Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny dikan-teny navigateur ampiasainao dia manana fanohanana voafetra ho an'ny CSS. Ho an'ny traikefa tsara indrindra dia manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na vonoy ny fomba fampifanarahana amin'ny Internet Explorer).
Ny fototarazo amin'ny fitsaboana ny aretin'ny havokavoka cystic fibrosis dia tokony hikendry ny lalan-drivotra mitarika satria tsy manome tombony ara-pahasalamana ny fampitana ny havokavoka periferika. Zava-dehibe fa sarotra ny ho tratrarina.Ny poti-magnetika misy conjugated générale izay azo alefa eny ambonin'ny lalan-drivotra dia afaka manatsara ny tanjona amin'ny faritra. Noho ny fanamby amin'ny fijerena ny vivo dia tsy takatry ny saina ny fihetsiky ny poti magnetika kely toy izany eo amin'ny habakabaka amin'ny fisian'ny sahan'andriamby ampiharina. Ny voalavo anastetika mba handinihana ny dinamika sy ny lamin'ny fitondran-tenan'ny tsirairay sy ny ampahany betsaka amin'ny vivo. Avy eo dia nanombantombana ihany koa izahay raha toa ka hampitombo ny fahombiazan'ny transduction ao amin'ny trachea voalavo ny fanaterana ny singa magnetika lentiviral amin'ny fisian'ny sahan'andriamby. magnets, fa mandritra ny fitaterana, ny fametrahana dia mifantoka amin'ny sehatry ny fijery izay matanjaka indrindra ny sahan'andriamby. Nitombo avo enina heny ihany koa ny fahombiazan'ny transduction rehefa natolotra teo anatrehan'ny sahan'andriamby lentiviral ny singa magnetika.
Ny cystic fibrosis (CF) dia vokatry ny fiovan'ny fototarazo tokana antsoina hoe CF transmembrane conductance regulator (CFTR). Manimba ny fahafahan'ny rafi-pitaterana mucociliary (MCT) hanala ireo poti-tsakafo sy otrikaretina avy amin'ny lalan-drivotra.Ny tanjonay dia ny hamolavola fitsaboana fototarazo lentiviral (LV) mba hanaterana ny dika mitovy amin'ny fototarazo CFTR ary hanatsara ny fahasalaman'ny ASL, MCT, ary ny havokavoka, ary hanohy ny fampivoarana teknolojia vaovao afaka mandrefy ireo mari-pamantarana ireo amin'ny vivo1.
Ny LV vectors dia iray amin'ireo kandidà lehibe indrindra amin'ny fitsaboana fototarazo CF, indrindra satria izy ireo dia afaka mampiditra maharitra ny fototarazo ara-pahasalamana ao amin'ny sela basal lalan-drivotra (selan'ny rivotra). Manomboka.Ny fanaterana ny véctor lalindalina kokoa ao amin'ny havokavoka dia mety miteraka transduction alveolar, saingy tsy misy tombony ara-pahasalamana izany ao amin'ny CF. Na izany aza, ny fluids toy ny mpitatitra fototarazo dia mifindra ho azy any amin'ny alveoli rehefa aingam-panahy aorian'ny fandefasana3,4 ary ny singa ara-pahasalamana dia esorina haingana ao amin'ny vavan'ny vavan'ny MCT.LV. fotoana "5 - izay mora ahena amin'ny alàlan'ny fikorianan'ny rivotra mahazatra ao amin'ny faritra ary koa ny fisamborana ny mucus particle sy ny MCT. Ho an'ny CF, ny fahafahana manalava ny fotoana ipetrahan'ny LV ao anatin'ny lalan-drivotra dia zava-dehibe mba hahatratrarana ny haavon'ny transduction ao amin'io faritra io, saingy mbola sarotra hatreto.
Mba handresena an'io sakana io, dia manoro hevitra izahay fa mety hanampy amin'ny fomba roa mifameno ny LV magnetic particles (MPs). ary ASL) mba hifindra any amin'ny sela sela 6. MPs dia nampiasaina be ho toy ny fiara fitaterana zava-mahadomelina lasibatra rehefa mifatotra amin'ny antibody, fanafody chimiotherapeutic, na molekiola kely hafa izay miraikitra amin'ny fonon'ny sela na mifatotra amin'ny receptors ambonin'ny sela mifandraika ary miangona amin'ny toerana fivontosana eo anatrehan'ny herinaratra static. Sahan'andriamby ho an'ny fitsaboana homamiadana 7. Ny teknika "hyperthermal" hafa dia mikendry ny hanafana ny solombavambahoaka rehefa tratran'ny sahan'andriamby mihetsiketsika izy ireo, ka manimba ny sela fivontosana. magnetotransfection dia naorina, miaraka amin'ny fandefasana in vitro LV-MPs amin'ny tsipika sela epithelial bronchial olombelona eo anatrehan'ny sahan'andriamby static, mampitombo ny fahombiazan'ny transduction amin'ny 186-fold raha oharina amin'ny LV vector irery. vivo magnetotransfection ny taova dia tsy dia nahazo saina kely ary nodinihina tamin'ny biby vitsivitsy fanadihadiana11,12,13,14,15, indrindra fa amin'ny havokavoka16,17. Na izany aza, mazava tsara ny fahafahana transfection magnetika amin'ny fitsaboana havokavoka CF. Tan et al. Paikady fifohana rivotra CFTR hanatsarana ny vokatra klinika amin'ny marary CF"6.
Sarotra ny mijery sy mianatra ny fitondran-tenan'ny poti magnetika kely eo amin'ny lalan-drivotra amin'ny fisian'ny sahan'andriamby ampiharina, ary noho izany dia tsy takatry ny saina. Ao amin'ny fianarana hafa, dia namolavola fomba fiasa X-ray (PB-PCXI) mifototra amin'ny fampielezana synchrotron-propagation (PB-PCXI) mba hijerena sy hamantatra ny fiovan'ny vivo amin'ny fiovan'ny vivo mivantana amin'ny fitondran-tena ASL19, Can 2 hyd. ary ampiasaina ho toy ny famantarana mialoha ny fahombiazan'ny fitsaboana.Ankoatr'izay, ny fomba fanombanana MCT antsika dia mampiasa poti-tsavily 10-35 µm misy alumina na fitaratra fanondroana refractive avo toy ny marika MCT hita amin'ny fampiasana PB-PCXI21. Ireo teknika roa ireo dia mety amin'ny fijerena ny karazana karazana singa, anisan'izany ny MP.
Noho ny vahaolana avo lenta sy ara-nofo, ny teknika fanadihadiana ASL sy MCT miorina amin'ny PB-PCXI dia mety tsara amin'ny fandinihana ny dinamika sy ny lamin'ny fitondran-tena tokana sy betsaka ao amin'ny vivo mba hanampiana antsika hahatakatra sy hanatsara ny teknika fanaterana fototarazo MP. Ny lalan-drivotry ny totozy ao amin'ny havokavoka mba hanampy amin'ny fanazavana ny fomba fanehoana ny fototarazo tsy mitovy hita ao amin'ny fandalinana ny biby mitondra ny fototarazo 3,4.
Ny tanjon'ity fanadihadiana ity dia ny fampiasana ny synchrotron PB-PCXI mba hijerena ny hetsika in vivo an'ny andiana solombavambahoaka ao amin'ny trachea misy voalavo velona. Amin'ny fanadihadiana andiany faharoa, dia nitady ny hampiasa an'io fanamafisana tsara indrindra io izahay mba hampisehoana ny lamin'ny transduction vokatry ny fandefasana in vivo ny LV-MPs mankany amin'ny lalan-drivotra voalavo, mifototra amin'ny fiheverana fa ny fandefasana LV-MP amin'ny tontolon'ny fikajiana ny lalan-drivotra dia hitondra fahombiazana amin'ny LV.
Ny fianarana biby rehetra dia natao araka ny protocols nankatoavin'ny University of Adelaide (M-2019-060 sy M-2020-022) ary ny SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Ny fanandramana dia natao araka ny torolàlana ARRIVE.
Ny sary X-ray rehetra dia natao tao amin'ny BL20XU beamline ao amin'ny SPring-8 synchrotron any Japana, amin'ny fampiasana setup mitovy amin'ny voalaza teo aloha21,22. Fohy, ny boaty fanandramana dia hita 245 m avy amin'ny peratra fitehirizana synchrotron. Ny halaviran'ny santionany-to-detector amin'ny 0.6 m dia ampiasaina amin'ny fandalinana ny fizika 0.6 m amin'ny fandalinana ny fizika 0. Nampiasa angovo taratra monochromatic 25 keV ny sary nalaina tamin'ny fampiasana mpanova X-ray avo lenta (SPring-8 BM3) miaraka amin'ny mpitsikilo sCMOS. (NA 0.3) Ny mpitsikilo sCMOS dia Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japana) miaraka amin'ny haben'ny array 2048 × 2048 teboka ary ny haben'ny teboka manta 6.5 × 6.5 µm. 100 ms no nofidina mba hanamafisana ny tahan'ny mari-pamantarana amin'ny tabataba amin'ny singa magnetika ao anaty sy ivelan'ny lalan-drivotra ary manamaivana ny artifacts mihetsika vokatry ny fofonaina.
Ny mpitatitra LV dia tsy nampiasaina tamin'ny fandalinana imaging SPring-8 PB-PCXI satria ny efitrano fitarafana BL20XU dia tsy voamarina Biosafety Level 2. Fa kosa, nisafidy solombavambahoaka voafaritra tsara izahay avy amin'ny mpamatsy ara-barotra roa - mandrakotra ny habeny, ny fitaovana, ny fatran'ny vy, ary ny fampiharana - aloha ny fahatakarana ny fiantraikan'ny rivotra ao anatin'ny sahan'andriamby ary ny kapila miaina ao anaty sahan'andriamby. eny ambonin'ny tany.Ny MP dia manana habe amin'ny 0.25 hatramin'ny 18 μm ary vita amin'ny fitaovana isan-karazany (jereo ny tabilao 1), fa ny firafitry ny santionany tsirairay, anisan'izany ny haben'ny poti-magnetika ao anatin'ny MP, dia tsy fantatra. manaisotra ny rafitra mifanesy mba hahitana ny fahitana ny fihetsehan'ny MP. Ny MP tokana 0,25 μm dia kely kokoa noho ny famahana ny fitaovana fanaovana sary, fa ny PB-PCXI dia andrasana hamantatra ny fifanoheran'izy ireo sy ny fihetsiky ny ranon-tany izay ametrahana azy ireo aorian'ny fametrahana azy.
Ny santionany ho an'ny MP tsirairay ao amin'ny Table 1 dia voaomana amin'ny capillaries vera 20 μl (Drummond Microcaps, PA, Etazonia) miaraka amin'ny savaivony anatiny amin'ny 0.63 mm. Ny singa corpuscular dia misy ao anaty rano, raha misy ny singa CombiMag dia misy ao amin'ny fluid proprietary mpanamboatra. Ny fantsona tsirairay dia feno ranon-javatra (jereo eo amin'ny 11 μl ny santionany) ary (jereo ny santionany amin'ny 1 μl) ary (jereo ny 1 μl ny santionany) napetraka horizontally eo amin'ny sehatra santionany ao amin'ny imaging boaty, tsirairay avy, ary nametraka ny sisin'ny fluide.A 19 mm savaivony (28 mm lava) nikela akorandriaka tsy fahita firy tany neodymium vy boron (NdFeB) andriamby (N35, cat. No. LM1652, Jaycar Electronics, Aostralia) miaraka amin'ny residual magnetization ny toerana fandikan-teny misaraka amin'ny 1.17 Tesla miraikitra amin'ny dingana misaraka amin'ny Tesla. Ny fakana sary X-ray dia manomboka rehefa mipetraka eo amin'ny 30 mm eo ho eo eo ambonin'ny santionany ny andriamby, ary ny sary dia azo amin'ny tahan'ny 4 frames isan-tsegondra. Nandritra ny fakana sary, ny andriamby dia nentina teo akaikin'ny fantsona capillary fitaratra (tokony ho 1 mm miala) ary avy eo dia nadika teo amin'ny fantsona mba hanombanana ny fiantraikan'ny herin'ny saha sy ny toerana misy azy.
Fametrahana sary in vitro misy santionany MP ao anaty capillaries fitaratra eo amin'ny dingana fandikan-teny xy santionany. Ny lalan'ny taratra X-ray dia voamarika amin'ny tsipika mena.
Vantany vao tafapetraka ny fahitan'ny solombavambahoaka in vitro, ny ampahany amin'izy ireo dia nosedraina in vivo amin'ny voalavo Wistar albino vavy (~ 12 herinandro, ~ 200 g). Seika) Ny voalavo dia notsaboina tamin'ny fangaro Pharma), Japana) tamin'ny tsindrona intraperitoneal. Taorian'ny fanatoranana, dia nomanina ho an'ny sary izy ireo tamin'ny fanesorana ny volony manodidina ny trachea, ary nasiany fantsona endotracheal (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) ary tsy mihetsika amin'ny alàlan'ny vata fampangatsiahana vita amin'ny vata fampangatsiahana. mipetaka amin'ny dingan'ny fandikana santionany ao amin'ny boaty fanaovana sary amin'ny zoro kely mba hampifanaraka ny trachea mitsivalana amin'ny sary X-ray, araka ny aseho amin'ny sary 2a.
(a) In vivo imaging setup ao amin'ny SPring-8 imaging box, ny lalan'ny taratra X-ray dia voamarika amin'ny tsipika mena.
Ny rafitra paompy syringe azo fehezina lavitra (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mampiasa 100 μl vera syringe dia mifandray amin'ny PE10 tubing (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) amin'ny alàlan'ny fanjaitra 30 Ga. Mariho ny fantsona mba hahazoana antoka fa ny tendrony dia eo amin'ny toerana marina ao amin'ny trachea rehefa ampidirina amin'ny traktera ny fantsona. nesorina raha natsofoka tao amin'ny santionany MP ny tendron'ny fantsona ho entina. Ny fantsona fanaterana entana dia nampidirina tao amin'ny fantsona endotracheal, nametraka ny tendrony tao anatin'ny ampahany matanjaka indrindra amin'ny sahan'andriamby andrasana. (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Rehefa tsy azo nidirana ny fefy, dia nisy fakan-tsary IP roa (Panasonic BB-SC382) napetraka teo amin'ny 90 ° teo ho eo ary nampiasaina hanaraha-maso ny toeran'ny andriamby mifandraika amin'ny trachea mandritra ny fakana sary (sary 2b, c).
Misy andriamby miraikitra amin'ny dingana faharoa izay azo jerena lavitra avy any ivelan'ny trano fonenan'ny sary.Nosedraina ny toeran'ny andriamby isan-karazany sy ny fanitsiana, anisan'izany ny: Apetaka amin'ny zoro eo amin'ny 30° eo ambonin'ny trachea (fanamboarana aseho eo amin'ny sary 2a sy 3a); ny andriamby iray eo ambonin'ny biby ary ny iray eo ambany, miaraka amin'ny bao natao hisarihana (sary 3b); ny andriamby iray eo ambonin'ny biby ary ny iray eo ambany, miaraka amin'ny bao napetraka handroaka (sary 3c); ary andriamby iray eo ambony ary mitsangana amin'ny trachea (sary 3d).Rehefa voarindra ny biby sy ny andriamby ary ny MP hotsapaina dia ampidirina ao amin'ny paompy syringe, alefaso ny doka 50 μl amin'ny tahan'ny 4 μl / sec rehefa mahazo sary.
Fikirakirana andriamby ho an'ny sary in vivo (a) andriamby tokana eo ambonin'ny trachea amin'ny zoro eo amin'ny 30° eo ho eo, (b) andriamby roa napetraka mba hisarihana, (c) andriamby roa napetraka mba handroaka, (d) andriamby tokana eo ambony sy perpendicular ao amin'ny trachea. Ny mpandinika dia nibanjina avy teo am-bava ka hatrany amin'ny havokavoka tamin'ny alalan'ny trachea, ary ny sisiny ankavanana dia nandalo ny X-ray beam. Ny andriamby dia na mihetsika manaraka ny halavan'ny lalan-drivotra na miankavia sy miankavanana eo ambonin'ny trachea mankany amin'ny taratra X-ray.
Niezaka ihany koa izahay hamantatra ny fahitana sy ny fitondran-tenan'ny singa ao amin'ny lalan-drivotra amin'ny tsy fisian'ny rivotra mampikorontan-tsaina sy ny fihetsehan'ny fo. Noho izany, tamin'ny fiafaran'ny vanim-potoanan'ny sary, ny biby dia novonoina ho an'ny overdose pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Etazonia; ~ 65 mg / kg ip, ary nijanona teo amin'ny lampihazo mifoka rivotra ny sasany amin'ny imag, ary ny fo mifoka rivotra. naverina indray ny dingana, nampiana fatra MP fanampiny raha tsy nisy MP hita teo amin'ny lalan-drivotra.
Ny sary azo dia eny amin'ny saha fisaka sy sahan'ny maizina voahitsy ary avy eo natambatra ho sarimihetsika (sary 20 isan-tsegondra; 15-25 × hafainganam-pandeha mahazatra miankina amin'ny tahan'ny taovam-pisefoana) amin'ny alàlan'ny script manokana nosoratana tamin'ny MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ny fanadihadiana rehetra momba ny fandefasana virtoaly LV dia natao tao amin'ny Laboratory Animal Research Facility ao amin'ny Oniversiten'i Adelaide ary mikendry ny hampiasa ny valin'ny fanandramana SPring-8 mba hanombanana raha afaka manatsara ny famindrana ny fototarazo amin'ny vivo ny LV-MP raha misy sahan'andriamby.
Ny vectors général LV dia novokarina tamin'ny alàlan'ny fomba voalaza teo aloha 25, 26 .Ny véctor LacZ dia maneho ny fototarazo beta-galactosidase nokleary ao an-toerana entin'ny mpanentana MPSV constitutive (LV-LacZ), izay mamokatra vokatra manga amin'ny sela transduced, hita amin'ny tadin'ny havokavoka sy ny fizarana tissue. titer amin'ny TU / ml. Ny mpitatitra dia voatahiry ao amin'ny -80 ° C, tselatra alohan'ny hampiasana, ary mifamatotra amin'ny CombiMag amin'ny fampifangaroana amin'ny tahan'ny 1: 1 ary manondraka ranomandry mandritra ny 30 minitra farafahakeliny alohan'ny hanaterana.
Ny voalavo Sprague Dawley mahazatra (n = 3 / vondrona, ~ 2-3 dia natao anesthetized intraperitoneally miaraka amin'ny fifangaroan'ny 0.4 mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) ary 60 mg / kg ketamine (Ilium, Australia) volana) ip) tsindrona ary tsy fandidiana oral cannulation miaraka amin'ny 16 Ga iv izay azo antoka fa ny 16 Ga iv dia azo antoka fa mahazo ny vavony. dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny protocol perturbation mekanika efa voalaza teo aloha, izay nokosehana axially ny lalan-drivotra tracheal tamin'ny sobika tariby (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Etazonia) 30 s28. Tracheal fitantanana ny LV-MP avy eo dia natao tao amin'ny kabinetra fiarovana biolojika 10 minitra taorian'izay.
Ny sahan'andriamby ampiasaina amin'ity andrana ity dia namboarina tamin'ny fomba mitovy amin'ny fandalinana sary X-ray in vivo, miaraka amin'ireo andriamby mitovy amin'ny tazonina eo ambonin'ny trachea amin'ny fampiasana clips stent distillation (sary 4) .A 50 μl volume (2 × 25 μl aliquots) an'ny LV-MP dia natolotra tao amin'ny trachea (n = 3 biby fiompiana) biby 3) dia nahazo LV-MP mitovy amin'ny tsy nampiasa andriamby. Rehefa vita ny fampidirana dia esorina amin'ny fantsona ET ny cannula ary avoaka ny biby. Mijanona eo amin'ny toerany mandritra ny 10 minitra ny andriamby, dia esorina. (Antisedan, Zoetis, Aostralia) Notazonina mafana sy naraha-maso ny voalavo mandra-pahasitrana tanteraka tamin’ny fanatoranana.
Ny fitaovana fanaterana LV-MP ao amin'ny kabinetra fiarovana biolojika.Ny habaka Luer maitso mavana amin'ny fantsona ET dia hita mipoitra avy amin'ny vava ary ny tendron'ny gel amin'ny pipette aseho amin'ny sary dia ampidirina amin'ny alàlan'ny fantsona ET mankany amin'ny halalin'ny faniriana ao amin'ny trachea.
Herinandro taorian'ny fomba fitsaboana LV-MP, ny biby dia novonoina tamin'ny alàlan'ny 100% CO2 inhalation ary ny fanehoana LacZ dia nodinihina tamin'ny fampiasana ny fitsaboana X-gal mahazatra. Ny peratra telo caudal indrindra amin'ny cartilaginous dia nesorina mba hahazoana antoka fa ny fahasimbana ara-mekanika na ny fihazonana ranon-javatra avy amin'ny fametrahana fantsona endotracheal dia tsy tafiditra ao amin'ny fanadihadiana. (Sylgard, Dow Inc) mampiasa fanjaitra Minutien (Fine Science Tools) mba hijerena ny ety ivelany.Ny fizarana sy ny lamin'ny sela transduced dia nohamafisin'ny sary eo anoloana amin'ny alàlan'ny mikraoskaopy Nikon (SMZ1500) miaraka amin'ny fakan-tsary DigiLite sy rindrambaiko TCapture (Tucsen Photonics, Shina) . Ny halavan'ny trachea dia alaina tsikelikely, miantoka ny fifandimbiasan'ny sary tsirairay mba ahafahan'ny sary "manjaitra". (R2020a, MathWorks) araka ny voalaza teo aloha, amin'ny fampiasana ny fikandrana 0.35
Ny trachea tsirairay dia napetraka ao anaty paraffine ary tapaka ny fizarana 5 μm. Ny fizarana dia nofafana tamin'ny mena haingana tsy miandany nandritra ny 5 min ary ny sary dia azo tamin'ny fampiasana mikroskopika Nikon Eclipse E400, fakantsary DS-Fi3 ary rindrambaiko fisamborana singa NIS (version 5.20.00).
Ny famakafakana statistika rehetra dia natao tao amin'ny GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.)
Ny solombavambahoaka enina voalaza ao amin'ny tabilao 1 dia nodinihina tamin'ny fampiasana PCXI, ary ny fahitana dia voalaza ao amin'ny tabilao 2. Ny solombavambahoaka polystyrene roa (MP1 sy MP2; 18 μm ary 0.25 μm, tsirairay avy) dia tsy hita teo ambanin'ny PCXI, fa ny sisa amin'ireo santionany dia azo fantarina (ohatra aseho ao amin'ny 1MP3 sy MP4 5). 0,25 μm sy 0,9 μm, tsirairay avy). andriamby nifindra niala ny capillary, ny poti nitarina amin'ny tady lava, fa rehefa ny andriamby nihanakaiky sy ny sahan'andriamby hery nitombo, ny poti kofehy nohafohezina toy ny poti nifindra monina ho any amin'ny ambony ambonin'ny ny capillary (jereo Fanampiny Video S1: MP4), mampitombo ny poti hakitroky ny surface. Mifanohitra amin'izany, rehefa ny andriamby dia nesorina avy amin'ny capillary sy ny ela ny tadin'ny saha ambonin'ny hanitatra ny tadin'ny MP ny rerange ambonin'ny tadin'ny elany. capillary (jereo ny horonan-tsary fanampiny S2: MP4) .Rehefa tsy mihetsika ny andriamby, dia manohy mihetsika mandritra ny fotoana fohy ireo poti rehefa tonga eo amin'ny toeran'ny equilibrium.Rehefa mandroso mankany sy miala amin'ny tendron'ny capillary ny MP, dia matetika ny poti-magnetika no misintona ny fako amin'ny fluid.
Ny fahitana ny MP eo ambanin'ny PCXI dia miovaova be eo anelanelan'ny santionany. mariho fa ny savaivony ny schematics andriamby amin'ny tarehimarika rehetra dia tsy mizana ary eo ho eo amin'ny 100 heny noho ny aseho.
Rehefa nadika havia sy havanana eo an-tampon'ny capillary ny andriamby, dia miova ny zoro amin'ny kofehy MP mba hifanaraka amin'ny andriamby (jereo ny sary 6), ka mamaritra ny tsipika sahan'andriamby. Ho an'ny MP3-5, rehefa tonga eo amin'ny zoro tokonam-baravarana ny chord, dia taritina eny amin'ny tendrony ambony amin'ny capillary ny singa. S3: MP5) Miharihary indrindra koa izany rehefa maka sary akaikin'ny faran'ny kapilara, izay mahatonga ny depiote hitambatra sy hifantoka amin'ny interface tsara amin'ny rivotra. Ny singa ao amin'ny MP6, izay sarotra kokoa ny manavaka azy noho ny MP3-5, dia tsy notaritaritina rehefa nivezivezy teny amin'ny kapilara ny andriamby, fa ny tadin'ny MP dia misaraka amin'ny sahan'ny MP4 (jereo ny sahan'ny MP4 sasany). toe-javatra, rehefa nihena ny sahan'andriamby nampiharina tamin'ny alalan'ny fihetsehana ny andriamby lavidavitra ny toerana misy sary, ny solombavambahoaka sisa tavela dia nidina tsimoramora ho any amin'ny faran'ny fantsona amin'ny alalan'ny gravité raha mbola mijanona ao amin'ny tady (jereo Fanampiny Video S5: MP3).
Miova ny zoro amin'ny kofehy MP rehefa adika miankavanana eo ambonin'ny kapila ny andriamby.
Ny fitsapana nataonay dia naneho fa ny fihetsehan'ny andriamby miadana sy miverina amin'ny trachea dia manamora ny fahitana ny MP ao anatin'ny tontolon'ny hetsika sarotra ao amin'ny vivo.In vivo ny fitsapana dia tsy natao satria ny polystyrene vakana (MP1 sy MP2) dia tsy hita ao amin'ny kapila. 3a), satria izany dia niteraka rojo MP lava kokoa ary nahomby kokoa noho ny najanon'ny andriamby. Ny MP3, ny MP4 ary ny MP6 dia tsy hita tao amin'ny trachea misy biby velona. Rehefa nalaina sary ny lalan'ny voalavo taorian'ny namonoana ny biby, dia tsy hita maso ireo poti-javatra na dia nampiana volume fanampiny aza tamin'ny fampiasana paompy syringe. vivo fitondran-tenan'ny MP.
Ny fametrahana ny andriamby eo ambonin'ny trachea nandritra ny fanaterana MP dia niteraka maro, fa tsy ny rehetra, ny solombavambahoaka dia mifantoka amin'ny sehatry ny fijery.Particles miditra ao amin'ny trachea no tsara indrindra hojerena amin'ny biby natao sorona olombelona.Figure 7 sy Fanampiny Video S6: MP5 mampiseho andriamby fisamborana haingana sy ny fampifanarahana ny poti eo ambonin'ny ventral trachea faritra dia afaka manondro fa ny trachea ventral faritra, izay manondro fa ny trachea ventral faritra, izay manondro fa ny MP5 ny faniriana. Nikaroka lavitra kokoa teo amin'ny trachea taorian'ny fanaterana MP, nisy solombavambahoaka hita teo akaikin'ny carina, nanoro hevitra fa tsy ampy ny herin'ny sahan'andriamby mba hanangonana sy hitazonana ny solombavambahoaka rehetra, satria naterina tamin'ny alalan'ny faritra manana tanjaky ny sahan'andriamby ambony indrindra izy ireo nandritra ny fizotran'ny fluid.
Sary avy amin'ny (a) alohan'ny sy (b) aorian'ny fandefasana MP5 ao anaty trachea misy voalavo vao nodiovina miaraka amin'ny andriamby napetraka mivantana eo ambonin'ny faritry ny sary. Ny faritra misy sary dia eo anelanelan'ny peratra cartilage roa. Alohan'ny fandefasana MP dia misy ranon-drivotra vitsivitsy. Ny boaty mena dia misy ny fanamafisana mampifanohitra. Ireo sary ireo dia avy amin'ny horonan-tsary S6:
Ny fandikana ny andriamby teo amin'ny trachea in vivo dia nahatonga ny rojo MP hanova ny zoro ao anatin'ny lalan-drivotra amin'ny fomba mitovy amin'ny hita amin'ny capillaries (jereo ny sary 8 sy ny video fanampiny S7: MP5). Ny tadin'ny poti dia toa manova ny halalin'ny sosona ranon-javatra ambonin'ny tany rehefa ahetsiketsika lavidavitra eo amin'ny trachea ny andriamby, ary mivelatra rehefa mihetsika mivantana eo ambonin'ny lohany ilay andriamby ary mihodina mankany amin'ny toerana mitsangana ny tadin'ny poti (jereo Video fanampiny S7). : MP5 amin'ny 0:09, ambany havanana).Niova ny lamina mampiavaka ny fihetsehana rehefa nadika teo amin'ny tampon'ny trachea ny andriamby (izany hoe miankavia na havanana amin'ny biby fa tsy manaraka ny halavan'ny trachea). mifanaraka amin'ny fitondran-tena MP hitanay teo ambanin'ny sahan'andriamby ampiharina amin'ny kapila fitaratra.
Sary ohatra mampiseho MP5 ao amin'ny trachea an'ny voalavo velona ananesthetika.(a) Ny andriamby dia ampiasaina mba hahazoana sary etsy ambony sy eo ankavian'ny trachea, avy eo (b) rehefa avy nafindra miankavanana ny andriamby. Ny boaty mena dia misy ny fanamafisam-peo mampifanohitra.
Rehefa natsangana tamin'ny orientation avaratra-atsimo ambony sy ambany ny trachea ny bao roa (izany hoe manintona; sary 3b), dia nipoitra lava kokoa ny akora MP ary hita teo amin'ny rindrin'ny trachea fa tsy teo amin'ny tampon'ny trachea dorsal (jereo ny Video fanampiny S9: MP5). Nisy fitaovana andriamby roa ampiasaina, izay matetika no mitranga rehefa mampiasa fitaovana andriamby tokana. mankany amin'ny lalan-drivotra fa mandalo amin'ny lalan-drivotra amin'ny mari-pahaizana 90 ka ny tsipika an-tsaha dia niampita ny rindrin'ny tracheal orthogonally (sary 3d), orientation natao hamaritana raha azo jerena ny fivondronan'ny particle amin'ny rindrina sisiny .Na izany aza, amin'ity fanamafisana ity, dia tsy misy hetsika azo fantarina ny fanangonana MP na ny hetsika magnetika. 3a) dia nofinidy ho an'ny fianarana mitondra ny fototarazo vivo.
Rehefa nojerena imbetsaka ilay biby avy hatrany taorian'ny famonoana olombelona, ny tsy fisian'ny fihetsehan'ny tavy mampisafotofoto dia midika fa ny tsipika madinika kokoa sy fohy kokoa dia azo fantarina ao amin'ny saha interchondral mazava, "mihozongozona" mifanaraka amin'ny fihetsik'ilay andriamby. Na izany aza, mbola tsy afaka mahita mazava tsara ny fisiana sy ny fihetsik'ireo singa MP6.
Ny titer LV-LacZ dia 1.8 × 108 TU / ml, ary taorian'ny 1: 1 nifangaro tamin'ny CombiMag MP (MP6), ny biby dia nahazo doka tracheal 50 μl amin'ny fiara 9 × 107 TU / ml LV (izany hoe 4.5 × 106 TU / rat). ).Amin'ireo fanadihadiana ireo, fa tsy nandika ny andriamby nandritra ny asa, dia nametraka ny andriamby amin'ny toerana iray mba hamaritana raha LV transduction (a) azo hatsaraina raha oharina amin'ny vector fanaterana amin'ny tsy fisian'ny sahan'andriamby, ary (b) mety hifantoka Airway sela dia transduced amin'ny andriamby kendrena faritra ny ambony lalan-drivotra.
Ny fisian'ny andriamby sy ny fampiasana CombiMag miaraka amin'ny LV vectors dia toa tsy nisy fiantraikany ratsy teo amin'ny fahasalaman'ny biby, toy ny mahazatra ny LV vector delivery protocols. Ny sary eo anoloana amin'ny faritra tracheal iharan'ny fikorontanan'ny mekanika (Fig. 1 fanampiny) dia nanondro fa misy ny haavon'ny transduction avo kokoa amin'ny vondron'ny biby tsaboina amin'ny LV-MP (Fig ny manga kely). staining dia hita ao amin'ny vondrona fanaraha-maso (sary 9b) . Ny quantification ny normalized X-Gal stained faritra dia nampiseho fa ny fitantanana ny LV-MP eo anatrehan'ny sahan'andriamby namokatra eo ho eo 6-foritra fanatsarana (sary 9c).
Ohatra mitambatra sary mampiseho tracheal transduction amin'ny alalan'ny LV-MP (a) eo anatrehan'ny sahan'andriamby sy (b) amin'ny tsy fisian'ny andriamby. (c) Statistical fanatsarana manan-danja eo amin'ny ara-dalàna lacZ transduction faritra ao anatin'ny trachea rehefa mampiasa ny andriamby (* p = 0.029, t-test, n = 3 isaky ny vondrona, midika hoe ± SEM).
Ny fizarana tsy miandany haingana mena mena (ohatra aseho amin'ny sary fanampiny 2) dia nampiseho sela misy loko LacZ misy amin'ny endrika sy toerana mitovy amin'ny voalaza teo aloha.
Ny fanamby lehibe ho an'ny fitsaboana fototarazo amin'ny lalan-drivotra dia ny fametrahana marina ireo poti-pitaterana any amin'ny faritra mahaliana sy ny fanatontosana ny fahombiazan'ny transduction avo lenta amin'ny havokavoka mihetsika amin'ny fisian'ny fikorianan'ny rivotra sy ny fanadiovana ny mucus mavitrika. Ny transduction dia manana tombony raha oharina amin'ny fomba fanaterana fototarazo hafa toy ny electroporation, satria afaka manambatra ny fahatsorana, ny fahombiazan'ny vidiny, ny fandefasana localization, ny fitomboan'ny fahombiazany, ary ny fotoana fohy kokoa ny incubation, ary mety ho kely kokoa ny dose 10. Na izany aza, ny fametrahana in vivo sy ny fitondran-tenan'ny singa magnetika ao amin'ny lalan-drivotra eo ambany fitarihan'ny hery magnetika ivelany dia tsy mbola nofaritana hatramin'izay. amin'ny lalan-drivotra velona.
Ny fanandramana in vitro synchrotron PCXI dia nampiseho fa ny singa rehetra notsapainay, afa-tsy ny polystyrene MP, dia hita ao amin'ny setup imaging ampiasainay. Eo anatrehan'ny sahan'andriamby, ny solombavambahoaka dia mamorona tady izay ny halavany dia mifandray amin'ny karazana particle sy ny tanjaky ny sahan'andriamby (izany hoe ny akaiky sy ny fihetsiky ny andriamby). saha.Ireo saha misaraka ireo dia miteraka poti hafa mitovitovy amin'izany mba hitambatra sy hifandray, miaraka amin'ny fihetsehana toy ny tady vondrona noho ny hery eo an-toerana avy amin'ny hery manintona sy maharikoriko avy amin'ny singa hafa.
Skema mampiseho (a,b) fiaran-dalamby miforona ao anatin'ny kapilara feno ranoka sy (c,d) trachea feno rivotra. Marihina fa ny kapilara sy ny trachea dia tsy voasarika amin'ny mari-pamantarana. Ny tontonana (a) dia misy famaritana ny MP ihany koa, izay misy ny singa Fe3O4 voalamina ao anaty tady.
Rehefa nafindra teo ambonin'ny capillary ny andriamby, dia tonga teo amin'ny tokonam-baravarankely ho an'ny MP3-5 misy Fe3O4 ny zoro amin'ny tadin'ny poti, ary taorian'izay dia tsy nijanona teo amin'ny toerana voalohany intsony ny tadin'ny poti, fa nifindra tany amin'ny toerana vaovao. kely kokoa, nanana coatings na fiampangana ambonin'ny samy hafa, na ny fananana fananana ny ranon-javatra nisy fiantraikany amin'ny fahafahany mihetsika.Ny sarin'ny fifanoheran'ny CombiMag poti dia malemy ihany koa, milaza fa ny ranon-javatra sy ny poti dia mety ho mitovy hakitroky ka noho izany dia tsy mora mifindra mankany amin'ny tsirairay. Ny herin'ny sahan'andriamby sy ny elanelana misy eo amin'ny andriamby sy ny faritra kendrena Tena zava-dehibe. Raha raisina miaraka, ireo valiny ireo dia manoro hevitra ihany koa fa, na dia afaka misambotra solombavambahoaka maro izay mikoriana amin'ny faritra kendrena aza ny andriamby, dia tsy azo inoana fa ny andriamby dia azo ianteherana amin'ny fampandehanana ny poti CombiMag eo ambonin'ny trachea.
Rehefa aterina ao amin'ny vatana ny poti dia sarotra ny mamantatra azy ireo ao anatin'ny tontolon'ny tavy mihetsiketsika be pitsiny, saingy nohatsaraina ny fahaizana mamantatra azy ireo amin'ny fandikana ny andriamby mitsivalana eo ambonin'ny trachea mba "hanozongozona" ny tadin'ny MP. Mifanohitra amin'ny fandalinana in vitro, ny poti dia tsy azo taritina miaraka amin'ny trachea amin'ny alàlan'ny fandikana ny andriamby. Ity fikarohana ity dia mifanaraka amin'ny fomba fiasan'ny mucus izay manarona ny eran'ny trachea amin'ny ankapobeny ireo singa voafoka, famandrihana azy ireo ao anaty mucus ary avy eo dia esorina amin'ny alàlan'ny mekanika fanadiovana mucociliary.
Noheverinay fa ny fampiasana andriamby ho fisarihana ambony sy ambany ny trachea (sary 3b) dia mety hiteraka sahan'andriamby mitovitovy kokoa, fa tsy sahan'andriamby izay mifantoka be amin'ny teboka iray, mety hitarika ho amin'ny fizarana zarazara mitovy kokoa. Ireo fikarohana roa ireo dia mampiseho fa tsy manatsara ny fanaraha-maso eo an-toerana amin'ny tanjona MP ny fametrahana andriamby roa, ary sarotra ny manamboatra ny hery andriamby matanjaka aterak'izany, ka mahatonga an'io fomba io ho tsy azo ampiharina. ao anatin'ny faritry ny fanapotehana.Noho izany, ny fanamafisam-peo andriamby zoro 30 degre (sary 3a) dia heverina ho fomba mora indrindra sy mahomby indrindra amin'ny fitiliana in vivo.
Ny fandinihana LV-MP dia naneho fa rehefa nampiarahina tamin'ny CombiMag ny vectors LV ary naterina taorian'ny fikorontanana ara-batana teo anatrehan'ny sahan'andriamby, dia nitombo be ny haavon'ny transduction tao amin'ny trachea raha oharina amin'ny fanaraha-maso. mitarika ho amin'ny fahombiazana ambony kokoa raha ny fampihenana ny naterina titers, off-kendrena transduction, mamaivay sy ny hery fiarovana, ary ny fototarazo vidin'ny mpitatitra.
Fotoana fandefasana: Jul-16-2022
