Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn díẹ̀ fún CSS. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀rọ ìṣàwárí tí a ti mú gbóná (tàbí kí ẹ pa ipò ìbáramu nínú Internet Explorer). Ní ​​àkókò yìí, láti rí i dájú pé a ń tẹ̀síwájú láti ṣe àtìlẹ́yìn, a ó máa fi ojú-ọ̀nà náà hàn láìsí àwọn àṣà àti JavaScript.
Àwọn èròjà ìbílẹ̀ fún ìtọ́jú àrùn ẹ̀dọ̀fóró cystic fibrosis yẹ kí ó fojú sí ọ̀nà atẹ́gùn tí ń ṣe ìtọ́jú nítorí pé ìyípo ẹ̀dọ̀fóró tí a gbé kalẹ̀ kò ní àǹfààní ìtọ́jú. Ìṣiṣẹ́ ìyípo ẹ̀dọ̀fóró ní í ṣe pẹ̀lú àkókò ìdúró vector. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn omi ìbílẹ̀ bíi àwọn olùgbé ìran tí ó ń tàn káàkiri sínú alveoli ní àdánidá nígbà ìmísí, àti àwọn èròjà ìtọ́jú èyíkéyìí ni a máa ń mú kúrò ní kíákíá nípasẹ̀ gbigbe mucociliary. Fífi àkókò ìdúró àwọn olùgbé ìran tí ó wà ní ọ̀nà atẹ́gùn pẹ́ sí i ṣe pàtàkì ṣùgbọ́n ó ṣòro láti ṣe. Àwọn èròjà ìbílẹ̀ tí a so mọ́ ara ìran tí a lè darí sí ojú ọ̀nà atẹ́gùn lè mú kí àfojúsùn agbègbè sunwọ̀n síi. Nítorí àwọn ìpèníjà ti ìrísí in vivo, ìwà àwọn èròjà ìbílẹ̀ kékeré bẹ́ẹ̀ lórí ojú ọ̀nà atẹ́gùn ní iwájú pápá ìbílẹ̀ tí a lò kò yé wa dáadáa. Ète ìwádìí yìí ni láti lo àwòrán synchrotron láti fojú inú wo ìṣípo in vivo ti àwọn èròjà ìbílẹ̀ nínú trachea ti àwọn eku tí a ti mú sunwọ̀n láti ṣàyẹ̀wò ìṣiṣẹ́ àti àwọn àpẹẹrẹ ti ìwà pàtákì oníkálukú àti ti gbogbo ènìyàn ní vivo. Lẹ́yìn náà, a tún ṣe àyẹ̀wò bóyá ìfijiṣẹ́ àwọn èròjà ìbílẹ̀ lentiviral ní iwájú pápá ìbílẹ̀ yóò mú kí ìṣiṣẹ́ transduction pọ̀ sí i nínú trachea eku.Synchrotron Àwòrán X-ray fi ìwà àwọn èròjà magnetic hàn ní àwọn pápá magnetic tí ó dúró ṣinṣin àti tí ó ń gbé kiri nínú vitro àti nínú vivo. A kò le fà àwọn èròjà magnetic ní ojú ọ̀nà atẹ́gùn alààyè pẹ̀lú àwọn mágnẹ́ẹ̀tì, ṣùgbọ́n nígbà ìrìn, àwọn ohun tí a fi sínú rẹ̀ wà ní ojú ọ̀nà atẹ́gùn níbi tí pápá magnetic ti lágbára jùlọ. A tún mú kí iṣẹ́ transduction ṣiṣẹ́ ní ìlọ́po mẹ́fà nígbà tí a fi àwọn èròjà magnetic lentivirus ránṣẹ́ ní iwájú pápá magnetic. Papọ̀, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé àwọn èròjà magnetic lentivirus àti àwọn pápá magnetic le jẹ́ ọ̀nà pàtàkì láti mú kí ìfọkànsí gene vector pọ̀ sí i àti láti mú kí àwọn ipele transduction pọ̀ sí i nínú ṣíṣe àwọn ọ̀nà atẹ́gùn ní vivo.
Àyípadà nínú ìṣẹ̀dá kan ṣoṣo tí a ń pè ní CF transmembrane conductance regulator (CFTR) ló ń fa cystic fibrosis (CFTR). Prótéènì CFTR jẹ́ ikanni ion kan tí ó wà nínú ọ̀pọ̀lọpọ̀ sẹ́ẹ̀lì epithelial jákèjádò ara, títí kan àwọn ọ̀nà atẹ́gùn tí ń darí, ibi pàtàkì tí àrùn CF ń ti ṣẹlẹ̀. Àbùkù CFTR máa ń yọrí sí ìrìn omi tí kò dára, ó máa ń mú kí omi gbẹ ojú ọ̀nà atẹ́gùn àti dín ìjìnlẹ̀ omi ojú ọ̀nà atẹ́gùn (ASL) kù. Èyí tún máa ń dín agbára ètò ìrìn mucociliary (MCT) kù láti mú àwọn èròjà àti àrùn tí a fà sínú atẹ́gùn kúrò. Ète wa ni láti ṣe àgbékalẹ̀ ìtọ́jú ìran lentiviral (LV) láti fi àwòkọ tó tọ́ ti ìran CFTR hàn àti láti mú ìlera ASL, MCT, àti ẹ̀dọ̀fóró sunwọ̀n sí i, àti láti tẹ̀síwájú nínú ṣíṣe àwọn ìmọ̀ ẹ̀rọ tuntun tí ó lè wọn àwọn pàrámítà wọ̀nyí ní vivo1.
Àwọn oníṣẹ́ LV jẹ́ ọ̀kan lára ​​àwọn olùfẹ́ ìtọ́jú jínì CF, nítorí pé wọ́n lè so jínì òògùn pọ̀ mọ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì basal ti afẹ́fẹ́ (àwọn sẹ́ẹ̀lì afẹ́fẹ́). Èyí ṣe pàtàkì nítorí wọ́n lè mú kí omi ara àti ìparẹ́ mucus padà sípò nípa ṣíṣe ìyàtọ̀ sí àwọn sẹ́ẹ̀lì afẹ́fẹ́ tí a ṣe àtúnṣe sí CF tí a fi jínì tọ́jú, èyí tí ó ń yọrí sí àwọn àǹfààní ìgbésí ayé. Àwọn oníṣẹ́ LV yẹ kí ó dojúkọ afẹ́fẹ́ tí ń ṣe àtúnṣe, nítorí pé ibí ni àrùn ẹ̀dọ̀fóró CF ti bẹ̀rẹ̀. Ìfijiṣẹ́ oníṣẹ́ náà jinlẹ̀ sínú ẹ̀dọ̀fóró lè yọrí sí ìfàsẹ́yìn alveolar, ṣùgbọ́n èyí kò ní àǹfààní ìtọ́jú nínú CF. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn omi bíi àwọn oníṣẹ́ jínì máa ń ṣí lọ sí alveoli nípa ti ara lẹ́yìn ìmísí lẹ́yìn ìbísí3,4 àti àwọn èròjà ìtọ́jú ni a máa ń yọ kúrò ní kíákíá sínú ihò ẹnu nípasẹ̀ MCT. LV transduction efficiency ní í ṣe pẹ̀lú gígùn àkókò tí vector náà dúró lẹ́gbẹ̀ẹ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a fojúsùn láti gba ìfàsẹ́yìn sẹ́ẹ̀lì láàyè - “àkókò gbígbé”5 - èyí tí a dínkù ní irọ̀rùn nípasẹ̀ afẹ́fẹ́ agbègbè tí ó wọ́pọ̀ àti ìkópa èròjà onípele àti MCT. Fún CF, agbára láti mú àkókò gbígbé LV gùn sí i nínú afẹ́fẹ́ ṣe pàtàkì láti ṣe àṣeyọrí àwọn ipele gíga ti ìfàsẹ́yìn ní agbègbè yìí, ṣùgbọ́n títí di ìsinsìnyí ti nija.
Láti borí ìdènà yìí, a dámọ̀ràn pé àwọn èròjà magnetic LV (MPs) lè ran lọ́wọ́ ní ọ̀nà méjì tó báramu. Àkọ́kọ́, a lè darí wọn lọ́nà magnetic sí ojú ọ̀nà afẹ́fẹ́ láti mú kí àfojúsùn sunwọ̀n síi àti láti ran àwọn èròjà generic tó ń gbé ìran lọ́wọ́ láti wà ní agbègbè ọ̀nà afẹ́fẹ́ tí a fẹ́; àti ASL) láti lọ sí ipele sẹ́ẹ̀lì 6. A ti lo àwọn MPs ní gbogbogbòò gẹ́gẹ́ bí ọkọ̀ ìfijiṣẹ́ oògùn tí a fojú sí nígbà tí wọ́n bá so mọ́ àwọn èròjà antibodies, àwọn oògùn kemotherapeutic, tàbí àwọn mọ́líkù kékeré mìíràn tí wọ́n so mọ́ àwọn awọ ara sẹ́ẹ̀lì tàbí tí wọ́n so mọ́ àwọn olugba ojú sẹ́ẹ̀lì tí ó yẹ tí wọ́n sì kó jọ ní àwọn ibi tí àrùn náà ti ṣẹlẹ̀ ní iwájú iná mànàmáná tí kò dúró. Àwọn Ibùdó Oogì fún Ìtọ́jú Àrùn Jẹjẹrẹ 7. Àwọn ọ̀nà ìtọ́jú “hyperthermal” mìíràn ń fẹ́ láti mú kí àwọn MP gbóná nígbà tí wọ́n bá fara hàn sí àwọn pápá oogì tí ń yípo, nípa bẹ́ẹ̀ wọ́n ń pa àwọn sẹ́ẹ̀lì tumor run. Ìlànà ìyípadà oogì, nínú èyí tí a ti ń lo pápá oogì gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìyípadà láti mú kí DNA pọ̀ sí i, ni a sábà máa ń lò ní in vitro nípa lílo onírúurú àwọn vector jínì tí kì í ṣe viral àti viral fún àwọn ìlà sẹ́ẹ̀lì tí ó ṣòro láti gbé jáde. A ti fi ìdí ìṣiṣẹ́ LV magnetotransfection múlẹ̀, pẹ̀lú ìfiránṣẹ́ in vitro ti LV-MPs sí ìlà sẹ́ẹ̀lì bronchial ènìyàn ní iwájú pápá oogì tí kò dúró, tí ó ń mú kí iṣẹ́ ìyípadà pọ̀ sí i ní ìlọ́po 186 ní ìfiwéra pẹ̀lú vector LV nìkan. A tún ti lo LV-MP sí àwòṣe CF in vitro, níbi tí transfection oogì mú kí transduction LV pọ̀ sí i nínú àwọn àṣà ìfọwọ́sowọ́pọ̀ afẹ́fẹ́ ní ìlọ́po 20 ní iwájú sputum CF10. Síbẹ̀síbẹ̀, in vivo magnetotransfection ti àwọn ẹ̀yà ara ti gba àfiyèsí díẹ̀, a sì ti ṣe àyẹ̀wò rẹ̀ nínú àwọn ìwádìí ẹranko díẹ̀11,12,13,14,15, pàápàá jùlọ nínú ẹ̀dọ̀fóró16,17. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn àǹfààní fún ìfàsẹ́yìn oofa nínú ìtọ́jú ẹ̀dọ̀fóró CF ṣe kedere.Tan àti àwọn ẹlòmíràn (2020) sọ pé “ìwádìí ẹ̀rí-ìmọ̀ nípa ìfijiṣẹ́ ẹ̀dọ̀fóró oofa oofa tí ó munadoko yóò ṣí ọ̀nà sílẹ̀ fún àwọn ọgbọ́n ìfàsẹ́yìn CFTR ọjọ́ iwájú láti mú àwọn àbájáde ìṣègùn sunwọ̀n síi nínú àwọn aláìsàn CF”6.
Ìwà àwọn èròjà magnetic kéékèèké lórí ojú ọ̀nà atẹ́gùn ní iwájú pápá magnetic tí a lò ṣòro láti fojú inú wò àti láti kẹ́kọ̀ọ́, nítorí náà a kò lóye wọn dáadáa. Nínú àwọn ìwádìí mìíràn, a ṣe àgbékalẹ̀ ọ̀nà synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) láti fojú inú wo àti láti mọ àwọn ìyípadà ìṣẹ́jú nínú ìjìnlẹ̀ ASL18 àti MCT behavior19,20 láìsí ìkọlù láti wọn tààràtà sí ojú ọ̀nà canal dada hydration àti tí a lò gẹ́gẹ́ bí àmì ìṣáájú ti ipa ìtọ́jú. Ní àfikún, ọ̀nà ìṣàyẹ̀wò MCT wa ń lo àwọn èròjà magnetic diameter 10–35 µm tí a fi alumina tàbí gilasi ìtọ́kasí gíga ṣe gẹ́gẹ́ bí àwọn àmì MCT tí a lè rí nípa lílo PB-PCXI21. Àwọn ọ̀nà méjèèjì dára fún ìwòran onírúurú irú èròjà patiku, títí kan MP.
Nítorí pé ó ní ààyè gíga àti ìpele àkókò, àwọn ọ̀nà ìṣàyẹ̀wò ASL àti MCT tí a fi PB-PCXI ṣe dáadáá fún ṣíṣàyẹ̀wò ìṣiṣẹ́ àti àwọn àpẹẹrẹ ìwà ìpalára ẹyọkan àti onípele nínú vivo láti ràn wá lọ́wọ́ láti lóye àti mú kí àwọn ọ̀nà ìfijiṣẹ́ jínì MP sunwọ̀n síi. Ọ̀nà tí a lò níbí yìí wá láti inú àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ wa nípa lílo ìlà ìpele SPring-8 BL20B2, nínú èyí tí a fojú inú wo ìṣípo omi lẹ́yìn ìfijiṣẹ́ ìwọ̀n sham vector sínú àwọn ọ̀nà atẹ́gùn imú àti ẹ̀dọ̀fóró ti àwọn eku láti ran lọ́wọ́ láti ṣàlàyé àwọn àpẹẹrẹ ìfihàn jínì tí kò bá ara mu tí a rí nínú àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ ẹranko onípele jínì wa 3,4.
Ète ìwádìí yìí ni láti lo synchrotron PB-PCXI láti fojú inú wo ìṣípo in vivo ti àwọn MPs nínú trachea ti àwọn eku alààyè. Àwọn ìwádìí àwòrán PB-PCXI wọ̀nyí ni a ṣe láti dán onírúurú MP wò, agbára pápá magnetic, àti àwọn ibi tí wọ́n wà láti pinnu ipa wọn lórí ìṣípo MP. A ṣe àbájáde pé pápá magnetic tí a lò níta yóò ran MP tí a fi ránṣẹ́ lọ́wọ́ láti dúró tàbí láti lọ sí agbègbè ibi tí a fojú sí. Àwọn ìwádìí wọ̀nyí tún jẹ́ kí a mọ àwọn ìṣètò oofa tí ó mú iye àwọn èròjà tí ó wà nínú trachea pọ̀ sí i lẹ́yìn ìfipamọ́. Nínú ìtẹ̀jáde ìwádìí kejì, a gbìyànjú láti lo ìṣètò tí ó dára jùlọ yìí láti fi àpẹẹrẹ ìfipamọ́ tí ó wá láti inú ìfiránṣẹ́ in vivo ti LV-MPs sí ọ̀nà afẹ́fẹ́ eku hàn, ní ìbámu pẹ̀lú èrò pé ìfiránṣẹ́ LV-MPs ní àyíká ìfọkànsí ọ̀nà afẹ́fẹ́ yóò mú kí iṣẹ́ ìfiránṣẹ́ LV sunwọ̀n síi.
Gbogbo ìwádìí nípa ẹranko ni a ṣe gẹ́gẹ́ bí ìlànà tí Yunifásítì Adelaide fọwọ́ sí (M-2019-060 àti M-2020-022) àti Ìgbìmọ̀ Ìwà Ẹranko SPring-8 Synchrotron ti fọwọ́ sí. Àwọn ìdánwò ni a ṣe gẹ́gẹ́ bí ìlànà ARRIVE.
Gbogbo àwòrán X-ray ni a ṣe ní ìlà ìlà BL20XU ní SPring-8 synchrotron ní Japan, nípa lílo ètò kan tí ó jọ èyí tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀21,22. Ní kúkúrú, àpótí ìdánwò náà wà ní 245 m láti òrùka ìpamọ́ synchrotron. A lo ijinna ayẹwo-sí-ojú-ìwòye ti 0.6 m fún àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ àwòrán patiku àti 0.3 m fún àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ àwòrán in vivo láti ṣe àwọn ipa ìyàtọ̀ phase. A lo agbára ìtànṣán monochromatic ti 25 keV. A ya àwọn àwòrán nípa lílo converter X-ray gíga (SPring-8 BM3) tí a so mọ́ detector sCMOS. Converter náà yí àwọn ìtànṣán X padà sí ìmọ́lẹ̀ tí a lè rí nípa lílo scintillator tí ó nípọn 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), èyí tí a wá darí sí sensọ sCMOS nípa lílo ohun èlò microscope × 10 (NA 0.3). Detector sCMOS ni Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) pẹ̀lú ìwọ̀n array ti Àwọn píksẹ́lì 2048 × 2048 àti ìwọ̀n píksẹ́lì aise ti 6.5 × 6.5 µm. Ètò yìí mú ìwọ̀n píksẹ́lì isotropic tó munadoko ti 0.51 µm àti ojú ìwòye tó tó 1.1 mm × 1.1 mm. A yan gígùn ìfarahàn ti 100 ms láti mú kí ìpíndọ́gba àmì-sí-ariwo ti àwọn píksẹ́lì oofa pọ̀ sí i nínú àti lóde ọ̀nà atẹ́gùn pẹ̀lú dínkù àwọn ohun èlò ìṣípo tí èémí fà kù. Fún àwọn ìwádìí in vivo, a gbé ìdènà X-ray kíákíá sí ipa ọ̀nà X-ray láti dín ìwọ̀n ìtànṣán kù nípa dídínà ìtànṣán X-ray láàrín àwọn ìfarahàn.
A kò lo ẹ̀rọ LV nínú àwọn ìwádìí àwòrán SPring-8 PB-PCXI kankan nítorí pé yàrá àwòrán BL20XU kò ní ìfọwọ́sowọ́pọ̀ Biosafety Level 2. Dípò bẹ́ẹ̀, a yan àwọn MP tí wọ́n ní àmì ìdánimọ̀ dáadáa láti ọ̀dọ̀ àwọn olùtajà méjì—tí ó bo oríṣiríṣi ìwọ̀n, àwọn ohun èlò, ìṣọ̀kan irin, àti àwọn ohun èlò—lákọ̀ọ́kọ́ láti mọ bí àwọn pápá magnetic ṣe ní ipa lórí ìṣípo MP nínú àwọn capillaries gilásì, àti lẹ́yìn náà nínú àwọn ọ̀nà atẹ́gùn alààyè. lórí ojú ilẹ̀. Àwọn MPs wà ní ìwọ̀n láti 0.25 sí 18 μm, a sì fi onírúurú ohun èlò ṣe wọ́n (wo Táblì 1), ṣùgbọ́n ìṣètò àwọn àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan, pẹ̀lú ìwọ̀n àwọn èròjà oofa inú MP, kò ṣe kedere. Gẹ́gẹ́ bí ìwádìí MCT wa 19, 20, 21, 23, 24, a retí pé àwọn MP tó kéré tó 5 μm ni a lè rí lórí ojú ọ̀nà atẹ́gùn tracheal, fún àpẹẹrẹ nípa yíyọ àwọn férémù ìtẹ̀léra kúrò láti rí ìrísí ìṣípo MP tó pọ̀ sí i. MP kan tó tó 0.25 μm kéré ju ìpinnu ẹ̀rọ àwòrán lọ, ṣùgbọ́n a retí pé PB-PCXI yóò ṣàwárí ìyàtọ̀ ìwọ̀n wọn àti ìṣípo omi ojú tí a gbé wọn sí lẹ́yìn ìṣípo.
Àwọn àpẹẹrẹ fún MP kọ̀ọ̀kan nínú Táblì 1 ni a pèsè nínú àwọn capillaries gilasi 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) pẹ̀lú ìwọ̀n inú 0.63 mm. Àwọn patikulu ara wà nínú omi, nígbà tí àwọn patikulu CombiMag wà nínú omi tí olùpèsè. A fi omi kún inú túbù kọ̀ọ̀kan (tó tó 11 μl) a sì gbé e sórí ohun tí a fi ṣe àpẹẹrẹ náà (wo Àwòrán 1). A gbé àwọn capillaries gilasi náà sí ìpele àpẹẹrẹ nínú àpótí àwòrán, lẹ́sẹẹsẹ, a sì gbé àwọn etí omi náà sí. A so 19 mm (gígùn 28 mm) nickel shell rare earth neodymium iron boron (NdFeB) magnet (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) pẹ̀lú magnetization tí ó kù ti 1.17 Tesla mọ́ ìpele ìtumọ̀ ọ̀tọ̀ láti ṣe àṣeyọrí Yí ipò rẹ̀ padà ní ọ̀nà jíjìn nígbà àwòrán. Gbígba àwòrán X-ray bẹ̀rẹ̀ nígbà tí a bá gbé magnet náà sí ìpele 30 mm lókè àpẹẹrẹ náà, a sì gba àwòrán náà ní ìwọ̀n 4 frame fún ìṣẹ́jú-àáyá kan. Nígbà àwòrán, a mú magnet náà sún mọ́ Pọ́ọ̀pù ìṣàn gilasi (tó jìnnà sí i ní nǹkan bí 1 mm) lẹ́yìn náà a yí i káàkiri pọ́ọ̀pù náà láti ṣe àyẹ̀wò ipa agbára pápá àti ipò rẹ̀.
Eto aworan inu vitro ti o ni awọn ayẹwo MP ninu awọn capillaries gilasi lori ipele itumọ xy ayẹwo. Ipa ọna ti X-ray ray ni a samisi pẹlu laini pupa ti o ni abawọn.
Nígbà tí a ti rí ìrísí àwọn MPs nínú vitro, a dán àwọn ẹ̀yà kan nínú wọn wò nínú vivo nínú àwọn eku Wistar obìnrin onírú ẹranko (tó tó ọ̀sẹ̀ méjìlá, tó tó 200 g).0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) àti 4 mg/kg butorphale (Vetorphale®, Meiji Seika) A fi abẹ́rẹ́ intraperitoneal fi pa eku lára ​​nípa lílo abẹ́rẹ́ intraperitoneal. Lẹ́yìn tí wọ́n ti lo abẹ́rẹ́, a múra wọn sílẹ̀ fún àwòrán nípa yíyọ irun tí ó yí trachea ká kúrò, kí a fi ọ̀pá endotracheal (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) sínú, kí a sì dá wọn dúró lórí àwo àwòrán tí a ṣe ní àdáni tí ó ní àpò ooru láti mú kí ara wọn gbóná 22. Lẹ́yìn náà, a so àwo àwòrán náà mọ́ àwo ìtumọ̀ àpẹẹrẹ nínú àpótí àwòrán ní igun díẹ̀ láti ṣe àtúnṣe trachea ní ìlà gígùn nínú àwòrán X-ray, gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn. nínú Àwòrán 2a.
(a) Eto aworan inu vivo ninu apoti aworan SPring-8, ipa ọna ti X-ray beam naa ni a fi ila pupa ti o ni abawọn.(b,c) A ṣe agbegbe eefa lori trachea latọna jijin nipa lilo awọn kamẹra IP meji ti a gbe sori orthogonal. Ni apa osi ti aworan iboju naa, a le rii iyipo waya ti o mu ori naa, ati cannula ifijiṣẹ ni ipo laarin tube ET.
Ètò fifa syringe tí a ń ṣàkóso láti ọ̀nà jíjìn (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) tí a fi syringe gilasi 100 μl so mọ́ páìpù PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) nípasẹ̀ abẹ́rẹ́ 30 Ga. Ṣe àmì sí páìpù náà láti rí i dájú pé páìpù náà wà ní ipò tí ó tọ́ nínú trachea nígbà tí a bá ń fi páìpù ET sí i. Nípa lílo micropump, a fa syringe plunger náà kúrò nígbà tí a fi páìpù náà sínú àyẹ̀wò MP tí a fẹ́ fi ránṣẹ́. Lẹ́yìn náà, a fi páìpù ìfijiṣẹ́ tí a kojọpọ sínú páìpù endotracheal, a sì fi páìpù náà sí apá tí ó lágbára jùlọ nínú pápá magnetic tí a retí. A darí gbígbà àwòrán nípa lílo ẹ̀rọ amí tí a so mọ́ àpótí àkókò Arduino wa, a sì gba gbogbo àmì (fún àpẹẹrẹ iwọ̀n otútù, ìmí, ṣíṣí/ìparí ìbòrí àti gbígbà àwòrán) sílẹ̀ nípa lílo Powerlab àti LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Nígbà tí a bá ń ya àwòrán Nígbà tí a kò bá lè rí páìpù náà, a gbé àwọn kámẹ́rà IP méjì (Panasonic BB-SC382) sí ipò tí ó tó 90° sí ara wọn. Wọ́n sì lò wọ́n láti ṣe àkíyèsí ipò oofa ní ìbámu pẹ̀lú trachea nígbà tí a bá ń ya àwòrán (Àwòrán 2b,c). Láti dín àwọn ohun ìṣẹ̀dá ìṣípo kù, a gba àwòrán kan fún ẹ̀mí kan nígbà tí omi bá ń ṣàn ní ìparí.
A so oofa mọ́ ìpele kejì tí a lè gbé síta láti ìta ibi tí a ti ń ṣe àwòrán. A dán onírúurú ipò oofa àti ìṣètò wò, títí bí: A gbé e kalẹ̀ ní igun tó tó 30° lókè ọfà (àwọn ìṣètò tí a fihàn nínú Àwòrán 2a àti 3a); oofa kan lókè ẹranko náà àti èkejì ní ìsàlẹ̀, pẹ̀lú àwọn ọ̀pá tí a ṣètò láti fà mọ́ra (Àwòrán 3b); oofa kan lókè ẹranko náà àti èkejì ní ìsàlẹ̀, pẹ̀lú àwọn ọ̀pá tí a ṣètò láti lé (Àwòrán 3c); àti oofa kan lókè àti ní ìdúró sí ọfà (Àwòrán 3d). Nígbà tí a bá ti ṣètò ẹranko náà àti oofa náà tí a sì ti fi MP tí a fẹ́ dán wò sínú ẹ̀rọ fifa abẹ́rẹ́, fi ìwọ̀n 50 μl fún un ní ìwọ̀n 4 μl/sẹ́jú-àáyá nígbà tí a bá ń gba àwòrán. Lẹ́yìn náà, a óò gbé oofa náà padà sí iwájú tàbí ní ẹ̀gbẹ́ lórí ọfà náà nígbà tí a bá ń tẹ̀síwájú láti gba àwòrán.
Ìṣètò oofa fún àwòrán in vivo (a) oofa kan ṣoṣo lókè oofa ní igun tó tó 30°, (b) oofa meji tó wà láti fà mọ́ra, (c) oofa meji tó wà láti lé wọn jáde, (d) oofa kan ṣoṣo ló wà lókè àti ní ìpele nínú oofa. Olùwòran náà wo ìsàlẹ̀ láti ẹnu sí ẹ̀dọ̀fóró nípasẹ̀ oofa, àti oofa X-ray náà kọjá ní apá òsì eku náà, ó sì jáde ní apá ọ̀tún. Ó ṣeé ṣe kí oofa náà gbéra ní gígùn ọ̀nà atẹ́gùn tàbí kí ó lọ sí òsì àti ọ̀tún lókè oofa X-ray.
A tún gbìyànjú láti mọ bí àwọn èròjà inú ọ̀nà atẹ́gùn ṣe rí àti bí wọ́n ṣe ń hùwà sí àwọn èròjà inú ọ̀nà atẹ́gùn láìsí ìmí àti ìṣípo ọkàn. Nítorí náà, ní òpin àkókò àwòrán, a pa àwọn ẹranko nípa ti ara ẹni fún ìlòkulò pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip). Àwọn ẹranko kan wà lórí pẹpẹ àwòrán, nígbà tí ẹ̀mí àti ìlù ọkàn bá dáwọ́ dúró, a tún ṣe àwòrán náà, a sì fi ìwọ̀n MP kún un bí kò bá sí MP tó hàn lórí ojú ọ̀nà atẹ́gùn.
A ṣe àtúnṣe àwọn àwòrán tí a rí, a sì kó wọn jọ sínú fíìmù (20 frame fún ìṣẹ́jú-àáyá kan; 15-25 × iyára déédé, ó sinmi lórí ìwọ̀n èémí) nípa lílo ìwé àdáni tí a kọ sínú MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Gbogbo àwọn ìwádìí ìfijiṣẹ́ ìjìnlẹ̀ LV ni a ṣe ní Ilé Ìwádìí Ẹranko ní Ilé Ẹ̀kọ́ ní Yunifásítì Adelaide, wọ́n sì fẹ́ lo àwọn àbájáde ìwádìí SPring-8 láti ṣe àyẹ̀wò bóyá ìfijiṣẹ́ LV-MP ní iwájú pápá oofa lè mú kí ìfijiṣẹ́ ìjìnlẹ̀ pọ̀ sí i ní vivo. Láti ṣe àyẹ̀wò àwọn ipa ti MP àti pápá oofa, a tọ́jú àwọn ẹgbẹ́ ẹranko méjì: a fún ẹgbẹ́ kan ní LV-MP pẹ̀lú oofa tí a gbé kalẹ̀, ẹgbẹ́ kejì sì gba ẹgbẹ́ ìṣàkóso pẹ̀lú LV-MP láìsí oofa.
Àwọn ìfàsẹ́yìn jínì LV ni a ṣẹ̀dá nípa lílo àwọn ọ̀nà tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ 25, 26. Ìfàsẹ́yìn LacZ ṣe àfihàn jínì beta-galactosidase tí a ti ṣe àkóso rẹ̀ láti inú ohun èlò ìdàgbàsókè MPSV (LV-LacZ), èyí tí ó ń ṣe àgbékalẹ̀ ìhùwàpadà aláwọ̀ búlúù nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a ti yọ jáde, tí a lè rí ní iwájú àsopọ ẹ̀dọ̀fóró àti àwọn apá àsopọ. A ṣe ìfàsẹ́yìn nínú àṣà sẹ́ẹ̀lì nípa kíka iye àwọn sẹ́ẹ̀lì rere LacZ pẹ̀lú hemocytometer láti ṣírò iye títà ní TU/ml. A ń pa àwọn olùgbé mọ́ ní -80 °C, a ń yọ́ wọn kí a tó lò wọ́n, a sì ń dè wọ́n mọ́ CombiMag nípa dídàpọ̀ wọn ní ìpíndọ́gba 1:1 àti fífi sínú yìnyín fún ó kéré tán ìṣẹ́jú 30 kí a tó fi wọ́n sílẹ̀.
A fi abẹ́rẹ́ 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) àti 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) oṣù kan) àti abẹ́rẹ́ ẹnu tí kì í ṣe iṣẹ́ abẹ pẹ̀lú cannula 16 Ga iv. Láti rí i dájú pé àsopọ ọ̀nà afẹ́fẹ́ tracheal gba transduction LV, a fi ìlànà ìdàrúdàpọ̀ oníṣẹ́ wa tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ ṣe é, nínú èyí tí a fi agbọ̀n wáyà pa ojú ọ̀nà afẹ́fẹ́ tracheal ní afẹ́fẹ́ (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. A fi LV-MP ṣe ìtọ́jú tracheal lẹ́yìn náà nínú àpótí ààbò ẹ̀dá alààyè ní nǹkan bí ìṣẹ́jú mẹ́wàá lẹ́yìn ìdàrúdàpọ̀ náà.
A ṣe àtúnṣe pápá oofa tí a lò nínú ìwádìí yìí ní ọ̀nà kan náà sí ìwádìí àwòrán X-ray in vivo, pẹ̀lú àwọn oofa kan náà tí a gbé sókè trachea nípa lílo àwọn agekuru stent distillation (Àwòrán 4). A fi iwọn didun 50 μl (2 × 25 μl aliquots) ti LV-MP sínú trachea (n = 3 ẹranko) nípa lílo pipette kan tí ó ní orí jeli gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ tẹ́lẹ̀. Ẹgbẹ́ ìṣàkóso kan (n = 3 ẹranko) gba àwọn LV-MP kan náà láìlo oofa. Lẹ́yìn tí ìfúnpọ̀ náà bá ti parí, a yọ cannula kúrò nínú tube ET a sì yọ ẹranko náà jáde. Oofa náà dúró sí ipò fún ìṣẹ́jú 10, lẹ́yìn náà a yọ ọ́ kúrò. Àwọn eku gba ìwọ̀n abẹ ti meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) lẹ́yìn náà a tún yí anesthesia padà nípa lílo ip ti 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia). A pa àwọn eku mọ́ gbóná a sì ń ṣe àbójútó wọn títí tí a ó fi gbádùn ara wọn pátápátá láti inú anesthesia.
Ẹ̀rọ ìfijiṣẹ́ LV-MP nínú àpótí ààbò ẹ̀dá alààyè. A lè rí ibùdó Luer aláwọ̀ ewé fẹ́ẹ́rẹ́fẹ́ ti tube ET tí ó ń yọ jáde láti ẹnu àti pé a fi orí gel ti pipette tí a fihàn nínú àwòrán náà sínú tube ET sí ibú tí a fẹ́ sínú trachea.
Ọ̀sẹ̀ kan lẹ́yìn ìlànà ìtọ́jú LV-MP, a pa àwọn ẹranko nípa lílo ìfàmísí CO2 100% àti pé a ṣe àyẹ̀wò ìfarahàn LacZ nípa lílo ìtọ́jú X-gal wa tí a ṣe déédéé. A yọ àwọn òrùka caudal most cartilaginous mẹ́ta kúrò láti rí i dájú pé ìbàjẹ́ ẹ̀rọ tàbí ìdúró omi láti ibi tí a gbé e sí nínú àyẹ̀wò náà kò sí nínú àyẹ̀wò náà. A gé trachea kọ̀ọ̀kan ní gígùn láti ṣẹ̀dá ìdajì méjì fún àyẹ̀wò, a sì gbé wọn sínú àwo tí ó ní roba silicone (Sylgard, Dow Inc) nípa lílo abẹ́rẹ́ Minutien (Fine Science Tools) láti fojú inú wo ojú ìmọ́lẹ̀ náà. A fi fọ́tò iwájú pẹ̀lú lílo ohun amúṣẹ́dá Nikon (SMZ1500) pẹ̀lú kámẹ́rà DigiLite àti kọ̀ǹpútà TCapture (Tucsen Photonics, China) ṣe àfihàn ìpínkiri àti àpẹẹrẹ àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a ti yọ jáde. A gba àwọn àwòrán ní ìbú 20x (pẹ̀lú ìtò tí ó ga jùlọ fún gbogbo ìbú trachea), pẹ̀lú gbogbo gígùn trachea tí a yàwòrán ní ìgbésẹ̀-ní-ìgbésẹ̀, ní rírí i dájú pé ó bò ara wọn pọ̀ tó láàárín àwòrán kọ̀ọ̀kan láti gba àwòrán láàyè fún “fíránṣẹ́”. Àwọn àwòrán láti inú trachea kọ̀ọ̀kan Lẹ́yìn náà ni a kó wọn jọ sínú àwòrán àpapọ̀ kan ṣoṣo nípa lílo Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) nípa lílo ètò ìṣípo tí ó ní planar. A ṣe ìwọ̀n àwọn agbègbè ìfihàn LacZ nínú àwọn àwòrán àpapọ̀ ti trachea láti ọ̀dọ̀ ẹranko kọ̀ọ̀kan nípa lílo ìwé àfọwọ́kọ MATLAB aládàáṣe (R2020a, MathWorks) gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀, nípa lílo àwọn ètò ti 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, àti Value < 0.7. Nípa títẹ̀lé àwọn ìlà ti àsopọ náà, a fi ọwọ́ ṣe ìbòjú kan nínú GIMP v2.10.24 fún àwòrán àpapọ̀ kọ̀ọ̀kan láti lè dá agbègbè àsopọ mọ̀ àti láti dènà àwọn àwárí èké láti òde àsopọ trachea. A ṣe àkópọ̀ àwọn agbègbè àbàwọ́n láti inú gbogbo àwọn àwòrán àpapọ̀ láti ọ̀dọ̀ ẹranko kọ̀ọ̀kan láti ṣe àpapọ̀ agbègbè àbàwọ́n fún ẹranko náà. Lẹ́yìn náà, a pín agbègbè àbàwọ́n náà sí àpapọ̀ agbègbè ìbòjú láti ṣe agbègbè tí a ti ṣètò tẹ́lẹ̀.
A fi paraffin sinu trachea kọọkan, a sì gé àwọn apá 5 μm. A fi pupa onípele-aláìlágbára bò àwọn apá náà fún ìṣẹ́jú 5, a sì fi microscope Nikon Eclipse E400, kámẹ́rà DS-Fi3 àti sọ́fítíwọ́ọ̀kì ìfàmìsí NIS (ẹ̀yà 5.20.00) gba àwọn àwòrán náà.
Gbogbo àwọn àyẹ̀wò ìṣirò ni a ṣe nínú GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). A ṣètò pàtàkì ìṣirò sí p ≤ 0.05. A fi ìdánwò Shapiro-Wilk ṣe ìdánwò déédé, a sì ṣe àyẹ̀wò ìyàtọ̀ nínú àwọ̀ LacZ nípa lílo ìdánwò t-test tí kò ní ìsopọ̀.
A ṣe àyẹ̀wò àwọn MP mẹ́fà tí a ṣàlàyé nínú Táblì 1 nípa lílo PCXI, a sì ṣe àpèjúwe ìríran náà nínú Táblì 2. Àwọn MP polystyrene méjì (MP1 àti MP2; 18 μm àti 0.25 μm, lẹ́sẹẹsẹ) kò hàn lábẹ́ PCXI, ṣùgbọ́n àwọn àpẹẹrẹ yòókù ni a lè dá mọ̀ (àpẹẹrẹ ni a fihàn nínú Àwòrán 5). MP3 àti MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm àti 0.9 μm, lẹ́sẹẹsẹ) ni a lè rí díẹ̀. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé wọ́n ní díẹ̀ nínú àwọn patikulu kéékèèké tí a dán wò, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) ni ó hàn gbangba jùlọ. Ó ṣòro láti rí ọjà CombiMag MP6. Ní gbogbo ìgbà, agbára wa láti ṣàwárí MP ni a mú sunwọ̀n síi nípa títúmọ̀ magnétì náà padà sí iwájú ní ìbámu pẹ̀lú capillary. Nígbà tí àwọn magnétì náà kúrò ní capillary, àwọn patikulu náà gùn sí i ní àwọn okùn gígùn, ṣùgbọ́n bí àwọn magnétì náà ṣe ń sún mọ́ ara wọn tí agbára pápá magnétì náà sì ń pọ̀ sí i, àwọn okùn patikulu náà kúrú bí àwọn patikulu náà ṣe ń lọ sí orí òkè capillary (wo Fídíò Àfikún S1: MP4), npọ si iwuwo patiku ti oju. Ni idakeji, nigbati a ba yọ oofa kuro ninu capillary, agbara aaye naa dinku ati pe awọn MPs tun ṣe atunto si awọn okun gigun ti o wa lati oke oju eefa naa (wo Fidio Afikun S2:MP4). Lẹhin ti oofa naa da duro gbigbe, awọn patikulu naa tẹsiwaju lati gbe fun igba diẹ lẹhin ti o de ipo iwọntunwọnsi. Bi MP ṣe n lọ si ati kuro ni oke oju eefa naa, awọn patikulu oofa maa n fa awọn idoti naa nipasẹ omi naa.
Ìrísí MP lábẹ́ PCXI yàtọ̀ síra gidigidi láàárín àwọn àpẹẹrẹ.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 àti (d) MP6. Gbogbo àwọn àwòrán tí a fihàn níbí ni a fi mágnẹ́ẹ̀tì tí ó wà ní ìwọ̀n 10 mm tààrà lórí capillary náà ya. Àwọn yíká ńlá tí ó hàn gbangba jẹ́ àwọn èéfín afẹ́fẹ́ tí a dì mọ́ inú capillaries, tí ó fi àwọn ẹ̀yà dúdú àti funfun tí ó hàn kedere ti àwòrán ìyàtọ̀ phase. Àpótí pupa náà ní ìgbéga tí ó ń mú ìyàtọ̀ náà pọ̀ sí i. Ṣàkíyèsí pé àwọn ìwọ̀n skematics oofa nínú gbogbo àwọn àwòrán kò tó ìwọ̀n àti pé ó tóbi tó ìgbà 100 ju èyí tí a fihàn lọ.
Bí a ṣe ń túmọ̀ mágnẹ́ẹ̀tì sí apá òsì àti ọ̀tún ní orí àpò ìsàlẹ̀, igun okùn MP yí padà láti bá mágnẹ́ẹ̀tì mu (wo Àwòrán 6), nípa bẹ́ẹ̀ ó ń ṣe àfihàn àwọn ìlà pápá mágnẹ́ẹ̀tì. Fún MP3-5, lẹ́yìn tí kọ́ọ̀dù náà bá dé igun ààlà, àwọn èròjà náà ni a máa ń fà ní orí òkè àpò ìsàlẹ̀. Èyí sábà máa ń yọrí sí pípín àwọn MP sí àwọn ẹgbẹ́ ńláńlá nítòsí ibi tí pápá mágnẹ́ẹ̀tì náà ti lágbára jùlọ (wo Fídíò Àfikún S3:MP5). Èyí tún hàn gbangba nígbà tí àwòrán bá súnmọ́ òpin àpò ìsàlẹ̀, èyí tí ó máa ń mú kí àwọn MP kórajọ kí wọ́n sì pọkàn pọ̀ ní ojú ọ̀nà omi-afẹ́fẹ́. Àwọn èròjà nínú MP6, tí ó ṣòro láti mọ̀ ju MP3-5 lọ, ni a kò fà bí mágnẹ́ẹ̀tì náà ṣe ń lọ ní orí àpò ìsàlẹ̀, ṣùgbọ́n àwọn okùn MP náà ń yapa, wọ́n sì fi àwọn èròjà náà sílẹ̀ ní ojú ìwòye (wo Fídíò Àfikún S4:MP6). Ní ​​àwọn ìgbà míì, nígbà tí a bá dín agbára mágnẹ́ẹ̀tì tí a lò kù nípa gbígbé mágnẹ́ẹ̀tì náà ní ìjìnnà ńlá láti ibi àwòrán náà, àwọn MP tí ó kù ń sọ̀kalẹ̀ díẹ̀díẹ̀ sí ojú ìsàlẹ̀ àpò ìsàlẹ̀ nígbà tí wọ́n bá wà nínú okùn náà (wo Fídíò Àfikún S5: MP3).
Igun okùn MP naa yipada bi a ṣe tumọ oofa si apa ọtun loke capillary naa.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ati (d) MP6. Apoti pupa naa ni imunadoko ti o mu iyatọ pọ si. Ṣakiyesi pe awọn fidio afikun jẹ alaye bi wọn ṣe ṣafihan eto pataki ti awọn ohun elo ati alaye ti o lagbara ti a ko le rii ninu awọn aworan alaimuṣinṣin wọnyi.
Àwọn ìdánwò wa fihàn pé gbígbé oofa náà lọ díẹ̀díẹ̀ síwá-sẹ́yìn ní ẹ̀gbẹ́ trachea ń mú kí àwòrán MP rọrùn ní ìbámu pẹ̀lú ìṣípo tó díjú nínú vivo. A kò ṣe ìdánwò In vivo nítorí pé àwọn ìlẹ̀kẹ̀ polystyrene (MP1 àti MP2) kò hàn nínú capillary. A dán ọ̀kọ̀ọ̀kan àwọn MP mẹ́rin tó kù wò ní vivo pẹ̀lú òòfà gígùn oofa tí a ṣètò lókè trachea ní igun tó tó 30° sí inaro (wo Àwòrán 2b àti 3a), nítorí èyí yọrí sí àwọn ẹ̀wọ̀n MP tó gùn jù, ó sì múná dóko ju bí ìṣètò oofa ṣe parí lọ. A kò rí MP3, MP4 àti MP6 nínú trachea ti àwọn ẹranko alààyè. Nígbà tí a ya àwòrán àwọn ọ̀nà afẹ́fẹ́ eku lẹ́yìn tí a pa àwọn ẹranko náà ní ọ̀nà ènìyàn, àwọn èròjà náà kò hàn gbangba kódà nígbà tí a fi ìwọ̀n afikún kún un nípa lílo syringe pump. MP5 ní ìwọ̀n iron oxide tó ga jùlọ, òun sì ni èròjà kan ṣoṣo tó hàn, nítorí náà a lò ó láti ṣe àyẹ̀wò àti ṣe àpèjúwe ìwà in vivo ti MP.
Fífi oofa sori trachea lakoko ifijiṣẹ MP yọrisi pe ọpọlọpọ, ṣugbọn kii ṣe gbogbo awọn MP, ni a pejọ ni aaye wiwo. Awọn patikulu ti n wọ inu trachea ni a ṣe akiyesi julọ ninu awọn ẹranko ti a fi eniyan rubọ. Aworan 7 ati Fidio Afikun S6: MP5 fihan gbigba oofa iyara ati tito awọn patikulu lori oju trachea ventral, ti o fihan pe awọn MP le dari si awọn agbegbe ti a fẹ ninu trachea. Nigbati wọn n wa kiri ni ijinna diẹ sii ni ọna trachea lẹhin ifijiṣẹ MP, awọn MP kan ni a rii nitosi carina, ti o daba pe agbara aaye oofa ko to lati gba ati tọju gbogbo awọn MP, bi a ti fi wọn ranṣẹ nipasẹ agbegbe ti agbara aaye oofa ti o pọju lakoko ilana omi. Sibẹsibẹ, awọn ifọkansi MP lẹhin oyun ga julọ ni ayika agbegbe ti a ya aworan naa, ti o daba pe ọpọlọpọ awọn MP duro ni awọn agbegbe atẹgun nibiti agbara aaye oofa ti a lo ga julọ.
Àwọn àwòrán láti (a) ṣáájú àti (b) lẹ́yìn ìfiránṣẹ́ MP5 sínú ọ̀nà eku tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ pa pẹ̀lú oofa tí a gbé kalẹ̀ ní òkè ibi àwòrán náà. Agbègbè tí a yàwòrán náà wà láàrín àwọn òrùka cartilage méjì náà. Kí a tó fi MP hàn, omi díẹ̀ wà nínú ọ̀nà atẹ́gùn. Àpótí pupa náà ní ìgbéga tí ń mú ìyàtọ̀ wá. Àwọn àwòrán wọ̀nyí wá láti inú fídíò tí a fihàn nínú Fídíò Àfikún S6:MP5.
Títúmọ̀ mágnẹ́ẹ̀tì náà ní ẹ̀gbẹ́ trachea in vivo mú kí ẹ̀wọ̀n MP yí igun inú ojú ọ̀nà afẹ́fẹ́ padà ní ọ̀nà tí ó jọ èyí tí a rí nínú àwọn capillaries (wo Àwòrán 8 àti Fídíò Àfikún S7:MP5). Síbẹ̀síbẹ̀, nínú ìwádìí wa, a kò lè fa àwọn MPs ní ojú ọ̀nà afẹ́fẹ́ alààyè bí wọ́n ṣe lè ṣe pẹ̀lú àwọn capillaries. Ní àwọn ìgbà míì, ẹ̀wọ̀n MP yóò gùn sí i bí mágnẹ́ẹ̀tì náà ṣe ń lọ sí òsì àti ọ̀tún. Ohun tó yani lẹ́nu ni pé, a tún rí i pé okùn particle náà máa ń yí ìjìnlẹ̀ omi ojú ilẹ̀ padà nígbà tí mágnẹ́ẹ̀tì náà bá ń lọ ní gígùn pẹ̀lú trachea, ó sì máa ń fẹ̀ sí i nígbà tí mágnẹ́ẹ̀tì náà bá ń lọ ní tààrà lórí rẹ̀ tí a sì ń yí okùn particle náà padà sí ipò inaro (wo Fídíò Àfikún S7). : MP5 ní 0:09, ní ìsàlẹ̀ ọ̀tún). Ìrísí ìṣípo náà yípadà nígbà tí a yí mágnẹ́ẹ̀tì náà kárí òkè ọ̀fun (ìyẹn ni, sí òsì tàbí ọ̀tún ẹranko náà dípò kí ó wà ní gígùn ọ̀fun). Àwọn mágnẹ́ẹ̀tì náà ṣì hàn kedere bí wọ́n ṣe ń gbéra, ṣùgbọ́n nígbà tí a yọ mágnẹ́ẹ̀tì kúrò nínú ọ̀fun, àwọn orí àwọn okùn mágnẹ́ẹ̀tì náà hàn gbangba (wo Fídíò Àfikún S8:MP5, bẹ̀rẹ̀ ní 0:08). Èyí bá ìwà MP tí a rí lábẹ́ pápá mágnẹ́ẹ̀tì tí a lò nínú ìṣùpọ̀ dígí mu.
Àpẹẹrẹ àwọn àwòrán tó ń fi MP5 hàn nínú trachea eku tó ní ìpalára.(a) A máa ń lo magnétì náà láti gba àwọn àwòrán lókè àti sí òsì trachea, lẹ́yìn náà (b) lẹ́yìn tí a bá ti gbé magnétì náà sí ọ̀tún. Àpótí pupa náà ní ìgbéga tó ń mú ìyàtọ̀ wá. Àwọn àwòrán wọ̀nyí wá láti inú fídíò tó wà nínú Àfikún Fídíò S7:MP5.
Nígbà tí a ṣètò àwọn ọ̀pá méjèèjì ní ìtọ́sọ́nà àríwá sí gúúsù lókè àti ní ìsàlẹ̀ trachea (ìyẹn ni fífà mọ́ra; Àwòrán 3b), àwọn MP chords farahàn ní gígùn, wọ́n sì wà ní ẹ̀gbẹ́ trachea dípò lórí ojú trachea dorsal (wo Fídíò Àfikún S9:MP5). Síbẹ̀síbẹ̀, a kò rí ìfọ́pọ̀ àwọn pàtákì ní ibi kan ṣoṣo (ìyẹn, ojú dorsal ti trachea) lẹ́yìn ìfijiṣẹ́ omi nígbà tí a lo ẹ̀rọ magnet méjì, èyí tí ó sábà máa ń ṣẹlẹ̀ nígbà tí a bá lo ẹ̀rọ magnet kan ṣoṣo. Lẹ́yìn náà, nígbà tí a ṣe àtúnṣe magnet kan láti lé àwọn ọ̀pá náà padà (Àwòrán 3c), iye àwọn pàtákì tí a rí ní ojú ìwòye kò dàbí pé ó pọ̀ sí i lẹ́yìn ìfijiṣẹ́. Ṣíṣe àtúnṣe àwọn ìtòlẹ́sẹẹsẹ magnet méjì méjèèjì jẹ́ ìpèníjà nítorí agbára pápá magnet gíga tí ó ń fa tàbí títẹ̀ àwọn magnet náà, lẹ́sẹẹsẹ. Lẹ́yìn náà, a yí ètò náà padà sí magnet kan ṣoṣo tí ó jọra sí ọ̀nà atẹ́gùn ṣùgbọ́n tí ó ń kọjá nípasẹ̀ ọ̀nà atẹ́gùn ní ìwọ̀n 90 kí àwọn ìlà pápá náà lè kọjá ògiri trachea ní ìtòlẹ́sẹẹsẹ (Àwòrán 3d), ìtọ́sọ́nà tí a ṣe láti pinnu bóyá a lè rí ìdàpọ̀ pàtákì lórí ògiri ẹ̀gbẹ́.Ṣùgbọ́n, Nínú ìṣètò yìí, kò sí ìṣípò tí a lè dá mọ̀ ti ìkójọpọ̀ MP tàbí ìṣípò oofa. Ní ìbámu pẹ̀lú gbogbo àwọn àbájáde wọ̀nyí, a yan ìṣètò oofa-kanṣoṣo, ìṣètò ìtọ́sọ́nà ìpele 30 (Àwòrán 3a) fún àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ onígbèsè jínì in vivo.
Nígbà tí wọ́n ya àwòrán ẹranko náà léraléra lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ lẹ́yìn pípa ènìyàn, àìsí ìṣípo àsopọ tó ń da rú túmọ̀ sí pé a lè rí àwọn ìlà pàǹtírì tó kéré sí i àti tó kúrú nínú pápá interchondral tó ṣe kedere, “láìsí ìyípo” ní ìbámu pẹ̀lú ìṣípo ìtumọ̀ ti mágnẹ́ẹ̀tì náà. Síbẹ̀síbẹ̀, a kò lè rí wíwà àti ìṣípo àwọn pàǹtírì MP6 kedere.
Titer LV-LacZ jẹ́ 1.8 × 108 TU/ml, lẹ́yìn tí a bá da CombiMag MP (MP6) pọ̀ mọ́ 1:1, àwọn ẹranko gba ìwọ̀n tracheal 50 μl ti ọkọ̀ LV 9 × 107 TU/ml (ìyẹn ni 4.5 × 106 TU/rat). Nínú àwọn ìwádìí wọ̀nyí, dípò tí a bá fi túmọ̀ mágnẹ́ẹ̀tì nígbà ìrọbí, a fi mágnẹ́ẹ̀tì náà sí ipò kan láti pinnu bóyá a lè mú kí LV transduction (a) sunwọ̀n sí i ní ìfiwéra pẹ̀lú ìfiránṣẹ́ vector ní àìsí pápá mágnẹ́ẹ̀tì, àti (b) a lè fi àwọn sẹ́ẹ̀lì afẹ́fẹ́ sí àwọn agbègbè ibi-afẹ́fẹ́ magnetic ti òkè.
Wíwà àwọn oofa àti lílo CombiMag tí a so pọ̀ mọ́ àwọn ofa LV kò dà bí ẹni pé ó ní àwọn ipa búburú lórí ìlera ẹranko, gẹ́gẹ́ bí ìlànà ìfijiṣẹ́ ofa LV wa ti ṣe. Àwọn àwòrán iwájú ti agbègbè tracheal tí a fi agbára ìdàrúdàpọ̀ ẹ̀rọ ṣe (Àfikún Àwòrán 1) fihàn pé àwọn ipele transduction tí ó ga jùlọ wà nínú ẹgbẹ́ àwọn ẹranko tí a fi LV-MP tọ́jú nígbà tí oofa náà wà (Àwòrán 9a). Ìwọ̀n díẹ̀ ti àwọ̀ LacZ aláwọ̀ búlúù ni ó wà nínú ẹgbẹ́ ìṣàkóso (Àwòrán 9b). Ìwọ̀n àwọn agbègbè tí ó ní àwọ̀ X-Gal tí a ṣe déédéé fihàn pé ìtọ́jú LV-MP ní iwájú pápá oofa mú ìdàgbàsókè ìlọ́po mẹ́fà wá (Àwòrán 9c).
Àpẹẹrẹ àwọn àwòrán àpapọ̀ tí ó ń fi ìyípadà tracheal hàn nípasẹ̀ LV-MP (a) ní iwájú pápá oofa àti (b) ní àìsí oofa. (c) Ìdàgbàsókè pàtàkì nínú agbègbè ìyípadà LacZ tí a ṣe déédéé nínú trachea nígbà tí a bá ń lo oofa (*p = 0.029, ìdánwò t, n = 3 fún ẹgbẹ́ kọ̀ọ̀kan, àròpọ̀ ± SEM).
Àwọn apá tí ó ní àwọ̀ pupa tí ó yára yípadà (àpẹẹrẹ tí a fihàn nínú Àfikún Àwòrán 2) fi àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ní àwọ̀ LacZ hàn ní ìrísí àti ipò kan náà gẹ́gẹ́ bí a ti ròyìn tẹ́lẹ̀.
Ìpèníjà pàtàkì fún ìtọ́jú jínì afẹ́fẹ́ ni wíwà àwọn èròjà tí ń gbé ọkọ̀ sí àwọn agbègbè tí ó wù ú àti ṣíṣe àṣeyọrí ìṣiṣẹ́ gíga nínú ẹ̀dọ̀fóró tí ń gbé ọkọ̀ nígbà tí afẹ́fẹ́ bá ń lọ àti píparẹ́ omi ara. Fún àwọn olùgbé LV tí a ṣe láti tọ́jú àrùn afẹ́fẹ́ CF, mímú àkókò ibùgbé àwọn èròjà tí ń gbé ọkọ̀ sínú àwọn ọ̀nà afẹ́fẹ́ tí ń ṣe iṣẹ́ pọ̀ sí i ti jẹ́ àfojúsùn tí kò ṣeé gbẹ́kẹ̀lé. Gẹ́gẹ́ bí Castellani àti àwọn ẹlòmíràn ti sọ, lílo àwọn pápá oofa láti mú kí ìṣiṣẹ́ ọkọ̀ sunwọ̀n sí i ní àwọn àǹfààní ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ọ̀nà ìfiránṣẹ́ jínì mìíràn bíi electroporation, nítorí ó lè so ìrọ̀rùn, ìnáwó-dínkù, ìbílẹ̀ ìfiránṣẹ́, ìṣiṣẹ́ tí ó pọ̀ sí i, àti àkókò ìbímọ kúkúrú, àti bóyá ìwọ̀n ìṣiṣẹ́ ọkọ̀ tí ó kéré sí i. Síbẹ̀síbẹ̀, a kò tíì ṣàlàyé ìpamọ́ àti ìwà àwọn èròjà oofa nínú àwọn ọ̀nà afẹ́fẹ́ lábẹ́ ipa agbára oofa òde, bẹ́ẹ̀ ni a kò tíì fihàn pé ọ̀nà yìí ṣeé ṣe ní vivo láti mú kí ipele ìfihàn jínì pọ̀ sí i ní àwọn ọ̀nà afẹ́fẹ́ alààyè tí ó wà ní ipò pípé.
Àwọn ìwádìí PCXI synchrotron in vitro wa fihàn pé gbogbo àwọn èròjà tí a dán wò, àyàfi polystyrene MP, ni a rí nínú ètò àwòrán tí a lò. Níwájú pápá mágnẹ́ẹ̀tì kan, àwọn MP máa ń ṣe àwọn okùn tí gígùn wọn ní í ṣe pẹ̀lú irú èròjà àti agbára pápá mágnẹ́ẹ̀tì (ìyẹn ni ìsúnmọ́ àti ìṣípo mágnẹ́ẹ̀tì náà). Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn ní Àwòrán 10, àwọn okùn tí a rí ni a ṣẹ̀dá nítorí pé èròjà kọ̀ọ̀kan ni a yọ́ mọ́ tí ó sì ń fa pápá mágnẹ́ẹ̀tì ti ara rẹ̀. Àwọn pápá ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ wọ̀nyí máa ń fa kí àwọn èròjà mìíràn tí ó jọra jọra láti so pọ̀, pẹ̀lú àwọn ìṣípo bí okùn ẹgbẹ́ nítorí agbára agbègbè láti inú agbára ìfàmọ́ra àti ìríra ti àwọn èròjà mìíràn.
Àwòrán tí ó ń fi (a,b) àwọn ọkọ̀ ojú irin pàǹtí tí a ń gbé jáde nínú àwọn capillaries tí omi kún àti (c,d) trachea tí afẹ́fẹ́ kún. Ṣàkíyèsí pé àwọn capillaries àti trachea kò fa sí ìwọ̀n. Pánẹ́lì (a) tún ní àpèjúwe MP, èyí tí ó ní àwọn patikulu Fe3O4 tí a ṣètò ní àwọn okùn.
Nígbà tí wọ́n gbé mágnẹ́ẹ̀tì sókè orí ìsàlẹ̀, igun okùn pàǹtí náà dé ààlà pàtàkì fún MP3-5 tí ó ní Fe3O4, lẹ́yìn èyí ni okùn pàǹtí náà kò dúró sí ipò àkọ́kọ́ mọ́, ṣùgbọ́n ó gbéra ní ojú ilẹ̀ sí ipò tuntun.magnet. Ó ṣeé ṣe kí ipa yìí ṣẹlẹ̀ nítorí pé ojú ìsàlẹ̀ gíláàsì náà rọrùn tó láti jẹ́ kí ìṣípo yìí ṣẹlẹ̀. Ohun tó yani lẹ́nu ni pé, MP6 (CombiMag) kò hùwà báyìí, bóyá nítorí pé àwọn pàǹtí náà kéré sí i, wọ́n ní oríṣiríṣi ìbòrí tàbí agbára ojú ilẹ̀, tàbí omi ìgbálẹ̀ tí ó ní agbára láti gbé. Ìyàtọ̀ àwòrán àwọn pàǹtí CombiMag náà tún jẹ́ aláìlera, èyí tí ó fihàn pé omi àti pàǹtí náà lè ní ìwọ̀n kan náà, nítorí náà wọn kò lè rìn sí ara wọn. Àwọn pàǹtí náà tún lè di mọ́ tí mágnẹ́ẹ̀tì náà bá yára jù, èyí tí ó fihàn pé agbára pàǹtí náà kò lè borí ìfọ́pọ̀ láàárín àwọn pàǹtí nínú omi náà nígbà gbogbo, èyí tí ó fihàn pé bóyá kò yani lẹ́nu pé agbára pàǹtí náà àti ìjìnnà láàrín mágnẹ́ẹ̀tì àti agbègbè ibi tí a fojú sí ṣe pàtàkì púpọ̀. Ní ti gbogbogbòò, àwọn àbájáde wọ̀nyí tún fihàn pé, bó tilẹ̀ jẹ́ pé mágnẹ́ẹ̀tì lè gba ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn MP tí ń ṣàn la agbègbè ibi tí a fojú sí, kò ṣeé ṣe kí a gbẹ́kẹ̀lé mágnẹ́ẹ̀tì náà. láti gbé àwọn èròjà CombiMag sí ojú ọ̀nà trachea. Nítorí náà, a parí èrò sí pé nínú ìwádìí LV-MP, ó yẹ kí a lo àwọn pápá magnetic static láti fojú sí àwọn agbègbè pàtó kan ti igi afẹ́fẹ́.
Nígbà tí a bá gbé àwọn èròjà inú ara jáde, ó ṣòro láti dá wọn mọ̀ ní ìbámu pẹ̀lú àsopọ ara tí ó díjú, ṣùgbọ́n agbára láti ṣàwárí wọn ni a mú pọ̀ sí i nípa títúmọ̀ oofa ní ìlà òkè trachea láti “yí” àwọn okùn MP. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ó ṣeé ṣe láti ṣe àwòrán láàyè, ó rọrùn láti mọ ìṣípo èròjà nígbà tí a bá ti pa ẹranko náà lọ́nà tí ó dára. Ìwọ̀n MP sábà máa ń ga jùlọ ní ibi yìí nígbà tí oofa bá wà ní òkè agbègbè àwòrán, bó tilẹ̀ jẹ́ pé a sábà máa ń rí àwọn èròjà kan ní apá ibi tí ó jìnnà sí trachea. Ní ìyàtọ̀ sí àwọn ìwádìí in vitro, a kò lè fa àwọn èròjà náà ní apá ibi tí ó wà nípa títúmọ̀ oofa náà. Wíwá yìí bá bí muca tí ó bo ojú trachea ṣe máa ń ṣe àwọn èròjà tí a fà sínú, tí ó máa ń dì wọ́n mú nínú muca, lẹ́yìn náà ni mucociliary clearing mechanism yóò ṣe mú wọn kúrò.
A ṣe àbájáde pé lílo àwọn mágnẹ́ẹ̀tì fún ìfàmọ́ra lókè àti ní ìsàlẹ̀ trachea (Àwòrán 3b) lè yọrí sí pápá mágnẹ́ẹ̀tì tó dọ́gba, dípò pápá mágnẹ́ẹ̀tì tó wọ́pọ̀ ní àkókò kan, tó lè yọrí sí ìpínkiri àwọn pàtákì tó dọ́gba. Síbẹ̀síbẹ̀, ìwádìí wa àkọ́kọ́ kò rí ẹ̀rí tó ṣe kedere láti ṣètìlẹ́yìn fún àbá yìí. Bákan náà, ṣíṣètò méjì mágnẹ́ẹ̀tì láti lé (Àwòrán 3c) kò yọrí sí ìfipamọ́ pàtákì púpọ̀ sí i ní agbègbè àwòrán náà. Àwọn àwárí méjì wọ̀nyí fihàn pé ṣíṣètò mágnẹ́ẹ̀tì méjì kò mú kí ìṣàkóso àgbègbè ti ìfọkànsí MP sunwọ̀n sí i, àti pé agbára mágnẹ́ẹ̀tì tó lágbára tó yọrí sí ṣòro láti ṣètò, èyí tó mú kí ọ̀nà yìí má wúlò mọ́. Bákan náà, ṣíṣàfihàn mágnẹ́ẹ̀tì lókè àti nípasẹ̀ trachea (Àwòrán 3d) kò mú iye àwọn pàtákì tó wà ní agbègbè àwòrán náà pọ̀ sí i. Díẹ̀ lára ​​àwọn ìṣètò mìíràn wọ̀nyí lè má ṣe àṣeyọrí nítorí wọ́n ń yọrí sí agbára mágnẹ́ẹ̀tì tó kéré síi láàárín agbègbè ìkópamọ́ náà. Nítorí náà, ìṣètò mágnẹ́ẹ̀tì onígun 30-degree kan (Àwòrán 3a) ni a kà sí ọ̀nà tó rọrùn jùlọ àti tó munadoko jùlọ fún ìdánwò in vivo.
Ìwádìí LV-MP fihàn pé nígbà tí a bá so àwọn vector LV pọ̀ mọ́ CombiMag tí a sì fi ránṣẹ́ lẹ́yìn ìdàrúdàpọ̀ ara ní iwájú pápá oofa, ipele transduction pọ̀ sí i ní trachea ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ìṣàkóso. Ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ àwòrán synchrotron àti àwọn àbájáde LacZ, pápá oofa náà hàn gbangba pé ó lè pa LV mọ́ nínú trachea kí ó sì dín iye àwọn patikulu vector tí ó wọ inú ẹ̀dọ̀fóró lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ kù. Irú àwọn àtúnṣe ìfojúsùn bẹ́ẹ̀ lè yọrí sí agbára gíga nígbàtí ó ń dín àwọn titers tí a fi ránṣẹ́ kù, transduction tí kò ní àfojúsùn, àwọn ipa ìgbóná ara àti ti ajẹsara, àti iye owó tí ń gbé jínì. Ní pàtàkì, gẹ́gẹ́ bí olùpèsè ti sọ, a lè lo CombiMag ní ìsopọ̀ pẹ̀lú àwọn ọ̀nà ìgbésẹ̀ jínì mìíràn, títí kan àwọn vector viral mìíràn (bíi AAV) àti nucleic acids.