Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще показваме сайта без стилове и JavaScript.
Генните вектори за лечение на белодробна болест с кистозна фиброза трябва да са насочени към проводимите дихателни пътища, тъй като периферната белодробна трансдукция не осигурява терапевтична полза. Ефективността на вирусната трансдукция е пряко свързана с времето на престой на вектора. Въпреки това, доставящите течности, като генни носители, естествено дифундират в алвеолите по време на вдишване и терапевтичните частици от всякаква форма бързо се изчистват чрез мукоцилиарен транспорт. Удължаването на времето на престой на генните носители в дихателните пътища е важно, но трудно постижимо. Магнитни частици, конюгирани с генни носители, които могат да бъдат насочени към повърхността на дихателните пътища, могат да подобрят регионалното насочване. Поради предизвикателствата на in vivo визуализацията, поведението на такива малки магнитни частици върху повърхността на дихателните пътища в присъствието на приложено магнитно поле е слабо разбрано. Целта на това проучване беше да се използва синхротронно изобразяване, за да се визуализира in vivo движението на серия от магнитни частици в трахеята на анестезирани плъхове, за да се изследва динамиката и моделите на поведение на индивидуални и обемни частици in vivo. След това оценихме дали доставянето на лентивирусни магнитни частици в присъствието на магнитно поле би увеличило ефективността на трансдукцията в трахеята на плъховете. Синхротронното рентгеново изобразяване разкрива... Поведението на магнитните частици в стационарни и движещи се магнитни полета in vitro и in vivo. Частиците не могат лесно да бъдат влачени по повърхността на живите дихателни пътища с магнити, но по време на транспортиране, отлаганията се концентрират в зрителното поле, където магнитното поле е най-силно. Ефективността на трансдукцията също се е увеличила шест пъти, когато лентивирусните магнитни частици са били доставени в присъствието на магнитно поле. Заедно тези резултати показват, че лентивирусните магнитни частици и магнитните полета могат да бъдат ценни подходи за подобряване на насочването на генните вектори и повишаване на нивата на трансдукция в проводимите дихателни пътища in vivo.
Кистозната фиброза (КФ) се причинява от вариация в един единствен ген, наречен регулатор на трансмембранната проводимост на КФ (CFTR). Протеинът CFTR е йонен канал, който присъства в много епителни клетки в цялото тяло, включително в проводимите дихателни пътища, основно място на патогенезата на КФ. Дефектите на CFTR водят до анормален транспорт на вода, дехидратиране на повърхността на дихателните пътища и намаляване на дълбочината на слоя течност на повърхността на дихателните пътища (ASL). Това също така нарушава способността на мукоцилиарната транспортна система (MCT) да изчиства вдишаните частици и патогени от дихателните пътища. Нашата цел е да разработим лентивирусна (LV) генна терапия, която да достави правилното копие на гена CFTR и да подобри здравето на ASL, MCT и белите дробове, както и да продължим да разработваме нови технологии, способни да измерват тези параметри in vivo1.
ЛВ векторите са едни от водещите кандидати за генна терапия на дихателните пътища при CF, главно защото могат трайно да интегрират терапевтичния ген в базалните клетки на дихателните пътища (стволови клетки на дихателните пътища). Това е важно, защото те могат да възстановят нормалната хидратация и клирънс на слузта чрез диференциране във функционални генно-коригирани повърхностни клетки на дихателните пътища, свързани с CF, което води до ползи за целия живот. ЛВ векторите трябва да бъдат насочени срещу провеждащите дихателни пътища, тъй като това е мястото, където започва белодробното заболяване при CF. Доставянето на вектора по-дълбоко в белия дроб може да доведе до алвеоларна трансдукция, но това няма терапевтична полза при CF. Въпреки това, течности като генни носители естествено мигрират към алвеолите при вдишване след доставката3,4 и терапевтичните частици бързо се отстраняват в устната кухина чрез MCT. Ефективността на ЛВ трансдукцията е пряко свързана с продължителността на времето, през което векторът остава до целевите клетки, за да позволи клетъчно усвояване – „времето на престой“5 – което лесно се намалява чрез типичния регионален въздушен поток, както и чрез координирано улавяне на частици слуз и MCT. При CF способността за удължаване на времето на престой на ЛВ в дихателните пътища е важна за постигане на високи нива на трансдукция в тази област, но досега е била предизвикателство.
За да се преодолее това препятствие, ние предполагаме, че магнитните частици (MP) на левия цитокин (LV) могат да помогнат по два допълващи се начина. Първо, те могат да бъдат магнитно насочени към повърхността на дихателните пътища, за да се подобри насочването и да се помогне на частиците-носители на гени да се установят в желаната област на дихателните пътища; и (ASL), за да се придвижат до клетъчен слой 6. MP са широко използвани като носители за насочено доставяне на лекарства, когато се свързват с антитела, химиотерапевтични лекарства или други малки молекули, които се прикрепят към клетъчните мембрани или се свързват със съответните рецептори на клетъчната повърхност и се натрупват в туморните места при наличие на статично електричество. Магнитни полета за лечение на рак 7. Други „хипертермични“ техники целят да нагряват микроплазматичните клетки (МП), когато са изложени на осцилиращи магнитни полета, като по този начин унищожават туморните клетки. Принципът на магнитната трансфекция, при който магнитно поле се използва като трансфекционен агент за подобряване на трансфера на ДНК към клетките, се използва често in vitro, като се използва набор от невирусни и вирусни генни вектори за трудно трансдуциращи клетъчни линии. Ефективността на левокамерната магнитотрансфекция е установена с in vitro доставяне на МП на човешка бронхиална епителна клетъчна линия в присъствието на статично магнитно поле, което увеличава ефективността на трансдукцията 186 пъти в сравнение само с МП вектор. МП на левокамерна киста е приложена и към in vitro модел на муковисцидоза (CF), където магнитната трансфекция увеличава LV трансдукцията в култури на интерфейс въздух-течност 20 пъти в присъствието на храчки от CF10. Въпреки това, in vivo магнитотрансфекцията на органи е получила сравнително малко внимание и е оценена само в няколко проучвания върху животни11,12,13,14,15, особено в бели дробове16,17. Въпреки това, възможностите за магнитна трансфекция в белодробната терапия на пациенти с CF са ясни. Tan et al. (2020) заявяват, че „проучване за доказване на концепцията за ефективно белодробно доставяне с магнитни наночастици ще проправи пътя за бъдещи стратегии за инхалиране на CFTR за подобряване на клиничните резултати при пациенти с CF“6.
Поведението на малки магнитни частици върху повърхностите на дихателните пътища в присъствието на приложено магнитно поле е трудно за визуализиране и изучаване и следователно е слабо разбрано. В други проучвания разработихме метод за фазово-контрастно рентгеново изобразяване (PB-PCXI), базиран на синхротронно разпространение, за неинвазивно визуализиране и количествено определяне на минимални in vivo промени в дълбочината на ASL18 и поведението на MCT19,20, за да измерим директно хидратацията на повърхността на газовия канал и да я използваме като ранен индикатор за ефикасността на лечението. В допълнение, нашият метод за оценка на MCT използва частици с диаметър 10–35 µm, съставени от алуминиев оксид или стъкло с висок индекс на пречупване, като MCT маркери, видими с помощта на PB-PCXI21. И двете техники са подходящи за визуализация на редица видове частици, включително MP.
Поради високата си пространствена и времева резолюция, нашите техники за ASL и MCT анализ, базирани на PB-PCXI, са много подходящи за изследване на динамиката и моделите на поведение на единични и обемни частици in vivo, за да ни помогнат да разберем и оптимизираме техниките за доставяне на MP гени. Подходът, който използваме тук, произтича от нашите изследвания, използващи лъчевата линия SPring-8 BL20B2, в която визуализирахме движението на течности след доставяне на симулирана векторна доза в носните и белодробните дихателни пътища на мишки, за да обясним нееднородните модели на генна експресия, наблюдавани в нашите изследвания върху животни с дози от генни носители 3,4.
Целта на това проучване беше да се използва синхротрон PB-PCXI за визуализиране in vivo на движенията на серия от микроплазматични частици (МП) в трахеята на живи плъхове. Тези PB-PCXI образни изследвания бяха предназначени да тестват редица МП, силни магнитни полета и местоположения, за да определят техния ефект върху движението на МП. Предположихме, че външно приложено магнитно поле би помогнало на доставения МП да остане или да се премести в целевата област. Тези проучвания ни позволиха също да идентифицираме конфигурации на магнити, които максимизират броя на частиците, задържани в трахеята след отлагане. Във втора серия от проучвания се стремихме да използваме тази оптимална конфигурация, за да демонстрираме модела на трансдукция, получен в резултат на in vivo доставянето на МП от левокамерна клапа (ЛК) към дихателните пътища на плъховете, въз основа на предположението, че доставянето на МП от ЛК в контекста на насочване към дихателните пътища би довело до подобрена ефективност на трансдукцията на ЛК.
Всички проучвания върху животни са проведени съгласно протоколи, одобрени от Университета в Аделаида (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитета по етика на синхротронните животни SPring-8. Експериментите са проведени съгласно насоките на ARRIVE.
Всички рентгенови изображения са извършени на лъчевата линия BL20XU на синхротрона SPring-8 в Япония, използвайки установка, подобна на описаната по-рано21,22. Накратко, експерименталната кутия е разположена на 245 м от пръстена за съхранение на синхротрона. Разстояние от пробата до детектора от 0,6 м се използва за изследвания на изображения на частици и 0,3 м за in vivo изследвания на изображения за генериране на ефекти на фазов контраст. Използвана е монохроматична енергия на лъча от 25 keV. Изображенията са заснети с помощта на рентгенов конвертор с висока резолюция (SPring-8 BM3), свързан с sCMOS детектор. Конверторът преобразува рентгеновите лъчи във видима светлина, използвайки сцинтилатор (Gd3Al2Ga3O12) с дебелина 10 µm, който след това се насочва към sCMOS сензор, използвайки микроскопски обектив × 10 (NA 0,3). sCMOS детекторът е Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) с размер на решетката от 2048 × 2048 пиксела и суров размер на пиксела 6,5 × 6,5 µm. Тази настройка дава ефективен изотропен размер на пиксела от 0,51 µm и зрително поле от приблизително 1,1 mm × 1,1 mm. Избрана е продължителност на експозицията от 100 ms, за да се максимизира съотношението сигнал/шум на магнитните частици вътре и извън дихателните пътища, като същевременно се минимизират артефактите от движение, предизвикани от дишането. За in vivo изследвания в рентгеновия път е поставен бърз рентгенов затвор, за да се ограничи дозата на облъчване чрез блокиране на рентгеновия лъч между експозициите.
Носачът на LV не е използван в никакви образни изследвания SPring-8 PB-PCXI, тъй като образната камера BL20XU не е сертифицирана по ниво 2 на биологична безопасност. Вместо това, ние избрахме набор от добре характеризирани микрочипове (МЧ) от два търговски доставчика – обхващащи диапазон от размери, материали, концентрации на желязо и приложения – първо, за да разберем как магнитните полета влияят на движението на МЧ в стъклени капиляри, а след това и в живите дихателни пътища. на повърхността. Размерите на микрочастиците варират от 0,25 до 18 μm и са изработени от различни материали (виж Таблица 1), но съставът на всяка проба, включително размерът на магнитните частици в микрочастиците, е неизвестен. Въз основа на нашите обширни MCT проучвания 19, 20, 21, 23, 24, очакваме, че микрочастици с размер до 5 μm могат да се видят на повърхността на трахеалните дихателни пътища, например чрез изваждане на последователни кадри, за да се види подобрена видимост на движението на микрочастиците. Единична микрочастица с размер 0,25 μm е по-малка от разделителната способност на устройството за изображения, но се очаква PB-PCXI да открие техния обемен контраст и движението на повърхностната течност, върху която са отложени след отлагането.
Пробите за всеки MP в Таблица 1 бяха приготвени в 20 μl стъклени капиляри (Drummond Microcaps, PA, САЩ) с вътрешен диаметър 0,63 mm. Корпускуларните частици се предлагат във вода, докато CombiMag частиците се предлагат в патентованата течност на производителя. Всяка епруветка е наполовина напълнена с течност (приблизително 11 μl) и поставена върху държача за проба (виж Фигура 1). Стъклените капиляри бяха поставени хоризонтално върху платформата за проба в кутията за изображения, съответно, и позиционирани по краищата на течността. Магнит с диаметър 19 mm (дължина 28 mm) от никелова обвивка, редкоземен неодимов желязо бор (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) с остатъчна намагнитеност 1,17 Tesla беше прикрепен към отделна платформа за транслация, за да се постигне дистанционна промяна на позицията му по време на изображения. Заснемането на рентгенови изображения започва, когато магнитът е позициониран приблизително на 30 mm над пробата, а изображенията се получават със скорост 4 кадъра в секунда. По време на изображенията магнитът беше доведен близо до... стъклена капилярна тръбичка (на около 1 mm разстояние) и след това преместена по дължина на тръбата, за да се оценят ефектите от силата на полето и положението.
Установка за in vitro изобразяване, съдържаща MP проби в стъклени капиляри на етапа на xy транслация на пробата. Пътят на рентгеновия лъч е маркиран с червена пунктирана линия.
След като беше установена in vitro видимостта на микроплазматичните проби (МП), подгрупа от тях беше тествана in vivo при женски албиноси Wistar плъхове от див тип (на възраст ~12 седмици, ~200 g). 0,24 mg/kg медетомидин (Domitor®, Zenoaq, Япония), 3,2 mg/kg мидазолам (Dormicum®, Astellas Pharma, Япония) и 4 mg/kg буторфанол (Vetorphale®, Meiji Seika). Плъховете бяха анестезирани със смес от (Pharma), Япония) чрез интраперитонеално инжектиране. След анестезията те бяха подготвени за образна диагностика чрез отстраняване на козината около трахеята, поставяне на ендотрахеална тръба (ET; 16 Ga iv канюла, Terumo BCT) и обездвижване по гръб върху специално изработена образна плака, съдържаща термочанта за поддържане на телесна температура 22. Образната плака след това беше прикрепена към платформата за транслация на пробата в кутията за образна диагностика под лек ъгъл, за да се подравни трахеята хоризонтално в рентгеновото изображение, както е показано на Фигура. 2а.
(a) Настройка за in vivo изображения в кутията за изображения SPring-8, пътят на рентгеновия лъч е маркиран с червена пунктирана линия. (b,c) Локализацията на магнита върху трахеята е извършена дистанционно с помощта на две ортогонално монтирани IP камери. От лявата страна на изображението на екрана може да се види телената примка, държаща главата, и канюлата за доставяне на място в ЕТ тръбата.
Дистанционно управлявана система за спринцовка (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида), използваща стъклена спринцовка с обем 100 μl, беше свързана към PE10 тръба (външен диаметър 0,61 mm, вътрешен диаметър 0,28 mm) чрез игла 30 Ga. Маркирайте тръбата, за да се уверите, че върхът ѝ е в правилната позиция в трахеята при поставяне на ендотрахеалната тръба. С помощта на микропомпата буталото на спринцовката беше изтеглено, докато върхът на тръбата беше потопен в MP пробата, която ще бъде доставена. След това заредената тръба за доставяне беше поставена в ендотрахеалната тръба, като върхът ѝ беше поставен в най-силната част на очакваното приложено магнитно поле. Заснемането на изображението беше контролирано с помощта на детектор за дишане, свързан с нашата кутия за синхронизация, базирана на Arduino, и всички сигнали (напр. температура, дишане, отваряне/затваряне на затвора и заснемане на изображение) бяха записани с помощта на Powerlab и LabChart (AD Instruments, Сидни, Австралия) 22. При заснемане, когато камерата беше недостъпна, две IP камери (Panasonic BB-SC382) бяха позиционирани на приблизително 90° една спрямо друга и бяха използвани за наблюдение на положението на магнита спрямо... към трахеята по време на изобразяване (фиг. 2б,в). За да се сведат до минимум артефактите от движението, е заснемано по едно изображение на вдишване по време на платото на крайния дихателен поток.
Магнит е прикрепен към втори етап, който може да бъде разположен дистанционно от външната страна на корпуса за изображения. Тествани са различни позиции и конфигурации на магнита, включително: Монтиран под ъгъл от приблизително 30° над трахеята (конфигурации, показани на фигури 2а и 3а); един магнит над животното, а другият отдолу, с полюси, настроени да се привличат (Фигура 3б); един магнит над животното, а другият отдолу, с полюси, настроени да се отблъскват (Фигура 3в); и един магнит над и перпендикулярно на трахеята (Фигура 3г). След като животното и магнитът са конфигурирани и микрочипът, който ще се тества, е зареден в спринцовката, се подава доза от 50 μl със скорост 4 μl/сек, докато се получават изображения. След това магнитът се движи напред-назад по или странично през трахеята, като продължава да се получават изображения.
Конфигурация на магнита за in vivo изображения: (а) единичен магнит над трахеята под ъгъл от приблизително 30°, (б) два магнита, настроени да привличат, (в) два магнита, настроени да отблъскват, (г) единичен магнит над трахеята и перпендикулярно на нея. Наблюдателят гледа надолу от устата към белите дробове през трахеята, а рентгеновият лъч преминава през лявата страна на плъха и излиза от дясната страна. Магнитът се движи или по дължината на дихателните пътища, или наляво и надясно над трахеята по посока на рентгеновия лъч.
Също така се стремихме да определим видимостта и поведението на частиците в дихателните пътища при липса на объркващо дишане и сърдечно движение. Следователно, в края на периода на изобразяване, животните бяха хуманно умъртвени за предозиране с пентобарбитал (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, САЩ; ~65 mg/kg ip). Някои животни бяха оставени на платформата за изобразяване и след като дишането и сърдечният ритъм спряха, процесът на изобразяване беше повторен, като се добави допълнителна доза MP, ако не се вижда MP на повърхността на дихателните пътища.
Получените изображения бяха коригирани за плоско и тъмно поле и след това сглобени във филм (20 кадъра в секунда; 15-25 × нормална скорост в зависимост от дихателната честота), използвайки персонализиран скрипт, написан в MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Всички проучвания за доставяне на LV генен вектор са проведени в Лабораторния изследователски център за животни към Университета в Аделаида и целят да използват резултатите от експеримента SPring-8, за да се оцени дали доставянето на LV-MP в присъствието на магнитно поле може да подобри генния трансфер in vivo. За да се оценят ефектите на MP и магнитното поле, са третирани две групи животни: на едната група е даден LV-MP с поставен магнит, а другата група е получила контролна група с LV-MP без магнит.
LV генните вектори са генерирани с помощта на предварително описани методи 25, 26. LacZ векторът експресира ядрено-локализирания бета-галактозидазен ген, задвижван от конститутивен MPSV промотор (LV-LacZ), който произвежда син реакционен продукт в трансдуцираните клетки, видим във фронтовете на белодробната тъкан и тъканните срези. Титруването е извършено в клетъчни култури чрез ръчно преброяване на броя на LacZ-позитивните клетки с хемоцитометър за изчисляване на титъра в TU/ml. Носителите са криоконсервирани при -80°C, размразени преди употреба и свързани с CombiMag чрез смесване в съотношение 1:1 и инкубиране върху лед за поне 30 минути преди доставяне.
Нормални плъхове Sprague Dawley (n = 3/група, ~2-3) бяха анестезирани интраперитонеално със смес от 0,4 mg/kg медетомидин (Domitor, Ilium, Австралия) и 60 mg/kg кетамин (Ilium, Австралия) на възраст един месец) чрез ip) инжектиране и нехирургична орална канюла с 16 Ga iv канюла. За да се гарантира, че тъканта на трахеалните дихателни пътища получава LV трансдукция, тя беше кондиционирана, използвайки нашия предварително описан протокол за механично смущение, при който повърхността на трахеалните дихателни пътища се търка аксиално с телена кошница (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, САЩ) 30 s28. Трахеалното приложение на LV-MP след това беше извършено в шкаф за биологична безопасност приблизително 10 минути след смущението.
Магнитното поле, използвано в този експеримент, е конфигурирано по подобен начин на това при in vivo рентгеново изследване, като същите магнити са държани над трахеята с помощта на дестилационни стент клипсове (Фигура 4). Обем от 50 μl (2 × 25 μl аликвоти) LV-MP е инжектиран в трахеята (n = 3 животни) с помощта на пипета, съдържаща гелов накрайник, както е описано по-рано. Контролна група (n = 3 животни) е получила същите LV-MP без използването на магнит. След завършване на инфузията канюлата се отстранява от ET тръбата и животното се екстубира. Магнитът остава на място 10 минути, след което се отстранява. Плъховете са получили подкожна доза мелоксикам (1 ml/kg) (Ilium, Австралия), последвана от обръщане на анестезията чрез ip инжектиране на 1 mg/kg атипамазол хидрохлорид (Antisedan, Zoetis, Австралия). Плъховете са държани на топло и са наблюдавани до пълно възстановяване от анестезията.
Устройство за доставяне на LV-MP в шкаф за биологична безопасност. Светлосивият луеров накрайник на ЕТ тръбата може да се види да стърчи от устата, а гелният връх на пипетата, показана на снимката, се вкарва през ЕТ тръбата до желаната дълбочина в трахеята.
Една седмица след процедурата по дозиране на LV-MP, животните бяха хуманно умъртвени чрез инхалиране на 100% CO2 и експресията на LacZ беше оценена с помощта на нашето стандартно X-gal третиране. Трите най-каудални хрущялни пръстена бяха отстранени, за да се гарантира, че всякакви механични повреди или задържане на течности от поставянето на ендотрахеалната тръба не са включени в анализа. Всяка трахея беше разрязана надлъжно, за да се създадат две половини за анализ, и те бяха монтирани в блюдо, съдържащо силиконов каучук (Sylgard, Dow Inc), използвайки игла Minutien (Fine Science Tools), за да се визуализира луминалната повърхност. Разпределението и моделът на трансдуцираните клетки бяха потвърдени чрез фронтална фотография с помощта на микроскоп Nikon (SMZ1500) с камера DigiLite и софтуер TCapture (Tucsen Photonics, Китай). Изображенията бяха получени при 20-кратно увеличение (включително най-високата настройка за пълната ширина на трахеята), като цялата дължина на трахеята беше изобразена стъпка по стъпка, като се осигури достатъчно припокриване между всяко изображение, за да се позволи „зашиване“ на изображението. Изображенията от всяка трахея след това бяха сглобени в едно. композитно изображение, използвайки Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research), използващ алгоритъм за планарно движение. Експресионните области на LacZ в композитните изображения на трахеята от всяко животно бяха количествено определени с помощта на автоматизиран MATLAB скрипт (R2020a, MathWorks), както е описано по-рано, използвайки настройки 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 и Value < 0.7. Чрез проследяване на контурите на тъканта, ръчно беше генерирана маска в GIMP v2.10.24 за всяко композитно изображение, за да се идентифицира тъканната област и да се предотвратят фалшиви откривания извън трахеалната тъкан. Оцветените области от всички композитни изображения от всяко животно бяха сумирани, за да се генерира общата оцветена площ за това животно. След това оцветената площ беше разделена на общата площ на маската, за да се генерира нормализираната площ.
Всяка трахея беше вградена в парафин и бяха изрязани срези от 5 μm. Срезите бяха оцветени с неутрално бързо червено за 5 минути и изображенията бяха получени с помощта на микроскоп Nikon Eclipse E400, камера DS-Fi3 и софтуер за заснемане на елементи NIS (версия 5.20.00).
Всички статистически анализи бяха извършени в GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Статистическата значимост беше определена на p ≤ 0,05. Нормалността беше проверена с помощта на теста на Shapiro-Wilk, а разликите в LacZ оцветяването бяха оценени с помощта на неспарен t-тест.
Шестте микрочастици (МП), описани в Таблица 1, бяха изследвани с помощта на PCXI, а видимостта е описана в Таблица 2. Два полистиренови МП (MP1 и MP2; съответно 18 μm и 0,25 μm) не бяха видими под PCXI, но останалите проби бяха разпознаваеми (примери са показани на Фигура 5). MP3 и MP4 (10-15% Fe3O4; съответно 0,25 μm и 0,9 μm) са слабо видими. Въпреки че съдържат едни от най-малките тествани частици, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) беше най-силно изразен. Продуктът на CombiMag MP6 е труден за забелязване. Във всички случаи способността ни да откриваме МП беше значително подобрена чрез преместване на магнита напред-назад успоредно на капиляра. Когато магнитите се отдалечаваха от капиляра, частиците се простираха в дълги нишки, но с приближаването на магнитите и увеличаването на силата на магнитното поле, нишките от частици се скъсяваха, докато частиците мигрираха към горната повърхност на капиляра (вижте Допълнително видео S1: MP4), увеличавайки... Плътността на частиците на повърхността. Обратно, когато магнитът се отстрани от капиляра, силата на полето намалява и микрочастиците (МП) се пренареждат в дълги нишки, простиращи се от горната повърхност на капиляра (вижте допълнителното видео S2:MP4). След като магнитът спре да се движи, частиците продължават да се движат за кратко време след достигане на равновесно положение. Докато МП се движи към и от горната повърхност на капиляра, магнитните частици обикновено влачат отломките през течността.
Видимостта на MP под PCXI варира значително между пробите. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6. Всички показани тук изображения са направени с магнит, разположен приблизително на 10 mm директно над капиляра. Видимите големи кръгове са въздушни мехурчета, хванати в капилярите, ясно показващи черно-белите ръбове на фазово-контрастното изобразяване. Червената кутия съдържа увеличението, усилващо контраста. Обърнете внимание, че диаметрите на схемите на магнита във всички фигури не са в мащаб и са приблизително 100 пъти по-големи от показаното.
Докато магнитът се премества наляво и надясно по горната част на капиляра, ъгълът на MP струната се променя, за да се подравни с магнита (вижте Фигура 6), като по този начин очертава линиите на магнитното поле. При MP3-5, след като хордата достигне прагов ъгъл, частиците се влачет по горната повърхност на капиляра. Това често води до групиране на MP в по-големи групи близо до мястото, където магнитното поле е най-силно (вижте Допълнително видео S3:MP5). Това е особено очевидно и при изобразяване близо до края на капиляра, което кара MP да се агрегират и концентрират на границата флуид-въздух. Частиците в MP6, които бяха по-трудни за разграничаване от MP3-5, не бяха влачени, докато магнитът се движеше по капиляра, но MP струните се дисоциираха, оставяйки частиците в зрителното поле (вижте Допълнително видео S4:MP6). В някои случаи, когато приложеното магнитно поле беше намалено чрез преместване на магнита на голямо разстояние от мястото на изобразяване, всички останали MP бавно се спускаха към долната повърхност на тръбата под въздействието на гравитацията, докато оставаха в струната (вижте Допълнително видео S5: MP3).
Ъгълът на MP нишката се променя, когато магнитът се премества надясно над капиляра. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 и (d) MP6. Червената кутия съдържа увеличението за усилване на контраста. Обърнете внимание, че допълнителните видеоклипове са информативни, тъй като разкриват важна информация за структурата на частиците и динамична информация, която не може да бъде визуализирана в тези статични изображения.
Нашите тестове показаха, че бавното движение на магнита напред-назад по трахеята улеснява визуализацията на микроплазматичния оксид (МП) в контекста на сложно движение in vivo. In vivo тестовете не бяха проведени, тъй като полистиролови перли (MP1 и MP2) не бяха видими в капиляра. Всеки от останалите четири МП беше тестван in vivo с дълга ос на магнита, конфигурирана над трахеята под ъгъл от около 30° спрямо вертикалата (вижте Фигури 2b и 3a), тъй като това доведе до по-дълги МП вериги и беше по-ефективно от конфигурацията с магнитен прекъснат елемент. MP3, MP4 и MP6 не бяха открити в трахеята на живи животни. Когато дихателните пътища на плъховете бяха изобразени след хуманното умъртвяване на животните, частиците останаха невидими, дори когато беше добавен допълнителен обем с помощта на спринцовка. MP5 имаше най-високо съдържание на железен оксид и беше единствената видима частица и следователно беше използван за оценка и характеризиране на in vivo поведението на МП.
Поставянето на магнита върху трахеята по време на доставянето на микроплазма (МП) доведе до концентриране на много, но не всички МП в зрителното поле. Частиците, влизащи в трахеята, се наблюдават най-добре при хуманно умъртвени животни. Фигура 7 и допълнително видео S6: МП5 показва бързо магнитно улавяне и подравняване на частици върху повърхността на вентралната трахея, което показва, че МП могат да бъдат насочени към желаните области на трахеята. При търсене по-дистално по трахеята след доставянето на МП, някои МП бяха открити по-близо до карината, което предполага, че силата на магнитното поле е била недостатъчна за събиране и задържане на всички МП, тъй като те са били доставени през областта с максимална сила на магнитното поле по време на флуидния процес. Въпреки това, концентрациите на МП след раждането бяха по-високи около изобразената област, което предполага, че много МП са останали в областите на дихателните пътища, където приложената сила на магнитното поле е била най-висока.
Изображения от (а) преди и (б) след доставяне на MP5 в трахеята на наскоро евтаназиран плъх с магнит, разположен директно над областта на изобразяване. Изобразената област е разположена между двата хрущялни пръстена. Преди доставянето на MP, в дихателните пътища има малко течност. Червената кутия съдържа увеличението, усилващо контраста. Тези изображения са от видеото, показано в допълнително видео S6:MP5.
Преместването на магнита по трахеята in vivo е довело до промяна на ъгъла на микроплазматичната верига в повърхността на дихателните пътища по начин, подобен на наблюдавания в капилярите (вижте Фигура 8 и Допълнително видео S7:MP5). В нашето проучване обаче микроплазматичните частици не са могли да бъдат влачени по повърхността на живите дихателни пътища, както е възможно с капилярите. В някои случаи микроплазматичната верига се удължава, когато магнитът се движи наляво и надясно. Интересното е, че открихме също, че нишката от частици изглежда променя дълбочината на повърхностния флуиден слой, когато магнитът се движи надлъжно по трахеята, и се разширява, когато магнитът се движи директно над главата и нишката от частици се завърта във вертикално положение (вижте Допълнително видео S7). : MP5 в 0:09, долу вдясно). Характерният модел на движение се променя, когато магнитът се премества странично през горната част на трахеята (т.е. вляво или вдясно от животното, а не по дължината на трахеята). Частиците все още се виждат ясно, докато се движат, но когато магнитът се отстранява от трахеята, върховете на струните от частици стават видими (вижте допълнителното видео S8:MP5, започващо от 0:08). Това е в съответствие с поведението на микроплазма, което наблюдавахме под въздействието на приложено магнитно поле в стъклен капиляр.
Примерни изображения, показващи MP5 в трахеята на жив анестезиран плъх. (a) Магнитът се използва за получаване на изображения над и отляво на трахеята, след това (b) след като магнитът се премести надясно. Червената кутия съдържа увеличението за усилване на контраста. Тези изображения са от видеото, показано в допълнително видео S7:MP5.
Когато двата полюса бяха конфигурирани в ориентация север-юг над и под трахеята (т.е. привличащи се; Фиг. 3б), MP хордите изглеждаха по-дълги и бяха разположени на страничната стена на трахеята, а не на дорзалната повърхност на трахеята (вижте Допълнително видео S9:MP5). Въпреки това, високи концентрации на частици на едно място (т.е. дорзалната повърхност на трахеята) не бяха открити след доставяне на течност, когато се използва устройство с два магнита, което обикновено се случва, когато се използва устройство с един магнит. След това, когато един магнит беше конфигуриран да отблъсква обърнатите полюси (Фиг. 3в), броят на видимите частици в зрителното поле не изглеждаше да се увеличава след доставянето. Настройката на двете конфигурации с два магнита е предизвикателство поради високите стойности на магнитното поле, което съответно дърпа или избутва магнитите. След това настройката беше променена на един магнит, успореден на дихателните пътища, но преминаващ през дихателните пътища под ъгъл от 90 градуса, така че линиите на полето пресичаха ортогонално стената на трахеята (Фиг. 3г), ориентация, предназначена да определи дали може да се наблюдава агрегация на частици на страничната стена. В тази конфигурация обаче, Нямаше идентифицируемо движение на натрупване на MP или движение на магнита. Въз основа на всички тези резултати, за in vivo изследвания на генни носители беше избрана конфигурация с един магнит и 30-градусова ориентация (Фигура 3а).
Когато животното е било многократно изобразено веднага след хуманното умъртвяване, липсата на объркващо движение на тъканите е означавала, че в ясното интерхондрално поле могат да се разграничат по-фини и по-къси линии от частици, „трептящи“ в съответствие с транслационното движение на магнита. Въпреки това, все още не може ясно да се види наличието и движението на MP6 частици.
Титърът на LV-LacZ беше 1,8 × 108 TU/ml и след смесване 1:1 с CombiMag MP (MP6), животните получиха 50 μl трахеална доза от 9 × 107 TU/ml LV носител (т.е. 4,5 × 106 TU/плъх). В тези проучвания, вместо да преместваме магнита по време на раждане, ние фиксирахме магнита в една позиция, за да определим дали LV трансдукцията (а) може да бъде подобрена в сравнение с векторното доставяне при липса на магнитно поле и (б) може да бъде фокусирана. Клетките на дихателните пътища се трансдуцират към магнитни целеви области на горните дихателни пътища.
Наличието на магнити и използването на CombiMag, комбиниран с LV вектори, не изглежда да имат неблагоприятни ефекти върху здравето на животните, както и нашият стандартен протокол за доставяне на LV вектор. Фронтални изображения на трахеалната област, подложена на механично смущение (Допълнителна фигура 1), показват, че има значително по-високи нива на трансдукция в групата животни, третирани с LV-MP, когато магнитът е наличен (фиг. 9а). В контролната група е налице само малко количество синьо LacZ оцветяване (фиг. 9б). Количественото определяне на нормализирани X-Gal оцветени области показва, че прилагането на LV-MP в присъствието на магнитно поле води до приблизително 6-кратно подобрение (фиг. 9в).
Примерни композитни изображения, показващи трахеална трансдукция чрез LV-MP (а) в присъствието на магнитно поле и (б) в отсъствието на магнит. (в) Статистически значимо подобрение в нормализираната площ на LacZ трансдукция в трахеята при използване на магнита (*p = 0,029, t-тест, n = 3 на група, средна стойност ± SEM).
Неутрално бързо оцветени в червено срези (пример, показан на допълнителна фигура 2) показват оцветени с LacZ клетки, присъстващи в подобен модел и местоположение, както е съобщено по-рано.
Ключово предизвикателство за генната терапия на дихателните пътища остава точното локализиране на носещите частици в области от интерес и постигането на високи нива на ефективност на трансдукция в движещия се бял дроб при наличие на въздушен поток и активно очистване на слуз. За левокамерните носители, предназначени за лечение на дихателни пътища с муковисцидоза, увеличаването на времето на престой на носещите частици в провеждащите дихателни пътища досега е било неуловима цел. Както посочват Castellani et al., използването на магнитни полета за подобряване на трансдукцията има предимства в сравнение с други методи за доставяне на гени, като електропорация, тъй като може да комбинира простота, икономическа ефективност, локализация на доставянето, повишена ефективност и по-кратки инкубационни времена, и евентуално по-малка доза носител10. Въпреки това, in vivo отлагането и поведението на магнитни частици в дихателните пътища под въздействието на външни магнитни сили никога не е било описано, нито пък е била демонстрирана in vivo осъществимостта на този метод за повишаване на нивата на генна експресия в непокътнати живи дихателни пътища.
Нашите in vitro синхротронни PCXI експерименти показаха, че всички тествани от нас частици, с изключение на полистирола MP, бяха видими в използваната от нас установка за изображения. В присъствието на магнитно поле, MP образуват струни, чиито дължини са свързани с типа на частиците и силата на магнитното поле (т.е. близостта и движението на магнита). Както е показано на Фигура 10, струните, които наблюдаваме, се образуват поради факта, че всяка отделна частица е намагнитена и индуцира собствено локално магнитно поле. Тези отделни полета карат други подобни частици да се агрегират и свързват, с групови струноподобни движения, дължащи се на локални сили от локалните сили на привличане и отблъскване на други частици.
Схематично представяне (a,b) на влакове от частици, генерирани вътре в капиляри, пълни с течност, и (c,d) трахея, пълна с въздух. Обърнете внимание, че капилярите и трахеята не са нарисувани в мащаб. Панел (a) съдържа също описание на микроскопичния слой (MP), който съдържа частици Fe3O4, подредени в струни.
Когато магнитът се премести над капиляра, ъгълът на струната от частици достигна критичен праг за MP3-5, съдържащ Fe3O4, след което струната от частици вече не остана в първоначалната си позиция, а се премести по повърхността до нова позиция. магнит. Този ефект вероятно се случва, защото повърхността на стъклената капиляра е достатъчно гладка, за да позволи това движение. Интересното е, че MP6 (CombiMag) не се държеше по този начин, вероятно защото частиците бяха по-малки, имаха различни покрития или повърхностни заряди, или патентована течност-носител е повлияла на способността им да се движат. Контрастът на изображението на CombiMag частиците също е по-слаб, което предполага, че течността и частиците може да имат сходна плътност и следователно да не се движат лесно една към друга. Частиците могат също да се залепят, ако магнитът се движи твърде бързо, което показва, че силата на магнитното поле не винаги може да преодолее триенето между частиците във течността, което предполага, че може би не е изненадващо, че силата на магнитното поле и разстоянието между магнита и целевата област са много важни. Взети заедно, тези резултати също така предполагат, че макар магнитите да могат да улавят много MP, които преминават през целевата област, е малко вероятно да може да се разчита на магнитите да се движат. CombiMag частици по повърхността на трахеята. Следователно, заключаваме, че in vivo LV-MP изследванията трябва да използват статични магнитни полета за физическо насочване към специфични области на дихателните пътища.
Когато частиците се доставят в тялото, те са трудни за идентифициране в контекста на сложна движеща се телесна тъкан, но способността за откриването им е подобрена чрез хоризонтално преместване на магнита над трахеята, за да се „раздвижат“ нишките на микроплазматичния агент (МП). Въпреки че е възможно изобразяване на живо, е по-лесно да се различи движението на частиците, след като животното е било хуманно умъртвено. Концентрациите на МП обикновено са най-високи на това място, когато магнитът е позициониран над областта на изобразяване, въпреки че някои частици обикновено се намират по-навътре в трахеята. За разлика от in vitro проучванията, частиците не могат да бъдат влачени по трахеята чрез преместване на магнита. Това откритие е в съответствие с начина, по който слузта, която покрива повърхността на трахеята, обикновено обработва вдишаните частици, улавяйки ги в слузта и впоследствие изчиствайки ги чрез механизма на мукоцилиарното клирънс.
Предположихме, че използването на магнити за привличане над и под трахеята (фиг. 3б) може да доведе до по-равномерно магнитно поле, а не до магнитно поле, което е силно концентрирано в една точка, което потенциално води до по-равномерно разпределение на частиците. Нашето предварително проучване обаче не откри ясни доказателства в подкрепа на тази хипотеза. По подобен начин, конфигурирането на двойка магнити за отблъскване (фиг. 3в) не доведе до повече отлагане на частици в изобразената област. Тези две открития показват, че настройката с два магнита не подобрява значително локалния контрол на насочването на микрочастиците и че получените силни магнитни сили са трудни за конфигуриране, което прави този подход по-малко практичен. По подобен начин, ориентирането на магнита над и през трахеята (фиг. 3г) също не увеличи броя на частиците, задържани в изобразената област. Някои от тези алтернативни конфигурации може да не са успешни, защото водят до по-ниска сила на магнитното поле в зоната на отлагане. Следователно, конфигурацията с единичен магнит с ъгъл от 30 градуса (фиг. 3а) се счита за най-лесния и ефикасен метод за in vivo тестване.
Проучването LV-MP показа, че когато левокамерните вектори са комбинирани с CombiMag и са доставени след физическо смущение в присъствието на магнитно поле, нивата на трансдукция са значително повишени в трахеята в сравнение с контролите. Въз основа на синхротронните образни изследвания и резултатите от LacZ, магнитното поле очевидно е в състояние да запази левокамерната куха ...