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Cov noob caj noob ces (gene vectors) rau kev kho mob cystic fibrosis mob ntsws yuav tsum tsom mus rau cov hlab pa vim tias peripheral lung transduction tsis muab kev pab kho mob. Kev ua haujlwm ntawm kev hloov pauv kab mob yog ncaj qha cuam tshuam nrog lub sijhawm nyob ntawm vector. Txawm li cas los xij, cov kua dej xa khoom xws li cov gene carriers ntuj tsim diffuse mus rau hauv alveoli thaum lub sijhawm ua pa, thiab cov khoom kho mob ntawm txhua daim ntawv raug tshem tawm sai sai los ntawm kev thauj mus los ntawm mucociliary. Kev ncua lub sijhawm nyob ntawm cov gene carriers hauv cov hlab pa yog qhov tseem ceeb tab sis nyuaj rau ua tiav. Cov khoom sib nqus sib txuas ntawm cov noob caj noob ces uas tuaj yeem coj mus rau qhov chaw ntawm cov hlab pa tuaj yeem txhim kho kev tsom mus rau thaj tsam. Vim muaj kev cov nyom ntawm kev pom hauv vivo, tus cwj pwm ntawm cov khoom sib nqus me me ntawm qhov chaw ntawm txoj hlab pa thaum muaj lub zog sib nqus siv tsis nkag siab zoo. Lub hom phiaj ntawm txoj kev tshawb fawb no yog siv cov duab synchrotron los pom qhov kev txav mus los hauv vivo ntawm cov khoom sib nqus hauv trachea ntawm cov nas uas tau siv tshuaj loog los tshuaj xyuas qhov dynamics thiab cov qauv ntawm tus kheej thiab cov khoom loj hauv vivo. Tom qab ntawd peb kuj tau soj ntsuam seb qhov kev xa khoom ntawm cov khoom sib nqus lentiviral thaum muaj lub zog sib nqus yuav ua rau muaj kev ua haujlwm ntawm kev hloov pauv hauv tus nas. trachea. Kev siv tshuab X-ray Synchrotron qhia txog tus cwj pwm ntawm cov khoom sib nqus hauv cov teb sib nqus uas nyob ruaj khov thiab txav mus los hauv vitro thiab hauv vivo. Cov khoom sib nqus tsis tuaj yeem rub tau yooj yim raws qhov chaw ntawm txoj hlab pa uas muaj sia nyob nrog cov hlau nplaum, tab sis thaum thauj mus los, cov khoom tso rau hauv thaj chaw pom qhov twg lub teb sib nqus muaj zog tshaj plaws. Kev ua haujlwm ntawm kev hloov pauv kuj tau nce rau npaug thaum cov khoom sib nqus lentiviral tau xa mus rau hauv qhov muaj lub teb sib nqus. Ua ke, cov txiaj ntsig no qhia tias cov khoom sib nqus lentiviral thiab cov teb sib nqus yuav yog cov hauv kev muaj txiaj ntsig zoo los txhim kho kev tsom mus rau cov noob caj noob ces thiab nce qib kev hloov pauv hauv kev coj ua pa hauv vivo.
Kab mob cystic fibrosis (CF) yog tshwm sim los ntawm kev hloov pauv ntawm ib lub noob hu ua CF transmembrane conductance regulator (CFTR). Cov protein CFTR yog ib qho ion channel uas muaj nyob hauv ntau lub hlwb epithelial thoob plaws lub cev, suav nrog cov hlab pa uas ua pa, qhov chaw tseem ceeb ntawm CF pathogenesis. Cov teeb meem CFTR ua rau muaj kev thauj dej tsis zoo, ua rau lub ntsws qhuav thiab txo qhov tob ntawm cov kua dej ntawm lub ntsws (ASL) txheej. Qhov no kuj ua rau lub peev xwm ntawm mucociliary transport (MCT) system tsis zoo los tshem tawm cov khoom me me thiab cov kab mob los ntawm cov hlab pa. Peb lub hom phiaj yog tsim kom muaj kev kho mob lentiviral (LV) gene los xa cov qauv raug ntawm CFTR gene thiab txhim kho ASL, MCT, thiab kev noj qab haus huv ntawm lub ntsws, thiab txuas ntxiv tsim cov thev naus laus zis tshiab uas muaj peev xwm ntsuas cov kev ntsuas no hauv vivo1.
Cov kab mob LV yog ib qho ntawm cov neeg sib tw ua ntej rau CF txoj kev kho mob caj ces, feem ntau vim tias lawv tuaj yeem koom ua ke cov noob kho mob rau hauv cov hlwb hauv txoj kev ua pa (cov hlwb ntawm txoj kev ua pa). Qhov no tseem ceeb vim tias lawv tuaj yeem rov qab ua kom cov dej noo thiab cov hnoos qeev tawm los ntawm kev sib txawv mus rau hauv cov hlwb saum npoo ntawm txoj kev ua pa uas kho tau cov noob CF, ua rau muaj txiaj ntsig mus tas li. Cov kab mob LV yuav tsum tau taw qhia rau txoj kev ua pa, vim qhov no yog qhov uas tus kab mob CF pib mob ntsws. Kev xa cov kab mob mus tob dua rau hauv lub ntsws yuav ua rau muaj kev hloov pauv alveolar, tab sis qhov no tsis muaj txiaj ntsig kho mob hauv CF. Txawm li cas los xij, cov kua dej xws li cov neeg nqa cov noob caj ces mus rau alveoli thaum ua pa tom qab yug menyuam3,4 thiab cov khoom kho mob tau raug tshem tawm sai sai rau hauv qhov ncauj los ntawm MCT. Kev ua haujlwm ntawm LV transduction yog ncaj qha cuam tshuam nrog lub sijhawm ntev npaum li cas tus kab mob nyob ib sab ntawm cov hlwb kom tso cai rau kev nqus ntawm tes - "lub sijhawm nyob"5 - uas yooj yim txo los ntawm cov huab cua hauv cheeb tsam ib txwm muaj nrog rau kev sib koom ua ke ntawm cov hnoos qeev thiab MCT. Rau CF, lub peev xwm los ncua lub sijhawm nyob ntawm LV hauv txoj kev ua pa yog qhov tseem ceeb kom ua tiav cov qib siab ntawm kev hloov pauv hauv thaj chaw no, tab sis txog tam sim no tau nyuaj.
Yuav kom kov yeej qhov teeb meem no, peb xav tias cov khoom sib nqus LV (MPs) yuav pab tau ob txoj hauv kev sib txuas. Ua ntej, lawv tuaj yeem raug coj mus rau qhov chaw ntawm txoj hlab pa kom txhim kho kev tsom mus rau thiab pab cov khoom siv gene carrier nyob hauv thaj chaw uas xav tau ntawm txoj hlab pa; thiab ASL) txav mus rau txheej cell 6.MPs tau siv dav ua cov tsheb xa tshuaj thaum lawv khi rau cov tshuaj tiv thaiv kab mob, tshuaj kho mob, lossis lwm yam khoom me me uas txuas rau cov cell membranes lossis khi rau cov cell surface receptors thiab sib sau ua ke ntawm cov qhov chaw mob qog nqaij hlav thaum muaj hluav taws xob zoo li qub. Cov Teb Sib Nqus Rau Kev Kho Mob Cancer 7. Lwm cov txheej txheem "hyperthermal" lub hom phiaj yog kom sov MPs thaum lawv raug rau cov teb sib nqus oscillating, yog li ntawd rhuav tshem cov hlwb qog. Lub hauv paus ntsiab lus ntawm kev hloov pauv sib nqus, uas siv lub teb sib nqus ua tus neeg sawv cev hloov pauv los txhim kho kev hloov pauv DNA mus rau cov hlwb, feem ntau siv hauv vitro siv ntau yam tsis yog-viral thiab viral gene vectors rau cov kab mob nyuaj-rau-hloov pauv. Kev ua haujlwm ntawm LV magnetotransfection tau tsim, nrog rau kev xa khoom hauv vitro ntawm LV-MPs mus rau tib neeg bronchial epithelial cell kab nyob rau hauv qhov muaj lub teb sib nqus zoo li qub, ua rau kev hloov pauv ua haujlwm los ntawm 186-npaug piv rau LV vector ib leeg. LV-MP kuj tau siv rau hauv vitro CF qauv, qhov twg kev hloov pauv sib nqus ua rau LV transduction hauv cov kab lis kev cai huab cua-kua dej los ntawm 20-npaug nyob rau hauv qhov muaj CF sputum10. Txawm li cas los xij, hauv vivo magnetotransfection ntawm cov kabmob tau txais kev saib xyuas me ntsis thiab tsuas yog tau soj ntsuam hauv ob peb qhov kev tshawb fawb tsiaj11,12,13,14,15, tshwj xeeb tshaj yog nyob rau hauv lub ntsws16,17. Txawm li cas los xij, cov cib fim rau kev hloov pauv magnetic hauv kev kho mob CF lub ntsws yog qhov tseeb. Tan et al. (2020) tau hais tias "kev tshawb fawb pov thawj ntawm lub tswv yim ntawm kev xa khoom magnetic nanoparticle pulmonary zoo yuav ua rau muaj kev rau cov tswv yim CFTR inhalation yav tom ntej los txhim kho cov txiaj ntsig kho mob hauv cov neeg mob CF"6.
Tus cwj pwm ntawm cov khoom me me sib nqus ntawm cov pa hauv qhov chaw muaj lub zog sib nqus siv yog qhov nyuaj rau pom thiab kawm, thiab yog li ntawd tsis nkag siab zoo. Hauv lwm txoj kev tshawb fawb, peb tau tsim txoj kev synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) los pom thiab ntsuas qhov kev hloov pauv me me hauv vivo hauv ASL qhov tob18 thiab MCT tus cwj pwm19,20 los ntsuas qhov dej ntws ntawm qhov chaw ntawm cov pa roj thiab siv ua qhov qhia thaum ntxov ntawm kev kho mob zoo. Tsis tas li ntawd, peb txoj kev ntsuam xyuas MCT siv cov khoom me me 10–35 µm uas muaj alumina lossis iav siab refractive index ua cov cim MCT pom siv PB-PCXI21. Ob txoj kev no tsim nyog rau kev pom ntawm ntau hom khoom me me, suav nrog MP.
Vim nws qhov kev daws teeb meem siab thiab lub sijhawm, peb cov txheej txheem tshuaj xyuas PB-PCXI-raws li ASL thiab MCT yog qhov zoo rau kev tshuaj xyuas cov dynamics thiab cov qauv ntawm cov khoom me me thiab cov khoom loj hauv vivo los pab peb nkag siab thiab ua kom zoo dua cov txheej txheem xa khoom MP gene. Txoj hauv kev uas peb siv ntawm no yog los ntawm peb txoj kev tshawb fawb siv SPring-8 BL20B2 beamline, uas peb pom cov kua dej txav tom qab kev xa khoom sham vector mus rau hauv qhov ntswg thiab ntsws ntawm cov nas los pab piav qhia peb cov qauv qhia tawm tsis sib xws uas pom hauv peb cov kev tshawb fawb tsiaj gene carrier koob tshuaj 3,4.
Lub hom phiaj ntawm txoj kev tshawb no yog siv lub synchrotron PB-PCXI los pom cov kev txav mus los hauv vivo ntawm cov MPs hauv lub trachea ntawm cov nas uas tseem muaj sia nyob. Cov kev tshawb fawb PB-PCXI no tau tsim los sim ntau yam MPs, lub zog ntawm lub zog magnetic, thiab qhov chaw los txiav txim siab lawv cov teebmeem rau MP kev txav mus los. Peb xav tias lub zog magnetic siv sab nraud yuav pab MP xa mus nyob lossis txav mus rau thaj chaw tsom. Cov kev tshawb fawb no kuj tso cai rau peb txheeb xyuas cov qauv magnetic uas ua rau muaj ntau cov khoom me me khaws cia hauv lub trachea tom qab tso tawm. Hauv cov kev tshawb fawb thib ob, peb nrhiav kev siv cov qauv zoo tshaj plaws no los qhia txog tus qauv transduction uas tshwm sim los ntawm kev xa khoom hauv vivo ntawm LV-MPs mus rau txoj hlab pa nas, raws li kev xav tias kev xa khoom ntawm LV-MPs hauv cov ntsiab lus ntawm txoj hlab pa tsom yuav ua rau LV transduction ua haujlwm zoo dua.
Txhua qhov kev tshawb fawb txog tsiaj txhu tau ua raws li cov txheej txheem uas tau pom zoo los ntawm University of Adelaide (M-2019-060 thiab M-2020-022) thiab SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Cov kev sim tau ua raws li cov lus qhia ntawm ARRIVE.
Tag nrho cov duab X-ray tau ua tiav ntawm BL20XU beamline ntawm SPring-8 synchrotron hauv Nyiv Pooj, siv qhov teeb tsa zoo ib yam li qhov tau piav qhia ua ntej21,22. Hauv luv luv, lub thawv sim tau nyob 245 m ntawm lub nplhaib cia synchrotron. Qhov deb ntawm cov qauv mus rau lub tshuab ntes ntawm 0.6 m yog siv rau kev kawm txog cov khoom me me thiab 0.3 m rau kev kawm txog kev thaij duab hauv vivo los tsim cov teebmeem sib piv theem. Lub zog ntawm lub teeb monochromatic ntawm 25 keV tau siv. Cov duab tau raug ntes siv lub tshuab hloov pauv X-ray siab daws teeb meem (SPring-8 BM3) txuas nrog lub tshuab ntes sCMOS. Lub tshuab hloov pauv hloov cov duab X-ray mus rau lub teeb pom kev siv lub tshuab scintillator tuab 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), uas tom qab ntawd raug xa mus rau lub sensor sCMOS siv lub hom phiaj × 10 microscope (NA 0.3). Lub tshuab ntes sCMOS yog Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Nyiv Pooj) nrog qhov loj me ntawm 2048 × 2048 pixels thiab qhov loj ntawm raw pixel ntawm 6.5 × 6.5 µm. Qhov kev teeb tsa no ua rau muaj qhov loj ntawm isotropic pixel ntawm 0.51 µm thiab qhov pom ntawm kwv yees li 1.1 mm × 1.1 mm. Qhov ntev ntawm 100 ms tau raug xaiv los ua kom qhov sib piv ntawm cov khoom sib nqus sab hauv thiab sab nraud ntawm txoj hlab pa loj tshaj plaws thaum txo qhov kev txav mus los ntawm kev ua pa. Rau kev tshawb fawb hauv vivo, lub qhov rai X-ray ceev tau muab tso rau hauv txoj kev X-ray kom txwv cov tshuaj tua kab mob los ntawm kev thaiv lub teeb X-ray ntawm cov kev raug mob.
Tus neeg nqa khoom LV tsis tau siv rau hauv kev tshawb fawb txog SPring-8 PB-PCXI vim tias lub chamber BL20XU tsis tau ntawv pov thawj Biosafety Level 2. Hloov chaw, peb tau xaiv ntau yam MPs uas muaj tus cwj pwm zoo los ntawm ob tus neeg muag khoom lag luam - uas npog ntau qhov loj me, cov ntaub ntawv, cov hlau, thiab cov ntawv thov - ua ntej kom nkag siab tias cov teb sib nqus cuam tshuam li cas rau kev txav ntawm MP hauv cov iav capillaries, thiab tom qab ntawd hauv cov pa ua pa. nyob rau saum npoo. MPs muaj qhov loj me txij li 0.25 txog 18 μm thiab yog ua los ntawm ntau yam khoom siv (saib Rooj 1), tab sis cov khoom sib xyaw ntawm txhua tus qauv, suav nrog qhov loj ntawm cov khoom sib nqus hauv MP, tsis paub. Raws li peb cov kev tshawb fawb MCT dav dav 19, 20, 21, 23, 24, peb xav tias MPs me me li 5 μm tuaj yeem pom ntawm qhov chaw tracheal airway, piv txwv li los ntawm kev rho tawm cov thav duab sib law liag kom pom kev pom zoo ntawm MP kev txav mus los. Ib qho MP me me 0.25 μm me dua qhov kev daws teeb meem ntawm lub cuab yeej thaij duab, tab sis PB-PCXI xav tias yuav ntes lawv qhov sib piv ntawm qhov ntim thiab kev txav mus los ntawm cov kua dej saum npoo uas lawv tau tso tom qab tso.
Cov qauv rau txhua MP hauv Rooj 1 tau npaj rau hauv 20 μl iav capillaries (Drummond Microcaps, PA, Tebchaws Meskas) nrog lub cheeb sab hauv ntawm 0.63 hli. Cov khoom me me muaj nyob rau hauv dej, thaum cov khoom me me CombiMag muaj nyob rau hauv cov kua dej ntawm cov chaw tsim khoom. Txhua lub raj yog ib nrab puv nrog kua (kwv yees li 11 μl) thiab muab tso rau ntawm lub thawv qauv (saib Daim Duab 1). Cov iav capillaries tau muab tso rau kab rov tav ntawm theem qauv hauv lub thawv duab, feem, thiab tso cov npoo ntawm cov kua dej. Lub 19 hli txoj kab uas hla (28 hli ntev) nickel plhaub av tsis tshua muaj neodymium hlau boron (NdFeB) hlau nplaum (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) nrog lub magnetization seem ntawm 1.17 Tesla tau txuas rau theem txhais lus sib cais kom ua tiav hloov nws txoj haujlwm deb thaum lub sijhawm thaij duab. Kev thaij duab X-ray pib thaum lub hlau nplaum tau tso kwv yees li 30 hli saum cov qauv, thiab cov duab tau txais ntawm tus nqi ntawm 4 thav duab ib ob. Thaum lub sijhawm thaij duab, lub hlau nplaum tau coj los ze rau lub raj iav capillary (kwv yees li 1 hli deb) thiab tom qab ntawd txhais raws lub raj kom ntsuas qhov cuam tshuam ntawm lub zog teb thiab qhov chaw.
Kev teeb tsa duab hauv vitro uas muaj cov qauv MP hauv cov hlab ntsha iav ntawm theem txhais lus xy. Txoj kev ntawm lub teeb X-ray yog cim nrog kab liab.
Thaum pom tau MPs hauv vitro, ib pawg ntawm lawv tau raug sim hauv vivo hauv cov nas Wistar poj niam albino qus (~ 12 lub lis piam, ~ 200 g). 0.24 mg / kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Nyiv), 3.2 mg / kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Nyiv) thiab 4 mg / kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika) Cov nas tau muab tshuaj loog nrog cov tshuaj sib xyaw ntawm Pharma), Nyiv) los ntawm kev txhaj tshuaj intraperitoneal. Tom qab tshuaj loog, lawv tau npaj rau kev thaij duab los ntawm kev tshem tawm cov plaub hau nyob ib puag ncig lub trachea, ntxig lub raj endotracheal (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) thiab immobilizing lawv supine ntawm lub phaj thaij duab ua tshwj xeeb uas muaj lub hnab thermal kom tswj tau lub cev kub 22. Lub phaj thaij duab tom qab ntawd tau txuas rau theem txhais lus qauv hauv lub thawv thaij duab ntawm lub kaum sab xis me ntsis kom phim lub trachea kab rov tav hauv daim duab X-ray, raws li qhia. nyob rau hauv Daim Duab 2a.
(a) Kev teeb tsa duab hauv vivo hauv lub thawv duab SPring-8, txoj kev ntawm lub teeb X-ray yog cim nrog kab liab dotted. (b, c) Kev teeb tsa hlau nplaum ntawm lub trachea tau ua tiav los ntawm kev siv ob lub koob yees duab IP orthogonally mounted. Ntawm sab laug ntawm daim duab ntawm lub vijtsam, lub voj hlau tuav lub taub hau tuaj yeem pom, thiab lub cannula xa khoom nyob rau hauv qhov chaw hauv lub raj ET.
Ib lub tshuab twj tso kua tshuaj uas tswj tau los ntawm chaw taws teeb (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) siv lub raj tshuaj iav 100 μl tau txuas nrog PE10 tubing (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) los ntawm 30 Ga koob. Kos lub raj kom paub tseeb tias lub hau nyob rau hauv qhov chaw raug hauv lub trachea thaum ntxig lub raj ET. Siv lub micropump, lub syringe plunger tau raug rho tawm thaum lub hau ntawm lub raj tau muab tso rau hauv MP qauv kom xa tuaj. Lub raj xa khoom tau raug xa mus rau hauv lub raj endotracheal, tso lub hau nyob rau hauv qhov muaj zog tshaj plaws ntawm peb qhov kev xav tau siv lub zog sib nqus. Kev ntes duab tau tswj hwm siv lub tshuab ntes pa uas txuas nrog peb lub thawv sijhawm Arduino, thiab txhua lub teeb liab (piv txwv li kub, kev ua pa, qhib / kaw lub qhov rooj thiab kev ntes duab) tau kaw cia siv Powerlab thiab LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Thaum thaij duab Thaum lub qhov rooj tsis tuaj yeem nkag mus tau, ob lub koob yees duab IP (Panasonic BB-SC382) tau muab tso rau ntawm kwv yees li 90 ° rau ib leeg thiab tau siv los saib xyuas qhov chaw. ntawm cov hlau nplaum piv rau lub trachea thaum lub sijhawm thaij duab (Daim Duab 2b, c). Txhawm rau kom txo qis cov khoom txav mus los, ib daim duab tau txais rau txhua txoj pa thaum lub sijhawm kawg ntawm cov dej ntws.
Muaj ib lub hlau nplaum txuas rau theem thib ob uas tuaj yeem nrhiav tau deb ntawm sab nraud ntawm lub tsev thaij duab. Muaj ntau qhov chaw thiab kev teeb tsa ntawm cov hlau nplaum, suav nrog: Muab ntsia rau ntawm lub kaum sab xis li 30° saum lub trachea (kev teeb tsa qhia hauv Daim Duab 2a thiab 3a); ib lub hlau nplaum saum tus tsiaj thiab lwm lub hauv qab, nrog cov ncej teeb tsa kom nyiam (Daim Duab 3b); ib lub hlau nplaum saum tus tsiaj thiab lwm lub hauv qab, nrog cov ncej teeb tsa kom thawb (Daim Duab 3c); thiab ib lub hlau nplaum saum toj thiab perpendicular rau lub trachea (Daim Duab 3d). Thaum tus tsiaj thiab hlau nplaum tau teeb tsa thiab MP uas yuav tsum tau kuaj tau thauj mus rau hauv lub twj tso kua mis, xa 50 μl koob tshuaj ntawm tus nqi ntawm 4 μl/sec thaum tau txais cov duab. Tom qab ntawd lub hlau nplaum raug txav mus los rov qab thiab tawm mus raws lossis sab nraud hla lub trachea thaum txuas ntxiv tau txais cov duab.
Kev teeb tsa hlau nplaum rau kev thaij duab hauv vivo (a) ib lub hlau nplaum saum lub trachea ntawm lub kaum sab xis li ntawm 30°, (b) ob lub hlau nplaum teeb tsa kom nyiam, (c) ob lub hlau nplaum teeb tsa kom thawb, (d) ib lub hlau nplaum saum toj thiab ntsug hauv lub trachea. Tus neeg soj ntsuam saib ntawm lub qhov ncauj mus rau lub ntsws los ntawm lub trachea, thiab lub teeb X-ray hla dhau tus nas sab laug thiab tawm sab xis. Lub hlau nplaum raug txav mus raws qhov ntev ntawm txoj hlab pa lossis sab laug thiab sab xis saum lub trachea hauv kev coj ntawm lub teeb X-ray.
Peb kuj nrhiav kev txiav txim siab qhov pom kev thiab tus cwj pwm ntawm cov khoom me me hauv txoj hlab pa thaum tsis muaj kev ua pa tsis meej thiab kev txav ntawm lub plawv. Yog li ntawd, thaum kawg ntawm lub sijhawm thaij duab, cov tsiaj raug tua tib neeg rau kev siv tshuaj pentobarbital ntau dhau (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Tebchaws Meskas; ~ 65 mg / kg ip). Qee cov tsiaj raug tso rau ntawm lub platform thaij duab, thiab thaum ua pa thiab lub plawv dhia nres, cov txheej txheem thaij duab tau rov ua dua, ntxiv ib koob tshuaj ntxiv ntawm MP yog tias tsis muaj MP pom ntawm qhov chaw ntawm txoj hlab pa.
Cov duab tau txais tau raug kho kom tiaj tiaj thiab tsaus ntuj thiab tom qab ntawd muab sib sau ua ke rau hauv zaj yeeb yaj kiab (20 thav duab ib ob; 15-25 × qhov ceev ib txwm nyob ntawm qhov ua pa) siv cov ntawv sau tshwj xeeb sau rau hauv MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Txhua txoj kev tshawb nrhiav txog kev xa cov noob caj noob ces LV tau ua nyob rau ntawm Chaw Tshawb Fawb Txog Tsiaj Txhu hauv University of Adelaide thiab lub hom phiaj yog siv cov txiaj ntsig ntawm kev sim SPring-8 los ntsuas seb kev xa LV-MP nyob rau hauv qhov muaj lub zog sib nqus puas tuaj yeem txhim kho kev hloov pauv noob caj noob ces hauv vivo. Txhawm rau ntsuas cov teebmeem ntawm MP thiab lub zog sib nqus, ob pawg tsiaj tau kho: ib pawg tau muab LV-MP nrog lub hlau nplaum tso rau, thiab lwm pawg tau txais pawg tswj nrog LV-MP tsis muaj hlau nplaum.
Cov vectors noob caj noob ces LV tau tsim los ntawm kev siv cov txheej txheem piav qhia ua ntej 25, 26. Lub vector LacZ qhia txog cov noob caj noob ces beta-galactosidase uas tau tsav los ntawm tus neeg txhawb nqa MPSV (LV-LacZ), uas tsim cov khoom xiav hauv cov hlwb hloov pauv, pom tau hauv cov ntaub so ntswg ntsws thiab cov ntu ntaub so ntswg. Kev ntsuas tau ua tiav hauv cov kab lis kev cai ntawm tes los ntawm kev suav tus lej ntawm cov hlwb LacZ zoo nrog lub hemocytometer los xam cov titer hauv TU/ml. Cov neeg nqa khoom raug khaws cia rau ntawm -80 ° C, yaj ua ntej siv, thiab khi rau CombiMag los ntawm kev sib tov ntawm 1: 1 piv thiab incubating ntawm dej khov tsawg kawg 30 feeb ua ntej yug me nyuam.
Cov nas Sprague Dawley ib txwm muaj (n = 3/pawg, ~2-3 tau muab tshuaj loog rau hauv plab nrog rau kev sib xyaw ntawm 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) thiab 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) ib hlis) ip) txhaj tshuaj thiab tsis yog phais cannulation qhov ncauj nrog 16 Ga iv cannula. Txhawm rau kom ntseeg tau tias cov ntaub so ntswg tracheal tau txais LV transduction, nws tau conditioned siv peb cov txheej txheem perturbation mechanical piav qhia ua ntej, uas qhov chaw tracheal airway tau rubbed axially nrog lub pob tawb hlau (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Tracheal kev tswj hwm ntawm LV-MP tau ua tiav hauv lub txee kev nyab xeeb txog li 10 feeb tom qab perturbation.
Lub zog sib nqus siv hauv qhov kev sim no tau teeb tsa zoo ib yam li kev tshawb fawb X-ray hauv vivo, nrog cov hlau nplaum zoo ib yam li tuav saum lub trachea siv cov khoom siv distillation stent (Daim Duab 4). Ib qho ntim 50 μl (2 × 25 μl aliquots) ntawm LV-MP tau xa mus rau hauv lub trachea (n = 3 tus tsiaj) siv lub pipette uas muaj lub taub hau gel raws li tau piav qhia ua ntej. Ib pawg tswj hwm (n = 3 tus tsiaj) tau txais tib LV-MPs yam tsis siv lub hlau nplaum. Tom qab kev txhaj tshuaj tiav lawm, lub cannula raug tshem tawm ntawm lub raj ET thiab tus tsiaj raug extubated. Lub hlau nplaum nyob hauv qhov chaw rau 10 feeb, tom qab ntawd nws raug tshem tawm. Cov nas tau txais ib koob tshuaj meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia) ua raws li kev thim rov qab ntawm kev siv tshuaj loog los ntawm kev txhaj tshuaj ip ntawm 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). Cov nas tau khaws cia sov thiab saib xyuas kom txog thaum rov zoo los ntawm kev siv tshuaj loog.
Lub cuab yeej xa khoom LV-MP hauv lub txee kev nyab xeeb txog kab mob. Lub hub Luer xim grey ntawm lub raj ET tuaj yeem pom tawm ntawm lub qhov ncauj thiab lub hau gel ntawm lub pipette uas pom hauv daim duab raug ntxig los ntawm lub raj ET mus rau qhov tob uas xav tau rau hauv lub trachea.
Ib lub lim tiam tom qab LV-MP dosing txheej txheem, cov tsiaj raug tua los ntawm 100% CO2 inhalation thiab LacZ kev qhia tawm tau raug soj ntsuam siv peb tus qauv X-gal kev kho mob. Peb lub caudal feem ntau cartilaginous rings tau raug tshem tawm kom ntseeg tau tias muaj kev puas tsuaj lossis cov kua dej los ntawm qhov chaw endotracheal tube tsis suav nrog hauv kev tshuaj xyuas. Txhua lub trachea tau txiav longitudinal kom tsim ob ib nrab rau kev tshuaj xyuas, thiab lawv tau mounted rau hauv lub tais uas muaj silicone roj hmab (Sylgard, Dow Inc) siv Minutien koob (Fine Science Tools) los pom qhov luminal nto. Kev faib tawm thiab cov qauv ntawm cov hlwb transduced tau lees paub los ntawm kev thaij duab pem hauv ntej siv Nikon microscope (SMZ1500) nrog lub koob yees duab DigiLite thiab TCapture software (Tucsen Photonics, Tuam Tshoj). Cov duab tau txais ntawm 20x magnification (suav nrog qhov chaw siab tshaj plaws rau tag nrho qhov dav ntawm lub trachea), nrog rau tag nrho qhov ntev ntawm lub trachea imagered ib kauj ruam zuj zus, xyuas kom meej tias muaj kev sib tshooj txaus ntawm txhua daim duab kom tso cai rau daim duab "stitching". Cov duab los ntawm txhua Cov hlab cua tau muab sib sau ua ke rau hauv ib daim duab sib xyaw siv Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) siv cov txheej txheem kev txav mus los ntawm planar. Cov cheeb tsam qhia LacZ hauv cov duab sib xyaw ntawm cov hlab cua los ntawm txhua tus tsiaj tau ntsuas siv cov ntawv sau MATLAB (R2020a, MathWorks) raws li tau piav qhia ua ntej, siv cov chaw teeb tsa ntawm 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, thiab Value < 0.7. Los ntawm kev taug qab cov duab ntawm cov ntaub so ntswg, lub ntsej muag tau tsim los ntawm tes hauv GIMP v2.10.24 rau txhua daim duab sib xyaw kom paub txog thaj chaw ntaub so ntswg thiab tiv thaiv kev kuaj pom cuav los ntawm sab nraud ntawm cov ntaub so ntswg tracheal. Cov cheeb tsam pleev xim los ntawm txhua daim duab sib xyaw los ntawm txhua tus tsiaj tau suav ua ke los tsim tag nrho thaj chaw pleev xim rau tus tsiaj ntawd. Thaj chaw pleev xim tom qab ntawd tau faib los ntawm tag nrho thaj chaw npog ntsej muag los tsim thaj chaw normalized.
Txhua lub trachea tau muab tso rau hauv paraffin thiab 5 μm seem tau txiav. Cov seem tau counterstained nrog neutral fast red rau 5 feeb thiab cov duab tau txais los ntawm kev siv Nikon Eclipse E400 microscope, DS-Fi3 lub koob yees duab thiab NIS element capture software (version 5.20.00).
Tag nrho cov kev tshuaj xyuas suav lej tau ua tiav hauv GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Qhov tseem ceeb ntawm kev suav lej tau teeb tsa ntawm p ≤ 0.05. Qhov ib txwm muaj tau txheeb xyuas siv qhov kev xeem Shapiro-Wilk, thiab qhov sib txawv ntawm LacZ staining tau soj ntsuam siv qhov kev xeem t-unpaired.
Rau rau tus MPs uas tau piav qhia hauv Rooj 1 tau raug kuaj xyuas siv PCXI, thiab qhov pom kev tau piav qhia hauv Rooj 2. Ob lub polystyrene MPs (MP1 thiab MP2; 18 μm thiab 0.25 μm, feem) tsis pom hauv PCXI, tab sis cov qauv seem tau pom tseeb (piv txwv tau qhia hauv Daim Duab 5). MP3 thiab MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm thiab 0.9 μm, feem) pom tsis meej. Txawm hais tias muaj qee cov khoom me me uas tau sim, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) yog qhov pom tseeb tshaj plaws. Cov khoom CombiMag MP6 nyuaj rau pom. Hauv txhua qhov xwm txheej, peb lub peev xwm los ntes MP tau txhim kho ntau heev los ntawm kev txhais cov hlau nplaum rov qab thiab tawm mus sib luag rau lub capillary. Thaum cov hlau nplaum txav deb ntawm lub capillary, cov khoom me me nthuav dav ua cov hlua ntev, tab sis thaum cov hlau nplaum tau ze dua thiab lub zog ntawm lub zog magnetic nce ntxiv, cov hlua me me luv dua thaum cov khoom me me tsiv mus rau saum npoo ntawm lub capillary (saib Supplementary Video S1: MP4), nce qhov ceev ntawm cov khoom me me ntawm qhov chaw. Conversely, thaum lub hlau nplaum raug tshem tawm ntawm lub capillary, lub zog teb txo qis thiab MPs rov qab ua cov hlua ntev txuas ntxiv los ntawm qhov chaw sab saud ntawm lub capillary (saib Supplementary Video S2: MP4). Tom qab lub hlau nplaum tsis txav mus los, cov khoom me me txuas ntxiv mus rau lub sijhawm luv luv tom qab mus txog qhov chaw sib npaug. Thaum MP txav mus rau thiab deb ntawm qhov chaw sab saud ntawm lub capillary, cov khoom me me feem ntau rub cov khib nyiab hla cov kua.
Qhov pom ntawm MP nyob rau hauv PCXI sib txawv ntawm cov qauv piv txwv. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 thiab (d) MP6. Tag nrho cov duab qhia ntawm no tau thaij nrog lub hlau nplaum nyob kwv yees li 10 hli ncaj qha saum cov capillary. Cov voj voog loj pom tseeb yog cov pa npuas uas raug kaw hauv cov hlab ntsha, qhia meej meej cov yam ntxwv dub thiab dawb ntug ntawm cov duab sib piv theem. Lub thawv liab muaj qhov sib piv-txhim kho magnification. Nco ntsoov tias cov kab uas hla ntawm cov hlau nplaum schematics hauv txhua daim duab tsis yog rau qhov ntsuas thiab yog kwv yees li 100 npaug loj dua li qhia.
Thaum lub hlau nplaum raug txhais sab laug thiab sab xis raws li sab saum toj ntawm lub capillary, lub kaum ntawm MP txoj hlua hloov pauv kom sib phim nrog lub hlau nplaum (saib Daim Duab 6), yog li qhia txog cov kab sib nqus. Rau MP3-5, tom qab lub chord ncav cuag lub kaum sab xis, cov khoom me me raug rub mus rau saum npoo ntawm lub capillary. Qhov no feem ntau ua rau MPs sib sau ua pawg loj dua ze rau qhov chaw uas lub zog sib nqus muaj zog tshaj plaws (saib Cov Yeeb Yaj Kiab Ntxiv S3: MP5). Qhov no kuj pom tseeb tshwj xeeb thaum thaij duab ze rau qhov kawg ntawm lub capillary, uas ua rau MPs sib sau ua ke thiab sib sau ua ke ntawm qhov sib txuas ntawm cov kua-cua. Cov khoom me me hauv MP6, uas nyuaj rau pom dua li MP3-5, tsis raug rub thaum lub hlau nplaum txav mus raws li lub capillary, tab sis cov hlua MP sib cais, tawm hauv cov khoom me me hauv thaj chaw pom (saib Cov Yeeb Yaj Kiab Ntxiv S4: MP6). Hauv qee kis, thaum lub zog sib nqus siv tau raug txo los ntawm kev txav lub hlau nplaum mus deb ntawm qhov chaw thaij duab, txhua MPs uas tseem tshuav maj mam nqis mus rau hauv qab ntawm lub raj los ntawm lub ntiajteb txawj nqus thaum tseem nyob hauv txoj hlua (saib Cov Yeeb Yaj Kiab Ntxiv S5: MP3).
Lub kaum sab xis ntawm txoj hlua MP hloov pauv thaum lub hlau nplaum raug txhais mus rau sab xis saum cov capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 thiab (d) MP6. Lub thawv liab muaj qhov sib piv-txhim kho magnification. Nco ntsoov tias cov yeeb yaj kiab ntxiv yog cov ntaub ntawv qhia vim lawv qhia txog cov qauv tseem ceeb thiab cov ntaub ntawv dynamic uas tsis tuaj yeem pom hauv cov duab static no.
Peb cov kev sim qhia tau tias kev txav cov hlau nplaum qeeb qeeb rov qab thiab tawm mus raws li lub trachea ua rau pom kev ntawm MP hauv cov ntsiab lus ntawm kev txav mus los nyuaj hauv vivo. Kev sim hauv vivo tsis tau ua vim tias cov hlaws polystyrene (MP1 thiab MP2) tsis pom hauv cov capillary. Txhua tus ntawm plaub MPs seem tau sim hauv vivo nrog lub hlau nplaum ntev axis teeb tsa saum lub trachea ntawm lub kaum sab xis ntawm kwv yees li 30 ° rau ntsug (saib Cov Duab 2b thiab 3a), vim qhov no ua rau cov saw hlau MP ntev dua thiab ua haujlwm zoo dua li qhov kev teeb tsa hlau nplaum xaus. MP3, MP4 thiab MP6 tsis tau pom hauv lub trachea ntawm cov tsiaj txhu uas muaj sia nyob. Thaum cov nas txoj hlab pa tau raug thaij duab tom qab cov tsiaj raug tua tib neeg, cov khoom me me tseem tsis pom txawm tias thaum ntxiv ntim ntxiv siv lub twj tso kua mis. MP5 muaj cov hlau oxide ntau tshaj plaws thiab yog tib qho khoom me me pom, thiab yog li ntawd tau siv los ntsuas thiab piav qhia txog tus cwj pwm hauv vivo ntawm MP.
Muab lub hlau nplaum tso rau saum lub trachea thaum lub sijhawm xa khoom MP ua rau ntau, tab sis tsis yog txhua tus, MPs tau sib sau ua ke hauv thaj chaw pom. Cov khoom me me nkag mus rau hauv lub trachea pom tau zoo tshaj plaws hauv cov tsiaj uas raug tua pov tseg. Daim Duab 7 thiab Cov Yeeb Yaj Kiab Ntxiv S6: MP5 qhia txog kev ntes thiab sib dhos ntawm cov khoom me me ntawm qhov chaw ntawm lub ventral trachea, qhia tias MPs tuaj yeem raug coj mus rau thaj chaw xav tau ntawm lub trachea. Thaum tshawb nrhiav ntau dua ntawm lub trachea tom qab xa khoom MP, qee cov MPs tau pom ze rau lub carina, qhia tias lub zog ntawm lub zog magnetic tsis txaus los sau thiab khaws cia txhua tus MPs, vim tias lawv tau xa mus los ntawm thaj chaw ntawm lub zog magnetic siab tshaj plaws thaum lub sijhawm ua kua. Txawm li cas los xij, cov concentration ntawm MP tom qab yug menyuam siab dua nyob ib puag ncig thaj chaw duab, qhia tias ntau tus MPs tseem nyob hauv thaj chaw ua pa uas lub zog magnetic siv siab tshaj plaws.
Cov duab los ntawm (a) ua ntej thiab (b) tom qab xa MP5 mus rau hauv lub trachea ntawm tus nas uas nyuam qhuav raug tua nrog lub hlau nplaum nyob ncaj qha saum toj ntawm thaj chaw thaij duab. Thaj chaw thaij duab nyob nruab nrab ntawm ob lub nplhaib pob txha mos. Ua ntej xa MP, muaj qee cov kua dej hauv txoj hlab pa. Lub thawv liab muaj qhov sib piv-txhim kho magnification. Cov duab no yog los ntawm cov yeeb yaj kiab qhia hauv Supplementary Video S6:MP5.
Kev txhais cov hlau nplaum raws li lub trachea hauv vivo ua rau MP saw hlau hloov lub kaum sab hauv qhov chaw ua pa zoo ib yam li pom hauv cov hlab ntsha capillaries (saib Daim Duab 8 thiab Cov Yeeb Yaj Kiab Ntxiv S7: MP5). Txawm li cas los xij, hauv peb txoj kev tshawb fawb, MPs tsis tuaj yeem raug rub raws qhov chaw ntawm txoj kev ua pa zoo li lawv tuaj yeem ua nrog cov hlab ntsha capillaries. Hauv qee kis, MP saw hlau yuav ntev dua thaum lub hlau nplaum txav mus rau sab laug thiab sab xis. Qhov nthuav yog, peb kuj pom tias cov hlua particle zoo li hloov qhov tob ntawm cov kua dej ntawm qhov chaw thaum lub hlau nplaum raug txav mus rau longitudinally raws li lub trachea, thiab nthuav dav thaum lub hlau nplaum raug txav mus rau saum taub hau thiab cov hlua particle tig mus rau qhov chaw ntsug (saib Cov Yeeb Yaj Kiab Ntxiv S7). : MP5 ntawm 0:09, sab xis hauv qab). Tus qauv ntawm kev txav mus los tau hloov pauv thaum lub hlau nplaum tau txhais hla sab saum toj ntawm lub trachea laterally (uas yog, mus rau sab laug lossis sab xis ntawm tus tsiaj es tsis yog raws qhov ntev ntawm lub trachea). Cov khoom me me tseem pom tseeb thaum lawv txav mus los, tab sis thaum lub hlau nplaum raug tshem tawm ntawm lub trachea, cov lus qhia ntawm cov hlua khoom me me tau pom tseeb (saib Cov Yeeb Yaj Kiab Ntxiv S8: MP5, pib ntawm 0:08). Qhov no yog sib xws nrog tus cwj pwm MP uas peb tau pom nyob rau hauv ib qho chaw siv hlau nplaum hauv lub iav capillary.
Piv txwv cov duab qhia MP5 hauv lub trachea ntawm tus nas uas muaj sia nyob uas tau txais tshuaj loog.(a) Lub hlau nplaum siv los ntes cov duab saum toj no thiab sab laug ntawm lub trachea, tom qab ntawd (b) tom qab lub hlau nplaum raug tsiv mus rau sab xis. Lub thawv liab muaj qhov sib piv-txhim kho magnification. Cov duab no yog los ntawm cov yeeb yaj kiab qhia hauv Supplementary Video S7:MP5.
Thaum ob lub ncej tau teeb tsa rau sab qaum teb-sab qab teb sab saud thiab hauv qab lub trachea (piv txwv li rub; Daim Duab 3b), cov MP chords tshwm sim ntev dua thiab nyob rau ntawm phab ntsa ntawm lub trachea es tsis yog nyob rau ntawm qhov chaw dorsal tracheal (saib Cov Yeeb Yaj Kiab Ntxiv S9: MP5). Txawm li cas los xij, cov khoom me me ntawm ib qho chaw (piv txwv li, qhov chaw dorsal ntawm lub trachea) tsis tau pom tom qab xa cov kua thaum siv lub cuab yeej hlau nplaum ob lub, uas feem ntau tshwm sim thaum siv lub cuab yeej hlau nplaum ib lub. Tom qab ntawd thaum ib lub hlau nplaum tau teeb tsa los thawb cov ncej rov qab (Daim Duab 3c), tus lej ntawm cov khoom me me pom hauv thaj chaw pom tsis zoo li nce tom qab xa khoom. Kev teeb tsa ntawm ob lub hlau nplaum ob lub yog qhov nyuaj vim muaj lub zog siab ntawm lub zog hlau nplaum uas rub lossis thawb cov hlau nplaum, raws li. Kev teeb tsa tom qab ntawd tau hloov mus rau ib lub hlau nplaum sib luag rau txoj hlab pa tab sis hla txoj hlab pa ntawm 90 degrees kom cov kab teb hla phab ntsa tracheal orthogonally (Daim Duab 3d), kev teeb tsa tsim los txiav txim siab seb puas tuaj yeem pom cov khoom me me sib sau ua ke ntawm phab ntsa sab. Txawm li cas los xij, hauv qhov kev teeb tsa no, tsis muaj kev txav mus los ntawm MP lossis kev txav mus los ntawm hlau nplaum. Raws li tag nrho cov txiaj ntsig no, ib qho hlau nplaum, 30-degree kev teeb tsa (Daim Duab 3a) tau raug xaiv rau kev tshawb fawb txog cov noob caj noob ces hauv vivo.
Thaum tus tsiaj raug thaij duab ntau zaus tom qab tua tib neeg, qhov tsis muaj kev txav ntawm cov ntaub so ntswg txhais tau tias cov kab me me thiab luv dua tuaj yeem pom tau hauv thaj chaw interchondral meej, "wobbly" raws li kev txav ntawm lub hlau nplaum. Txawm li cas los xij, tseem tsis tuaj yeem pom tseeb qhov muaj thiab kev txav ntawm cov khoom me me MP6.
Tus LV-LacZ titer yog 1.8 × 108 TU/ml, thiab tom qab 1:1 sib xyaw nrog CombiMag MP (MP6), cov tsiaj tau txais 50 μl tracheal koob tshuaj ntawm 9 × 107 TU/ml LV lub tsheb (piv txwv li 4.5 × 106 TU/rat). Hauv cov kev tshawb fawb no, es tsis txhob txhais cov hlau nplaum thaum lub sijhawm yug menyuam, peb tau kho cov hlau nplaum rau hauv ib qho chaw los txiav txim siab seb LV transduction (a) puas tuaj yeem txhim kho piv rau vector xa khoom thaum tsis muaj lub teb hlau nplaum, thiab (b) tuaj yeem tsom mus rau Airway cells raug hloov mus rau thaj chaw hlau nplaum ntawm txoj hlab pa sab saud.
Qhov muaj cov hlau nplaum thiab kev siv CombiMag ua ke nrog LV vectors zoo li tsis muaj kev cuam tshuam tsis zoo rau kev noj qab haus huv ntawm cov tsiaj, ib yam li peb tus qauv LV vector xa khoom. Cov duab pem hauv ntej ntawm thaj chaw tracheal raug kev cuam tshuam los ntawm kev siv tshuab (Daim Duab Ntxiv 1) qhia tias muaj cov theem siab dua ntawm kev hloov pauv hauv pawg tsiaj kho nrog LV-MP thaum lub hlau nplaum nyob ntawd (Daim Duab 9a). Tsuas yog me ntsis ntawm cov xim xiav LacZ nyob hauv pawg tswj (Daim Duab 9b). Kev ntsuas ntawm cov cheeb tsam X-Gal stained normalized qhia tau hais tias kev tswj hwm ntawm LV-MP nyob rau hauv qhov muaj lub zog sib nqus tau tsim kev txhim kho kwv yees li 6 npaug (Daim Duab 9c).
Piv txwv cov duab sib xyaw ua ke uas qhia txog kev hloov pauv tracheal los ntawm LV-MP (a) thaum muaj lub zog sib nqus thiab (b) thaum tsis muaj hlau nplaum.(c) Kev txhim kho tseem ceeb hauv thaj chaw hloov pauv LacZ hauv trachea thaum siv hlau nplaum (*p = 0.029, t-test, n = 3 ib pawg, nruab nrab ± SEM).
Cov seem uas muaj xim liab sai sai (piv txwv qhia hauv Daim Duab Ntxiv 2) qhia tau tias cov hlwb uas muaj xim LacZ muaj nyob rau hauv tus qauv thiab qhov chaw zoo sib xws li tau tshaj tawm ua ntej.
Ib qho kev sib tw tseem ceeb rau kev kho mob pa hauv txoj hlab pa tseem yog qhov chaw tseeb ntawm cov khoom me me uas nqa mus rau thaj chaw uas xav tau thiab ua tiav cov qib siab ntawm kev ua haujlwm transduction hauv lub ntsws txav mus los thaum muaj cua thiab cov hnoos qeev tawm. Rau cov neeg nqa LV uas tsim los kho CF txoj hlab pa, kev nce lub sijhawm nyob ntawm cov khoom me me uas nqa hauv cov hlab pa tau yog lub hom phiaj uas tsis yooj yim sua. Raws li Castellani et al. tau taw qhia, kev siv cov teb sib nqus los txhim kho kev hloov pauv muaj qhov zoo dua piv rau lwm txoj hauv kev xa cov noob xws li electroporation, vim nws tuaj yeem ua ke yooj yim, kev siv nyiaj tsim nyog, kev xa khoom hauv zos, kev ua haujlwm ntau dua, thiab lub sijhawm luv dua, thiab tej zaum yuav muaj cov koob tshuaj me dua10. Txawm li cas los xij, qhov kev tso tawm hauv vivo thiab tus cwj pwm ntawm cov khoom sib nqus hauv cov hlab pa nyob rau hauv kev cuam tshuam ntawm cov zog sib nqus sab nraud yeej tsis tau piav qhia, thiab tsis tau ua pov thawj qhov ua tau ntawm txoj kev no hauv vivo los txhim kho cov qib kev qhia noob hauv cov hlab pa uas tseem muaj sia nyob.
Peb cov kev sim hauv vitro synchrotron PCXI qhia tau tias txhua yam khoom me me uas peb tau sim, tshwj tsis yog polystyrene MP, pom tau hauv qhov teeb tsa duab uas peb siv. Thaum muaj lub zog sib nqus, MPs tsim cov hlua uas nws qhov ntev cuam tshuam nrog hom khoom me me thiab lub zog sib nqus (piv txwv li qhov sib ze thiab kev txav ntawm lub hlau nplaum). Raws li pom hauv Daim Duab 10, cov hlua uas peb pom tau tsim vim txhua tus khoom me me raug magnetized thiab induce nws tus kheej lub zog sib nqus hauv zos. Cov teb sib cais no ua rau lwm cov khoom zoo sib xws sib sau ua ke thiab txuas, nrog cov kev txav zoo li hlua pawg vim yog lub zog hauv zos los ntawm lub zog nyiam thiab rov ua dua ntawm lwm cov khoom me me.
Daim duab qhia txog (a,b) cov khoom me me uas tsim tawm hauv cov hlab ntsha uas muaj kua thiab (c,d) lub raj cua uas muaj cua. Nco ntsoov tias cov hlab ntsha thiab lub raj cua tsis tau kos rau qhov ntsuas. Vaj huam sib luag (a) kuj muaj cov lus piav qhia ntawm MP, uas muaj cov khoom me me Fe3O4 uas tau teeb tsa ua cov hlua.
Thaum lub hlau nplaum raug txav mus rau saum lub capillary, lub kaum ntawm cov hlua particle tau mus txog qhov tseem ceeb rau MP3-5 uas muaj Fe3O4, tom qab ntawd cov hlua particle tsis nyob hauv qhov chaw qub, tab sis txav mus rau ntawm qhov chaw mus rau qhov chaw tshiab. hlau nplaum. Qhov cuam tshuam no yuav tshwm sim vim tias qhov chaw iav capillary du txaus kom tso cai rau qhov kev txav mus los no tshwm sim. Qhov nthuav yog, MP6 (CombiMag) tsis ua li no, tej zaum vim tias cov khoom me dua, muaj cov txheej sib txawv lossis cov nqi ntawm qhov chaw, lossis cov kua dej tshwj xeeb cuam tshuam rau lawv lub peev xwm txav mus los. Qhov sib piv ntawm cov duab ntawm CombiMag cov khoom me me kuj tsis muaj zog, qhia tias cov kua thiab cov khoom me me yuav muaj qhov sib xws thiab yog li ntawd tsis yooj yim txav mus rau ib leeg. Cov khoom me me kuj tuaj yeem daig yog tias lub hlau nplaum txav mus los sai dhau, qhia tias lub zog ntawm lub zog magnetic tsis tuaj yeem kov yeej qhov kev sib txhuam ntawm cov khoom me me hauv cov kua, qhia tias tej zaum nws tsis yog qhov xav tsis thoob tias lub zog ntawm lub zog magnetic thiab qhov deb ntawm lub hlau nplaum thiab thaj chaw tsom tseem ceeb heev. Thaum muab ua ke, cov txiaj ntsig no kuj qhia tias, thaum cov hlau nplaum tuaj yeem ntes tau ntau MPs uas ntws los ntawm thaj chaw tsom, nws tsis zoo li tias cov hlau nplaum tuaj yeem cia siab tau. kom txav cov khoom me me CombiMag raws qhov chaw ntawm lub trachea. Yog li ntawd, peb xaus lus tias kev tshawb fawb hauv vivo LV-MP yuav tsum siv cov teb sib nqus zoo li qub los tsom mus rau thaj chaw tshwj xeeb ntawm tsob ntoo txoj hlab pa.
Thaum cov khoom me me raug xa mus rau hauv lub cev, lawv nyuaj rau txheeb xyuas hauv cov ntaub so ntswg uas txav mus los ntawm lub cev, tab sis lub peev xwm los ntes lawv tau txhim kho los ntawm kev txhais cov hlau nplaum kab rov tav saum lub trachea kom "wiggle" cov hlua MP. Txawm hais tias kev thaij duab nyob ua tau, nws yooj yim dua los paub txog kev txav mus los ntawm cov khoom me me thaum tus tsiaj raug tua tib neeg. Cov ntsiab lus ntawm MP feem ntau siab tshaj plaws ntawm qhov chaw no thaum lub hlau nplaum tau muab tso rau saum thaj chaw thaij duab, txawm hais tias qee cov khoom me me feem ntau pom ntxiv raws lub trachea. Sib piv rau kev tshawb fawb hauv vitro, cov khoom me me tsis tuaj yeem rub mus raws lub trachea los ntawm kev txhais cov hlau nplaum. Qhov kev tshawb pom no yog sib xws nrog li cas cov hnoos qeev uas npog qhov chaw ntawm lub trachea feem ntau ua cov khoom me me uas nqus tau, ntes lawv hauv cov hnoos qeev thiab tom qab ntawd tshem tawm los ntawm cov txheej txheem mucociliary clearance.
Peb xav tias kev siv cov hlau nplaum rau kev rub saum toj thiab hauv qab lub trachea (Daim Duab 3b) yuav ua rau muaj lub zog sib nqus sib npaug ntau dua, es tsis yog lub zog sib nqus uas muaj ntau ntawm ib qho taw tes, uas ua rau muaj kev faib tawm ntawm cov khoom me me sib npaug ntau dua. Txawm li cas los xij, peb txoj kev tshawb fawb thawj zaug tsis pom muaj pov thawj meej los txhawb qhov kev xav no. Ib yam li ntawd, kev teeb tsa ob lub hlau nplaum kom thim rov qab (Daim Duab 3c) tsis ua rau muaj ntau cov khoom me me tso rau hauv thaj chaw uas tau thaij duab. Ob qho kev tshawb pom no qhia tau tias kev teeb tsa ob lub hlau nplaum tsis txhim kho kev tswj hwm hauv zos ntawm MP targeting, thiab tias cov zog sib nqus muaj zog ua rau nyuaj rau teeb tsa, ua rau txoj hauv kev no tsis yooj yim dua. Ib yam li ntawd, kev teeb tsa lub hlau nplaum saum toj thiab dhau los ntawm lub trachea (Daim Duab 3d) kuj tsis tau ua rau muaj ntau cov khoom me me khaws cia hauv thaj chaw uas tau thaij duab. Qee qhov kev teeb tsa lwm txoj hauv kev no yuav tsis ua tiav vim tias lawv ua rau muaj zog sib nqus qis dua hauv thaj chaw tso. Yog li ntawd, kev teeb tsa ib lub kaum sab xis 30-degree (Daim Duab 3a) yog suav tias yog txoj hauv kev yooj yim tshaj plaws thiab ua tau zoo tshaj plaws rau kev sim hauv vivo.
Daim ntawv tshawb fawb LV-MP qhia tau hais tias thaum cov vectors LV raug muab sib xyaw nrog CombiMag thiab xa tom qab muaj kev cuam tshuam lub cev nyob rau hauv qhov muaj lub zog sib nqus, cov theem transduction tau nce ntxiv hauv lub trachea piv rau cov neeg tswj. Raws li kev tshawb fawb synchrotron imaging thiab LacZ cov txiaj ntsig, lub zog sib nqus tau pom tseeb tias tuaj yeem khaws LV hauv lub trachea thiab txo cov lej ntawm cov khoom me me uas nkag mus tob rau hauv lub ntsws. Kev txhim kho kev tsom mus rau qhov no yuav ua rau muaj txiaj ntsig zoo dua thaum txo cov titers xa tawm, kev hloov pauv tawm ntawm lub hom phiaj, kev mob thiab kev tiv thaiv kab mob, thiab cov nqi nqa cov noob caj noob ces. Qhov tseem ceeb, raws li tus neeg tsim khoom, CombiMag tuaj yeem siv ua ke nrog lwm txoj hauv kev hloov pauv noob caj noob ces, suav nrog lwm cov kab mob viral (xws li AAV) thiab nucleic acids.