Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana ny CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na hamono ny fomba mifanaraka amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia hampiseho ny tranonkala tsy misy styles sy JavaScript izahay.
Ny fototarazo ampiasaina amin'ny fitsaboana ny aretin'ny havokavoka fibrosis cystika dia tokony hifantoka amin'ny lalan-drivotra mpitondra satria ny fifindran'ny fototarazo amin'ny havokavoka dia tsy mitondra soa ara-pahasalamana. Ny fahombiazan'ny fifindran'ny viriosy dia mifandray mivantana amin'ny fotoana ijanonan'ny fototarazo. Na izany aza, ny ranoka fanaterana toy ny mpitatitra fototarazo dia miparitaka ho azy ao amin'ny alveoli mandritra ny fifohana rivotra, ary ny poti-pahasalamana amin'ny endriny rehetra dia voadio haingana amin'ny alàlan'ny fitaterana mucociliary. Ny fanalavana ny fotoana ijanonan'ny mpitatitra fototarazo ao amin'ny lalan-drivotra dia zava-dehibe saingy sarotra tratrarina. Ny poti-magnetika mifamatotra amin'ny mpitatitra fototarazo izay azo alefa any amin'ny velaran'ny lalan-drivotra dia afaka manatsara ny fikendrena isam-paritra. Noho ny fanamby amin'ny fijerena in vivo, ny fihetsiky ny poti-magnetika kely toy izany eo amin'ny velaran'ny lalan-drivotra eo anatrehan'ny saha magnetika ampiharina dia tsy dia takatra loatra. Ny tanjon'ity fandalinana ity dia ny fampiasana sary synchrotron mba hijerena ny fihetsehan'ny andiana poti-magnetika in vivo ao amin'ny trachea amin'ny voalavo nodidiana mba handinihana ny dinamika sy ny lamina amin'ny fihetsiky ny poti-magnetika tsirairay sy ny poti-be in vivo. Avy eo dia nanombana ihany koa izahay raha toa ka hampitombo ny fahombiazan'ny fifindran'ny fototarazo ao amin'ny trachea voalavo ny fandefasana poti-magnetika lentiviral eo anatrehan'ny saha magnetika. Taratra X Synchrotron Ny sary dia mampiseho ny fihetsiky ny poti-magnetika ao anatin'ny saha magnetika tsy mihetsika sy mihetsika in vitro sy in vivo. Tsy mora tarihina manaraka ny velaran'ny lalan-drivotra velona amin'ny alalan'ny andriamby ny poti-javatra, fa mandritra ny fitaterana, dia mifantoka amin'ny sehatry ny fahitana izay tena matanjaka ny saha magnetika ny poti-javatra. Nitombo avo enina heny ihany koa ny fahombiazan'ny transduction rehefa nalefa teo anatrehan'ny saha magnetika ny poti-magnetika lentiviral. Miaraka amin'izany, ireo valiny ireo dia manondro fa ny poti-magnetika lentiviral sy ny saha magnetika dia mety ho fomba fiasa sarobidy hanatsarana ny fikendrena ny vector génétique sy hampitombo ny haavon'ny transduction amin'ny lalan-drivotra mitarika in vivo.
Ny fibrosis kistikika (CF) dia vokatry ny fiovaovan'ny fototarazo tokana antsoina hoe CF transmembrane conductance regulator (CFTR). Ny proteinina CFTR dia fantsona ion izay hita ao amin'ny sela epithelial maro manerana ny vatana, anisan'izany ny lalan-drivotra mitarika, toerana lehibe mahatonga ny aretina CF. Ny lesoka CFTR dia mitarika fitaterana rano tsy ara-dalàna, mahatonga ny velaran'ny lalan-drivotra ho maina ary mampihena ny halalin'ny sosona ranoka (ASL) amin'ny velaran'ny lalan-drivotra. Izany koa dia manimba ny fahafahan'ny rafitra fitaterana mucociliary (MCT) hanadio ireo poti-javatra sy otrikaretina voafoka avy amin'ny lalan-drivotra. Ny tanjonay dia ny hampivelatra fitsaboana fototarazo lentiviral (LV) mba hanomezana ny dika mitovy marina amin'ny fototarazo CFTR ary hanatsara ny fahasalaman'ny ASL, MCT, ary ny havokavoka, ary hanohy hampivelatra teknolojia vaovao afaka mandrefy ireo masontsivana ireo in vivo1.
Ny vecteur LV dia iray amin'ireo kandidà lehibe indrindra amin'ny fitsaboana ny fototarazon'ny lalan-drivotra CF, indrindra satria afaka mampiditra maharitra ny fototarazo fitsaboana ao amin'ny sela fototra lalan-drivotra (sela fototry ny lalan-drivotra) izy ireo. Zava-dehibe izany satria afaka mamerina ny rano sy ny fanadiovana moka ara-dalàna izy ireo amin'ny alàlan'ny fiovaovana ho sela ety ambonin'ny lalan-drivotra mifandraika amin'ny CF izay nohamarinin'ny fototarazo, ka miteraka tombony mandritra ny androm-piainana. Ny vecteur LV dia tokony hatodika manohitra ny lalan-drivotra mitarika, satria eto no manomboka ny aretin'ny havokavoka CF. Ny fanaterana ny vecteur lalindalina kokoa ao amin'ny havokavoka dia mety hiteraka transduction alveolar, saingy tsy misy tombony ara-pahasalamana amin'ny CF izany. Na izany aza, ny ranoka toy ny mpitondra fototarazo dia mifindra ho azy any amin'ny alveoli rehefa avy mifoka rivotra aorian'ny fiterahana3,4 ary ny poti-panafody dia diovina haingana ao amin'ny lavaka am-bava amin'ny alàlan'ny MCT. Ny fahombiazan'ny transduction LV dia mifandray mivantana amin'ny faharetan'ny fotoana ijanonan'ny vecteur eo akaikin'ny sela kendrena mba hamelana ny fidiran'ny sela - ny "fotoana ipetrahana"5 - izay mora ahena amin'ny alàlan'ny fivezivezen'ny rivotra mahazatra eo amin'ny faritra ary koa ny fisamborana moka poti-javatra mirindra sy ny MCT. Ho an'ny CF, ny fahafahana manalava ny fotoana ipetrahan'ny LV ao anatin'ny lalan-drivotra dia zava-dehibe mba hahazoana transduction avo lenta amin'ity faritra ity, saingy hatreto dia sarotra.
Mba handresena io sakana io, dia manoro hevitra izahay fa ny poti-magnetika LV (MP) dia mety hanampy amin'ny fomba roa mifameno. Voalohany, azo tarihina amin'ny alalan'ny andriamby mankany amin'ny velaran'ny lalan-drivotra izy ireo mba hanatsarana ny fikendrena sy hanampiana ny poti-mpamily fototarazo hipetraka ao amin'ny faritra lalan-drivotra irina; ary ASL) hifindra any amin'ny sosona sela 6. Ny MP dia efa nampiasaina betsaka ho toy ny fitaovana fanaterana fanafody kendrena rehefa mifamatotra amin'ny antikôra, fanafody simika, na molekiola kely hafa izay miraikitra amin'ny fonon'ny sela na mifatotra amin'ny mpandray ny velaran'ny sela mifandraika amin'izany ary miangona any amin'ny toerana misy ny fivontosana eo anatrehan'ny herinaratra statika. Saha Magnetika ho an'ny Fitsaboana Kansera 7. Ny teknika "hyperthermal" hafa dia mikendry ny hanafana ny MP rehefa tratran'ny saha magnetika mihozongozona izy ireo, ka manimba ny sela fivontosana. Ny fitsipiky ny transfection magnetika, izay ampiasana saha magnetika ho toy ny transfection mba hampitomboana ny famindrana ADN amin'ny sela, dia matetika ampiasaina in vitro amin'ny fampiasana karazana vectors tsy viriosy sy viriosy ho an'ny tsipika sela sarotra afindra. Ny fahombiazan'ny LV magnetotransfection dia efa voaporofo, miaraka amin'ny fanaterana in vitro ny LV-MPs amin'ny tsipika sela epithelial bronchial olombelona eo anatrehan'ny saha magnetika statika, izay mampitombo ny fahombiazan'ny transduction amin'ny 186 heny raha oharina amin'ny vector LV irery. Ny LV-MP koa dia nampiharina tamin'ny modely CF in vitro, izay nampitombo ny transduction LV tao amin'ny kolontsaina interface air-liquid tamin'ny 20 heny teo anatrehan'ny sputum CF ny transfection magnetika10. Na izany aza, ny magnetotransfection in vivo amin'ny taova dia tsy dia nahazo fiheverana firy ary nodinihina tamin'ny fandalinana biby vitsivitsy ihany11,12,13,14,15, indrindra fa amin'ny havokavoka16,17. Na izany aza, mazava ny fahafahana manao transfection magnetika amin'ny fitsaboana CF amin'ny havokavoka. Nilaza i Tan et al.(2020) fa "ny fanadihadiana porofon'ny hevitra momba ny fanaterana nanoparticle magnetika mahomby amin'ny havokavoka dia hanokatra lalana ho an'ny paikady fifohana CFTR amin'ny ho avy mba hanatsarana ny vokatra ara-pitsaboana amin'ny marary CF"6.
Sarotra sary an-tsaina sy ianarana ny fihetsiky ny poti-magnetika kely eo amin'ny velaran'ny lalan-drivotra eo anatrehan'ny saha magnetika ampiharina, ary noho izany dia tsy dia takatra loatra. Tao amin'ny fanadihadiana hafa, dia namorona fomba fitiliana X-ray phase-contrast (PB-PCXI) mifototra amin'ny synchrotron-propagation izahay mba hijerena sy handrefesana amin'ny fomba tsy misy fandidiana ny fiovana kely in vivo amin'ny halaliny ASL18 sy ny fihetsiky ny MCT19,20 mba handrefesana mivantana ny hydration amin'ny velaran'ny Lakandranon'ny Gaz ary ampiasaina ho toy ny famantarana mialoha ny fahombiazan'ny fitsaboana. Ho fanampin'izany, ny fomba fanombanana MCT anay dia mampiasa poti-javatra 10–35 µm ny savaivony vita amin'ny alumina na fitaratra misy refractive avo lenta ho marika MCT hita maso amin'ny fampiasana PB-PCXI21. Samy mety amin'ny fijerena karazana poti-javatra isan-karazany ireo teknika roa ireo, anisan'izany ny MP.
Noho ny famaha avo lenta ara-toerana sy ara-potoana, ny teknika famakafakana ASL sy MCT mifototra amin'ny PB-PCXI dia mety tsara amin'ny fandinihana ny dinamika sy ny lamina amin'ny fihetsiky ny singa tokana sy betsaka in vivo mba hanampiana anay hahatakatra sy hanatsara ny teknika fanaterana fototarazo MP. Ny fomba fiasa ampiasainay eto dia avy amin'ny fanadihadianay mampiasa ny SPring-8 BL20B2 beamline, izay nahitanay sary an-tsaina ny fihetsehan'ny tsiranoka manaraka ny fanaterana fatra vector sandoka ao amin'ny lalan-drivotra orona sy havokavoka amin'ny totozy mba hanampiana amin'ny fanazavana ny lamina fanehoana fototarazo tsy mitovy hita tamin'ny fanadihadiana biby mpitondra fototarazo 3,4.
Ny tanjon'ity fandalinana ity dia ny hampiasa ny synchrotron PB-PCXI mba hijerena ny fihetsehan'ny andiana MP ao amin'ny trachea-n'ny voalavo velona. Ireo fandalinana sary PB-PCXI ireo dia natao hitsapana karazana MP, tanjaky ny saha magnetika, ary toerana samihafa mba hamaritana ny fiantraikany amin'ny fihetsehan'ny MP. Nieritreritra izahay fa ny saha magnetika ampiharina avy any ivelany dia hanampy ny MP alefa hijanona na hifindra any amin'ny faritra kendrena. Ireo fandalinana ireo koa dia namela anay hamantatra ny firafitry ny andriamby izay mampitombo ny isan'ny poti-javatra voatahiry ao amin'ny trachea aorian'ny fametrahana azy. Tao amin'ny andiana fandalinana faharoa, dia nikatsaka ny hampiasa ity firafitra tsara indrindra ity izahay mba hampisehoana ny lamina transduction vokatry ny fanaterana LV-MP in vivo mankany amin'ny lalan-drivotran'ny voalavo, mifototra amin'ny fiheverana fa ny fanaterana LV-MP ao anatin'ny sehatry ny fikendrena ny lalan-drivotra dia hiteraka fahombiazan'ny transduction LV tsara kokoa.
Natao araka ny protocole neken'ny Oniversiten'i Adelaide (M-2019-060 sy M-2020-022) sy ny Komitin'ny Etika momba ny Biby Synchrotron SPring-8 ny fanadihadiana rehetra natao tamin'ny biby. Natao araka ny torolàlana ARRIVE ny fanandramana.
Natao tao amin'ny BL20XU beamline tao amin'ny SPring-8 synchrotron any Japon ny fakana sary X-ray rehetra, tamin'ny fampiasana fomba mitovy amin'ny voalaza teo aloha21,22. Raha fintinina, ny boaty fanandramana dia napetraka 245 m miala ny peratra fitahirizana synchrotron. Ny elanelana santionany-mankany amin'ny detector dia ampiasaina amin'ny fandalinana sary poti-javatra ary 0.3 m ho an'ny fandalinana sary in vivo mba hamoronana vokatra mifanohitra dingana. Ny angovon'ny taratra monochromatic 25 keV no nampiasaina. Ny sary dia nalaina tamin'ny fampiasana mpanova X-ray avo lenta (SPring-8 BM3) mifamatotra amin'ny detector sCMOS. Ny mpanova dia mamadika ny taratra X ho hazavana hita maso amin'ny fampiasana scintillator 10 µm matevina (Gd3Al2Ga3O12), izay avy eo alefa any amin'ny sensor sCMOS amin'ny fampiasana tanjona mikroskopika × 10 (NA 0.3). Ny detector sCMOS dia Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japon) miaraka amin'ny haben'ny array Piksela 2048 × 2048 ary haben'ny piksela manta 6.5 × 6.5 µm. Ity fametrahana ity dia miteraka haben'ny piksela isotropika mahomby 0.51 µm ary sehatry ny fijery eo amin'ny 1.1 mm × 1.1 mm eo ho eo. Ny halavan'ny fiparitahana 100 ms no nofidiana mba hampitomboana ny tahan'ny signal-to-noise amin'ny poti-magnetika ao anatiny sy ivelan'ny lalan-drivotra sady mampihena ny fihetsehana ateraky ny fifohana rivotra. Ho an'ny fanadihadiana in vivo, dia napetraka teo amin'ny lalan'ny taratra X ny varavarankely X-ray haingana mba hamerana ny fatran'ny taratra amin'ny alàlan'ny fanakanana ny taratra X-ray eo anelanelan'ny fiparitahana.
Tsy nampiasaina tamin'ny fanadihadiana sary SPring-8 PB-PCXI ny mpitondra LV satria tsy nahazo mari-pahaizana Biosafety Level 2 ny efitrano sary BL20XU. Nifantina karazana MP voafaritra tsara avy amin'ny mpamatsy ara-barotra roa kosa izahay—izay mandrakotra habe, fitaovana, fifantohana vy ary fampiharana isan-karazany—aloha mba hahatakarana ny fiantraikan'ny saha magnetika amin'ny fihetsehan'ny MP ao anatin'ny kapilary fitaratra, ary avy eo ao amin'ny lalan-drivotra velona. eo amin'ny velarana. Ny MP dia miovaova habe manomboka amin'ny 0.25 ka hatramin'ny 18 μm ary vita amin'ny fitaovana isan-karazany (jereo ny Tabilao 1), saingy tsy fantatra ny firafitry ny santionany tsirairay, anisan'izany ny haben'ny poti-andriamby ao anatin'ny MP. Mifototra amin'ny fanadihadiana MCT mivelatra 19, 20, 21, 23, 24, dia antenainay fa ny MP kely toy ny 5 μm dia azo jerena eo amin'ny velaran'ny lalan-drivotra trachea, ohatra amin'ny fanesorana ireo sary mifanesy mba hahitana ny fahitana bebe kokoa ny fihetsehan'ny MP. Ny MP tokana 0.25 μm dia kely kokoa noho ny famaha ny fitaovana fakana sary, saingy antenaina fa hahita ny fifanoheran'ny volume sy ny fihetsehan'ny ranoka eny ambonin'ny velarana izay ametrahana azy ireo aorian'ny fametrahana ny PB-PCXI.
Ny santionany ho an'ny MP tsirairay ao amin'ny Tabilao 1 dia nomanina tao anaty kapilary fitaratra 20 μl (Drummond Microcaps, PA, Etazonia) miaraka amin'ny savaivony anatiny 0.63 mm. Ny poti-javatra ao anaty vatana dia misy ao anaty rano, raha ny poti-javatra CombiMag kosa dia misy ao amin'ny ranoka manokana an'ny mpanamboatra. Ny fantsona tsirairay dia feno ranoka antsasany (eo amin'ny 11 μl eo ho eo) ary apetraka eo amin'ny fitoeran'ny santionany (jereo ny Sary 1). Ny kapilary fitaratra dia napetraka mitsivalana eo amin'ny sehatra santionany ao amin'ny boaty sary, tsirairay avy, ary napetraka ny sisin'ny ranoka. Magnetika 19 mm ny savaivony (28 mm ny lavany) vita amin'ny akorandriaka nikela tsy fahita firy (neodymium iron boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Aostralia) miaraka amin'ny magnetization sisa tavela 1.17 Tesla dia napetaka tamin'ny sehatra fandikan-teny misaraka mba hahazoana ny fanovana ny toerany lavitra mandritra ny fakana sary. Manomboka ny fakana sary X-ray rehefa apetraka eo amin'ny 30 mm eo ho eo ambonin'ny santionany ny andriamby, ary ny sary dia alaina amin'ny tahan'ny 4 frames isan-tsegondra. Mandritra ny fakana sary, ny andriamby dia nentina akaikin'ny fantsona kapilary fitaratra. (eo amin'ny 1 mm eo ho eo) ary avy eo dia afindra manaraka ny fantsona mba hanombanana ny vokatry ny tanjaky ny saha sy ny toerana misy azy.
Fametrahana sary in vitro misy santionany MP ao anaty kapilary fitaratra eo amin'ny dingana fandikana xy. Ny lalan'ny taratra X dia voamarika amin'ny tsipika mena tapaka.
Rehefa voafaritra ny fahitana in vitro an'ireo MP, dia notsapaina in vivo tamin'ny voalavo Wistar vavy albino karazana voajanahary (~12 herinandro, ~200 g) ny ampahany amin'izy ireo. 0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japon), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japon) ary 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) ny voalavo. Nomena fanatoranana tamin'ny alalan'ny tsindrona intraperitoneal izy ireo. Taorian'ny fanatoranana, dia nomanina ho an'ny fakana sary izy ireo tamin'ny fanesorana ny volo manodidina ny trachea, ny fampidirana fantsona endotracheal (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) ary ny fametrahana azy ireo mandry eo amin'ny takelaka fakana sary namboarina manokana misy kitapo mafana mba hihazonana ny hafanan'ny vatana 22. Avy eo dia napetaka tamin'ny dingana fandikana santionany tao anaty boaty fakana sary tamin'ny zoro kely mba hampifanaraka ny trachea mitsivalana amin'ny sary X-ray, araka ny aseho amin'ny Sary 2a.
(a) Fametrahana sary in vivo ao amin'ny boaty sary SPring-8, ny lalan'ny taratra X dia asiana tsipika mena tapaka. (b,c) Ny toerana misy ny andriamby eo amin'ny trachea dia natao lavitra tamin'ny fampiasana fakantsary IP roa napetraka orthogonally. Eo amin'ny ilany havia amin'ny sary amin'ny efijery, dia hita ny tadivavarana tariby mihazona ny loha, ary ny cannula fanaterana dia eo amin'ny toerany ao anatin'ny fantsona ET.
Rafitra paompy syringe fehezin'ny lavitra (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mampiasa syringe fitaratra 100 μl no nampifandraisina tamin'ny fantsona PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) tamin'ny alalan'ny fanjaitra 30 Ga. Asio marika ny fantsona mba hahazoana antoka fa eo amin'ny toerana marina ao amin'ny trachea ny tendrony rehefa ampidirina ny fantsona ET. Amin'ny fampiasana paompy bitika, dia nesorina ny plunger syringe raha mbola natsoboka tao anaty santionany MP ny tendron'ny fantsona. Avy eo dia nampidirina tao amin'ny fantsona endotracheal ny fantsona fanaterana feno, nametraka ny tendrony tao anatin'ny faritra matanjaka indrindra amin'ny saha magnetika andrasana. Ny fakana sary dia nofehezina tamin'ny fampiasana fitaovana mpitsikilo respiration mifandray amin'ny boaty fotoana Arduino, ary ny famantarana rehetra (ohatra ny mari-pana, ny respiration, ny fisokafana/fanakatonana ny varavarankely ary ny fakana sary) dia noraketina tamin'ny fampiasana Powerlab sy LabChart (AD Instruments, Sydney, Aostralia) 22. Rehefa naka sary Rehefa tsy azo idirana ny fonony, dia napetraka teo amin'ny 90° eo ho eo ny fakantsary IP roa (Panasonic BB-SC382) ary nampiasaina hanaraha-maso ny toerana. ny andriamby mifandraika amin'ny trachea mandritra ny fakana sary (Sary 2b, c). Mba hampihenana ny fiantraikan'ny fihetsehana, sary iray no nalaina isaky ny fofonaina nandritra ny fiakaran'ny rano amin'ny faran'ny ranomasina.
Misy andriamby miraikitra amin'ny dingana faharoa izay azo apetraka lavitra avy any ivelan'ny fonosan'ny sary. Notsapaina ny toerana sy ny firafitry ny andriamby isan-karazany, anisan'izany: Napetraka amin'ny zoro eo amin'ny 30° eo ho eo ambonin'ny trachea (firafitra aseho amin'ny Sary 2a sy 3a); andriamby iray ambonin'ny biby ary ny iray etsy ambany, miaraka amin'ny tsato-kazo napetraka mba hisarihana (Sary 3b); andriamby iray ambonin'ny biby ary ny iray etsy ambany, miaraka amin'ny tsato-kazo napetraka mba handroaka (Sary 3c); ary andriamby iray eo amboniny sy mifanitsy amin'ny trachea (Sary 3d). Rehefa voalamina ny biby sy ny andriamby ary ampidirina ao anaty paompy fanindronana ny MP hotsapaina, dia asio fatra 50 μl amin'ny tahan'ny 4 μl/segondra sady maka sary. Avy eo dia ahetsiketsika mandroso sy miverina manaraka na amin'ny ilany manerana ny trachea ny andriamby sady manohy maka sary.
Firafitry ny andriamby ho an'ny fakana sary in vivo (a) andriamby tokana eo ambonin'ny trachea amin'ny zoro 30° eo ho eo, (b) andriamby roa napetraka mba hisarika, (c) andriamby roa napetraka mba handroaka, (d) andriamby tokana eo ambonin'ny trachea sy mahitsy. Nijery avy any am-bava mankany amin'ny havokavoka tamin'ny alalan'ny trachea ny mpandinika, ary nandalo ny ilany havia amin'ny voalavo ny taratra X ary nivoaka ny ilany havanana. Na mihetsika manaraka ny lalan-drivotra na miankavia sy miankavanana eo ambonin'ny trachea ny andriamby amin'ny lalana alehan'ny taratra X.
Nikatsaka ny hamantatra ny fahitana sy ny fihetsiky ny poti-javatra ao amin'ny lalan-drivotra ihany koa izahay raha tsy misy fifohana rivotra sy fihetsehan'ny fo manelingelina. Noho izany, tamin'ny faran'ny vanim-potoana fakana sary, dia novonoina tamim-pahaiza-miaina ny biby noho ny overdose pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Etazonia; ~65 mg/kg ip). Nisy biby navela teo amin'ny sehatra fakana sary, ary rehefa nijanona ny fifohana rivotra sy ny fitempon'ny fo, dia naverina ny dingana fakana sary, nanampy fatra MP fanampiny raha tsy nisy MP hita teo amin'ny lalan-drivotra.
Nohavaozina tamin'ny lafiny fisaka sy ny lafiny maizina ireo sary azo, ary avy eo dia natambatra ho sarimihetsika (20 frames isan-tsegondra; 15-25 × hafainganam-pandeha ara-dalàna miankina amin'ny tahan'ny fifohana rivotra) tamin'ny fampiasana script namboarina nosoratana tao amin'ny MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Natao tao amin'ny Laboratoara Fikarohana Biby ao amin'ny Oniversiten'i Adelaide ny fanadihadiana rehetra momba ny fanaterana fototarazo LV ary nikendry ny hampiasa ny vokatry ny andrana SPring-8 mba hanombanana raha toa ka afaka manatsara ny famindrana fototarazo in vivo ny fanaterana LV-MP eo anatrehan'ny saha magnetika. Mba hanombanana ny vokatry ny MP sy ny saha magnetika, dia vondrona biby roa no notsaboina: ny vondrona iray dia nomena LV-MP misy andriamby napetraka, ary ny vondrona iray kosa dia nahazo vondrona fanaraha-maso misy LV-MP tsy misy andriamby.
Noforonina tamin'ny alalan'ny fomba voalaza teo aloha 25, 26 ireo vecteur génée LV. Ny vecteur LacZ dia maneho ny génée beta-galactosidase eo an-toerana ao amin'ny nokleary tarihin'ny mpanentana MPSV (LV-LacZ), izay mamokatra vokatra fihetsika manga ao amin'ny sela nafindra, hita maso eo amin'ny sisin'ny sela ao amin'ny havokavoka sy ny fizarana sela. Natao tao amin'ny kolontsaina sela ny titration tamin'ny fanisana tanana ny isan'ny sela LacZ positive tamin'ny alalan'ny hemocytometer mba hikajiana ny titer amin'ny TU/ml. Tehirizina ao anaty vata fampangatsiahana amin'ny -80 °C ireo mpitatitra, atsoboka alohan'ny hampiasana azy, ary afatotra amin'ny CombiMag amin'ny alalan'ny fampifangaroana amin'ny tahan'ny 1:1 ary ampidirina ao anaty ranomandry mandritra ny 30 minitra farafahakeliny alohan'ny hanaterana azy.
Voalavo Sprague Dawley ara-dalàna (n = 3/vondrona, ~2-3 no nodidiana tamin'ny alalan'ny tsindrona medetomidine 0.4 mg/kg (Domitor, Ilium, Aostralia) sy ketamine (Ilium, Aostralia) 60 mg/kg (ip) ary cannulation am-bava tsy misy fandidiana miaraka amin'ny cannula 16 Ga iv. Mba hahazoana antoka fa mahazo transduction LV ny sela lalan-drivotra trachea, dia nokarakaraina tamin'ny fampiasana ny protocole perturbation mekanika voalaza teo aloha izany, izay nikosehana ny velaran'ny lalan-drivotra trachea tamin'ny alalan'ny harona tariby (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Etazonia) 30 s28. Ny fampidirana ny LV-MP amin'ny trachea dia natao tao anaty kabinetra fiarovana biolojika tokony ho 10 minitra taorian'ny perturbation.
Ny saha magnetika nampiasaina tamin'ity andrana ity dia namboarina tamin'ny fomba mitovy amin'ny fandalinana sary X-ray in vivo, miaraka amin'ireo andriamby mitovy amin'izany nohazonina teo ambonin'ny trachea tamin'ny alàlan'ny clip stent distillation (Sary 4). LV-MP 50 μl (2 × 25 μl aliquots) no nampidirina tao amin'ny trachea (n = biby 3) tamin'ny alàlan'ny pipette misy tendron'ny gel araka ny voalaza teo aloha. Ny vondrona fanaraha-maso (n = biby 3) dia nahazo LV-MP mitovy tsy nampiasa andriamby. Rehefa vita ny fampidirana, dia esorina amin'ny fantsona ET ny cannula ary esorina ny biby. Mijanona eo amin'ny toerany mandritra ny 10 minitra ny andriamby, avy eo dia esorina. Ny voalavo dia nahazo fatra meloxicam (1 ml/kg) ambanin'ny hoditra (Ilium, Aostralia) arahin'ny famerenana ny fanatoranana amin'ny alàlan'ny tsindrona ip 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Aostralia). Ny voalavo dia nohazonina ho mafana ary narahi-maso mandra-pahasitrana tanteraka tamin'ny fanatoranana.
Fitaovana fanaterana LV-MP ao anaty kabinetra fiarovana biolojika. Hita mivoaka avy ao am-bava ny foibe Luer volondavenona mazava amin'ny fantsona ET ary ny tendron'ny gel amin'ny pipette aseho amin'ny sary dia ampidirina amin'ny alàlan'ny fantsona ET hatrany amin'ny halaliny irina ao amin'ny trachea.
Herinandro taorian'ny fomba fampidirana LV-MP, dia novonoina tamin'ny fomba maha-olombelona ireo biby tamin'ny alalan'ny fifohana CO2 100% ary nojerena ny fanehoana LacZ tamin'ny alalan'ny fitsaboana X-gal mahazatra anay. Nesorina ireo peratra telo amin'ny taolan-damosina indrindra mba hahazoana antoka fa tsy tafiditra ao anatin'ny fanadihadiana ny fahasimbana mekanika na ny fitazonana rano avy amin'ny fametrahana fantsona endotracheal. Notapahina lava ny trachea tsirairay mba hamoronana tapany roa ho an'ny fanadihadiana, ary napetraka tao anaty lovia misy fingotra silikônina (Sylgard, Dow Inc) izy ireo tamin'ny fampiasana fanjaitra Minutien (Fine Science Tools) mba hijerena ny velaran'ny luminal. Ny fizarana sy ny lamina amin'ny sela nafindra dia nohamafisina tamin'ny alalan'ny fakana sary eo anoloana mampiasa mikroskopia Nikon (SMZ1500) miaraka amin'ny fakantsary DigiLite sy rindrambaiko TCapture (Tucsen Photonics, Sina). Nalaina tamin'ny fampitomboana 20x ny sary (anisan'izany ny fametrahana avo indrindra ho an'ny sakany feno amin'ny trachea), ary ny halavan'ny trachea manontolo dia nalaina sary tsikelikely, mba hahazoana antoka fa ampy ny fifanindriana eo amin'ny sary tsirairay mba ahafahana "manjaitra" ny sary. Ny sary avy amin'ny trachea tsirairay dia avy eo dia natambatra ho sary mitambatra tokana tamin'ny alàlan'ny Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) mampiasa algorithm fihetsehana planar. Ny faritra fanehoana LacZ amin'ny sary mitambatra amin'ny trachea avy amin'ny biby tsirairay dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny script MATLAB mandeha ho azy (R2020a, MathWorks) araka ny voalaza teo aloha, tamin'ny fampiasana fikirana 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, ary Value < 0.7. Tamin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny endriky ny sela, dia noforonina tanana tao amin'ny GIMP v2.10.24 ny saron-tava ho an'ny sary mitambatra tsirairay mba hamantarana ny faritra misy ny sela sy hisorohana ny fahitana diso avy any ivelan'ny sela trachea. Ny faritra voaloko avy amin'ny sary mitambatra rehetra avy amin'ny biby tsirairay dia natambatra mba hamoronana ny faritra voaloko manontolo ho an'io biby io. Ny faritra voaloko dia nozaraina tamin'ny velaran'ny saron-tava manontolo mba hamoronana ny faritra voalamina.
Natsofoka tao anaty paraffine ny trachea tsirairay ary notapatapahina ny fizarana 5 μm. Nolokoina tamin'ny loko mena tsy miandany nandritra ny 5 minitra ireo fizarana ary nalaina tamin'ny alalan'ny mikraoskaopy Nikon Eclipse E400, fakantsary DS-Fi3 ary rindrambaiko fakana singa NIS (version 5.20.00) ny sary.
Natao tao amin'ny GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) avokoa ny fanadihadiana statistika rehetra. Napetraka tamin'ny p ≤ 0.05 ny lanjan'ny statistika. Nohamarinina tamin'ny fampiasana ny fitsapana Shapiro-Wilk ny ara-dalàna, ary notombanana tamin'ny fampiasana ny fitsapana-t tsy misy tsiroaroa ny fahasamihafan'ny fandokoana LacZ.
Nodinihina tamin'ny fampiasana PCXI ireo MP enina voalaza ao amin'ny Tabilao 1, ary voalaza ao amin'ny Tabilao 2 ny fahitana azy. Tsy hita maso teo ambanin'ny PCXI ny MP polystyrene roa (MP1 sy MP2; 18 μm sy 0.25 μm, tsirairay avy), fa azo fantarina kosa ny ambin'ireo santionany (aseho amin'ny Sary 5 ny ohatra). Hita maso kely ny MP3 sy MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm sy 0.9 μm, tsirairay avy). Na dia misy ny sasany amin'ireo poti-javatra kely indrindra nosedraina aza, ny MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) no tena niharihary indrindra. Sarotra hita ny vokatra CombiMag MP6. Amin'ny tranga rehetra, nihatsara be ny fahafahantsika mamantatra ny MP tamin'ny fandikana ny andriamby mandroso sy miverina mifanitsy amin'ny kapilary. Rehefa nifindra niala tamin'ny kapilary ireo andriamby, dia niitatra tamin'ny tady lava ireo poti-javatra, saingy rehefa nanakaiky kokoa ireo andriamby ary nitombo ny tanjaky ny saha andriamby, dia nihafohy ireo tady poti-javatra rehefa nifindra monina nankeo amin'ny velaran'ny kapilary ireo poti-javatra (jereo ny Lahatsary Fanampiny S1: MP4), izay nitombo. hakitroky ny poti-javatra amin'ny velarana. Mifanohitra amin'izany, rehefa esorina amin'ny kapilary ny andriamby, dia mihena ny tanjaky ny saha ary miova ho kofehy lava mivelatra avy amin'ny velarana ambony amin'ny kapilary ny MP (jereo ny Lahatsary Fanampiny S2:MP4). Rehefa mijanona tsy mihetsika ny andriamby, dia manohy mihetsika vetivety ireo poti-javatra rehefa tonga amin'ny toerana misy ny fifandanjana. Rehefa mihetsika mankany sy miala amin'ny velarana ambony amin'ny kapilary ny MP, dia mazàna misintona ny poti-javatra amin'ny alalan'ny ranoka ireo poti-andriamby.
Miovaova be ny fahitana ny MP eo ambanin'ny PCXI arakaraka ny santionany. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ary (d) MP6. Ny sary rehetra aseho eto dia nalaina tamin'ny andriamby eo amin'ny 10 mm eo ho eo ambonin'ny kapilary. Ireo faribolana lehibe miharihary dia fiboiboika rivotra voafandrika ao amin'ny kapilary, izay mampiseho mazava tsara ny endriky ny sisiny mainty sy fotsy amin'ny sary mifanohitra amin'ny dingana. Ny boaty mena dia misy ny fampitomboana ny fifanoherana. Mariho fa ny savaivon'ny kisarisary andriamby amin'ny sary rehetra dia tsy araka ny refy ary lehibe kokoa in-100 eo ho eo noho ny aseho.
Rehefa afindra miankavia sy miankavanana manaraka ny tampon'ny kapilary ny andriamby, dia miova ny zoron'ny tady MP mba hifanaraka amin'ny andriamby (jereo ny Sary 6), ka mamaritra ny tsipika misy ny saha magnetika. Ho an'ny MP3-5, rehefa tonga amin'ny zoro tokonam-baravarana ny akora, dia tarihina manaraka ny tampony amin'ny kapilary ny poti-javatra. Matetika izany dia miteraka fivondronan'ny MP ho vondrona lehibe kokoa akaikin'ny toerana matanjaka indrindra amin'ny saha magnetika (jereo ny Lahatsary Fanampiny S3:MP5). Hita miharihary ihany koa izany rehefa maka sary akaikin'ny faran'ny kapilary, izay mahatonga ny MP hiangona sy hifantoka amin'ny fifandraisan'ny ranoka sy ny rivotra. Ny poti-javatra ao amin'ny MP6, izay sarotra kokoa ny mamantatra azy noho ny MP3-5, dia tsy notarihina rehefa nihetsika nanaraka ny kapilary ny andriamby, fa nisaraka ny tady MP, ka namela ny poti-javatra teo amin'ny sehatry ny fahitana (jereo ny Lahatsary Fanampiny S4:MP6). Indraindray, rehefa nihena ny saha magnetika nampiharina tamin'ny famindrana ny andriamby lavitra be avy amin'ny toerana fakana sary, dia nidina moramora tany amin'ny farany ambanin'ny fantsona noho ny hery misintona ny MP sisa tavela raha mbola nijanona tao anaty tady (jereo ny Lahatsary Fanampiny S5: MP3).
Miova ny zoron'ny tady MP rehefa afindra miankavanana eo ambonin'ny kapila ny andriamby. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ary (d) MP6. Ny boaty mena dia misy ny fampitomboana ny fifanoherana. Mariho fa ireo horonan-tsary fanampiny dia manome fampahalalana satria mampiseho rafitra poti-javatra manan-danja sy fampahalalana dinamika izay tsy azo jerena amin'ireo sary tsy mihetsika ireo.
Nasehon'ny fitsapana nataonay fa ny fanetsehana miadana ny andriamby mandroso sy miverina manaraka ny trachea dia manamora ny fijerena ny MP amin'ny toe-javatra misy fihetsehana sarotra in vivo. Tsy natao ny fitsapana in vivo satria tsy hita maso tao amin'ny kapila ny vakana polystyrene (MP1 sy MP2). Ny tsirairay amin'ireo MP efatra sisa dia notsapaina in vivo niaraka tamin'ny axe lava andriamby napetraka teo ambonin'ny trachea tamin'ny zoro 30° eo ho eo ka hatramin'ny mitsangana (jereo ny Sary 2b sy 3a), satria izany dia nahatonga rojo MP lava kokoa ary nahomby kokoa noho ny famaranana ny endriky ny andriamby. Tsy hita tao amin'ny trachean'ny biby velona ny MP3, MP4 ary MP6. Rehefa nalaina sary ny lalan-drivotran'ny voalavo taorian'ny namonoana ireo biby tamin'ny fomba maha-olombelona, ​​dia nijanona tsy hita maso ireo poti-javatra na dia nampiana volume fanampiny aza tamin'ny fampiasana paompy fanindronana. Ny MP5 no nanana ny votoatin'ny oksida vy avo indrindra ary io no poti-javatra hita maso tokana, ary noho izany dia nampiasaina hanombanana sy hanavahana ny fitondran-tenan'ny MP in vivo.
Ny fametrahana ny andriamby teo ambonin'ny trachea nandritra ny fanaterana MP dia nahatonga ny MP maro, fa tsy ny rehetra, ho tafangona teo amin'ny sehatry ny fahitana. Ny poti-javatra miditra ao amin'ny trachea dia hita tsara indrindra amin'ny biby natao sorona. Sary 7 sy Lahatsary Fanampiny S6: Ny MP5 dia mampiseho ny fisamborana sy ny fampifanarahana andriamby haingana ny poti-javatra eo amin'ny velaran'ny trachea ventral, izay manondro fa ny MP dia azo alefa any amin'ny faritra irina ao amin'ny trachea. Rehefa nikaroka lavitra kokoa teo amin'ny trachea taorian'ny fanaterana MP, dia hita fa akaiky kokoa ny carina ny MP sasany, izay manondro fa tsy ampy ny tanjaky ny saha andriamby hanangonana sy hitazonana ny MP rehetra, satria nalefa tamin'ny alàlan'ny faritra misy tanjaky ny saha andriamby ambony indrindra izy ireo nandritra ny fizotran'ny ranoka. Na izany aza, ny fifantohana MP postpartum dia ambony kokoa manodidina ny faritra sary, izay manondro fa ny MP maro dia nijanona tao amin'ny faritra lalan-drivotra izay avo indrindra ny tanjaky ny saha andriamby ampiharina.
Sary avy amin'ny (a) taloha sy (b) taorian'ny nandefasana ny MP5 tao amin'ny trachea an'ny voalavo vao novonoina miaraka amin'ny andriamby napetraka mivantana eo ambonin'ny faritra fakana sary. Ny faritra fakana sary dia eo anelanelan'ny peratra taola-malemy roa. Alohan'ny nandefasana ny MP, misy ranoka ao amin'ny lalan-drivotra. Ny boaty mena dia misy ny fampitomboana ny fifanoherana. Ireo sary ireo dia avy amin'ny lahatsary aseho ao amin'ny Lahatsary Fanampiny S6:MP5.
Ny famindrana ny andriamby manaraka ny trachea in vivo dia nahatonga ny rojo MP hanova ny zoro ao anatin'ny velaran'ny lalan-drivotra amin'ny fomba mitovy amin'ny hita ao amin'ny kapilary (jereo ny Sary 8 sy ny Lahatsary Fanampiny S7:MP5). Na izany aza, tao amin'ny fanadihadianay, ny MP dia tsy azo notaritaritina nanaraka ny velaran'ny lalan-drivotra velona toy ny tamin'ny kapilary. Amin'ny tranga sasany, ny rojo MP dia hihalava rehefa mihetsika miankavia sy miankavanana ny andriamby. Mahaliana fa hitanay ihany koa fa toa manova ny halalin'ny sosona ranon-javatra eny ambonin'ny tany ny tady poti rehefa mihetsika lava manaraka ny trachea ny andriamby, ary mivelatra rehefa mihetsika mivantana eo ambonin'ny lohany ny andriamby ary mihodina amin'ny toerana mitsangana ny tady poti (jereo ny Lahatsary Fanampiny S7). : MP5 amin'ny 0:09, ambany havanana). Niova ny lamina mampiavaka ny fihetsehana rehefa nafindra teny amin'ny tampon'ny trachea ny andriamby (izany hoe, miankavia na miankavanana amin'ny biby fa tsy manaraka ny halavan'ny trachea). Mbola hita mazava tsara ireo poti-javatra rehefa nihetsika izy ireo, saingy rehefa nesorina tamin'ny trachea ny andriamby, dia nanjary hita ny tendron'ny tady poti-javatra (jereo ny Lahatsary Fanampiny S8:MP5, manomboka amin'ny 0:08). Mifanaraka amin'ny fihetsiky ny MP izay hitanay teo ambanin'ny saha andriamby ampiharina ao anaty kapilary fitaratra izany.
Sary ohatra mampiseho ny MP5 ao amin'ny trachea-n'ny voalavo velona nodidiana. (a) Ampiasaina hahazoana sary eo ambony sy eo ankavian'ny trachea ny andriamby, avy eo (b) rehefa avy afindra miankavanana ny andriamby. Ny boaty mena dia misy ny fampitomboana ny fifanoherana. Ireo sary ireo dia avy amin'ny lahatsary aseho ao amin'ny Lahatsary Fanampiny S7:MP5.
Rehefa natsangana tamin'ny fironana avaratra-atsimo teo ambonin'ny sy teo ambanin'ny trachea (ohatra, manintona; Sary 3b) ireo tsato-kazo roa, dia niseho lava kokoa ireo akora MP ary hita teo amin'ny rindrin'ny trachea fa tsy teo amin'ny velaran'ny trachea dorsal (jereo ny Lahatsary Fanampiny S9:MP5). Na izany aza, ny fifantohana avo lenta amin'ny poti-javatra amin'ny toerana tokana (ohatra, ny velaran'ny trachea dorsal) dia tsy hita taorian'ny fanaterana ranoka rehefa nampiasaina fitaovana andriamby roa, izay matetika mitranga rehefa ampiasaina fitaovana andriamby tokana. Avy eo, rehefa natsangana ny andriamby iray mba handroaka ireo tsato-kazo nivadika (Sary 3c), dia toa tsy nitombo ny isan'ny poti-javatra hita maso eo amin'ny sehatry ny fahitana taorian'ny fanaterana. Sarotra ny fametrahana ny fametrahana ny fametrahana andriamby roa noho ny tanjaky ny saha andriamby avo izay misintona na manosika ireo andriamby. Avy eo dia novaina ho andriamby tokana mifanitsy amin'ny lalan-drivotra ny fametrahana saingy mandalo amin'ny lalan-drivotra amin'ny 90 degre mba hahafahan'ny tsipika saha miampita ny rindrin'ny trachea amin'ny fomba orthogonal (Sary 3d), izay toerana natao hamaritana raha azo jerena ny fitambaran'ny poti-javatra eo amin'ny rindrina ilany. Na izany aza, ao amin'ny tamin'ity firafitra ity, dia tsy nisy fihetsehana azo fantarina momba ny fiangonan'ny MP na ny fihetsehan'ny andriamby. Mifototra amin'ireo valiny rehetra ireo, dia firafitra andriamby tokana, mitongilana 30 degre (Sary 3a) no nofidina ho an'ny fanadihadiana momba ny mpitondra fototarazo in vivo.
Rehefa nalaina sary imbetsaka avy hatrany ilay biby taorian'ny famonoana olona tsy nisy fihetsika maha-olombelona, ​​ny tsy fisian'ny fihetsehan'ny sela mampikorontana dia midika fa azo jerena ao amin'ny saha mazava eo anelanelan'ny chondral ny tsipika manify sy fohy kokoa, "mihozongozona" mifanaraka amin'ny fihetsehan'ny andriamby. Na izany aza, mbola tsy afaka mahita mazava tsara ny fisian'ny sy ny fihetsehan'ny poti-MP6.
Ny titer LV-LacZ dia 1.8 × 108 TU/ml, ary rehefa avy nifangaro tamin'ny CombiMag MP (MP6) tamin'ny tahan'ny 1:1, dia nahazo fatra 50 μl amin'ny trachea 9 × 107 TU/ml LV vehicle (izany hoe 4.5 × 106 TU/voalavo) ireo biby. ). Tao anatin'ireo fanadihadiana ireo, tsy nandika ny andriamby nandritra ny fiterahana izahay, fa nametraka ny andriamby tamin'ny toerana iray mba hamaritana raha azo hatsaraina ny transduction LV (a) raha oharina amin'ny fanaterana vector raha tsy misy saha andriamby, ary (b) azo ifantohana. Ny sela lalan-drivotra dia afindra any amin'ny faritra kendrena andriamby amin'ny lalan-drivotra ambony.
Toa tsy nisy fiantraikany ratsy teo amin'ny fahasalaman'ny biby ny fisian'ny andriamby sy ny fampiasana CombiMag miaraka amin'ny vecteur LV, toy ny protocole fanaterana vecteur LV mahazatra anay. Ny sary eo anoloan'ny faritra trachea iharan'ny fikorontanan'ny mekanika (Sary Fanampiny 1) dia nanondro fa nisy ambaratonga avo kokoa ny transduction tao amin'ny vondron'ny biby notsaboina tamin'ny LV-MP rehefa teo ny andriamby (Sary 9a). Kely dia kely ny fandokoana LacZ manga tao amin'ny vondrona fanaraha-maso (Sary 9b). Ny fandrefesana ny faritra voaloko X-Gal voalamina dia naneho fa ny fampidirana LV-MP teo anatrehan'ny saha andriamby dia niteraka fanatsarana in-6 eo ho eo (Sary 9c).
Ohatra amin'ny sary mitambatra mampiseho ny fifindran'ny trachea amin'ny alalan'ny LV-MP (a) eo anatrehan'ny saha magnetika ary (b) eo anatrehan'ny tsy fisian'ny andriamby. (c) Fihatsarana ara-statistika manan-danja eo amin'ny faritra fifindran'ny LacZ voarindra ao anatin'ny trachea rehefa mampiasa ny andriamby (*p = 0.029, t-test, n = 3 isaky ny vondrona, salan'isa ± SEM).
Ny fizarana mena haingana tsy miandany (ohatra aseho amin'ny Sary Fanampiny 2) dia naneho sela voaloko LacZ izay hita amin'ny lamina sy toerana mitovy amin'ny notaterina teo aloha.
Ny fanamby lehibe amin'ny fitsaboana fototarazo amin'ny lalan-drivotra dia ny fametrahana marina ny singa mpitatitra any amin'ny faritra mahaliana ary ny fahazoana fahombiazana avo lenta amin'ny transduction ao amin'ny havokavoka mihetsika eo anatrehan'ny fivezivezen'ny rivotra sy ny fanadiovana mucus mavitrika. Ho an'ireo mpitatitra LV natao hitsaboana ny aretin'ny lalan-drivotra CF, ny fampitomboana ny fotoana ipetrahan'ny singa mpitatitra ao anatin'ny lalan-drivotra mitarika dia tanjona sarotra hatreto. Araka ny notondroin'i Castellani et al., ny fampiasana sehatra magnetika hanatsarana ny transduction dia manana tombony raha oharina amin'ny fomba fanaterana fototarazo hafa toy ny electroporation, satria afaka mampifangaro ny fahatsorana, ny fahombiazan'ny vidiny, ny toerana fanaterana, ny fahombiazana mitombo, ary ny fotoana incubation fohy kokoa, ary mety ho fatra mpitatitra kely kokoa10. Na izany aza, ny fametrahana sy ny fitondran-tenan'ny singa magnetika in vivo ao amin'ny lalan-drivotra eo ambany fitaoman'ny hery magnetika ivelany dia tsy mbola voalaza mihitsy, ary tsy mbola naseho in vivo ny fahafahan'ity fomba ity manatsara ny haavon'ny fanehoan-kevitry ny fototarazo ao amin'ny lalan-drivotra velona tsy simba.
Ny andrana PCXI synchrotron in vitro nataonay dia nampiseho fa ny poti-javatra rehetra nosedrainay, afa-tsy ny polystyrene MP, dia hita maso tao amin'ny fametrahana sary nampiasainay. Eo anatrehan'ny saha magnetika, ny MP dia mamorona tady izay mifandray amin'ny karazana poti-javatra sy ny tanjaky ny saha magnetika (ohatra ny akaiky sy ny fihetsehan'ny andriamby). Araka ny aseho amin'ny Sary 10, ny tady hitanay dia miforona noho ny poti-javatra tsirairay voagejan'ny andriamby ary miteraka ny saha magnetika eo an-toerana. Ireo saha misaraka ireo dia mahatonga ny poti-javatra mitovy amin'izany hiangona sy hifandray, miaraka amin'ny fihetsehana toy ny tady vondrona noho ny hery eo an-toerana avy amin'ny hery manintona sy mandroaka eo an-toerana an'ny poti-javatra hafa.
Sary mampiseho (a,b) andian-tsinga novokarina tao anatin'ny kapilara feno ranoka sy (c,d) trachea feno rivotra. Mariho fa tsy voasoritra araka ny mizana ny kapilara sy ny trachea. Ny takelaka (a) koa dia ahitana famaritana ny MP, izay misy singa Fe3O4 voalamina amin'ny tady.
Rehefa nafindra teo ambonin'ny kapila ny andriamby, dia nahatratra ny tokonam-baravarana manan-danja ho an'ny MP3-5 misy Fe3O4 ny zoron'ny tadin'ny poti, ary avy eo dia tsy nijanona tamin'ny toerana voalohany intsony ny tadin'ny poti, fa nifindra nanaraka ny velarana ho amin'ny toerana vaovao. andriamby. Mety hitranga io vokatra io satria malama tsara ny velaran'ny kapilary fitaratra ka mamela io fihetsehana io hitranga. Mahaliana fa tsy nitondra tena toy izany ny MP6 (CombiMag), angamba satria kely kokoa ny poti, nanana sosona na fiampangana velarana samihafa, na nisy fiantraikany tamin'ny fahafahany mihetsika ny ranoka mpitondra manokana. Malemy kokoa ihany koa ny fifanoheran'ny sary amin'ny poti CombiMag, izay manondro fa mety hitovy ny hakitroky ny ranoka sy ny poti ka noho izany dia tsy mora mihetsika mifanatrika. Mety ho tafahitsoka ihany koa ny poti raha mihetsika haingana loatra ny andriamby, izay manondro fa ny tanjaky ny saha andriamby dia tsy afaka mandresy foana ny fifandonana eo amin'ny poti ao amin'ny ranoka, izay manondro fa angamba tsy mahagaga raha tena zava-dehibe ny tanjaky ny saha andriamby sy ny elanelana misy eo amin'ny andriamby sy ny faritra kendrena. Raha fintinina, ireo valiny ireo dia manondro ihany koa fa, na dia afaka misambotra MP maro izay mikoriana amin'ny faritra kendrena aza ny andriamby, dia tsy azo inoana fa azo ianteherana ny andriamby. mba hamindrana ireo poti-javatra CombiMag manaraka ny velaran'ny trachea. Noho izany, manatsoaka hevitra izahay fa ny fanadihadiana LV-MP in vivo dia tokony hampiasa saha magnetika statika mba hikendrena ara-batana ireo faritra manokana ao amin'ny lalan-drivotra.
Rehefa alefa ao amin'ny vatana ny poti-javatra dia sarotra ny mamantatra azy ireo ao anatin'ny sela vatana mihetsika sarotra, saingy nohatsaraina ny fahafahana mamantatra azy ireo tamin'ny alàlan'ny famindrana ny andriamby mitsivalana eo ambonin'ny trachea mba "hihetsiketsika" ny tady MP. Na dia azo atao aza ny maka sary mivantana, dia mora kokoa ny mamantatra ny fihetsiky ny poti-javatra rehefa novonoina tamim-pahamendrehana ny biby. Ny fifantohana MP dia amin'ny ankapobeny no avo indrindra amin'io toerana io rehefa napetraka eo ambonin'ny faritra fakana sary ny andriamby, na dia matetika aza no hita any amin'ny trachea ny poti-javatra sasany. Mifanohitra amin'ny fanadihadiana in vitro, ny poti-javatra dia tsy azo tarihina manaraka ny trachea amin'ny alàlan'ny famindrana ny andriamby. Ity zavatra hita ity dia mifanaraka amin'ny fomba fiasan'ny moka izay mandrakotra ny velaran'ny trachea amin'ny poti-javatra voafoka, ka misambotra azy ireo ao anaty moka ary avy eo dia diovina amin'ny alàlan'ny mekanisma fanadiovana mucociliary.
Nieritreritra izahay fa ny fampiasana andriamby ho an'ny fisarihana eo ambonin'ny sy ambanin'ny trachea (Sary 3b) dia mety hiteraka saha andriamby mitovy kokoa, fa tsy saha andriamby izay mifantoka be amin'ny teboka iray, izay mety hitarika amin'ny fizarana mitovy kokoa ny poti-javatra. Na izany aza, ny fanadihadiana voalohany nataonay dia tsy nahita porofo mazava hanohanana io petra-kevitra io. Toy izany koa, ny fanamboarana andriamby roa mba handroaka (Sary 3c) dia tsy nahatonga ny fametrahana poti-javatra bebe kokoa tao amin'ny faritra sary. Ireo zavatra roa hita ireo dia mampiseho fa ny fametrahana andriamby roa dia tsy manatsara be loatra ny fanaraha-maso eo an-toerana ny fikendrena MP, ary sarotra ny manamboatra ny hery andriamby matanjaka vokatr'izany, ka mahatonga ity fomba fiasa ity ho tsy dia azo ampiharina loatra. Toy izany koa, ny fametrahana ny andriamby eo ambonin'ny sy amin'ny alàlan'ny trachea (Sary 3d) dia tsy nampitombo ny isan'ny poti-javatra voatahiry ao amin'ny faritra sary. Ny sasany amin'ireo fanamboarana hafa ireo dia mety tsy hahomby satria miteraka tanjaky ny saha andriamby ambany kokoa ao anatin'ny faritra fametrahana. Noho izany, ny fanamboarana andriamby tokana amin'ny zoro 30 degre (Sary 3a) dia heverina ho fomba mora indrindra sy mahomby indrindra amin'ny fitsapana in vivo.
Ny fanadihadiana LV-MP dia naneho fa rehefa natambatra tamin'ny CombiMag ireo vecteur LV ary natolotra taorian'ny fikorontanana ara-batana teo anatrehan'ny saha magnetika, dia nitombo be ny haavon'ny transduction tao amin'ny trachea raha oharina amin'ny fanaraha-maso. Mifototra amin'ny fanadihadiana momba ny sary synchrotron sy ny valin'ny LacZ, dia toa afaka niaro ny LV tao anatin'ny trachea ny saha magnetika ary nampihena ny isan'ny poti-vecteur izay niditra lalina tao amin'ny havokavoka. Ny fanatsarana ny fikendrena toy izany dia mety hitarika amin'ny fahombiazana ambony kokoa sady mampihena ny titers natolotra, ny transduction tsy lasibatra, ny voka-dratsin'ny fivontosana sy ny hery fiarovana, ary ny vidin'ny mpitondra fototarazo. Zava-dehibe, araka ny mpanamboatra, ny CombiMag dia azo ampiasaina miaraka amin'ny fomba famindrana fototarazo hafa, anisan'izany ny vecteur viraliny hafa (toy ny AAV) sy ny asidra nokleika.