Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS uchun cheklangan qo'llab-quvvatlash mavjud. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz namoyish qilamiz.
Kistik fibrozli o'pka kasalligini davolash uchun gen vektorlari o'tkazuvchi nafas yo'llariga qaratilgan bo'lishi kerak, chunki periferik o'pka transduksiyasi terapevtik foyda keltirmaydi. Virusli transduktsiya samaradorligi vektorning yashash vaqtiga bevosita bog'liq. Biroq, gen tashuvchilari kabi yetkazib berish suyuqliklari nafas olish paytida alveolalarga tabiiy ravishda tarqaladi va har qanday shakldagi terapevtik zarralar shilliq qavat transporti orqali tezda tozalanadi. Nafas yo'llarida gen tashuvchilarning yashash vaqtini uzaytirish muhim, ammo bunga erishish qiyin. Nafas yo'llari yuzasiga yo'naltirilishi mumkin bo'lgan gen tashuvchisi bilan bog'langan magnit zarralar mintaqaviy nishonga olishni yaxshilashi mumkin. In vivo vizualizatsiya qilishdagi qiyinchiliklar tufayli, qo'llaniladigan magnit maydon mavjud bo'lganda nafas yo'llari yuzasida bunday kichik magnit zarralarning xatti-harakatlari yaxshi tushunilmagan. Ushbu tadqiqotning maqsadi anesteziya qilingan kalamushlarning traxeyasidagi bir qator magnit zarralarning in vivo harakatini vizualizatsiya qilish uchun sinxrotron tasvirlashdan foydalanish, in vivo individual va hajmli zarrachalar xatti-harakatlarining dinamikasi va naqshlarini o'rganish edi. Keyin biz shuningdek, magnit maydon mavjud bo'lganda lentivirus magnit zarralarini yetkazib berish kalamushlarda transduktsiya samaradorligini oshirishini baholadik. traxeya. Sinxrotron rentgen tasviri magnit zarrachalarning in vitro va in vivo sharoitida statsionar va harakatlanuvchi magnit maydonlardagi xatti-harakatlarini ochib beradi. Zarrachalarni magnitlar yordamida tirik havo yo'li yuzasi bo'ylab osongina sudrab bo'lmaydi, lekin tashish paytida konlar magnit maydon eng kuchli bo'lgan ko'rish maydonida to'planadi. Lentivirus magnit zarralari magnit maydon ishtirokida yetkazib berilganda transduktsiya samaradorligi ham olti baravar oshdi. Bu natijalar birgalikda lentivirus magnit zarralari va magnit maydonlari in vivo sharoitida o'tkazuvchan havo yo'llarida gen vektorlarini nishonga olishni yaxshilash va transduktsiya darajasini oshirish uchun qimmatli yondashuvlar bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Kistik fibroz (KF) CF transmembran o'tkazuvchanlik regulyatori (CFTR) deb ataladigan bitta genning o'zgarishi natijasida yuzaga keladi. KFTR oqsili tanadagi ko'plab epitelial hujayralarda, jumladan, KF patogenezining asosiy joyi bo'lgan o'tkazuvchi havo yo'llarida mavjud bo'lgan ion kanalidir. KFTR nuqsonlari suvning g'ayritabiiy tashishiga, havo yo'llari yuzasining suvsizlanishiga va havo yo'llari yuzasidagi suyuqlik (ASL) qatlamining chuqurligini pasayishiga olib keladi. Bu shuningdek, shilliq qavat transporti (MCT) tizimining nafas yo'llaridan nafas olish yo'llari orqali zarrachalar va patogenlarni tozalash qobiliyatini pasaytiradi. Bizning maqsadimiz KFTR genining to'g'ri nusxasini yetkazib berish va ASL, MCT va o'pka salomatligini yaxshilash uchun lentivirus (LV) gen terapiyasini ishlab chiqish va bu parametrlarni in vivo1 da o'lchashga qodir yangi texnologiyalarni ishlab chiqishda davom etishdir.
Chap qorincha vektorlari CF havo yo'li gen terapiyasi uchun yetakchi nomzodlardan biri hisoblanadi, chunki ular terapevtik genni havo yo'li bazal hujayralariga (havo yo'li ildiz hujayralari) doimiy ravishda integratsiyalashi mumkin. Bu muhim, chunki ular funktsional gen bilan tuzatilgan CF bilan bog'liq havo yo'li yuzasi hujayralariga differentsiatsiya qilish orqali normal gidratatsiya va shilimshiqni tozalashni tiklay oladi va natijada umrbod foyda keltiradi. Chap qorincha vektorlari o'tkazuvchan havo yo'liga qarshi yo'naltirilishi kerak, chunki bu yerda CF o'pka kasalligi boshlanadi. Vektorni o'pkaga chuqurroq yetkazib berish alveolyar transduksiyaga olib kelishi mumkin, ammo bu CFda terapevtik foyda keltirmaydi. Biroq, gen tashuvchilari kabi suyuqliklar tug'ruqdan keyin nafas olganda tabiiy ravishda alveolalarga ko'chib o'tadi3,4 va terapevtik zarralar MCT orqali og'iz bo'shlig'iga tezda tozalanadi. Chap qorincha transduksiya samaradorligi vektorning hujayralarni qabul qilish uchun maqsadli hujayralar yonida qolish vaqtiga bevosita bog'liq - "yashash vaqti"5 - bu odatiy mintaqaviy havo oqimi, shuningdek, muvofiqlashtirilgan zarrachalar shilimshiqni ushlash va MCT bilan osongina kamayadi. CF uchun, Chap qorinchaning havo yo'lida qolish vaqtini uzaytirish qobiliyati bu mintaqada yuqori darajadagi transduksiyaga erishish uchun muhimdir, ammo shunday ancha qiyin bo'ldi.
Ushbu to'siqni yengib o'tish uchun biz chap qorincha magnit zarralari (MP) ikkita qo'shimcha usulda yordam berishi mumkinligini taklif qilamiz. Birinchidan, ularni nishonga olishni yaxshilash va gen tashuvchi zarrachalarning kerakli havo yo'li mintaqasida joylashishiga yordam berish uchun havo yo'li yuzasiga magnit yo'naltirish mumkin; va ASL) hujayra qatlami 6 ga o'tish uchun. MPlar antikorlar, kimyoterapevtik dorilar yoki hujayra membranalariga birikadigan yoki tegishli hujayra yuzasi retseptorlariga bog'lanadigan va statik elektr mavjud bo'lganda o'sma joylarida to'planadigan boshqa kichik molekulalar bilan bog'langanda maqsadli dori yetkazib berish vositalari sifatida keng qo'llanilgan. Saraton kasalligini davolash uchun magnit maydonlar 7. Boshqa "gipertermik" usullar MPlarni tebranuvchi magnit maydonlarga duchor bo'lganda qizdirishga va shu bilan o'sma hujayralarini yo'q qilishga qaratilgan. DNKni hujayralarga o'tkazishni kuchaytirish uchun magnit maydon transfeksiya agenti sifatida ishlatiladigan magnit transfeksiya printsipi odatda transduksiya qilish qiyin bo'lgan hujayra liniyalari uchun virussiz va virusli gen vektorlari qatoridan foydalanib, in vitro sharoitida qo'llaniladi. LV magnitotransfeksiyasining samaradorligi aniqlangan, LV-MPlarni inson bronxial epiteliy hujayra liniyasiga statik magnit maydon mavjudligida in vitro yetkazib berish, transduksiya samaradorligini faqat LV vektoriga nisbatan 186 baravar oshiradi. LV-MP shuningdek, in vitro CF modeliga ham qo'llanilgan, bu yerda magnit transfeksiya CF balg'am mavjudligida havo-suyuqlik interfeysi kulturalarida LV transduksiyasini 20 baravar oshirgan10. Biroq, organlarning in vivo magnitotransfeksiyasi nisbatan kam e'tiborga olingan va faqat bir nechta hayvonlarda baholangan. tadqiqotlar11,12,13,14,15, ayniqsa o'pkada16,17. Shunga qaramay, CF o'pka terapiyasida magnit transfeksiya imkoniyatlari aniq. Tan va boshqalar (2020) "samarali magnit nanopartikulyar o'pka yetkazib berishning kontseptsiyasini isbotlovchi tadqiqot CF bemorlarida klinik natijalarni yaxshilash uchun kelajakda CFTR inhalatsiya strategiyalari uchun yo'l ochadi"6, deb ta'kidladilar.
Qo'llaniladigan magnit maydon mavjud bo'lganda havo yo'llari sirtlaridagi kichik magnit zarrachalarning xatti-harakatlarini tasavvur qilish va o'rganish qiyin, shuning uchun u yaxshi tushunilmagan. Boshqa tadqiqotlarda biz gaz kanali yuzasi gidratatsiyasini to'g'ridan-to'g'ri o'lchash uchun ASL chuqurligi18 va MCT xatti-harakatlaridagi19,20 kichik in vivo o'zgarishlarni invaziv bo'lmagan tarzda vizualizatsiya qilish va miqdorini aniqlash uchun sinxrotron-tarqalish asosidagi fazali kontrastli rentgen tasvirlash (PB-PCXI) usulini ishlab chiqdik va davolash samaradorligining dastlabki ko'rsatkichi sifatida foydalandik. Bundan tashqari, bizning MCT baholash usulimiz PB-PCXI21 yordamida ko'rinadigan MCT markerlari sifatida alyuminiy oksidi yoki yuqori sinish ko'rsatkichli shishadan tashkil topgan 10-35 µm diametrli zarrachalardan foydalanadi. Ikkala usul ham MP ni o'z ichiga olgan turli xil zarracha turlarini vizualizatsiya qilish uchun mos keladi.
Yuqori fazoviy va vaqtinchalik aniqligi tufayli, bizning PB-PCXI asosidagi ASL va MCT tahlil texnikalarimiz MP genlarini yetkazib berish texnikasini tushunish va optimallashtirishga yordam berish uchun in vivo sharoitida yakka va hajmli zarrachalar xatti-harakatlarining dinamikasi va naqshlarini o'rganish uchun juda mos keladi. Bu yerda biz qo'llaydigan yondashuv SPring-8 BL20B2 nur chizig'idan foydalangan holda o'tkazilgan tadqiqotlarimizdan kelib chiqadi, unda biz sichqonlarning burun va o'pka havo yo'llariga soxta vektor dozasini yetkazib berishdan keyin suyuqlik harakatini vizualizatsiya qildik, bu bizning gen tashuvchisi dozasi bo'yicha hayvonlar tadqiqotlarimizda kuzatilgan notekis gen ekspressiyasi naqshlarimizni tushuntirishga yordam beradi 3,4.
Ushbu tadqiqotning maqsadi tirik kalamushlarning traxeyasida bir qator MPlarning in vivo harakatlarini vizualizatsiya qilish uchun sinxrotron PB-PCXI dan foydalanish edi. Ushbu PB-PCXI tasvirlash tadqiqotlari MP harakatiga ta'sirini aniqlash uchun bir qator MPlarni, magnit maydon kuchlarini va joylashuvlarini sinash uchun mo'ljallangan edi. Biz tashqi qo'llaniladigan magnit maydon yetkazib berilgan MPning maqsadli hududda qolishiga yoki harakatlanishiga yordam beradi deb taxmin qildik. Ushbu tadqiqotlar, shuningdek, cho'ktirilgandan keyin traxeyada saqlanib qolgan zarrachalar sonini maksimal darajada oshiradigan magnit konfiguratsiyalarini aniqlashga imkon berdi. Ikkinchi tadqiqotlar seriyasida biz LV-MPlarni kalamush havo yo'liga in vivo yetkazib berish natijasida hosil bo'lgan transduktsiya naqshini namoyish etish uchun ushbu optimal konfiguratsiyadan foydalanishga harakat qildik, bu esa LV-MPlarni havo yo'lini nishonga olish kontekstida yetkazib berish LV transduktsiya samaradorligini oshirishga olib keladi degan taxminga asoslanadi.
Barcha hayvonlar ustida o'tkazilgan tadqiqotlar Adelaida universiteti (M-2019-060 va M-2020-022) va SPring-8 Synchrotron hayvonlar etikasi qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan protokollarga muvofiq amalga oshirildi. Tajribalar ARRIVE ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi.
Barcha rentgen tasvirlari Yaponiyadagi SPring-8 sinxrotronidagi BL20XU nurlanish liniyasida, avval tasvirlanganga o'xshash o'rnatish yordamida amalga oshirildi21,22. Qisqacha aytganda, tajriba qutisi sinxrotron saqlash halqasidan 245 m masofada joylashgan edi. Faza kontrasti effektlarini yaratish uchun zarrachalarni tasvirlash tadqiqotlari uchun namunadan detektorgacha 0,6 m va in vivo tasvirlash tadqiqotlari uchun 0,3 m masofa ishlatiladi. 25 keV monoxromatik nur energiyasi ishlatilgan. Tasvirlar sCMOS detektoriga ulangan yuqori aniqlikdagi rentgen konvertori (SPring-8 BM3) yordamida olingan. Konverter rentgen nurlarini 10 µm qalinlikdagi sintillyator (Gd3Al2Ga3O12) yordamida ko'rinadigan yorug'likka aylantiradi, keyin u × 10 mikroskop obyektivi (NA 0,3) yordamida sCMOS sensoriga yo'naltiriladi. sCMOS detektori Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Yaponiya) edi, uning o'lchami... 2048 × 2048 piksel va xom piksel o'lchami 6,5 × 6,5 µm. Ushbu sozlama 0,51 µm samarali izotrop piksel o'lchamini va taxminan 1,1 mm × 1,1 mm ko'rish maydonini beradi. Nafas olish natijasida hosil bo'lgan harakat artefaktlarini minimallashtirish bilan birga, havo yo'li ichidagi va tashqarisidagi magnit zarrachalarning signal-shovqin nisbatini maksimal darajada oshirish uchun 100 ms ta'sir qilish uzunligi tanlandi. In vivo tadqiqotlar uchun rentgen nurlarini ta'sir qilish oralig'ida blokirovka qilish orqali nurlanish dozasini cheklash uchun rentgen yo'liga tez rentgen deklanşeri joylashtirildi.
LV tashuvchisi hech qanday SPring-8 PB-PCXI tasvirlash tadqiqotlarida ishlatilmadi, chunki BL20XU tasvirlash kamerasi Biosafety Level 2 sertifikatiga ega emas. Buning o'rniga, biz avval magnit maydonlarning shisha kapillyarlarda, keyin esa tirik havo yo'llarida MP harakatiga qanday ta'sir qilishini tushunish uchun ikkita tijorat yetkazib beruvchisidan yaxshi tavsiflangan MPlarni tanladik - turli o'lchamlar, materiallar, temir konsentratsiyasi va qo'llanilish doirasini qamrab oldik. sirtda. MPlarning o'lchami 0,25 dan 18 mkm gacha va turli xil materiallardan tayyorlangan (1-jadvalga qarang), ammo har bir namunaning tarkibi, shu jumladan MP ichidagi magnit zarrachalarning o'lchami noma'lum. Bizning keng qamrovli MCT tadqiqotlarimizga asoslanib, 19, 20, 21, 23, 24, biz traxeya havo yo'llari yuzasida 5 mkm gacha bo'lgan MPlarni ko'rish mumkinligini kutmoqdamiz, masalan, MP harakatining yaxshilangan ko'rinishini ko'rish uchun ketma-ket kadrlarni ayirish orqali. Bitta 0,25 mkm o'lchamdagi MP tasvirlash moslamasining o'lchamidan kichikroq, ammo PB-PCXI ularning hajm kontrastini va ular cho'ktirilgandan keyin cho'ktirilgan sirt suyuqligining harakatini aniqlay oladi deb kutilmoqda.
1-jadvaldagi har bir MP uchun namunalar ichki diametri 0,63 mm bo'lgan 20 mkl shisha kapillyarlarda (Drummond Microcaps, PA, AQSh) tayyorlangan. Korpuskulyar zarrachalar suvda, CombiMag zarrachalari esa ishlab chiqaruvchining maxsus suyuqligida mavjud. Har bir naycha suyuqlik bilan yarim to'ldirilgan (taxminan 11 mkl) va namuna ushlagichiga joylashtirilgan (1-rasmga qarang). Shisha kapillyarlari mos ravishda tasvirlash qutisidagi namunaviy bosqichga gorizontal ravishda joylashtirilgan va suyuqlikning chekkalarini joylashtirgan. Tasvirlash paytida uning o'rnini masofadan o'zgartirish uchun 1,17 Tesla qoldiq magnitlanishiga ega 19 mm diametrli (28 mm uzunlikdagi) nikel qobiqli noyob yer neodimiy temir bor (NdFeB) magniti (N35, katakcha raqami LM1652, Jaycar Electronics, Avstraliya) alohida tarjima bosqichiga biriktirilgan. Rentgen tasvirini olish magnit namunadan taxminan 30 mm balandlikda joylashganda boshlanadi va tasvirlar sekundiga 4 kadr tezlikda olinadi. Tasvirlash paytida magnit yaqinlashtirildi. shisha kapillyar naycha (taxminan 1 mm masofada) va keyin maydon kuchi va joylashuvining ta'sirini baholash uchun naycha bo'ylab aylantirildi.
Namuna xy translyatsiya bosqichida shisha kapillyarlarda MP namunalarini o'z ichiga olgan in vitro tasvirlash moslamasi. Rentgen nurlarining yo'li qizil chiziq bilan belgilangan.
MPlarning in vitro ko'rinishi aniqlangandan so'ng, ularning bir qismi yovvoyi tipdagi urg'ochi albinos Wistar kalamushlarida (~12 haftalik, ~200 g) in vivo sinovdan o'tkazildi. 0,24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Yaponiya), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Yaponiya) va 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika) kalamushlari qorin bo'shlig'iga in'ektsiya yo'li bilan Pharma (Japan) aralashmasi bilan anesteziya qilindi. Anesteziyadan so'ng, ular traxeya atrofidagi junni olib tashlash, endotraxeal naycha (ET; 16 Ga iv kanül, Terumo BCT) kiritish va tana haroratini ushlab turish uchun termal sumka solingan maxsus tayyorlangan tasvirlash plastinkasida chalqancha yotgan holda immobilizatsiya qilish orqali tasvirlash uchun tayyorlandi. 22 Keyin tasvirlash plastinkasi tasvirlash qutisidagi namunani tarjima qilish bosqichiga rentgen tasvirida traxeyani gorizontal ravishda tekislash uchun ozgina burchak ostida biriktirildi. 2a-rasmda ko'rsatilganidek.
(a) SPring-8 tasvirlash qutisidagi in vivo tasvirlash tizimida rentgen nurlarining yo'li qizil chiziq bilan belgilangan.(b,c) Traxeyadagi magnit lokalizatsiyasi ikkita ortogonal o'rnatilgan IP kameralar yordamida masofadan turib amalga oshirildi. Ekran tasvirining chap tomonida boshni ushlab turgan sim halqasi va ET naychasi ichidagi yetkazib berish kanülini ko'rish mumkin.
100 mkl shisha shpritsdan foydalangan holda masofadan boshqariladigan shprits nasos tizimi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 30 Ga igna orqali PE10 naychasiga (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) ulandi. ET naychasini kiritishda uchi traxeyada to'g'ri holatda ekanligiga ishonch hosil qilish uchun naychani belgilang. Mikropompadan foydalanib, naychaning uchi yetkazib beriladigan MP namunasiga botirilgan holda shprits pistoni tortib olindi. Keyin yuklangan yetkazib berish naychasi endotraxeal naychaga kiritildi va uchi kutilgan qo'llaniladigan magnit maydonimizning eng kuchli qismiga joylashtirildi. Tasvirni olish Arduino asosidagi vaqt qutisiga ulangan nafas olish detektori yordamida boshqarildi va barcha signallar (masalan, harorat, nafas olish, deklanşörü ochish/yopish va tasvirni olish) Powerlab va LabChart (AD Instruments, Sidney, Avstraliya) 22 yordamida yozib olindi. Tasvirga olish paytida. Korpusga kirish imkoni bo'lmaganda, ikkita IP kamera (Panasonic BB-SC382) bir-biriga taxminan 90° burchak ostida joylashtirildi va ishlatilgan. tasvirlash paytida magnitning traxeyaga nisbatan holatini kuzatish uchun (2b, c-rasm). Harakat artefaktlarini minimallashtirish uchun suv oqimining oxirgi platosi paytida har bir nafas uchun bitta tasvir olindi.
Magnit tasvirlash korpusining tashqarisidan masofadan turib joylashtirilishi mumkin bo'lgan ikkinchi bosqichga biriktirilgan. Turli xil magnit pozitsiyalari va konfiguratsiyalari sinovdan o'tkazildi, jumladan: Traxeyadan taxminan 30° burchak ostida o'rnatilgan (konfiguratsiyalar 2a va 3a-rasmlarda ko'rsatilgan); bitta magnit hayvon ustida, ikkinchisi pastda, qutblari tortish uchun o'rnatilgan (3b-rasm); bitta magnit hayvon ustida, ikkinchisi pastda, qutblari itarish uchun o'rnatilgan (3c-rasm); va bitta magnit traxeya ustida va unga perpendikulyar (3d-rasm). Hayvon va magnit konfiguratsiya qilingandan va sinovdan o'tkaziladigan MP shprits nasosiga yuklangandan so'ng, tasvirlarni olishda 50 mkl dozani 4 mkl/sek tezlikda yuboring. Keyin magnit tasvirlarni olishda davom etib, traxeya bo'ylab yoki yon tomonga oldinga va orqaga harakatlanadi.
In vivo tasvirlash uchun magnit konfiguratsiyasi (a) traxeya ustida taxminan 30° burchak ostida joylashgan bitta magnit, (b) tortish uchun o'rnatilgan ikkita magnit, (c) itarish uchun o'rnatilgan ikkita magnit, (d) traxeya ustida va perpendikulyar bo'lgan bitta magnit. Kuzatuvchi og'izdan traxeya orqali o'pkaga qaradi va rentgen nurlari kalamushning chap tomonidan o'tib, o'ng tomonidan chiqdi. Magnit nafas yo'lining uzunligi bo'ylab yoki rentgen nurlari yo'nalishi bo'yicha traxeya ustida chapga va o'ngga siljiydi.
Shuningdek, biz nafas olish va yurak harakati chalkash bo'lmaganda nafas yo'llarida zarrachalarning ko'rinishi va xatti-harakatlarini aniqlashga harakat qildik. Shuning uchun, tasvirlash davri oxirida hayvonlar pentobarbitalning haddan tashqari dozasi tufayli insoniy tarzda o'ldirildi (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, AQSh; ~65 mg/kg ip). Ba'zi hayvonlar tasvirlash platformasida qoldirildi va nafas olish va yurak urishi to'xtagandan so'ng, tasvirlash jarayoni takrorlandi, agar nafas yo'llari yuzasida MP ko'rinmasa, qo'shimcha MP dozasi qo'shildi.
Olingan tasvirlar tekis va qorong'u maydonlarda tuzatildi va keyin MATLABda yozilgan maxsus skript yordamida (R2020a, The Mathworks) filmga yig'ildi (soniyasiga 20 kadr; nafas olish tezligiga qarab 15-25 × normal tezlik).
Barcha LV gen vektorlarini yetkazib berish bo'yicha tadqiqotlar Adelaida universitetining Laboratoriya hayvonlarini tadqiq qilish markazida o'tkazildi va SPring-8 tajribasi natijalaridan magnit maydon mavjudligida LV-MP yetkazib berish in vivo sharoitida genlarning uzatilishini kuchaytirishi mumkinligini baholash uchun foydalanishga qaratilgan edi. MP va magnit maydonning ta'sirini baholash uchun ikki guruh hayvonlar davolandi: bir guruhga magnit qo'yilgan LV-MP berildi, ikkinchi guruhga esa magnitsiz LV-MP bilan nazorat guruhi berildi.
LV gen vektorlari ilgari tasvirlangan 25, 26 usullari yordamida yaratilgan. LacZ vektori konstitutiv MPSV promouteri (LV-LacZ) tomonidan boshqariladigan yadroda joylashgan beta-galaktozidaza genini ifodalaydi, bu esa transduksiyalangan hujayralarda ko'k reaksiya mahsulotini ishlab chiqaradi, bu o'pka to'qimasi frontlarida va to'qima bo'limlarida ko'rinadi. Titrlash hujayra kulturalarida titrni TU/ml da hisoblash uchun gemositometr yordamida LacZ musbat hujayralar sonini qo'lda sanash orqali amalga oshirildi. Tashuvchilar -80 °C da kriokonservatsiya qilinadi, ishlatishdan oldin eritiladi va CombiMag ga 1:1 nisbatda aralashtirib va ​​yetkazib berishdan kamida 30 daqiqa oldin muz ustida inkubatsiya qilish orqali bog'lanadi.
Oddiy Sprague Dawley kalamushlari (n = 3/guruh, ~2-3) qorin bo'shlig'iga 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Avstraliya) va 60 mg/kg ketamin (Ilium, Avstraliya) oylik) ip) in'ektsiyasi va 16 Ga vena ichiga kanül bilan jarrohliksiz og'iz orqali kanülasyon qilindi. Traxeya havo yo'llari to'qimasi chap qorincha transduksiyasi qabul qilishini ta'minlash uchun u avval tasvirlangan mexanik perturbatsiya protokoli yordamida konditsionerlashtirildi, bunda traxeya havo yo'llari yuzasi simli savat (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, AQSh) bilan eksenel ravishda ishqalandi (30 s28). Keyin LV-MP traxeyaga yuborildi, bu perturbatsiyadan taxminan 10 daqiqa o'tgach, biologik xavfsizlik shkafida amalga oshirildi.
Ushbu tajribada qo'llanilgan magnit maydon in vivo rentgen tasvirlash tadqiqotiga o'xshash tarzda konfiguratsiya qilingan bo'lib, xuddi shu magnitlar distillash stent qisqichlari yordamida traxeya ustida ushlab turilgan (4-rasm). 50 mkl hajmdagi (2 × 25 mkl alikvotlar) LV-MP traxeyaga (n = 3 hayvon) avval tasvirlanganidek, gel uchi bo'lgan pipetka yordamida yuborilgan. Nazorat guruhi (n = 3 hayvon) magnit ishlatmasdan bir xil LV-MPlarni olgan. Infuziya tugagandan so'ng, kanül ET naychasidan chiqariladi va hayvon ekstubatsiya qilinadi. Magnit 10 daqiqa davomida joyida qoladi, keyin u olib tashlanadi. Kalamushlarga teri ostiga meloksikam (1 ml/kg) dozasi yuborildi (Ilium, Avstraliya), so'ngra 1 mg/kg atipamazol gidroxlorid (Antisedan, Zoetis, Avstraliya) ning ip orqali in'ektsiyasi orqali anesteziyani bekor qilish amalga oshirildi. Kalamushlar anesteziyadan to'liq tuzalguncha issiq holda saqlangan va kuzatilgan.
Biologik xavfsizlik shkafidagi LV-MP yetkazib berish moslamasi. ET naychasining och kulrang Luer markazi og'izdan chiqib turganini ko'rish mumkin va rasmda ko'rsatilgan pipetkaning gel uchi ET naychasi orqali traxeyaga kerakli chuqurlikka kiritiladi.
LV-MP dozalash protsedurasidan bir hafta o'tgach, hayvonlar 100% CO2 inhalatsiyasi orqali insonparvarlik bilan o'ldirildi va LacZ ekspressiyasi bizning standart X-gal davolash usuli yordamida baholandi. Endotraxeya naychasini joylashtirishdan kelib chiqadigan har qanday mexanik shikastlanish yoki suyuqlikni ushlab qolish tahlilga kiritilmaganligiga ishonch hosil qilish uchun uchta kaudal eng tog'ay halqalari olib tashlandi. Har bir traxeya tahlil qilish uchun ikkita yarmini hosil qilish uchun uzunlamasına kesildi va ular luminal sirtni vizualizatsiya qilish uchun Minutien ignasi (Fine Science Tools) yordamida silikon kauchuk solingan idishga (Sylgard, Dow Inc) o'rnatildi. Transduksiyalangan hujayralarning tarqalishi va shakli DigiLite kamerasi va TCapture dasturi (Tucsen Photonics, Xitoy) yordamida Nikon mikroskopi (SMZ1500) yordamida frontal fotosuratga olish orqali tasdiqlandi. Tasvirlar 20x kattalashtirishda (traxeyaning to'liq kengligi uchun eng yuqori sozlamani o'z ichiga olgan holda) olindi, traxeyaning butun uzunligi bosqichma-bosqich tasvirga olindi, bu esa har bir tasvir o'rtasida tasvirni "tikish" imkonini beradigan darajada etarli darajada ustma-ust tushishni ta'minladi. Rasmlardan Keyin har bir traxeya tekis harakat algoritmidan foydalangan holda Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) yordamida bitta kompozit tasvirga yig'ildi. Har bir hayvonning traxeya kompozit tasvirlaridagi LacZ ifoda maydonlari avval tasvirlanganidek, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 va Value < 0.7 sozlamalaridan foydalangan holda avtomatlashtirilgan MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) yordamida aniqlandi. To'qimaning konturlarini kuzatib borish orqali, to'qima maydonini aniqlash va traxeya to'qimasidan tashqarida har qanday noto'g'ri aniqlashlarning oldini olish uchun har bir kompozit tasvir uchun GIMP v2.10.24 da qo'lda niqob yaratildi. Har bir hayvonning barcha kompozit tasvirlaridan bo'yalgan joylar o'sha hayvon uchun umumiy bo'yalgan maydonni hosil qilish uchun jamlandi. Keyin bo'yalgan maydon normallashtirilgan maydonni hosil qilish uchun umumiy niqob maydoniga bo'lindi.
Har bir traxeya kerosinga solingan va 5 mkm kesmalar kesilgan. Kesimlar 5 daqiqa davomida neytral tez qizil rang bilan bo'yalgan va tasvirlar Nikon Eclipse E400 mikroskopi, DS-Fi3 kamerasi va NIS elementlarni suratga olish dasturi (5.20.00 versiyasi) yordamida olingan.
Barcha statistik tahlillar GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) da o'tkazildi. Statistik ahamiyatlilik p ≤ 0,05 ga o'rnatildi. Normallik Shapiro-Wilk testi yordamida tasdiqlandi va LacZ bo'yashidagi farqlar juftlashtirilmagan t-testi yordamida baholandi.
1-jadvalda tasvirlangan oltita MP PCXI yordamida tekshirildi va ko'rinishi 2-jadvalda tasvirlangan. PCXI ostida ikkita polistirol MP (MP1 va MP2; mos ravishda 18 μm va 0,25 μm) ko'rinmadi, ammo qolgan namunalar aniqlandi (misollar 5-rasmda ko'rsatilgan). MP3 va MP4 (mos ravishda 10-15% Fe3O4; 0,25 μm va 0,9 μm) zaif ko'rinadi. Sinovdan o'tgan eng kichik zarrachalarning bir qismini o'z ichiga olgan bo'lsa-da, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) eng aniq ko'rindi. CombiMag mahsuloti MP6 ni aniqlash qiyin. Barcha holatlarda, magnitni kapillyarga parallel ravishda oldinga va orqaga aylantirish orqali MP ni aniqlash qobiliyatimiz sezilarli darajada oshdi. Magnitlar kapillyardan uzoqlashganda, zarrachalar uzun iplar shaklida cho'zildi, lekin magnitlar yaqinlashganda va magnit maydon kuchi oshgani sayin, zarrachalar kapillyarning yuqori yuzasiga qarab siljigan sari zarrachalar iplari qisqardi (Qo'shimcha video S1 ga qarang: MP4), sirt zarrachalari zichligini oshiradi. Aksincha, magnit kapillyardan chiqarilganda, maydon kuchi pasayadi va MPlar kapillyarning yuqori yuzasidan cho'zilgan uzun iplarga aylanadi (Qo'shimcha video S2:MP4 ga qarang). Magnit harakatlanishni to'xtatgandan so'ng, zarrachalar muvozanat holatiga yetgandan keyin qisqa vaqt davomida harakatlanishda davom etadi. MP kapillyarning yuqori yuzasiga yaqinlashganda va undan uzoqlashganda, magnit zarrachalar odatda qoldiqlarni suyuqlik orqali sudrab o'tadi.
PCXI ostida MP ning ko'rinishi namunalar orasida sezilarli darajada farq qiladi.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 va (d) MP6. Bu yerda ko'rsatilgan barcha tasvirlar kapillyar ustida taxminan 10 mm masofada joylashgan magnit bilan olingan. Ko'rinadigan katta doiralar kapillyarlarda qolib ketgan havo pufakchalari bo'lib, fazaviy kontrastli tasvirning qora va oq qirralarini aniq ko'rsatadi. Qizil katakchada kontrastni kuchaytiruvchi kattalashtirish mavjud. Barcha rasmlardagi magnit sxemalarining diametrlari masshtablash uchun emas va ko'rsatilganidan taxminan 100 baravar katta ekanligini unutmang.
Magnit kapillyarning yuqori qismi bo'ylab chapga va o'ngga siljiganida, MP ipining burchagi magnit bilan moslashish uchun o'zgaradi (6-rasmga qarang) va shu bilan magnit maydon chiziqlarini belgilaydi. MP3-5 uchun, akkord chegara burchagiga yetgandan so'ng, zarrachalar kapillyarning yuqori yuzasi bo'ylab sudraladi. Bu ko'pincha MPlarning magnit maydoni eng kuchli bo'lgan joyga yaqinroq katta guruhlarga to'planishiga olib keladi (Qo'shimcha video S3:MP5 ga qarang). Bu, ayniqsa, kapillyar uchiga yaqin tasvirlashda yaqqol ko'rinadi, bu esa MPlarning suyuqlik-havo interfeysida agregatsiyalanishiga va konsentratsiyasiga olib keladi. MP6 tarkibidagi MP3-5 ga qaraganda ajratish qiyinroq bo'lgan zarrachalar magnit kapillyar bo'ylab harakatlanayotganda sudralmagan, lekin MP iplari ajralib chiqqan va zarrachalarni ko'rish maydonida qoldirgan (Qo'shimcha video S4:MP6 ga qarang). Ba'zi hollarda, magnitni tasvirlash joyidan uzoqroqqa siljitish orqali qo'llaniladigan magnit maydon kamaytirilganda, qolgan MPlar ipda qolgan holda tortishish kuchi bilan naychaning pastki yuzasiga asta-sekin tushgan (Qo'shimcha video S5: MP3 ga qarang).
MP ipining burchagi magnit kapillyar ustida o'ngga siljigan sari o'zgaradi.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 va (d) MP6. Qizil katakchada kontrastni kuchaytiruvchi kattalashtirish mavjud. Qo'shimcha videolar ma'lumotli ekanligini unutmang, chunki ular ushbu statik tasvirlarda tasavvur qilib bo'lmaydigan muhim zarrachalar tuzilishi va dinamik ma'lumotlarni ochib beradi.
Sinovlarimiz shuni ko'rsatdiki, magnitni traxeya bo'ylab sekin oldinga va orqaga siljitish in vivo murakkab harakat sharoitida MP ni vizualizatsiya qilishni osonlashtiradi. In vivo sinovlari o'tkazilmadi, chunki polistirol boncuklari (MP1 va MP2) kapillyarda ko'rinmas edi. Qolgan to'rtta MP ning har biri magnitning uzun o'qi traxeya ustida vertikalga taxminan 30° burchak ostida konfiguratsiya qilingan holda in vivo sinovdan o'tkazildi (2b va 3a-rasmlarga qarang), chunki bu MP zanjirlarining uzunroq bo'lishiga olib keldi va magnit konfiguratsiyasi tugaganidan ko'ra samaraliroq edi. MP3, MP4 va MP6 hech qanday tirik hayvonlarning traxeyasida aniqlanmadi. Hayvonlar insonparvarlik bilan o'ldirilgandan so'ng, kalamush havo yo'llari tasvirlanganida, shprits nasosi yordamida qo'shimcha hajm qo'shilganda ham zarrachalar ko'rinmas bo'lib qoldi. MP5 eng yuqori temir oksidi miqdoriga ega edi va yagona ko'rinadigan zarracha edi va shuning uchun MP ning in vivo xatti-harakatlarini baholash va tavsiflash uchun ishlatilgan.
MP yetkazib berish paytida magnitni traxeya ustiga qo'yish natijasida ko'plab MPlar, ammo hammasi emas, ko'rish maydonida to'plangan. Traxeyaga kiradigan zarrachalar insonparvarlik yo'li bilan qurbon qilingan hayvonlarda eng yaxshi kuzatiladi. 7-rasm va qo'shimcha video S6: MP5 ventral traxeya yuzasida zarrachalarning tez magnit ushlanishi va hizalanishini ko'rsatadi, bu MPlarni traxeyaning kerakli mintaqalariga yo'naltirish mumkinligini ko'rsatadi. MP yetkazib berilgandan keyin traxeya bo'ylab distalroq qidiruvda ba'zi MPlar karinaga yaqinroq topildi, bu magnit maydon kuchi barcha MPlarni to'plash va ushlab turish uchun yetarli emasligini ko'rsatadi, chunki ular suyuqlik jarayonida maksimal magnit maydon kuchi mintaqasi orqali yetkazib berildi. Shunga qaramay, tug'ruqdan keyingi MP konsentratsiyasi tasvirlangan sohada yuqori bo'ldi, bu ko'plab MPlar qo'llaniladigan magnit maydon kuchi eng yuqori bo'lgan havo yo'llari mintaqalarida qolganligini ko'rsatadi.
Yaqinda evtanaziya qilingan kalamushning traxeyasiga MP5 yetkazib berishdan oldin va keyin (a) olingan tasvirlar, magnit tasvirlash maydonining tepasida joylashgan. Tasvirlangan maydon ikkita tog'ay halqasi orasida joylashgan. MP yetkazib berishdan oldin nafas yo'llarida suyuqlik bor. Qizil katakchada kontrastni kuchaytiruvchi kattalashtirish mavjud. Ushbu tasvirlar S6:MP5 qo'shimcha videosida ko'rsatilgan videodan olingan.
Magnitni in vivo traxeya bo'ylab o'tkazish MP zanjirining havo yo'li yuzasidagi burchakni kapillyarlarda ko'rinadigan tarzda o'zgartirishiga olib keldi (8-rasm va S7 qo'shimcha videoga qarang: MP5). Biroq, bizning tadqiqotimizda MPlarni kapillyarlarda bo'lgani kabi tirik havo yo'li yuzasi bo'ylab sudrab bo'lmadi. Ba'zi hollarda, magnit chapga va o'ngga harakatlanganda MP zanjiri uzunroq bo'ladi. Qizig'i shundaki, biz shuningdek, magnit traxeya bo'ylab uzunlamasına harakatlantirilganda zarrachalar qatori sirt suyuqligi qatlamining chuqurligini o'zgartiradigan ko'rinishini va magnit to'g'ridan-to'g'ri yuqoriga ko'tarilganda va zarrachalar qatori vertikal holatga aylantirilganda kengayishini aniqladik (S7 qo'shimcha videoga qarang). : MP5 0:09 da, pastki o'ngda). Magnit traxeyaning yuqori qismi bo'ylab lateral ravishda (ya'ni, traxeyaning uzunligi bo'ylab emas, balki hayvonning chap yoki o'ng tomoniga) o'tkazilganda xarakterli harakat shakli o'zgardi. Zarrachalar harakatlanayotganda hali ham aniq ko'rinib turardi, ammo magnit traxeyadan chiqarilganda, zarrachalar zanjirlarining uchlari ko'rinib qoldi (0:08 dan boshlab S8:MP5 qo'shimcha videosiga qarang). Bu shisha kapillyarda qo'llaniladigan magnit maydon ostida kuzatilgan MP xatti-harakatlariga mos keladi.
Tirik anesteziya qilingan kalamushning traxeyasida MP5 ni ko'rsatuvchi namunaviy tasvirlar.(a) Magnit traxeyaning yuqorisida va chap tomonida tasvirlarni olish uchun ishlatiladi, keyin esa (b) magnit o'ngga siljitilgandan so'ng. Qizil katakchada kontrastni kuchaytiruvchi kattalashtirish mavjud. Ushbu tasvirlar S7:MP5 qo'shimcha videosida ko'rsatilgan videodan olingan.
Ikki qutb traxeyaning ustida va ostida shimol-janub yo'nalishida konfiguratsiya qilinganida (ya'ni tortuvchi; 3b-rasm), MP akkordlari uzunroq ko'rindi va traxeyaning dorsal yuzasida emas, balki yon devorida joylashgan edi (Qo'shimcha video S9:MP5 ga qarang). Biroq, suyuqlik yetkazib berilgandan keyin ikki magnitli qurilma ishlatilganda bitta joyda (ya'ni traxeyaning dorsal yuzasida) zarrachalarning yuqori konsentratsiyasi aniqlanmadi, bu odatda bitta magnitli qurilma ishlatilganda sodir bo'ladi. Keyin bitta magnit qutblarni teskari yo'naltirish uchun konfiguratsiya qilinganida (3c-rasm), ko'rish maydonida ko'rinadigan zarrachalar soni yetkazib berilgandan keyin ko'paymagan ko'rinadi. Ikkala ikki magnitli konfiguratsiyani sozlash mos ravishda magnitlarni tortadigan yoki itaradigan yuqori magnit maydon kuchlari tufayli qiyin. Keyin sozlash havo yo'liga parallel, lekin havo yo'lidan 90 gradusda o'tadigan bitta magnitga o'zgartirildi, shunda maydon chiziqlari traxeya devorini ortogonal ravishda kesib o'tdi (3d-rasm), bu yo'nalish yon devordagi zarrachalar agregatsiyasini kuzatish mumkinligini aniqlash uchun mo'ljallangan. Biroq, ushbu konfiguratsiyada MP to'planishi yoki magnit harakatining aniqlanadigan harakati kuzatilmadi. Ushbu natijalarning barchasiga asoslanib, in vivo gen tashuvchisi tadqiqotlari uchun bitta magnitli, 30 graduslik yo'nalish konfiguratsiyasi (3a-rasm) tanlandi.
Hayvon insonparvarlik yo'li bilan o'ldirilgandan so'ng darhol qayta-qayta tasvirlanganida, chalkashtiruvchi to'qima harakatining yo'qligi magnitning translyatsion harakatiga mos ravishda "tebranadigan" aniq interkondral maydonda ingichka va qisqaroq zarracha chiziqlarini ajratish mumkinligini anglatardi. Shunga qaramay, MP6 zarrachalarining mavjudligi va harakatini hali ham aniq ko'ra olmaydi.
LV-LacZ titri 1,8 × 108 TU/ml ni tashkil etdi va CombiMag MP (MP6) bilan 1:1 aralashtirilgandan so'ng, hayvonlarga 9 × 107 TU/ml LV vositasining 50 mkl traxeya dozasi (ya'ni 4,5 × 106 TU/kalamush) berildi. Ushbu tadqiqotlarda, tug'ruq paytida magnitni o'tkazish o'rniga, biz magnitni bitta holatda o'rnatdik, shunda LV transduksiyasini (a) magnit maydon bo'lmaganda vektor yetkazib berishga nisbatan yaxshilash mumkinmi va (b) fokuslanishi mumkinmi yoki yo'qligini aniqladik. Havo yo'llari hujayralari yuqori nafas yo'llarining magnit maqsadli hududlariga o'tkaziladi.
Magnitlarning mavjudligi va CombiMag ni chap qorincha vektorlari bilan birgalikda qo'llash hayvonlar salomatligiga salbiy ta'sir ko'rsatmagan ko'rinadi, xuddi bizning standart chap qorincha vektorini yetkazib berish protokolimiz kabi. Mexanik buzilishga uchragan traxeya sohasining frontal tasvirlari (1-qo'shimcha rasm) magnit mavjud bo'lganda LV-MP bilan davolangan hayvonlar guruhida transduksiya darajasi ancha yuqori ekanligini ko'rsatdi (9a-rasm). Nazorat guruhida faqat oz miqdordagi ko'k LacZ bo'yalishi mavjud edi (9b-rasm). Normallashtirilgan X-Gal bo'yalgan joylarni miqdoriy aniqlash shuni ko'rsatdiki, magnit maydon mavjud bo'lganda LV-MP ni yuborish taxminan 6 baravar yaxshilanishga olib keldi (9c-rasm).
LV-MP tomonidan traxeya transduksiyasini ko'rsatuvchi kompozit tasvirlarga misollar (a) magnit maydon mavjudligida va (b) magnit yo'qligida.(c) Magnitdan foydalanganda traxeya ichidagi normallashtirilgan LacZ transduksiya maydonida statistik jihatdan sezilarli yaxshilanish (*p = 0.029, t-test, har bir guruh uchun n = 3, o'rtacha ± SEM).
Neytral tez qizil rangga bo'yalgan kesmalar (misol 2-qo'shimcha rasmda ko'rsatilgan) ilgari xabar qilinganidek, o'xshash naqsh va joylashuvda LacZ bilan bo'yalgan hujayralarni ko'rsatdi.
Havo yo'llari gen terapiyasi uchun asosiy muammo tashuvchi zarrachalarni qiziqish hududlariga aniq joylashtirish va havo oqimi va faol shilimshiqni tozalash mavjud bo'lganda harakatlanuvchi o'pkada yuqori darajadagi transduktsiya samaradorligiga erishish bo'lib qolmoqda. CF havo yo'llari kasalligini davolash uchun mo'ljallangan chap qorincha tashuvchilari uchun tashuvchi zarrachalarning o'tkazuvchan havo yo'llarida qolish vaqtini ko'paytirish shu paytgacha qiyin maqsad bo'lib kelgan. Castellani va boshqalar ta'kidlaganidek, transduktsiyani yaxshilash uchun magnit maydonlardan foydalanish elektroporatsiya kabi boshqa genlarni yetkazib berish usullariga nisbatan afzalliklarga ega, chunki u soddalik, iqtisodiy samaradorlik, yetkazib berishni lokalizatsiya qilish, samaradorlikni oshirish va inkubatsiya vaqtini qisqartirish va ehtimol kichikroq tashuvchi dozasini birlashtirishi mumkin10. Biroq, tashqi magnit kuchlar ta'sirida havo yo'llarida magnit zarrachalarning in vivo cho'kishi va xatti-harakati hech qachon tasvirlanmagan va aslida bu usulning butun tirik havo yo'llarida genlarning ifoda darajasini oshirish uchun in vivo imkoniyatliligi namoyish etilmagan.
Bizning in vitro sinxrotron PCXI tajribalarimiz shuni ko'rsatdiki, biz sinovdan o'tkazgan barcha zarralar, polistirol MP dan tashqari, biz foydalangan tasvirlash tizimida ko'rinib turardi. Magnit maydon mavjud bo'lganda, MPlar uzunligi zarracha turi va magnit maydon kuchiga (ya'ni magnitning yaqinligi va harakati) bog'liq bo'lgan iplarni hosil qiladi. 10-rasmda ko'rsatilganidek, biz kuzatadigan iplar har bir alohida zarrachaning magnitlanishi va o'zining mahalliy magnit maydonini qo'zg'atishi natijasida hosil bo'ladi. Bu alohida maydonlar boshqa shunga o'xshash zarrachalarning agregatsiyalanishiga va ulanishiga olib keladi, boshqa zarrachalarning mahalliy jozibador va itarish kuchlaridan kelib chiqadigan mahalliy kuchlar tufayli guruh ipiga o'xshash harakatlar sodir bo'ladi.
Sxema (a, b) suyuqlik bilan to'ldirilgan kapillyarlarda va (c, d) havo bilan to'ldirilgan traxeyada hosil bo'lgan zarrachalar poyezdlarini ko'rsatadi. Kapillyarlar va traxeya masshtab bo'yicha chizilmaganligiga e'tibor bering. (a) panelda shuningdek, Fe3O4 zarralarini o'z ichiga olgan MP tavsifi ham mavjud, unda qatorlarga joylashtirilgan.
Magnit kapillyar ustida harakatlantirilganda, zarrachalar qatorining burchagi Fe3O4 ni o'z ichiga olgan MP3-5 uchun kritik chegaraga yetdi, shundan so'ng zarrachalar qatori endi asl holatida qolmadi, balki sirt bo'ylab yangi holatga o'tdi. magnit. Bu effekt shisha kapillyar yuzasi bu harakatni amalga oshirish uchun yetarlicha silliq bo'lgani uchun yuzaga kelishi mumkin. Qizig'i shundaki, MP6 (CombiMag) bunday yo'l tutmadi, ehtimol zarrachalar kichikroq, turli qoplamalar yoki sirt zaryadlariga ega edi yoki mulkiy tashuvchi suyuqlik ularning harakatlanish qobiliyatiga ta'sir qilgan. CombiMag zarralarining tasvir kontrasti ham kuchsizroq, bu suyuqlik va zarrachalar o'xshash zichlikka ega bo'lishi mumkinligini va shuning uchun bir-biriga osongina harakatlanmasligini ko'rsatadi. Agar magnit juda tez harakat qilsa, zarrachalar ham tiqilib qolishi mumkin, bu magnit maydon kuchi har doim ham suyuqlikdagi zarrachalar orasidagi ishqalanishni yengib o'tolmasligini ko'rsatadi, bu esa magnit maydon kuchi va magnit bilan nishon maydoni orasidagi masofa juda muhim ekanligi ajablanarli emasligini ko'rsatadi. Birgalikda, bu natijalar shuni ham ko'rsatadiki, magnitlar nishon maydonidan oqib o'tadigan ko'plab MPlarni ushlay olsa-da, magnitlarga ishonish mumkin emas. CombiMag zarralarini traxeya yuzasi bo'ylab harakatlantiring. Shuning uchun, biz in vivo LV-MP tadqiqotlari nafas yo'llari daraxtining ma'lum mintaqalarini jismonan nishonga olish uchun statik magnit maydonlardan foydalanishi kerak degan xulosaga keldik.
Zarrachalar tanaga yetkazilganda, ularni murakkab harakatlanuvchi tana to'qimalari kontekstida aniqlash qiyin, ammo ularni aniqlash qobiliyati magnitni traxeya ustida gorizontal ravishda MP iplarini "silkitish" uchun o'tkazish orqali yaxshilandi. Jonli tasvirlash mumkin bo'lsa-da, hayvon insonparvarlik yo'li bilan o'ldirilgandan so'ng zarrachalar harakatini aniqlash osonroq. Magnit tasvirlash maydoni ustida joylashganda MP konsentratsiyasi odatda bu joyda eng yuqori bo'lgan, garchi ba'zi zarrachalar odatda traxeya bo'ylab topilgan bo'lsa ham. In vitro tadqiqotlardan farqli o'laroq, magnitni tarjima qilish orqali zarrachalarni traxeya bo'ylab sudrab bo'lmaydi. Bu topilma traxeya yuzasini qoplaydigan shilimshiq odatda nafas olish yo'li bilan zarrachalarni qayta ishlashi, ularni shilimshiqda ushlab turishi va keyinchalik shilliq qavatni tozalash mexanizmi orqali qanday tozalanishi bilan mos keladi.
Biz traxeya ustida va ostida tortishish uchun magnitlardan foydalanish (3b-rasm) bir nuqtada yuqori darajada konsentratsiyalangan magnit maydon o'rniga yanada bir xil magnit maydonga olib kelishi mumkin, degan gipotezani ilgari surdik, bu esa zarrachalarning bir xil taqsimlanishiga olib kelishi mumkin. Biroq, bizning dastlabki tadqiqotimiz bu gipotezani qo'llab-quvvatlaydigan aniq dalillarni topmadi. Xuddi shunday, bir juft magnitni itarish uchun sozlash (3c-rasm) tasvirlangan sohada ko'proq zarrachalar cho'kishiga olib kelmadi. Bu ikkita topilma shuni ko'rsatadiki, ikki magnitli o'rnatish MP nishonga olishning mahalliy boshqaruvini sezilarli darajada yaxshilamaydi va natijada paydo bo'ladigan kuchli magnit kuchlarni sozlash qiyin, bu esa bu yondashuvni kamroq amaliy qiladi. Xuddi shunday, magnitni traxeya ustida va orqali yo'naltirish (3d-rasm) ham tasvirlangan sohada saqlanib qolgan zarrachalar sonini ko'paytirmadi. Ushbu muqobil konfiguratsiyalarning ba'zilari muvaffaqiyatli bo'lmasligi mumkin, chunki ular cho'kish sohasidagi magnit maydon kuchlarining pasayishiga olib keladi. Shuning uchun, bitta 30 graduslik burchakli magnit konfiguratsiyasi (3a-rasm) in vivo sinov uchun eng oson va eng samarali usul hisoblanadi.
LV-MP tadqiqoti shuni ko'rsatdiki, LV vektorlari CombiMag bilan birlashtirilganda va magnit maydon ishtirokida fizik buzilishdan so'ng yetkazib berilganda, traxeyada transduktsiya darajasi nazorat guruhiga nisbatan sezilarli darajada oshdi. Sinxrotron tasvirlash tadqiqotlari va LacZ natijalariga ko'ra, magnit maydon traxeya ichidagi LVni saqlab qolishga va o'pkaga darhol chuqur kirib boradigan vektor zarrachalari sonini kamaytirishga qodir edi. Bunday nishonga olish yaxshilanishlari yetkazib berilgan titrlarni, maqsaddan tashqari transduktsiyani, yallig'lanish va immun yon ta'sirlarni va gen tashuvchisi xarajatlarini kamaytirish bilan birga yuqori samaradorlikka olib kelishi mumkin. Muhimi, ishlab chiqaruvchining so'zlariga ko'ra, CombiMag boshqa genlarni uzatish usullari, jumladan, boshqa virusli vektorlar (masalan, AAV) va nuklein kislotalar bilan birgalikda ishlatilishi mumkin.