Биологиялык коопсуздуктун 2-деңгээлине сертификатталган эмес. Анын ордуна, биз эки коммерциялык жеткирүүчүдөн ар кандай өлчөмдөрдү, материалдарды, темирдин концентрациясын жана колдонулушун камтыган жакшы мүнөздөлгөн MPлердин диапазонун тандап алдык, алгач магнит талаалары айнек капиллярлардын ичиндеги, андан кийин тирүү аба жолдорундагы MP кыймылына кандай таасир этерин түшүнүү үчүн. бетинде. МПлардын өлчөмү 0,25тен 18 мкмге чейин жана ар кандай материалдардан жасалган (1-таблицаны караңыз), бирок ар бир үлгүнүн курамы, анын ичинде МПнын ичиндеги магниттик бөлүкчөлөрдүн өлчөмү белгисиз. Биздин кеңири MCT изилдөөлөрүбүзгө 19, 20, 21, 23, 24 таянып, биз 5 мкм сыяктуу кичинекей МПларды трахеянын аба жолдорунун бетинде көрүүгө болот деп күтөбүз, мисалы, МПнын кыймылынын жакшыраак көрүнүүсүн көрүү үчүн удаалаш кадрларды кемитүү менен. Бир 0,25 мкм өлчөмүндөгү МП сүрөт тартуучу түзмөктүн чечилишинен кичине, бирок PB-PCXI алардын көлөмдүк контрастын жана алар чөккөндөн кийин чөккөн беттик суюктуктун кыймылын аныктайт деп күтүлүүдө.
1-таблицадагы ар бир MP үчүн үлгүлөр ички диаметри 0,63 мм болгон 20 мкл айнек капиллярларда (Drummond Microcaps, PA, АКШ) даярдалган. Корпускулярдык бөлүкчөлөр сууда, ал эми CombiMag бөлүкчөлөрү өндүрүүчүнүн менчик суюктугунда бар. Ар бир түтүк суюктук менен жарымына чейин толтурулган (болжол менен 11 мкл) жана үлгү кармагычка коюлган (1-сүрөттү караңыз). Айнек капиллярлар сүрөткө тартуу кутучасындагы үлгү баскычына горизонталдуу жайгаштырылып, суюктуктун четтерин жайгаштырган. Диаметри 19 мм (узундугу 28 мм) никель кабыгындагы сейрек кездешүүчү жер неодимий темир бор (NdFeB) магнити (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) сүрөткө тартуу учурунда анын абалын алыстан өзгөртүү үчүн өзүнчө которуу баскычына бекитилген. Рентген сүрөтүн алуу магнит үлгүдөн болжол менен 30 мм жогору жайгашканда башталат жана сүрөттөр секундасына 4 кадр ылдамдыгында алынат. Сүрөткө тартуу учурунда магнит жакын келтирилген айнек капиллярдык түтүктү (болжол менен 1 мм алыстыкта), андан кийин талаанын күчүнүн жана абалынын таасирин баалоо үчүн түтүк боюнча которулат.
xy үлгүсүн которуу этабындагы айнек капиллярларындагы MP үлгүлөрүн камтыган in vitro сүрөткө тартуу түзүлүшү. Рентген нурунун жолу кызыл үзүк сызык менен белгиленген.
MPлердин in vitro көрүнүшү аныкталгандан кийин, алардын бир бөлүгү жапайы типтеги ургаачы альбинос Вистар келемиштеринде (~12 жумалык, ~200 г) in vivo сыноодон өткөрүлдү. 0,24 мг/кг медетомидин (Domitor®, Zenoaq, Япония), 3,2 мг/кг мидазолам (Dormicum®, Astellas Pharma, Япония) жана 4 мг/кг буторфанол (Vetorphale®, Meiji Seika) келемиштери Pharma), Япония) аралашмасы менен ич көңдөйүнө сайып наркоздон өткөрүлдү. Наркоздон кийин, алар трахеянын айланасындагы жүндү алып салуу, эндотрахеалдык түтүктү (ET; 16 Ga iv канюлясы, Terumo BCT) киргизүү жана дене температурасын кармап туруу үчүн термикалык баштыкчасы бар атайын жасалган сүрөт тартуучу пластинага чалкасынан жаткыруу менен сүрөт тартуучу пластинага даярдалды. Андан кийин сүрөт тартуучу пластина рентген сүрөтүндө трахеяны горизонталдуу тегиздөө үчүн сүрөт тартуучу кутучадагы үлгүнү которуу этабына бир аз бурч менен бекитилген, 2a-сүрөттө көрсөтүлгөндөй.
(a) SPring-8 сүрөткө тартуу кутучасындагы in vivo сүрөткө тартуу орнотуусунда рентген нурунун жолу кызыл үзүк сызык менен белгиленген.(b,c) Трахеядагы магниттик локализация эки ортогоналдуу орнотулган IP камераны колдонуу менен алыстан жүргүзүлдү. Экрандагы сүрөттүн сол жагында башты кармап турган зым илмеги жана ET түтүгүнүн ичиндеги жеткирүүчү канюляны көрүүгө болот.
100 мкл айнек шприцти колдонгон алыстан башкарылуучу шприц насосу системасы (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) 30 Ga ийнеси аркылуу PE10 түтүгүнө (OD 0.61 мм, ID 0.28 мм) туташтырылган. ET түтүгүн киргизгенде учу трахеяда туура абалда экенине ынануу үчүн түтүктү белгилеңиз. Микронасосту колдонуп, шприцтин поршени түтүктүн учу жеткирилүүчү MP үлгүсүнө чөмүлтүлүп жатканда алынып салынган. Андан кийин жүктөлгөн жеткирүү түтүгү эндотрахеалдык түтүккө салынып, учу биз күткөн колдонулган магнит талаасынын эң күчтүү бөлүгүнө жайгаштырылган. Сүрөттү алуу биздин Arduino негизиндеги убакыт кутучасына туташтырылган дем алуу детектору аркылуу башкарылган жана бардык сигналдар (мисалы, температура, дем алуу, жапкычты ачуу/жабуу жана сүрөттү алуу) Powerlab жана LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) 22 аркылуу жазылып алынган. Сүрөткө тартуу учурунда Корпуска жетүүгө мүмкүн болбогондо, эки IP камера (Panasonic BB-SC382) бири-бирине болжол менен 90° бурчта жайгаштырылган жана колдонулган. сүрөткө тартуу учурунда магниттин трахеяга карата абалын көзөмөлдөө үчүн (2b,c-сүрөт). Кыймыл артефакттарын минималдаштыруу үчүн, ташкындын аягындагы агым платосу учурунда ар бир дем алууда бир сүрөт алынган.
Экинчи баскычка магнит бекитилген, аны сүрөткө тартуу корпусунун сыртынан алыстан жайгаштырууга болот. Магниттин ар кандай позициялары жана конфигурациялары текшерилген, анын ичинде: Трахеядан болжол менен 30° бурчта орнотулган (конфигурациялар 2a жана 3a сүрөттөрүндө көрсөтүлгөн); бир магнит жаныбардын үстүндө, экинчиси төмөндө, уюлдары тартуу үчүн коюлган (3b сүрөт); бир магнит жаныбардын үстүндө, экинчиси төмөндө, уюлдары түртүү үчүн коюлган (3c сүрөт); жана бир магнит трахеянын үстүндө жана ага перпендикуляр (3d сүрөт). Жаныбар жана магнит конфигурациялангандан кийин жана текшериле турган MP шприц насосуна жүктөлгөндөн кийин, сүрөттөрдү алуу менен 50 мкл дозаны 4 мкл/сек ылдамдыкта бериңиз. Андан кийин магнит сүрөттөрдү алуу менен бирге трахея боюнча алдыга жана артка жылдырылат.
In vivo сүрөткө тартуу үчүн магниттин конфигурациясы (а) трахеянын үстүндө болжол менен 30° бурчта жайгашкан бир магнит, (б) тартуу үчүн коюлган эки магнит, (в) түртүү үчүн коюлган эки магнит, (г) трахеянын үстүндө жана ага перпендикуляр жайгашкан бир магнит. Байкоочу ооздон трахея аркылуу өпкөгө карады, рентген нуру келемиштин сол тарабынан өтүп, оң тарабынан чыкты. Магнит дем алуу жолдорунун узундугу боюнча же рентген нурунун багыты боюнча трахеянын үстүндө солго жана оңго жылдырылат.
Ошондой эле, дем алуу жана жүрөктүн кыймылы чаташтырылбаган учурда дем алуу жолдорундагы бөлүкчөлөрдүн көрүнүшүн жана жүрүм-турумун аныктоого аракет кылдык. Ошондуктан, сүрөткө тартуу мезгилинин аягында жаныбарлар пентобарбиталдын ашыкча дозасынан улам адамгерчиликтүү түрдө өлтүрүлгөн (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, АКШ; ~65 мг/кг ip). Айрым жаныбарлар сүрөткө тартуу платформасында калтырылып, дем алуу жана жүрөктүн согушу токтогондон кийин, сүрөткө тартуу процесси кайталанып, дем алуу жолдорунун бетинде MP көрүнбөсө, кошумча MP дозасы кошулган.
Алынган сүрөттөр жалпак жана караңгы талаада оңдолуп, андан кийин MATLAB тилинде жазылган атайын сценарийди (R2020a, The Mathworks) колдонуп, тасмага чогултулган (секундасына 20 кадр; дем алуу ылдамдыгына жараша 15-25 × кадимки ылдамдык).
Бардык сол карынча генинин векторун жеткирүү боюнча изилдөөлөр Аделаида университетинин Лабораториялык жаныбарларды изилдөө борборунда жүргүзүлдү жана SPring-8 экспериментинин жыйынтыктарын магнит талаасынын катышуусунда сол карынча-миллионердик генди жеткирүү in vivo шартында гендин өткөрүлүшүн күчөтө алабы же жокпу, баалоо үчүн колдонууга багытталган. MP жана магнит талаасынын таасирин баалоо үчүн эки топ жаныбарлар дарыланган: бир топко магнит коюлган сол карынча-миллионердик ген берилген, ал эми экинчи топко магнитсиз сол карынча-миллионердик гени бар контролдук топ берилген.
LV ген векторлору мурда сүрөттөлгөн 25, 26 ыкмаларды колдонуу менен түзүлгөн. LacZ вектору MPSV промотору (LV-LacZ) тарабынан башкарылуучу ядролук локалдашкан бета-галактозидаза генин билдирет, ал трансдукцияланган клеткаларда көк реакция продуктуну пайда кылат, ал өпкө тканынын алдыңкы беттеринде жана ткандардын кесилиштеринде көрүнөт. Титрлөө клетка культураларында LacZ позитивдүү клеткаларынын санын гемоцитометр менен кол менен санап, титрди TU/мл менен эсептөө жолу менен жүргүзүлдү. Алып жүрүүчүлөр -80 °C температурада криоконсервацияланат, колдонуудан мурун эритилет жана жеткирүүдөн мурун 1:1 катышында аралаштырып, музда кеминде 30 мүнөт инкубациялоо менен CombiMag менен байланыштырылат.
Кадимки Sprague Dawley келемиштерине (n = 3/топ, ~2-3) 0,4 мг/кг медетомидин (Domitor, Ilium, Австралия) жана 60 мг/кг кетамин (Ilium, Австралия) айлык) ip) инъекциясынын аралашмасы менен ич көңдөйүнө анестезия жасалып, 16 Ga iv канюлясы менен хирургиялык эмес ооз көңдөйүнө канюляция жасалган. Трахеянын дем алуу жолдорунун тканы сол карынчанын трансдукциясын кабыл алышын камсыз кылуу үчүн, ал мурда сүрөттөлгөн механикалык пертурбация протоколун колдонуу менен кондицияланган, анда трахеянын дем алуу жолдорунун бети зым себет менен октук түрдө сүртүлгөн (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, АКШ) 30 с28. Андан кийин сол карынчанын пертурбациясынан болжол менен 10 мүнөт өткөндөн кийин трахеяга сол карынчанын пертурбациясы биологиялык коопсуздук шкафында жүргүзүлгөн.
Бул экспериментте колдонулган магнит талаасы in vivo рентген сүрөткө тартуу изилдөөсүнө окшош түрдө конфигурацияланган, ошол эле магниттер дистилляциялык стент клиптерин колдонуп, трахеянын үстүндө кармалып турган (4-сүрөт). Мурда сүрөттөлгөндөй, гель учу бар пипетка аркылуу трахеяга (n = 3 жаныбар) 50 мкл көлөмдөгү (2 × 25 мкл аликвоттор) LV-MP жеткирилген. Контролдук топко (n = 3 жаныбар) магнит колдонбостон ошол эле LV-MP берилген. Инфузия аяктагандан кийин, канюля ET түтүгүнөн алынып, жаныбар экстубацияланат. Магнит 10 мүнөт ордунда калат, андан кийин ал алынып салынат. Келемиштерге мелоксикамдын (1 мл/кг) тери астына дозасы берилген (Ilium, Австралия), андан кийин 1 мг/кг атипамазол гидрохлоридинин (Antisedan, Zoetis, Австралия) ичегиге сайылышы менен анестезияны жокко чыгаруу жүргүзүлгөн. Келемиштер наркоздон толук айыкканга чейин жылуу кармалып, көзөмөлдө болгон.
Биологиялык коопсуздук шкафындагы LV-MP жеткирүүчү түзүлүш. ET түтүгүнүн ачык боз түстөгү Люэр борбору ооздон чыгып турганын көрүүгө болот жана сүрөттө көрсөтүлгөн пипетканын гель учу ET түтүгү аркылуу трахеяга керектүү тереңдикке киргизилет.
LV-MP дозалоо процедурасынан бир жума өткөндөн кийин, жаныбарлар 100% CO2 ингаляциясы менен адамгерчиликтүү түрдө өлтүрүлдү жана LacZ экспрессиясы биздин стандарттуу X-gal дарылообузду колдонуу менен бааланды. Эндотрахеалдык түтүктү жайгаштыруудан улам келип чыккан механикалык бузулуулар же суюктуктун кармалышы анализге кирбегенин камсыз кылуу үчүн үч эң куйрук кемирчек шакекчелери алынып салынды. Ар бир трахея анализ үчүн эки жарым түзүү үчүн узунунан кесилди жана алар люминалдык бетти көрсөтүү үчүн Minutien ийнеси (Fine Science Tools) колдонулуп, силикон резина камтылган идишке (Sylgard, Dow Inc) орнотулду. Трансдукцияланган клеткалардын таралышы жана схемасы DigiLite камерасы жана TCapture программасы (Tucsen Photonics, Кытай) менен Nikon микроскобун (SMZ1500) колдонуп фронталдык сүрөткө тартуу менен тастыкталды. Сүрөттөр 20 эсе чоңойтуу менен алынды (трахеянын толук туурасы үчүн эң жогорку жөндөөнү кошо алганда), трахеянын бүт узундугу этап-этабы менен сүрөткө тартылып, сүрөттү "тигишке" мүмкүндүк берүү үчүн ар бир сүрөттүн ортосунда жетиштүү дал келүүнү камсыз кылды. Сүрөттөрдөн алынган Андан кийин ар бир трахея тегиз кыймыл алгоритмин колдонуп, Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) программасын колдонуп бирдиктүү курама сүрөткө чогултулган. Ар бир жаныбардын трахеясынын курама сүрөттөрүндөгү LacZ экспрессиясынын аймактары мурда сүрөттөлгөндөй, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 жана Value < 0.7 жөндөөлөрүн колдонуп, автоматташтырылган MATLAB скрипти (R2020a, MathWorks) колдонуу менен сандык жактан аныкталган. Ткандын контурларын издөө менен, ткандын аймагын аныктоо жана трахея тканынын сыртынан жалган аныктоолордун алдын алуу үчүн GIMP v2.10.24 версиясында ар бир курама сүрөт үчүн маска кол менен түзүлгөн. Ар бир жаныбардын бардык курама сүрөттөрүнөн алынган боёлгон аймактар ​​ошол жаныбардын жалпы боёлгон аянтын түзүү үчүн кошулган. Андан кийин боёлгон аянт нормалдаштырылган аянтты түзүү үчүн жалпы маска аянтына бөлүнгөн.
Ар бир трахеяга парафин салынып, 5 мкм кесимдер кесилген. Кесимдер 5 мүнөт бою нейтралдуу тез кызыл түс менен боёлгон жана сүрөттөр Nikon Eclipse E400 микроскобу, DS-Fi3 камерасы жана NIS элементтерин тартуу программасы (5.20.00 версиясы) аркылуу алынган.
Бардык статистикалык анализдер GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) программасында жүргүзүлдү. Статистикалык маанилүүлүк p ≤ 0,05 деп белгиленген. Нормалдуулук Шапиро-Уилк тести аркылуу текшерилген, ал эми LacZ боёосундагы айырмачылыктар жупташпаган t-тесттин жардамы менен бааланган.
1-таблицада сүрөттөлгөн алты MP PCXI колдонуу менен текшерилген жана көрүнүү 2-таблицада сүрөттөлгөн. Эки полистирол MP (MP1 жана MP2; тиешелүүлүгүнө жараша 18 мкм жана 0,25 мкм) PCXI астында көрүнгөн эмес, бирок калган үлгүлөрдү аныктоого мүмкүн болгон (мисалдары 5-сүрөттө көрсөтүлгөн). MP3 жана MP4 (тиешелүүлүгүнө жараша 10-15% Fe3O4; 0,25 мкм жана 0,9 мкм) анча байкалбайт. Сыналган эң кичинекей бөлүкчөлөрдүн айрымдарын камтыганы менен, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) эң айкын болгон. CombiMag продуктусу MP6 аныктоо кыйын. Бардык учурларда, магнитти капиллярга параллель түрдө алдыга жана артка которуу менен MP аныктоо жөндөмүбүз бир топ жогорулаган. Магниттер капиллярдан алыстаганда, бөлүкчөлөр узун жиптер болуп созулган, бирок магниттер жакындап, магнит талаасынын күчү жогорулаган сайын, бөлүкчөлөр капиллярдын үстүнкү бетине карай жылып баратканда бөлүкчө жиптери кыскарган (кошумча S1 ​​видеосун караңыз: MP4), беттин бөлүкчөлөрүнүн тыгыздыгын жогорулатуу. Тескерисинче, магнит капиллярдан алынганда, талаанын күчү төмөндөйт жана MPлер капиллярдын үстүнкү бетинен созулган узун жиптерге айланат (кошумча видео S2:MP4 караңыз). Магнит кыймылдоону токтоткондон кийин, бөлүкчөлөр тең салмактуулук абалына жеткенден кийин кыска убакытка чейин кыймылдай берет. MP капиллярдын үстүнкү бетине карай жана андан алыстаганда, магниттик бөлүкчөлөр, адатта, калдыктарды суюктук аркылуу сүйрөп өтөт.
PCXI астындагы MP көрүнүү деңгээли үлгүлөрдүн ортосунда бир топ айырмаланат.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 жана (d) MP6. Бул жерде көрсөтүлгөн бардык сүрөттөр капиллярдын үстүндө болжол менен 10 мм жайгашкан магнит менен тартылган. Көрүнүп турган чоң тегерекчелер капиллярларда камалып калган аба көбүкчөлөрү болуп саналат, алар фазалык контрасттуу сүрөттүн кара жана ак четтеринин өзгөчөлүктөрүн даана көрсөтүп турат. Кызыл кутучада контрастты күчөтүүчү чоңойтуу камтылган. Бардык сүрөттөрдөгү магнит схемаларынын диаметрлери масштабдуу эмес жана көрсөтүлгөндөн болжол менен 100 эсе чоң экенин эске алыңыз.
Магнит капиллярдын үстүнкү бөлүгү боюнча солго жана оңго жылганда, MP жипчесинин бурчу магнит менен дал келүү үчүн өзгөрөт (6-сүрөттү караңыз), ошону менен магнит талаасынын сызыктарын аныктайт. MP3-5 үчүн, хорда босого бурчуна жеткенден кийин, бөлүкчөлөр капиллярдын үстүнкү бети боюнча сүйрөлөт. Бул көбүнчө MPлердин магнит талаасы эң күчтүү болгон жерге жакын чоңураак топторго топтолушуна алып келет (кошумча видео S3:MP5 караңыз). Бул, айрыкча, капиллярдын учуна жакын сүрөткө тартууда байкалат, бул MPлердин агрегацияланышына жана суюктук-аба интерфейсинде топтолушуна алып келет. MP6дагы MP3-5ке караганда айырмалоо кыйыныраак болгон бөлүкчөлөр магнит капилляр боюнча жылып баратканда сүйрөлгөн эмес, бирок MP жипчелери диссоциацияланып, бөлүкчөлөрдү көрүү талаасында калтырган (кошумча видео S4:MP6 караңыз). Айрым учурларда, магнитти сүрөткө тартуу ордунан алысыраак жылдыруу менен колдонулган магнит талаасы азайганда, калган MPлер жипте калып, тартылуу күчү менен түтүктүн астыңкы бетине акырындык менен түшүп турган (кошумча видео S5: MP3 караңыз).
Магнит капиллярдын үстүнөн оңго жылганда MP жипчесинин бурчу өзгөрөт.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 жана (d) MP6. Кызыл кутучада контрастты күчөтүүчү чоңойтуу бар. Кошумча видеолор маалыматтык экенин эске алыңыз, анткени алар бул статикалык сүрөттөрдө көрсөтүлбөгөн маанилүү бөлүкчөлөрдүн түзүлүшүн жана динамикалык маалыматты ачып берет.
Биздин сыноолор көрсөткөндөй, магнитти трахея боюнча жай алдыга жана артка жылдыруу in vivo татаал кыймыл контекстинде MPди визуализациялоого көмөктөшөт. In vivo сыноо жүргүзүлгөн жок, анткени полистирол мончоктору (MP1 жана MP2) капиллярда көрүнгөн жок. Калган төрт MPнин ар бири магниттин узун огу трахеянын үстүндө вертикалдыкка болжол менен 30° бурчта конфигурацияланган (2b жана 3a сүрөттөрүн караңыз) in vivo сыналган, анткени бул MP чынжырларынын узундугуна алып келген жана магнит конфигурациясы аяктаганга караганда натыйжалуураак болгон. MP3, MP4 жана MP6 тирүү жаныбарлардын трахеясында аныкталган эмес. Жаныбарлар адамгерчилик менен өлтүрүлгөндөн кийин келемиштердин дем алуу жолдору сүрөткө тартылганда, шприц насосу менен кошумча көлөм кошулганда да бөлүкчөлөр көрүнбөй калган. MP5 темир кычкылынын эң жогорку курамына ээ болгон жана жалгыз көрүнгөн бөлүкчө болгон, ошондуктан MPнин in vivo жүрүм-турумун баалоо жана мүнөздөө үчүн колдонулган.
MP жеткирүү учурунда магнитти трахеяга коюу көптөгөн MPлердин көрүү талаасына топтолушуна алып келди, бирок баары эмес. Трахеяга кирген бөлүкчөлөрдү адамгерчилик менен курмандыкка чалынган жаныбарлардан байкаса болот. 7-сүрөт жана кошумча видео S6: MP5 вентральдык трахеянын бетиндеги бөлүкчөлөрдүн тез магниттик кармалышын жана жайгашуусун көрсөтөт, бул MPлерди трахеянын каалаган аймактарына багыттаса болорун көрсөтөт. MP жеткирүүдөн кийин трахея боюнча дисталдык жактан издөө жүргүзгөндө, кээ бир MPлер каринага жакыныраак табылган, бул магнит талаасынын күчү бардык MPлерди чогултуу жана кармап туруу үчүн жетишсиз экенин көрсөтүп турат, анткени алар суюктук процессинде максималдуу магнит талаасынын күчү аймагы аркылуу жеткирилген. Ошого карабастан, төрөттөн кийинки MP концентрациясы сүрөттөлгөн аймактын айланасында жогору болгон, бул көптөгөн MPлер колдонулган магнит талаасынын күчү эң жогорку болгон дем алуу жолдорунун аймактарында калганын көрсөтүп турат.
Жакында эле эвтаназияланган келемиштин трахеясына MP5 киргизилгенге чейинки жана (b) сүрөттөр, магнит сүрөткө тартуу аймагынын үстүндө жайгашкан. Сүрөткө тартылган аймак эки кемирчек шакекчесинин ортосунда жайгашкан. MP жеткирүү алдында дем алуу жолдорунда бир аз суюктук бар. Кызыл кутучада контрастты күчөтүүчү чоңойтуу көрсөтүлгөн. Бул сүрөттөр S6:MP5 кошумча видеосунда көрсөтүлгөн видеодон алынган.
Магниттин трахея боюнча in vivo которулушу MP чынжырынын дем алуу жолдорунун бетиндеги бурчун капиллярларда байкалгандай өзгөртүшүнө алып келди (8-сүрөттү жана S7 кошумча видеосун караңыз: MP5). Бирок, биздин изилдөөдө MPлерди тирүү дем ​​алуу жолдорунун бети боюнча капиллярлардагыдай сүйрөп жүрүүгө мүмкүн болгон жок. Айрым учурларда, магнит солго жана оңго жылган сайын MP чынжыры узарат. Кызыктуусу, биз ошондой эле магнит трахея боюнча узунунан жылганда бөлүкчөлөр тизмеги беттик суюктук катмарынын тереңдигин өзгөрткөндөй көрүнөрүн жана магнит түз жогору көтөрүлгөндө жана бөлүкчөлөр тизмеги вертикалдык абалга айланганда кеңейерин байкадык (S7 кошумча видеосун караңыз). : MP5 0:09да, төмөнкү оң жакта). Магнит трахеянын үстү жагына капталга (башкача айтканда, трахеянын узундугу боюнча эмес, жаныбардын сол же оң жагына) жылдырылганда кыймылдын мүнөздүү схемасы өзгөргөн. Бөлүкчөлөр кыймылдап жатканда дагы эле даана көрүнүп турган, бирок магнит трахеядан алынганда, бөлүкчөлөрдүн тизмектеринин учтары көрүнүп калган (кошумча видео S8:MP5ти караңыз, 0:08ден баштап). Бул айнек капиллярдагы магнит талаасынын астында байкалган MP жүрүм-турумуна дал келет.
Тирүү наркоз берилген келемиштин трахеясындагы MP5ти көрсөткөн үлгү сүрөттөр.(а) Магнит трахеянын үстүндө жана сол жагында сүрөттөрдү алуу үчүн колдонулат, андан кийин (b) магнит оңго жылдырылгандан кийин. Кызыл кутучада контрастты күчөтүүчү чоңойтуу бар. Бул сүрөттөр S7:MP5 кошумча видеосунда көрсөтүлгөн видеодон алынган.
Эки уюл трахеянын үстүндө жана астында түндүк-түштүк багытында конфигурацияланганда (б.а. тартуу; 3b-сүрөт), MP хордалары узунураак көрүнүп, трахеянын дорсалдык бетинде эмес, капталында жайгашкан (S9 кошумча видеосун караңыз: MP5). Бирок, суюктук жеткирилгенден кийин, кош магниттүү түзүлүш колдонулганда, бир жердеги (б.а., трахеянын дорсалдык бетиндеги) бөлүкчөлөрдүн жогорку концентрациясы аныкталган эмес, бул көбүнчө бир магниттүү түзүлүш колдонулганда болот. Андан кийин бир магнит уюлдарды тескери түртүү үчүн конфигурацияланганда (3c-сүрөт), көрүү талаасында көрүнгөн бөлүкчөлөрдүн саны жеткирилгенден кийин көбөйгөн жок. Эки кош магниттүү конфигурациянын тең орнотулушу магниттерди тиешелүү түрдө тарткан же түрткөн жогорку магнит талаасынын күчүнөн улам татаал. Андан кийин орнотмо дем алуу жолуна параллель, бирок дем алуу жолу аркылуу 90 градуста өткөн бир магнитке өзгөртүлдү, ошондуктан талаа сызыктары трахея дубалын ортогоналдуу кесип өттү (3d-сүрөт), бул багыт каптал дубалдагы бөлүкчөлөрдүн агрегациясын байкоого болобу же жокпу, аныктоо үчүн иштелип чыккан. Бирок, бул конфигурацияда MP топтолушунун же магниттин кыймылынын аныкталуучу кыймылы болгон эмес. Ушул жыйынтыктардын баарына таянып, in vivo ген алып жүрүүчү изилдөөлөр үчүн бир магниттүү, 30 градустук багыт конфигурациясы (3a-сүрөт) тандалып алынган.
Жаныбарды адамгерчилик менен өлтүргөндөн кийин дароо кайра-кайра сүрөткө тартканда, ткандардын кыймылынын жоктугу магниттин которулуучу кыймылына ылайык "титиреп" турган тунук интерхондралдык талаада майда жана кыска бөлүкчөлөрдүн сызыктарын көрүүгө мүмкүндүк берген. Ошого карабастан, MP6 бөлүкчөлөрүнүн бар экендигин жана кыймылын дагы эле даана көрө албай жатышат.
LV-LacZ титринин мааниси 1,8 × 108 TU/мл болгон жана CombiMag MP (MP6) менен 1:1 аралаштыруудан кийин, жаныбарларга 9 × 107 TU/мл сол карынчанын транспорт каражатынын 50 мкл трахеалдык дозасы берилген (б.а. 4,5 × 106 TU/келемиш). Бул изилдөөлөрдө, төрөт учурунда магнитти которуунун ордуна, биз сол карынчанын трансдукциясын (а) магнит талаасы жок болгондо вектордук жеткирүүгө салыштырмалуу жакшыртууга болобу жана (б) фокустоого болобу аныктоо үчүн магнитти бир абалга бекиттик. Дем алуу жолдорунун клеткалары жогорку дем алуу жолдорунун магниттик максаттуу аймактарына трансдукцияланат.
Магниттердин болушу жана CombiMagди сол карынчанын векторлору менен айкалыштырып колдонуу жаныбарлардын ден соолугуна терс таасирин тийгизген жок, биздин стандарттуу сол карынчанын векторун жеткирүү протоколубуз сыяктуу эле. Механикалык бузулууга дуушар болгон трахеалдык аймактын фронталдык сүрөттөрү (1-кошумча сүрөт) магнит болгондо сол карынчанын-MP менен дарыланган жаныбарлар тобунда трансдукциянын бир топ жогорку деңгээли бар экенин көрсөттү (9a-сүрөт). Контролдук топто аз гана көлөмдөгү көк LacZ боёгу болгон (9b-сүрөт). Нормалдаштырылган X-Gal боёлгон аймактарды сандык жактан аныктоо магнит талаасынын катышуусунда сол карынчанын-MPди колдонуу болжол менен 6 эсе жакшырганын көрсөттү (9c-сүрөт).
Магнит талаасынын катышуусунда (а) жана магнит жок учурда (б) LV-MP аркылуу трахеалдык трансдукцияны көрсөткөн курама сүрөттөрдүн мисалы.(в) Магнит колдонулганда трахеиянын ичиндеги нормалдаштырылган LacZ трансдукция аймагынын статистикалык жактан маанилүү жакшырышы (*p = 0,029, t-тест, ар бир топ үчүн n = 3, орточо ± SEM).
Нейтралдуу тез кызыл түскө боёлгон кесилиштер (мисалы, 2-кошумча сүрөттө көрсөтүлгөн) мурда кабарлангандай окшош схемада жана жайгашкан жерде LacZ менен боёлгон клеткаларды көрсөттү.
Дем алуу жолдорунун ген терапиясынын негизги көйгөйү ташуучу бөлүкчөлөрдүн кызыкчылык аймактарына так жайгашуусу жана аба агымы жана активдүү былжырды тазалоо учурунда кыймылдуу өпкөдө трансдукциянын жогорку натыйжалуулугуна жетүү бойдон калууда. CF дем алуу жолдорунун оорусун дарылоо үчүн иштелип чыккан сол карынчанын ташуучулары үчүн, ташуучу бөлүкчөлөрдүн өткөрүүчү дем ​​алуу жолдорунда болуу убактысын көбөйтүү ушул кезге чейин кол жеткис максат болуп келген. Кастеллани жана башкалар белгилегендей, трансдукцияны жакшыртуу үчүн магнит талааларын колдонуу электропорация сыяктуу башка генди жеткирүү ыкмаларына салыштырмалуу артыкчылыктарга ээ, анткени ал жөнөкөйлүктү, үнөмдүүлүктү, жеткирүүнүн локализациясын, натыйжалуулукту жогорулатууну жана инкубация убактысын кыскартууну жана, балким, ташуучунун дозасын азайтууну айкалыштыра алат10. Бирок, тышкы магниттик күчтөрдүн таасири астында дем алуу жолдорунда магниттик бөлүкчөлөрдүн in vivo чөкмөсү жана жүрүм-туруму эч качан сүрөттөлгөн эмес, ошондой эле бул ыкманын тирүү дем ​​алуу жолдорунда ген экспрессиясынын деңгээлин жогорулатуу үчүн in vivo мүмкүнчүлүгү көрсөтүлгөн эмес.
Биздин in vitro синхротрондук PCXI эксперименттерибиз көрсөткөндөй, биз сынаган бардык бөлүкчөлөр, полистирол MPден тышкары, биз колдонгон сүрөткө тартуу түзүлүшүндө көрүнүп турган. Магнит талаасынын катышуусунда, MPлер узундугу бөлүкчөнүн түрүнө жана магнит талаасынын күчүнө (б.а. магниттин жакындыгы жана кыймылы) байланыштуу болгон жиптерди түзөт. 10-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, биз байкаган жиптер ар бир өзүнчө бөлүкчөнүн магниттелишинен жана өзүнүн жергиликтүү магнит талаасын индукциялоосунан улам пайда болот. Бул өзүнчө талаалар башка окшош бөлүкчөлөрдүн агрегацияланышына жана туташуусуна алып келет, ал эми башка бөлүкчөлөрдүн жергиликтүү тартылуу жана түртүү күчтөрүнөн улам топтук жип сыяктуу кыймылдар пайда болот.
Суюктукка толгон капиллярлардын ичинде пайда болгон (а, б) бөлүкчөлөрдүн жана абага толгон трахеянын схемасы (с, г) көрсөтүлгөн. Капиллярлар жана трахея масштаб боюнча тартылбаганын эске алыңыз. (а) панелинде ошондой эле жипчелерге тизилген Fe3O4 бөлүкчөлөрүн камтыган MPнин сүрөттөмөсү камтылган.
Магнит капиллярдын үстүнө жылдырылганда, бөлүкчөлөрдүн тизмегинин бурчу Fe3O4 камтыган MP3-5 үчүн критикалык босогого жеткен, андан кийин бөлүкчөлөрдүн тизмеги баштапкы абалында калбай, бети боюнча жаңы абалга жылган. магнит. Бул эффект айнек капиллярдын бети бул кыймылдын жүрүшүнө мүмкүндүк бере тургандай жылмакай болгондуктан пайда болушу мүмкүн. Кызыгы, MP6 (CombiMag) мындай кылган эмес, балким, бөлүкчөлөр кичирээк болгондуктан, ар кандай каптоолорго же беттик заряддарга ээ болгондуктан же менчик ташуучу суюктук алардын кыймылдоо жөндөмүнө таасир эткендиктен. CombiMag бөлүкчөлөрүнүн сүрөт контрасты да алсызыраак, бул суюктуктун жана бөлүкчөлөрдүн тыгыздыгы окшош болушу мүмкүн жана ошондуктан бири-бирине оңой жылбайт дегенди билдирет. Эгерде магнит өтө тез кыймылдаса, бөлүкчөлөр да тыгылып калышы мүмкүн, бул магнит талаасынын күчү суюктуктагы бөлүкчөлөрдүн ортосундагы сүрүлүүнү дайыма эле жеңе албастыгын көрсөтүп турат, бул магнит талаасынын күчү жана магнит менен максаттуу аймактын ортосундагы аралыктын абдан маанилүү экени таң калыштуу эмес экенин көрсөтүп турат. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар ошондой эле магниттер максаттуу аймак аркылуу агып өткөн көптөгөн MPлерди кармай алса да, магниттерге ишенүүгө болбойт дегенди билдирет. CombiMag бөлүкчөлөрүн трахеянын бети боюнча жылдырат. Ошондуктан, биз in vivo LV-MP изилдөөлөрү дем ​​алуу жолдорунун белгилүү бир аймактарын физикалык жактан бутага алуу үчүн статикалык магнит талааларын колдонушу керек деген тыянакка келдик.
Бөлүкчөлөр денеге жеткирилгенде, аларды татаал кыймылдуу дене ткандарынын контекстинде аныктоо кыйын, бирок аларды аныктоо мүмкүнчүлүгү магнитти трахеянын үстүнө горизонталдуу түрдө которуу менен MP жипчелерин "кыймылдатуу" менен жакшыртылган. Түз эфирде сүрөткө тартуу мүмкүн болсо да, жаныбар адамгерчилик менен өлтүрүлгөндөн кийин бөлүкчөлөрдүн кыймылын аныктоо оңой. Магнит сүрөткө тартуу аймагынын үстүнө коюлганда MP концентрациясы бул жерде эң жогорку болгон, бирок кээ бир бөлүкчөлөр көбүнчө трахеянын боюнан табылган. In vitro изилдөөлөрүнөн айырмаланып, бөлүкчөлөрдү магнитти которуу менен трахея боюнча сүйрөөгө болбойт. Бул ачылыш трахеянын бетин каптаган былжырдын дем алуудагы бөлүкчөлөрдү кантип иштетип, аларды былжырда кармап, андан кийин мукоцилиардык тазалоо механизми менен кантип тазаланары менен шайкеш келет.
Биз трахеянын үстүндө жана астында тартылуу үчүн магниттерди колдонуу (3b-сүрөт) бир чекитте жогорку концентрацияланган магнит талаасына караганда бир калыпта магнит талаасын пайда кылышы мүмкүн деген гипотезаны койдук, бул бөлүкчөлөрдүн бирдей бөлүштүрүлүшүнө алып келиши мүмкүн. Бирок, биздин алдын ала изилдөөбүз бул гипотезаны колдогон так далилдерди тапкан жок. Ошо сыяктуу эле, бир жуп магнитти түртүү үчүн конфигурациялоо (3c-сүрөт) сүрөттөлгөн аймакта бөлүкчөлөрдүн көбүрөөк топтолушуна алып келген жок. Бул эки ачылыш кош магниттик орнотуу MP бутага алуунун жергиликтүү башкаруусун олуттуу түрдө жакшыртпай турганын жана натыйжада пайда болгон күчтүү магниттик күчтөрдү конфигурациялоо кыйын экенин көрсөтүп турат, бул ыкманы анча практикалык эмес кылат. Ошо сыяктуу эле, магнитти трахеянын үстүндө жана аркылуу багыттоо (3d-сүрөт) да сүрөттөлгөн аймакта кармалып калган бөлүкчөлөрдүн санын көбөйткөн жок. Бул альтернативдүү конфигурациялардын айрымдары ийгиликтүү болбошу мүмкүн, анткени алар топтолуу аймагындагы магнит талаасынын күчүнүн төмөндөшүнө алып келет. Ошондуктан, бир 30 градустук бурчтуу магниттик конфигурация (3a-сүрөт) in vivo сыноо үчүн эң оңой жана эң натыйжалуу ыкма деп эсептелет.
Сол карынчанын чоң карынчасынын векторлору CombiMag менен айкалышып, магнит талаасынын катышуусунда физикалык козголуудан кийин берилгенде, контролдук топко салыштырмалуу трахеяда трансдукция деңгээли бир кыйла жогорулаганын көрсөткөн. Синхротрондук сүрөткө тартуу изилдөөлөрүнө жана LacZ жыйынтыктарына таянып, магнит талаасы сол карынчаны трахеянын ичинде сактап, өпкөгө терең кирген вектордук бөлүкчөлөрдүн санын азайта алган окшойт. Мындай максаттуу жакшыртуулар берилген титрлерди, максаттан тышкаркы трансдукцияны, сезгенүү жана иммундук терс таасирлерди жана ген алып жүрүүчүлөрдүн чыгымдарын азайтуу менен бирге жогорку натыйжалуулукка алып келиши мүмкүн. Өндүрүүчүнүн айтымында, маанилүүсү, CombiMag башка гендерди өткөрүп берүү ыкмалары, анын ичинде башка вирустук векторлор (мисалы, AAV) жана нуклеин кислоталары менен бирге колдонулушу мүмкүн.