Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew titfi l-modalità ta' kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Vetturi tal-ġeni għat-trattament tal-marda tal-pulmun bil-fibrożi ċistika għandhom jimmiraw lejn il-passaġġi tan-nifs li jikkonduċu l-arja għaliex it-trażduzzjoni periferali tal-pulmun ma tipprovdix benefiċċju terapewtiku. L-effiċjenza tat-trażduzzjoni virali hija direttament relatata mal-ħin ta' residenza tal-vettur. Madankollu, fluwidi tal-kunsinna bħal trasportaturi tal-ġeni jinfirxu b'mod naturali fl-alveoli waqt l-ispirazzjoni, u partiċelli terapewtiċi ta' kwalunkwe forma jitneħħew malajr permezz ta' trasport mukoċiljari. It-titwil tal-ħin ta' residenza tat-trasportaturi tal-ġeni fil-passaġġi tan-nifs huwa importanti iżda diffiċli biex jinkiseb. Partiċelli manjetiċi konjugati ma' trasportatur tal-ġeni li jistgħu jiġu diretti lejn il-wiċċ tal-passaġġi tan-nifs jistgħu jtejbu l-immirar reġjonali. Minħabba l-isfidi tal-viżwalizzazzjoni in vivo, l-imġiba ta' partiċelli manjetiċi żgħar bħal dawn fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs fil-preżenza ta' kamp manjetiku applikat mhix mifhuma sew. L-għan ta' dan l-istudju kien li jintuża immaġini sinkrotron biex jiġi viżwalizzat il-moviment in vivo ta' serje ta' partiċelli manjetiċi fit-trakea ta' firien anestetizzati biex jiġu eżaminati d-dinamika u x-xejriet tal-imġiba tal-partiċelli individwali u tal-massa in vivo. Imbagħad ivvalutajna wkoll jekk il-kunsinna ta' partiċelli manjetiċi lentivirali fil-preżenza ta' kamp manjetiku żżidx l-effiċjenza tat-trażduzzjoni fit-trakea tal-firien. Sinkrotron L-immaġini bir-raġġi-X tiżvela l-imġiba tal-partiċelli manjetiċi f'kampi manjetiċi stazzjonarji u li jiċċaqalqu in vitro u in vivo. Il-partiċelli ma jistgħux jiġu mkaxkra faċilment tul il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs ħaj bil-kalamiti, iżda waqt it-trasport, id-depożiti huma kkonċentrati fil-kamp viżiv fejn il-kamp manjetiku huwa l-aktar qawwi. L-effiċjenza tat-trasduzzjoni żdiedet ukoll sitt darbiet meta l-partiċelli manjetiċi lentivirali twasslu fil-preżenza ta' kamp manjetiku. Flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-partiċelli manjetiċi lentivirali u l-kampi manjetiċi jistgħu jkunu approċċi siewja biex itejbu l-immirar tal-vettur tal-ġeni u jżidu l-livelli ta' trasduzzjoni fil-passaġġi tan-nifs konduttivi in ​​vivo.
Il-fibrożi ċistika (CF) hija kkawżata minn varjazzjoni f'ġene wieħed imsejjaħ ir-regolatur tal-konduttanza transmembrana tas-CF (CFTR). Il-proteina CFTR hija kanal joniku li huwa preżenti f'ħafna ċelloli epiteljali madwar il-ġisem, inklużi l-passaġġi tan-nifs li jikkonduċu, sit ewlieni tal-patoġenesi tas-CF. Id-difetti tas-CFTR iwasslu għal trasport anormali tal-ilma, jiddeidrataw il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs u jnaqqsu l-fond tas-saff tal-likwidu tal-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs (ASL). Dan ixekkel ukoll il-kapaċità tas-sistema tat-trasport mukoċiljari (MCT) li tneħħi l-partiċelli u l-patoġeni inalati mill-passaġġi tan-nifs. L-għan tagħna huwa li niżviluppaw terapija ġenika lentivirali (LV) biex nipprovdu l-kopja korretta tal-ġene CFTR u ntejbu s-saħħa tal-ASL, l-MCT, u l-pulmun, u li nkomplu niżviluppaw teknoloġiji ġodda kapaċi li jkejlu dawn il-parametri in vivo1.
Il-vetturi LV huma wieħed mill-kandidati ewlenin għat-terapija ġenika tal-passaġġ tan-nifs CF, prinċipalment għax jistgħu jintegraw b'mod permanenti l-ġene terapewtiku fiċ-ċelloli bażali tal-passaġġ tan-nifs (ċelloli staminali tal-passaġġ tan-nifs). Dan huwa importanti għax jistgħu jirrestawraw l-idratazzjoni normali u t-tneħħija tal-mukus billi jiddifferenzjaw f'ċelloli tal-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs assoċjati mas-CF ikkoreġuti bil-ġene funzjonali, li jirriżulta f'benefiċċji tul il-ħajja. Il-vetturi LV għandhom ikunu diretti kontra l-passaġġ tan-nifs konduttiv, peress li hawnhekk tibda l-marda tal-pulmun CF. Il-kunsinna tal-vettur aktar fil-fond fil-pulmun tista' tirriżulta fi trasduzzjoni alveolari, iżda dan m'għandu l-ebda benefiċċju terapewtiku fis-CF. Madankollu, fluwidi bħal trasportaturi tal-ġeni jemigraw b'mod naturali lejn l-alveoli mal-ispirazzjoni wara l-kunsinna3,4 u l-partiċelli terapewtiċi jitneħħew malajr fil-kavità orali permezz tal-MCT. L-effiċjenza tat-trasduzzjoni tal-LV hija direttament relatata mat-tul ta' żmien li l-vettur jibqa' ħdejn iċ-ċelloli fil-mira biex jippermetti l-assorbiment ċellulari - il-"ħin ta' residenza"5 - li jitnaqqas faċilment permezz ta' fluss tal-arja reġjonali tipiku kif ukoll qbid ikkoordinat tal-mukus tal-partiċelli u MCT. Għas-CF, il-kapaċità li jiġi prolungat il-ħin ta' residenza tal-LV fil-passaġġ tan-nifs hija importanti biex jinkisbu livelli għoljin ta' trasduzzjoni f'dan ir-reġjun, iżda s'issa kienet ta' sfida.
Biex negħlbu dan l-ostaklu, nissuġġerixxu li l-partiċelli manjetiċi LV (MPs) jistgħu jgħinu b'żewġ modi komplementari. L-ewwel, jistgħu jiġu ggwidati manjetikament lejn il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs biex itejbu l-immirar u jgħinu lill-partiċelli tat-trasport tal-ġeni jgħixu fir-reġjun mixtieq tal-passaġġ tan-nifs; u ASL) biex jiċċaqalqu lejn is-saff taċ-ċellula 6. L-MPs intużaw ħafna bħala vetturi mmirati għall-kunsinna tal-mediċini meta jorbtu ma' antikorpi, mediċini kemoterapewtiċi, jew molekuli żgħar oħra li jeħlu mal-membrani taċ-ċelluli jew jorbtu ma' riċetturi rilevanti tal-wiċċ taċ-ċelluli u jakkumulaw f'siti tat-tumur fil-preżenza ta' elettriku statiku. Oqsma Manjetiċi għat-Trattament tal-Kanċer 7. Tekniki "ipertermali" oħra għandhom l-għan li jsaħħnu l-MPs meta jkunu esposti għal oqsma manjetiċi oxxillanti, u b'hekk jeqirdu ċ-ċelloli tat-tumur. Il-prinċipju tat-trasfezzjoni manjetika, fejn kamp manjetiku jintuża bħala aġent tat-trasfezzjoni biex itejjeb it-trasferiment tad-DNA għaċ-ċelloli, huwa komunement użat in vitro bl-użu ta' firxa ta' vettori tal-ġeni mhux virali u virali għal linji taċ-ċelloli diffiċli biex jiġu trasdotti. L-effettività tat-trasfezzjoni manjetika tal-LV ġiet stabbilita, bil-kunsinna in vitro ta' LV-MPs lil linja taċ-ċelloli epiteljali bronkjali umani fil-preżenza ta' kamp manjetiku statiku, li żżid l-effiċjenza tat-trasduzzjoni b'186 darba meta mqabbla mal-vettur LV waħdu. LV-MP ġie applikat ukoll għal mudell CF in vitro, fejn it-trasfezzjoni manjetika żiedet it-trasduzzjoni tal-LV f'kulturi ta' interfaċċja arja-likwidu b'20 darba fil-preżenza ta' sputum CF10. Madankollu, it-trasfezzjoni manjetika in vivo tal-organi rċeviet relattivament ftit attenzjoni u ġiet evalwata biss fi ftit studji fuq l-annimali11,12,13,14,15, speċjalment fil- pulmuni16,17. Madankollu, l-opportunitajiet għat-trasfezzjoni manjetika fit-terapija tal-pulmun CF huma ċari. Tan et al. (2020) iddikjaraw li "studju ta' prova tal-kunċett ta' kunsinna pulmonari effiċjenti ta' nanopartiċelli manjetiċi se jwitti t-triq għal strateġiji futuri ta' inalazzjoni CFTR biex itejbu r-riżultati kliniċi f'pazjenti CF"6.
L-imġiba ta' partiċelli manjetiċi żgħar fuq l-uċuħ tal-passaġġi tan-nifs fil-preżenza ta' kamp manjetiku applikat hija diffiċli biex tiġi viżwalizzata u studjata, u għalhekk mifhuma ħażin. Fi studji oħra, żviluppajna metodu ta' immaġini bir-raġġi-X b'kuntrast ta' fażi bbażat fuq il-propagazzjoni tas-sinkrotron (PB-PCXI) biex nivviżwalizzaw u nikkwantifikaw b'mod mhux invażiv bidliet żgħar in vivo fil-fond tal-ASL18 u l-imġiba tal-MCT19,20 biex inkejlu direttament l-idratazzjoni tal-wiċċ tal-Kanal tal-gass u użajna bħala indikatur bikri tal-effikaċja tat-trattament. Barra minn hekk, il-metodu ta' evalwazzjoni tal-MCT tagħna juża partiċelli b'dijametru ta' 10–35 µm magħmula minn alumina jew ħġieġ b'indiċi ta' rifrazzjoni għoli bħala markaturi MCT viżibbli bl-użu ta' PB-PCXI21. Iż-żewġ tekniki huma adattati għall-viżwalizzazzjoni ta' firxa ta' tipi ta' partiċelli, inkluż MP.
Minħabba r-riżoluzzjoni spazjali u temporali għolja tagħha, it-tekniki ta' analiżi ASL u MCT ibbażati fuq PB-PCXI tagħna huma adattati sew biex jeżaminaw id-dinamika u x-xejriet tal-imġiba ta' partiċelli singoli u bl-ingrossa in vivo biex jgħinuna nifhmu u nottimizzaw it-tekniki tal-kunsinna tal-ġeni MP. L-approċċ li nużaw hawnhekk ġej mill-istudji tagħna bl-użu tal-linja ta' raġġ SPring-8 BL20B2, fejn viżwalizzajna l-moviment tal-fluwidu wara l-kunsinna ta' doża ta' vettur finta fil-passaġġi tan-nifs nażali u pulmonari tal-ġrieden biex ngħinu nispjegaw ix-xejriet ta' espressjoni tal-ġeni mhux uniformi tagħna osservati fl-istudji tagħna fuq annimali b'doża ta' trasportatur tal-ġeni 3,4.
L-għan ta' dan l-istudju kien li juża s-sinkrotron PB-PCXI biex jivviżwalizza l-movimenti in vivo ta' serje ta' MPs fit-trakea ta' firien ħajjin. Dawn l-istudji tal-immaġini PB-PCXI kienu mfassla biex jittestjaw firxa ta' MPs, saħħiet tal-kamp manjetiku, u postijiet biex jiddeterminaw l-effett tagħhom fuq il-moviment tal-MP. Aħna ipoteżizzajna li kamp manjetiku applikat esternament jgħin lill-MP ikkonsenjat jibqa' jew jiċċaqlaq lejn iż-żona fil-mira. Dawn l-istudji ppermettewlna wkoll li nidentifikaw konfigurazzjonijiet tal-kalamiti li jimmassimizzaw in-numru ta' partiċelli miżmuma fit-trakea wara d-depożizzjoni. Fit-tieni serje ta' studji, fittixna li nużaw din il-konfigurazzjoni ottimali biex nuru l-mudell ta' trasduzzjoni li jirriżulta mill-kunsinna in vivo ta' LV-MPs lill-passaġġ tan-nifs tal-firien, ibbażat fuq is-suppożizzjoni li l-kunsinna ta' LV-MPs fil-kuntest tal-immirar tal-passaġġ tan-nifs tirriżulta f'effiċjenza mtejba tat-trasduzzjoni tal-LV.
L-istudji kollha fuq l-annimali twettqu skont il-protokolli approvati mill-Università ta' Adelaide (M-2019-060 u M-2020-022) u l-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tas-Sinkrotron SPring-8. L-esperimenti twettqu skont il-linji gwida tal-ARRIVE.
L-immaġini kollha bir-raġġi-X twettqu fil-linja tar-raġġi BL20XU fis-sinkrotron SPring-8 fil-Ġappun, bl-użu ta' setup simili għal dak deskritt qabel21,22. Fil-qosor, il-kaxxa sperimentali kienet tinsab 245 m miċ-ċirku tal-ħażna tas-sinkrotron. Distanza ta' 0.6 m bejn il-kampjun u d-ditekter tintuża għal studji ta' immaġini ta' partiċelli u 0.3 m għal studji ta' immaġini in vivo biex jiġġeneraw effetti ta' kuntrast tal-fażi. Intużat enerġija ta' raġġ monokromatiku ta' 25 keV. L-immaġini nqabdu bl-użu ta' konvertitur tar-raġġi-X b'riżoluzzjoni għolja (SPring-8 BM3) akkoppjat ma' ditekter sCMOS. Il-konvertitur jikkonverti r-raġġi-X f'dawl viżibbli bl-użu ta' xintillatur ta' 10 µm ħxuna (Gd3Al2Ga3O12), li mbagħad jiġi dirett lejn sensur sCMOS bl-użu ta' oġġettiv ta' mikroskopju × 10 (NA 0.3). Id-ditekter sCMOS kien Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, il-Ġappun) b'daqs ta' matriċi ta' 2048 × 2048 pixel u daqs mhux ipproċessat tal-pixel ta' 6.5 × 6.5 µm. Din is-setup tagħti daqs effettiv tal-pixel iżotropiku ta' 0.51 µm u kamp viżiv ta' madwar 1.1 mm × 1.1 mm. Intgħażel tul ta' espożizzjoni ta' 100 ms biex jiġi massimizzat il-proporzjon sinjal-ħoss tal-partiċelli manjetiċi ġewwa u barra l-passaġġ tan-nifs filwaqt li jiġu minimizzati l-artefatti tal-moviment ikkawżati min-nifs. Għal studji in vivo, tqiegħed shutter veloċi tar-raġġi-X fil-mogħdija tar-raġġi-X biex jillimita d-doża tar-radjazzjoni billi jimblokka r-raġġ tar-raġġi-X bejn l-espożizzjonijiet.
It-trasportatur LV ma ntuża fl-ebda studju tal-immaġini SPring-8 PB-PCXI għaliex il-kamra tal-immaġini BL20XU mhijiex iċċertifikata għal-Livell 2 ta' Bijosigurtà. Minflok, għażilna firxa ta' MPs karatterizzati sew minn żewġ fornituri kummerċjali—li jkopru firxa ta' daqsijiet, materjali, konċentrazzjonijiet tal-ħadid, u applikazzjonijiet—l-ewwel biex nifhmu kif il-kampi manjetiċi jaffettwaw il-moviment tal-MP fi ħdan il-kapillari tal-ħġieġ, u mbagħad fil-passaġġi tan-nifs ħajjin. fuq il-wiċċ. L-MPs ivarjaw fid-daqs minn 0.25 sa 18 μm u huma magħmula minn varjetà ta' materjali (ara Tabella 1), iżda l-kompożizzjoni ta' kull kampjun, inkluż id-daqs tal-partiċelli manjetiċi fi ħdan l-MP, mhix magħrufa. Abbażi tal-istudji estensivi tagħna tal-MCT 19, 20, 21, 23, 24, nistennew li MPs żgħar daqs 5 μm jistgħu jidhru fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs tat-trakea, pereżempju billi jitnaqqsu frejms konsekuttivi biex tara viżibilità mtejba tal-moviment tal-MP. MP wieħed ta' daqs 0.25 μm huwa iżgħar mir-riżoluzzjoni tal-apparat tal-immaġini, iżda l-PB-PCXI huwa mistenni li jinduna bil-kuntrast tal-volum tagħhom u l-moviment tal-fluwidu tal-wiċċ li fuqu jiġu depożitati wara d-depożizzjoni.
Kampjuni għal kull MP fit-Tabella 1 ġew ippreparati f'kapillari tal-ħġieġ ta' 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) b'dijametru intern ta' 0.63 mm. Partiċelli korpuskulari huma disponibbli fl-ilma, filwaqt li l-partiċelli CombiMag huma disponibbli fil-fluwidu proprjetarju tal-manifattur. Kull tubu huwa nofs mimli b'likwidu (madwar 11 μl) u mqiegħed fuq id-detentur tal-kampjun (ara l-Figura 1). Il-kapillari tal-ħġieġ tqiegħdu orizzontalment fuq l-istadju tal-kampjun fil-kaxxa tal-immaġini, rispettivament, u pożizzjonati mat-truf tal-fluwidu. Kalamita tan-nikil, tan-neodimju, tal-ħadid u tal-boron (NdFeB) b'dijametru ta' 19 mm (tul ta' 28 mm) (N35, numru tal-kat. LM1652, Jaycar Electronics, l-Awstralja) b'manjetizzazzjoni residwa ta' 1.17 Tesla ġiet imwaħħla ma' stadju ta' traduzzjoni separat biex jinkiseb tibdil fil-pożizzjoni tiegħu mill-bogħod waqt l-immaġini. L-akkwist tal-immaġni bir-raġġi-X jibda meta l-kalamita tkun pożizzjonata madwar 30 mm 'il fuq mill-kampjun, u l-immaġnijiet jinkisbu b'rata ta' 4 frejms kull sekonda. Waqt l-immaġini, il-kalamita nġiebet qrib it-tubu kapillari tal-ħġieġ (madwar 1 mm 'il bogħod) u mbagħad trasferit tul it-tubu biex jiġu vvalutati l-effetti tas-saħħa tal-kamp u l-pożizzjoni.
Setup ta' immaġini in vitro li fih kampjuni MP f'kapillari tal-ħġieġ fuq l-istadju tat-traduzzjoni xy tal-kampjun. Il-mogħdija tar-raġġ tar-raġġi-X hija mmarkata b'linja ħamra bit-tikek.
Ladarba ġiet stabbilita l-viżibilità in vitro tal-MPs, sottosett minnhom ġie ttestjat in vivo fi firien nisa albini Wistar tat-tip selvaġġ (~12-il ġimgħa, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Ġappun), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Ġappun) u 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) Il-firien ġew anestetizzati b'taħlita ta' Pharma), Ġappun) permezz ta' injezzjoni intraperitoneali. Wara l-anestesija, ġew ippreparati għall-immaġini billi tneħħa l-pil madwar it-trakea, iddaħħal tubu endotrakeali (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) u ġew immobilizzati supinati fuq pjanċa tal-immaġini magħmula apposta li fiha borża termali biex tinżamm it-temperatura tal-ġisem 22. Il-pjanċa tal-immaġini mbagħad ġiet imwaħħla mal-istadju tat-traduzzjoni tal-kampjun fil-kaxxa tal-immaġini f'angolu żgħir biex tallinja t-trakea orizzontalment fl-immaġni bir-raġġi-X, kif muri fil-Figura 2a.
(a) Is-setup tal-immaġini in vivo fil-kaxxa tal-immaġini SPring-8, il-mogħdija tar-raġġ tar-raġġi-X hija mmarkata b'linja ħamra mqattgħa. (b,c) Il-lokalizzazzjoni tal-kalamita fuq it-trakea twettqet mill-bogħod bl-użu ta' żewġ kameras IP immuntati ortogonalment. Fuq in-naħa tax-xellug tal-immaġni tal-iskrin, tista' tidher il-linja tal-wajer li żżomm ir-ras, u l-kannula tal-kunsinna f'postha fit-tubu ET.
Sistema ta' pompa tas-siringa kkontrollata mill-bogħod (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) li tuża siringa tal-ħġieġ ta' 100 μl ġiet imqabbda ma' tubu PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) permezz ta' labra ta' 30 Ga. Immarka t-tubu biex tiżgura li l-ponta tkun fil-pożizzjoni korretta fit-trakea meta tiddaħħal it-tubu ET. Bl-użu tal-mikropompa, il-planġer tas-siringa tneħħa waqt li l-ponta tat-tubu kienet mgħaddsa fil-kampjun MP li kellu jitwassal. It-tubu tal-kunsinna mgħobbi mbagħad iddaħħal fit-tubu endotrakeali, billi tpoġġiet il-ponta fl-aktar parti b'saħħitha tal-kamp manjetiku applikat mistenni tagħna. L-akkwist tal-immaġni ġie kkontrollat ​​bl-użu ta' ditekter tar-respirazzjoni konness mal-kaxxa tal-ħin ibbażata fuq Arduino tagħna, u s-sinjali kollha (eż. temperatura, respirazzjoni, ftuħ/għeluq tax-shutter u akkwist tal-immaġni) ġew irreġistrati bl-użu ta' Powerlab u LabChart (AD Instruments, Sydney, l-Awstralja) 22. Meta ttieħdu l-immaġini, meta l-għeluq ma kienx aċċessibbli, żewġ kameras IP (Panasonic BB-SC382) ġew pożizzjonati f'madwar 90° ma' xulxin u ntużaw biex jimmonitorjaw il-pożizzjoni tal-kalamita relattiva... għat-trakea waqt l-immaġini (Fig. 2b,c). Biex jiġu minimizzati l-artefatti tal-moviment, inkisbet immaġni waħda għal kull nifs matul il-plateau tal-fluss tat-tmiem tal-marea.
Kalamita hija mwaħħla ma' stadju ieħor li jista' jitqiegħed mill-bogħod minn barra l-housing tal-immaġini. Ġew ittestjati diversi pożizzjonijiet u konfigurazzjonijiet tal-kalamiti, inklużi: Immuntati f'angolu ta' madwar 30° 'il fuq mit-trakea (konfigurazzjonijiet murija fil-Figuri 2a u 3a); kalamita waħda 'l fuq mill-annimal u l-oħra taħtha, bil-poli ssettjati biex jattiraw (Figura 3b); kalamita waħda 'l fuq mill-annimal u l-oħra taħtha, bil-poli ssettjati biex jirripellaw (Figura 3c); u kalamita waħda 'l fuq u perpendikolari għat-trakea (Figura 3d). Ladarba l-annimal u l-kalamita jkunu kkonfigurati u l-MP li għandu jiġi ttestjat jitgħabba fil-pompa tas-siringa, agħti doża ta' 50 μl b'rata ta' 4 μl/sek waqt li takkwista l-immaġini. Il-kalamita mbagħad tiġi mċaqalqa 'l quddiem u lura tul jew lateralment mat-trakea waqt li tkompli takkwista l-immaġini.
Konfigurazzjoni tal-kalamita għall-immaġini in vivo (a) kalamita waħda 'l fuq mit-trakea f'angolu ta' madwar 30°, (b) żewġ kalamiti ssettjati biex jattiraw, (ċ) żewġ kalamiti ssettjati biex jirripellaw, (d) kalamita waħda 'l fuq u perpendikolari fit-trakea. L-osservatur ħares 'l isfel mill-ħalq lejn il-pulmuni mit-trakea, u r-raġġ tar-raġġi-X għadda min-naħa tax-xellug tal-far u ħareġ min-naħa tal-lemin. Il-kalamita jew tiġi mċaqalqa tul it-tul tal-passaġġ tan-nifs jew lejn ix-xellug u l-lemin 'il fuq mit-trakea fid-direzzjoni tar-raġġ tar-raġġi-X.
Fittixna wkoll li niddeterminaw il-viżibilità u l-imġiba tal-partiċelli fil-passaġġi tan-nifs fin-nuqqas ta' nifs u moviment kardijaku li jħawdu. Għalhekk, fi tmiem il-perjodu tal-immaġini, l-annimali nqatlu b'mod uman għal doża eċċessiva ta' pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Xi annimali tħallew fuq il-pjattaforma tal-immaġini, u ladarba n-nifs u t-taħbit tal-qalb waqfu, il-proċess tal-immaġini ġie ripetut, billi żdiedet doża addizzjonali ta' MP jekk l-ebda MP ma kien viżibbli fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs.
L-immaġnijiet miksuba ġew ikkoreġuti b'kamp ċatt u b'kamp skur u mbagħad ingħaqdu f'film (20 frejm kull sekonda; 15-25 × veloċità normali skont ir-rata respiratorja) bl-użu ta' skript apposta miktub f'MATLAB (R2020a, The Mathworks).
L-istudji kollha dwar il-kunsinna tal-vettur tal-ġene LV twettqu fil-Faċilità tar-Riċerka tal-Annimali tal-Laboratorju fl-Università ta' Adelaide u kellhom l-għan li jużaw ir-riżultati tal-esperiment SPring-8 biex jivvalutaw jekk il-kunsinna tal-LV-MP fil-preżenza ta' kamp manjetiku tistax ittejjeb it-trasferiment tal-ġeni in vivo. Biex jiġu vvalutati l-effetti tal-MP u l-kamp manjetiku, żewġ gruppi ta' annimali ġew ittrattati: grupp wieħed ingħata LV-MP b'kalamita mqiegħda, u l-grupp l-ieħor irċieva grupp ta' kontroll b'LV-MP mingħajr kalamita.
Il-vetturi tal-ġene LV ġew iġġenerati bl-użu ta' metodi deskritti qabel 25, 26. Il-vettur LacZ jesprimi l-ġene beta-galactosidase lokalizzat fin-nuklei mmexxi mill-promotur kostituttiv tal-MPSV (LV-LacZ), li jipproduċi prodott ta' reazzjoni blu f'ċelloli trasdotti, viżibbli fil-fronti tat-tessut tal-pulmun u fis-sezzjonijiet tat-tessut. It-titrazzjoni twettqet f'kulturi taċ-ċelloli billi ngħadd manwalment in-numru ta' ċelloli pożittivi għal LacZ b'emoċitometru biex jiġi kkalkulat it-titru f'TU/ml. It-trasportaturi huma krijopreservati f'-80 °C, imdewba qabel l-użu, u marbuta ma' CombiMag billi jitħalltu fi proporzjon ta' 1:1 u jiġu inkubati fuq is-silġ għal mill-inqas 30 minuta qabel il-kunsinna.
Firien normali Sprague Dawley (n = 3/grupp, ~2-3 ġew anestetizzati intraperitonealment b'taħlita ta' 0.4 mg/kg medetomidina (Domitor, Ilium, l-Awstralja) u 60 mg/kg ketamina (Ilium, l-Awstralja) (xahar) ip) injezzjoni u kanulazzjoni orali mhux kirurġika b'kannula iv ta' 16 Ga. Biex jiġi żgurat li t-tessut tal-passaġġ tan-nifs tat-trakea jirċievi trasduzzjoni LV, ġie kkundizzjonat bl-użu tal-protokoll ta' perturbazzjoni mekkanika deskritt qabel, fejn il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs tat-trakea ġie mgħorok assjalment b'basket tal-wajer (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. L-għoti tat-trakea ta' LV-MP imbagħad twettqet f'kabinett tas-sigurtà bijoloġika madwar 10 minuti wara l-perturbazzjoni.
Il-kamp manjetiku użat f'dan l-esperiment kien ikkonfigurat b'mod simili għall-istudju tal-immaġini bir-raġġi-X in vivo, bl-istess kalamiti miżmuma 'l fuq mit-trakea bl-użu ta' klipps ta' stent tad-distillazzjoni (Figura 4). Volum ta' 50 μl (2 × 25 μl alikwoti) ta' LV-MP twassal fit-trakea (n = 3 annimali) bl-użu ta' pipetta li fiha ponta tal-ġell kif deskritt qabel. Grupp ta' kontroll (n = 3 annimali) irċieva l-istess LV-MPs mingħajr l-użu ta' kalamita. Wara li titlesta l-infużjoni, il-kannula titneħħa mit-tubu ET u l-annimal jiġi estubat. Il-kalamita tibqa' f'postha għal 10 minuti, imbagħad titneħħa. Il-firien irċevew doża taħt il-ġilda ta' meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, l-Awstralja) segwita minn treġġigħ lura tal-anestesija permezz ta' injezzjoni ip ta' 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, l-Awstralja). Il-firien inżammu sħan u ġew immonitorjati sakemm irkupru sħiħ mill-anestesija.
Apparat tal-kunsinna LV-MP f'kabinett tas-sigurtà bijoloġika. Il-buttun Luer griż ċar tat-tubu ET jista' jidher ħiereġ mill-ħalq u l-ponta tal-ġell tal-pipetta murija fl-istampa tiddaħħal mit-tubu ET sal-fond mixtieq fit-trakea.
Ġimgħa wara l-proċedura tad-dożaġġ tal-LV-MP, l-annimali nqatlu b'mod uman permezz ta' inalazzjoni ta' 100% CO2 u l-espressjoni ta' LacZ ġiet ivvalutata bl-użu tat-trattament standard tagħna X-gal. It-tliet ċrieki kawdali l-aktar kartilaġini tneħħew biex jiġi żgurat li kwalunkwe ħsara mekkanika jew żamma ta' fluwidu mit-tqegħid tat-tubu endotrakeali ma ġietx inkluża fl-analiżi. Kull trakea nqatgħet lonġitudinalment biex jinħolqu żewġ nofsijiet għall-analiżi, u ġew immuntati f'dixx li fih gomma tas-silikon (Sylgard, Dow Inc) bl-użu ta' labra Minutien (Fine Science Tools) biex jiġi viżwalizzat il-wiċċ luminali. Id-distribuzzjoni u l-mudell taċ-ċelloli trasdotti ġew ikkonfermati permezz ta' fotografija frontali bl-użu ta' mikroskopju Nikon (SMZ1500) b'kamera DigiLite u softwer TCapture (Tucsen Photonics, iċ-Ċina). L-immaġini nkisbu b'ingrandiment ta' 20x (inkluż l-ogħla setting għall-wisa' sħiħa tat-trakea), bit-tul kollu tat-trakea immaġinat pass pass, u b'hekk jiġi żgurat biżżejjed sovrappożizzjoni bejn kull immaġni biex jippermetti l-"ħjata" tal-immaġni. Imbagħad ġew immuntati immaġini minn kull trakea. f'immaġni komposta waħda bl-użu tal-Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) li juża algoritmu ta' moviment planari. Iż-żoni ta' espressjoni ta' LacZ f'immaġni komposti tat-trakea minn kull annimal ġew kwantifikati bl-użu ta' skript MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel, bl-użu ta' settings ta' 0.35 < Lewn < 0.58, Saturazzjoni > 0.15, u Valur < 0.7. Billi ġew traċċati l-kontorni tat-tessut, ġiet iġġenerata maskra manwalment f'GIMP v2.10.24 għal kull immaġni komposta sabiex tiġi identifikata ż-żona tat-tessut u tiġi evitata kwalunkwe skoperta falza minn barra t-tessut tat-trakea. Iż-żoni mtebbgħin mill-immaġni komposti kollha minn kull annimal ġew miġbura flimkien biex jiġġeneraw iż-żona mtebbgħa totali għal dak l-annimal. Iż-żona mtebbgħa mbagħad ġiet diviża bl-erja totali tal-maskra biex tiġġenera ż-żona normalizzata.
Kull trakea ġiet inkorporata fil-paraffina u nqatgħu sezzjonijiet ta' 5 μm. Is-sezzjonijiet ġew imtebbgħin b'kontra-aħmar newtrali mgħaġġel għal 5 minuti u l-immaġini nkisbu bl-użu ta' mikroskopju Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 u softwer tal-qbid tal-elementi NIS (verżjoni 5.20.00).
L-analiżijiet statistiċi kollha twettqu f'GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Is-sinifikat statistiku ġie stabbilit għal p ≤ 0.05. In-normalità ġiet ivverifikata bl-użu tat-test Shapiro-Wilk, u d-differenzi fit-tebgħa ta' LacZ ġew ivvalutati bl-użu tat-test-t mhux imqabbad.
Is-sitt MPs deskritti fit-Tabella 1 ġew eżaminati bl-użu tal-PCXI, u l-viżibilità hija deskritta fit-Tabella 2. Żewġ MPs tal-polistirene (MP1 u MP2; 18 μm u 0.25 μm, rispettivament) ma kinux viżibbli taħt il-PCXI, iżda l-bqija tal-kampjuni kienu identifikabbli (eżempji huma murija fil-Figura 5). MP3 u MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm u 0.9 μm, rispettivament) huma viżibbli b'mod dgħajjef. Għalkemm fihom uħud mill-iżgħar partiċelli ttestjati, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) kien l-aktar prominenti. Il-prodott CombiMag MP6 huwa diffiċli biex jiġi identifikat. Fil-każijiet kollha, il-kapaċità tagħna li niskopru MP tjiebet b'mod sinifikanti billi ttraduċejna l-kalamita 'l quddiem u lura parallel mal-kapillari. Meta l-kalamiti tbiegħdu mill-kapillari, il-partiċelli estendew fi strixxi twal, iżda hekk kif il-kalamiti resqu eqreb u s-saħħa tal-kamp manjetiku żdiedet, il-strixxi tal-partiċelli qsaru hekk kif il-partiċelli emigraw lejn il-wiċċ ta' fuq tal-kapillari (ara l-Vidjo Supplimentari S1: MP4), u b'hekk tiżdied id-densità tal-partiċelli tal-wiċċ. Bil-maqlub, meta l-kalamita titneħħa mill-kapillari, is-saħħa tal-kamp tonqos u l-MPs jerġgħu jiġu rranġati f'kordi twal li jestendu mill-wiċċ ta' fuq tal-kapillari (ara l-Vidjo Supplimentari S2:MP4). Wara li l-kalamita tieqaf tiċċaqlaq, il-partiċelli jkomplu jiċċaqalqu għal żmien qasir wara li jilħqu l-pożizzjoni ta' ekwilibriju. Hekk kif l-MP jiċċaqlaq lejn u 'l bogħod mill-wiċċ ta' fuq tal-kapillari, il-partiċelli manjetiċi tipikament ikaxkru l-fdalijiet fil-fluwidu.
Il-viżibilità ta' MP taħt PCXI tvarja b'mod sinifikanti bejn il-kampjuni. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 u (d) MP6. L-immaġini kollha murija hawn ittieħdu b'kalamita li tinsab madwar 10 mm direttament 'il fuq mill-kapillari. Iċ-ċrieki kbar apparenti huma bżieżaq tal-arja maqbuda fil-kapillari, li juru b'mod ċar il-karatteristiċi tat-truf suwed u bojod tal-immaġini b'kuntrast tal-fażi. Il-kaxxa l-ħamra fiha l-ingrandiment li jtejjeb il-kuntrast. Innota li d-dijametri tal-iskemi tal-kalamita fil-figuri kollha mhumiex fuq skala u huma madwar 100 darba akbar milli muri.
Hekk kif il-kalamita tiġi trasferita lejn ix-xellug u l-lemin tul il-parti ta' fuq tal-kapillari, l-angolu tas-sekwenza tal-MP jinbidel biex jallinja mal-kalamita (ara l-Figura 6), u b'hekk jiddelinja l-linji tal-kamp manjetiku. Għal MP3-5, wara li l-korda tilħaq angolu limitu, il-partiċelli jiġu mkaxkra tul il-wiċċ ta' fuq tal-kapillari. Dan spiss jirriżulta fi gruppi akbar ta' MPs qrib fejn il-kamp manjetiku huwa l-aktar qawwi (ara l-Vidjo Supplimentari S3:MP5). Dan huwa wkoll partikolarment evidenti meta wieħed jimmaġina qrib it-tarf tal-kapillari, li jikkawża li l-MPs jaggregaw u jikkonċentraw fl-interfaċċja fluwidu-arja. Il-partiċelli fl-MP6, li kienu aktar diffiċli biex jiġu dixxernuti mill-MP3-5, ma ġewx imkaxkra hekk kif il-kalamita mxiet tul il-kapillari, iżda s-sekwenzi tal-MP iddissoċjaw, u ħallew il-partiċelli fil-kamp viżiv (ara l-Vidjo Supplimentari S4:MP6). F'xi każijiet, meta l-kamp manjetiku applikat tnaqqas billi l-kalamita mxiet distanza kbira mill-post tal-immaġini, kwalunkwe MPs li kien fadal niżel bil-mod lejn il-wiċċ ta' isfel tat-tubu bil-gravità filwaqt li baqa' fis-sekwenza (ara l-Vidjo Supplimentari S5: MP3).
L-angolu tas-sekwenza MP jinbidel hekk kif il-kalamita tiġi trasferita lejn il-lemin 'il fuq mill-kapillari. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 u (d) MP6. Il-kaxxa l-ħamra fiha l-ingrandiment li jtejjeb il-kuntrast. Innota li l-vidjows supplimentari huma informattivi peress li jiżvelaw struttura importanti tal-partiċelli u informazzjoni dinamika li ma tistax tiġi viżwalizzata f'dawn l-immaġini statiċi.
It-testijiet tagħna wrew li l-moviment bil-mod tal-kalamita 'l quddiem u lura tul it-trakea jiffaċilita l-viżwalizzazzjoni tal-MP fil-kuntest ta' moviment kumpless in vivo. It-testijiet in vivo ma sarux peress li ż-żibeġ tal-polistirene (MP1 u MP2) ma kinux viżibbli fil-kapillari. Kull wieħed mill-erba' MPs li fadal ġie ttestjat in vivo bl-assi twil tal-kalamita kkonfigurat 'il fuq mit-trakea f'angolu ta' madwar 30° mal-vertikali (ara l-Figuri 2b u 3a), peress li dan irriżulta f'ktajjen MP itwal u kien aktar effettiv mill-konfigurazzjoni tal-kalamita terminata. MP3, MP4 u MP6 ma nstabux fit-trakea ta' xi annimali ħajjin. Meta l-passaġġi tan-nifs tal-firien ġew immaġinati wara li l-annimali nqatlu b'mod uman, il-partiċelli baqgħu inviżibbli anke meta żdied volum addizzjonali bl-użu ta' pompa tas-siringa. MP5 kellu l-ogħla kontenut ta' ossidu tal-ħadid u kien l-unika partiċella viżibbli, u għalhekk intuża biex jivvaluta u jikkaratterizza l-imġiba in vivo tal-MP.
It-tqegħid tal-kalamita fuq it-trakea waqt il-kunsinna tal-MP irriżulta f'ħafna, iżda mhux l-MPs kollha, li kienu kkonċentrati fil-kamp viżiv. Il-partiċelli li jidħlu fit-trakea huma osservati l-aħjar f'annimali ssagrifikati b'mod uman. Il-Figura 7 u l-Vidjo Supplimentari S6: L-MP5 juri qbid manjetiku rapidu u allinjament tal-partiċelli fuq il-wiċċ tat-trakea ventrali, li jindika li l-MPs jistgħu jiġu diretti lejn reġjuni mixtieqa tat-trakea. Meta tfittxiet aktar 'il bogħod tul it-trakea wara l-kunsinna tal-MP, instabu xi MPs eqreb tal-karina, li jissuġġerixxi li s-saħħa tal-kamp manjetiku ma kinitx biżżejjed biex tiġbor u żżomm l-MPs kollha, peress li twasslu mir-reġjun tal-ogħla saħħa tal-kamp manjetiku matul il-proċess tal-fluwidu. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet tal-MP wara t-twelid kienu ogħla madwar iż-żona immaġinata, li jissuġġerixxi li ħafna MPs baqgħu fir-reġjuni tal-passaġġ tan-nifs fejn is-saħħa tal-kamp manjetiku applikat kienet l-ogħla.
Stampi minn (a) qabel u (b) wara l-kunsinna ta' MP5 fit-trakea ta' far li ġie ewtanizzat reċentement bil-kalamita pożizzjonata direttament 'il fuq miż-żona tal-immaġini. Iż-żona tal-immaġini tinsab bejn iż-żewġ ċrieki tal-qarquċa. Qabel il-kunsinna ta' MP, ikun hemm xi fluwidu fil-passaġġ tan-nifs. Il-kaxxa l-ħamra fiha l-ingrandiment li jtejjeb il-kuntrast. Dawn l-istampi huma mill-vidjo muri fil-Vidjo Supplimentari S6:MP5.
It-traduzzjoni tal-kalamita tul it-trakea in vivo kkawżat li l-katina MP tbiddel l-angolu fil-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs b'mod simili għal dak li jidher fil-kapillari (ara l-Figura 8 u l-Vidjo Supplimentari S7:MP5). Madankollu, fl-istudju tagħna, l-MPs ma setgħux jiġu mkaxkra tul il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs ħaj kif setgħu bil-kapillari. F'xi każijiet, il-katina MP titwal hekk kif il-kalamita tiċċaqlaq lejn ix-xellug u lejn il-lemin. Interessanti, sibna wkoll li s-sekwenza tal-partiċelli tidher li tbiddel il-fond tas-saff tal-fluwidu tal-wiċċ meta l-kalamita tiġi mċaqalqa lonġitudinalment tul it-trakea, u tespandi meta l-kalamita tiġi mċaqalqa direttament 'il fuq minn rasha u s-sekwenza tal-partiċelli tiġi mdawra għal pożizzjoni vertikali (ara l-Vidjo Supplimentari S7). : MP5 f'0:09, fin-naħa t'isfel tal-lemin). Il-mudell karatteristiku tal-moviment inbidel meta l-kalamita ġiet trasferita lateralment fil-parti ta' fuq tat-trakea (jiġifieri, lejn ix-xellug jew il-lemin tal-annimal aktar milli tul it-tul tat-trakea). Il-partiċelli kienu għadhom viżibbli b'mod ċar hekk kif iċċaqalqu, iżda meta l-kalamita tneħħiet mit-trakea, it-truf tal-kordi tal-partiċelli saru viżibbli (ara l-Vidjo Supplimentari S8:MP5, li jibda minn 0:08). Dan huwa konsistenti mal-imġiba tal-MP li osservajna taħt kamp manjetiku applikat f'kapillari tal-ħġieġ.
Eżempji ta' immaġnijiet li juru MP5 fit-trakea ta' far anestetizzat ħaj. (a) Il-kalamita tintuża biex takkwista immaġnijiet 'il fuq u lejn ix-xellug tat-trakea, imbagħad (b) wara li l-kalamita tiġi mċaqalqa lejn il-lemin. Il-kaxxa l-ħamra fiha l-ingrandiment li jtejjeb il-kuntrast. Dawn l-immaġnijiet huma mill-vidjo muri fil-Vidjo Supplimentari S7:MP5.
Meta ż-żewġ poli kienu kkonfigurati f'orjentazzjoni tramuntana-nofsinhar 'il fuq u taħt it-trakea (jiġifieri jattiraw; Fig. 3b), il-kordi MP dehru itwal u kienu jinsabu fuq il-ħajt tal-ġenb tat-trakea aktar milli fuq il-wiċċ dorsali tat-trakea (ara l-Vidjo Supplimentari S9:MP5). Madankollu, konċentrazzjonijiet għoljin ta' partiċelli f'post wieħed (jiġifieri, il-wiċċ dorsali tat-trakea) ma ġewx skoperti wara l-kunsinna tal-fluwidu meta ntuża apparat b'kalamita doppja, li tipikament iseħħ meta jintuża apparat b'kalamita waħda. Imbagħad meta kalamita waħda ġiet ikkonfigurata biex tirripella l-poli bil-maqlub (Fig. 3c), in-numru ta' partiċelli viżibbli fil-kamp viżiv ma deherx li jiżdied wara l-kunsinna. Is-setup taż-żewġ konfigurazzjonijiet b'kalamita doppja huwa ta' sfida minħabba s-saħħiet għoljin tal-kamp manjetiku li jiġbdu jew jimbuttaw il-kalamiti, rispettivament. Is-setup imbagħad inbidel għal kalamita waħda parallela mal-passaġġ tan-nifs iżda li tgħaddi mill-passaġġ tan-nifs f'90 grad sabiex il-linji tal-kamp qasmu l-ħajt tat-trakea ortogonalment (Fig. 3d), orjentazzjoni mfassla biex tiddetermina jekk l-aggregazzjoni tal-partiċelli fuq il-ħajt tal-ġenb tistax tiġi osservata. Madankollu, f'dan Fil-konfigurazzjoni, ma kien hemm l-ebda moviment identifikabbli ta' akkumulazzjoni ta' MP jew moviment ta' kalamita. Abbażi ta' dawn ir-riżultati kollha, intgħażlet konfigurazzjoni ta' kalamita waħda b'orjentazzjoni ta' 30 grad (Figura 3a) għal studji in vivo dwar trasportaturi ta' ġeni.
Meta l-annimal ġie ripetutament immaġinat immedjatament wara l-qtil b'mod uman, in-nuqqas ta' moviment konfuż fit-tessut fisser li linji ta' partiċelli ifjen u iqsar setgħu jiġu identifikati fil-kamp interkondrali ċar, "imċaqalqa" f'konformità mal-moviment translazzjonali tal-kalamita. Madankollu, xorta ma jistax jidher b'mod ċar il-preżenza u l-moviment tal-partiċelli MP6.
It-titru LV-LacZ kien ta' 1.8 × 108 TU/ml, u wara taħlit ta' 1:1 ma' CombiMag MP (MP6), l-annimali rċevew doża trakeali ta' 50 μl ta' 9 × 107 TU/ml LV vehicle (jiġifieri 4.5 × 106 TU/far). F'dawn l-istudji, minflok ma ttraduċejna l-kalamita waqt il-ħlas, iffissajna l-kalamita f'pożizzjoni waħda biex niddeterminaw jekk it-trażduzzjoni LV (a) tistax titjieb meta mqabbla mal-kunsinna vettorjali fin-nuqqas ta' kamp manjetiku, u (b) tistax tiġi ffukata. Iċ-ċelloli tal-passaġġ tan-nifs huma trasdotti għal reġjuni fil-mira manjetiċi tal-passaġġ tan-nifs ta' fuq.
Il-preżenza ta' kalamiti u l-użu ta' CombiMag flimkien ma' vetturi LV ma dehrux li kellhom effetti ħżiena fuq is-saħħa tal-annimali, kif għamel il-protokoll standard tagħna ta' kunsinna ta' vettur LV. Stampi frontali tar-reġjun trakeali soġġett għal perturbazzjoni mekkanika (Fig. Supplimentari 1) indikaw li kien hemm livelli sinifikament ogħla ta' trasduzzjoni fil-grupp ta' annimali ttrattati b'LV-MP meta l-kalamita kienet preżenti (Fig. 9a). Ammont żgħir biss ta' tebgħa blu LacZ kien preżenti fil-grupp ta' kontroll (Fig. 9b). Il-kwantifikazzjoni taż-żoni normalizzati mtebbgħin b'X-Gal uriet li l-għoti ta' LV-MP fil-preżenza ta' kamp manjetiku pproduċa titjib ta' madwar 6 darbiet (Fig. 9c).
Eżempji ta' immaġni komposti li juru t-trażduzzjoni tat-trakea permezz ta' LV-MP (a) fil-preżenza ta' kamp manjetiku u (b) fin-nuqqas ta' kalamita. (ċ) Titjib statistikament sinifikanti fiż-żona normalizzata tat-trażduzzjoni ta' LacZ fit-trakea meta tintuża l-kalamita (*p = 0.029, test-t, n = 3 għal kull grupp, medja ± SEM).
Sezzjonijiet imtebbgħin bl-aħmar newtrali u mgħaġġel (eżempju muri fil-Fig. Supplimentari 2) urew ċelloli mtebbgħin b'LacZ preżenti f'mudell u post simili kif irrappurtat qabel.
Sfida ewlenija għat-terapija ġenika tal-passaġġi tan-nifs tibqa' l-lokalizzazzjoni preċiża tal-partiċelli trasportaturi f'reġjuni ta' interess u l-kisba ta' livelli għoljin ta' effiċjenza tat-trasduzzjoni fil-pulmun li jiċċaqlaq fil-preżenza ta' fluss tal-arja u tneħħija attiva tal-mukus. Għal trasportaturi LV iddisinjati biex jikkuraw il-marda tal-passaġġi tan-nifs CF, iż-żieda fil-ħin ta' residenza tal-partiċelli trasportaturi fil-passaġġi tan-nifs konduttivi kienet mira s'issa elużiva. Kif irrimarkat minn Castellani et al., l-użu ta' kampi manjetiċi biex tittejjeb it-trasduzzjoni għandu vantaġġi meta mqabbel ma' metodi oħra ta' kunsinna ta' ġeni bħall-elettroporazzjoni, peress li jista' jgħaqqad is-sempliċità, l-effettività tal-ispejjeż, il-lokalizzazzjoni tal-kunsinna, effiċjenza akbar, u ħinijiet ta' inkubazzjoni iqsar, u possibilment doża iżgħar ta' trasportatur10. Madankollu, id-depożizzjoni u l-imġiba in vivo ta' partiċelli manjetiċi fil-passaġġi tan-nifs taħt l-influwenza ta' forzi manjetiċi esterni qatt ma ġew deskritti, u lanqas il-fattibbiltà ta' dan il-metodu ma ġiet murija in vivo biex ittejjeb il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni fil-passaġġi tan-nifs ħajjin intatti.
L-esperimenti in vitro tagħna tas-sinkrotron PCXI wrew li l-partiċelli kollha li ttestjajna, bl-eċċezzjoni tal-polistirene MP, kienu viżibbli fis-setup tal-immaġini li użajna. Fil-preżenza ta' kamp manjetiku, l-MPs jiffurmaw kordi li t-tul tagħhom huwa relatat mat-tip ta' partiċella u s-saħħa tal-kamp manjetiku (jiġifieri l-prossimità u l-moviment tal-kalamita). Kif muri fil-Figura 10, il-kordi li nosservaw huma ffurmati minħabba li kull partiċella individwali tiġi manjetizzata u tinduċi l-kamp manjetiku lokali tagħha stess. Dawn il-kampi separati jikkawżaw li partiċelli simili oħra jaggregaw u jikkonnettjaw, b'movimenti simili għal kordi fi grupp minħabba forzi lokali mill-forzi attraenti u repulsivi lokali ta' partiċelli oħra.
Skematika li turi (a,b) trenijiet ta' partiċelli ġġenerati ġewwa kapillari mimlija fluwidu u (c,d) trakea mimlija bl-arja. Innota li l-kapillari u t-trakea mhumiex imfassla fuq skala. Il-Panel (a) fih ukoll deskrizzjoni tal-MP, li fih partiċelli Fe3O4 irranġati fi strixxi.
Meta l-kalamita ġiet imċaqalqa 'l fuq mill-kapillari, l-angolu tas-sekwenza tal-partiċelli laħaq limitu kritiku għall-MP3-5 li fih Fe3O4, u wara dan is-sekwenza tal-partiċelli ma baqgħetx fil-pożizzjoni oriġinali, iżda mxiet tul il-wiċċ għal pożizzjoni ġdida. Dan l-effett x'aktarx iseħħ għaliex il-wiċċ kapillari tal-ħġieġ huwa lixx biżżejjed biex jippermetti li jseħħ dan il-moviment. Interessanti, MP6 (CombiMag) ma ġabx ruħu b'dan il-mod, possibilment għaliex il-partiċelli kienu iżgħar, kellhom kisi jew ħlasijiet tal-wiċċ differenti, jew fluwidu trasportatur proprjetarju affettwa l-abbiltà tagħhom li jiċċaqalqu. Il-kuntrast tal-immaġni tal-partiċelli CombiMag huwa wkoll aktar dgħajjef, li jissuġġerixxi li l-fluwidu u l-partiċelli jista' jkollhom densitajiet simili u għalhekk ma jiċċaqalqux faċilment lejn xulxin. Il-partiċelli jistgħu wkoll jeħlu jekk il-kalamita tiċċaqlaq malajr wisq, li jindika li s-saħħa tal-kamp manjetiku mhux dejjem tista' tegħleb il-frizzjoni bejn il-partiċelli fil-fluwidu, li jissuġġerixxi li forsi mhux sorprendenti li s-saħħa tal-kamp manjetiku u d-distanza bejn il-kalamita u ż-żona fil-mira huma importanti ħafna. Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu wkoll li, filwaqt li l-kalamiti jistgħu jaqbdu ħafna MPs li jiċċirkolaw miż-żona fil-mira, mhux probabbli li l-kalamiti jistgħu jiġu fdati biex jiċċaqalqu. Partiċelli CombiMag tul il-wiċċ tat-trakea. Għalhekk, nikkonkludu li studji in vivo LV-MP għandhom jużaw kampi manjetiċi statiċi biex jimmiraw fiżikament reġjuni speċifiċi tas-siġra tal-passaġġ tan-nifs.
Meta l-partiċelli jitwasslu fil-ġisem, ikun diffiċli li jiġu identifikati fil-kuntest ta’ tessut tal-ġisem kumpless li jiċċaqlaq, iżda l-abbiltà li jiġu skoperti tjiebet billi l-kalamita tiġi trasferita orizzontalment 'il fuq mit-trakea biex "tiċċaqlaq" il-kordi tal-MP. Għalkemm l-immaġini ħajjin huma possibbli, huwa aktar faċli li wieħed jagħraf il-moviment tal-partiċelli ladarba l-annimal ikun inqatel b'mod uman. Il-konċentrazzjonijiet tal-MP ġeneralment kienu l-ogħla f'dan il-post meta l-kalamita kienet pożizzjonata 'l fuq miż-żona tal-immaġini, għalkemm xi partiċelli ġeneralment instabu aktar tul it-trakea. B'kuntrast ma' studji in vitro, il-partiċelli ma jistgħux jiġu mkaxkra tul it-trakea billi l-kalamita tiġi trasferita. Din is-sejba hija konsistenti ma' kif il-mukus li jiksi l-wiċċ tat-trakea tipikament jipproċessa l-partiċelli inalati, jaqbadhom fil-mukus u sussegwentement jitneħħa mill-mekkaniżmu ta' tneħħija mukoċiljari.
Aħna ipoteżizzajna li l-użu ta' kalamiti għall-attrazzjoni 'l fuq u taħt it-trakea (Fig. 3b) jista' jirriżulta f'kamp manjetiku aktar uniformi, aktar milli kamp manjetiku li huwa kkonċentrat ħafna f'punt wieħed, li potenzjalment iwassal għal distribuzzjoni aktar uniformi tal-partiċelli. Madankollu, l-istudju preliminari tagħna ma sabx evidenza ċara li tappoġġja din l-ipoteżi. Bl-istess mod, il-konfigurazzjoni ta' par kalamiti biex jirripellaw (Fig. 3c) ma rriżultatx f'aktar depożizzjoni ta' partiċelli fiż-żona tal-immaġni. Dawn iż-żewġ sejbiet juru li s-setup b'żewġ kalamiti ma jtejjibx b'mod sinifikanti l-kontroll lokali tal-immirar tal-MP, u li l-forzi manjetiċi qawwija li jirriżultaw huma diffiċli biex jiġu kkonfigurati, u dan jagħmel dan l-approċċ inqas prattiku. Bl-istess mod, l-orjentazzjoni tal-kalamita 'l fuq u minn ġot-trakea (Fig. 3d) lanqas ma żiedet in-numru ta' partiċelli miżmuma fiż-żona tal-immaġni. Xi wħud minn dawn il-konfigurazzjonijiet alternattivi jistgħu ma jkunux ta' suċċess għaliex jirriżultaw f'qawwiet tal-kamp manjetiku aktar baxxi fiż-żona tad-depożizzjoni. Għalhekk, il-konfigurazzjoni ta' kalamita b'angolu wieħed ta' 30 grad (Figura 3a) hija kkunsidrata l-aktar metodu faċli u effiċjenti għall-ittestjar in vivo.
L-istudju LV-MP wera li meta l-vetturi LV ingħataw flimkien ma' CombiMag u twasslu wara perturbazzjoni fiżika fil-preżenza ta' kamp manjetiku, il-livelli ta' trasduzzjoni żdiedu b'mod sinifikanti fit-trakea meta mqabbla mal-kontrolli. Abbażi tal-istudji tal-immaġini tas-sinkrotron u r-riżultati ta' LacZ, il-kamp manjetiku apparentement kien kapaċi jippreserva l-LV fit-trakea u jnaqqas in-numru ta' partiċelli tal-vettur li ppenetraw immedjatament fil-fond fil-pulmun. Titjib fl-immirar bħal dan jista' jwassal għal effikaċja ogħla filwaqt li jnaqqas it-titri mwassla, it-trasduzzjoni barra mill-mira, l-effetti sekondarji infjammatorji u immuni, u l-ispejjeż tat-trasportatur tal-ġeni. Importanti, skont il-manifattur, CombiMag jista' jintuża flimkien ma' metodi oħra ta' trasferiment tal-ġeni, inkluż ma' vetturi virali oħra (bħal AAV) u aċidi nuklejċi.