Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünde CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteğin sağlanması için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Gözenekli silika parçacıkları, makro gözenekli parçacıklar elde etmek için bazı değişikliklerle bir sol-jel yöntemi ile hazırlandı. Bu parçacıklar, polistiren (PMP) sabit fazının N-fenilmaleimit ara katmanını hazırlamak için N-fenilmaleimit-metilvinilizosiyanat (PMI) ve stiren ile geri dönüşümlü ekleme parçalanma zincir transferi (RAFT) polimerizasyonu ile türetildi. Dar delikli paslanmaz çelik kolonlar (100 × 1,8 mm iç çap) bulamaç paketleme ile dolduruldu. Beş peptitten (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin enkefalin) oluşan bir peptit karışımının PMP kolon ayrımı değerlendirildi (kromatografik performans) ve insan serum albümininin (HAS) tripsin sindirimi. Optimal elüsyon koşulları altında, peptit karışımının teorik plaka sayısı 280.000 kadar yüksektir plaka/m². Geliştirilen kolonun ayırma performansı ticari Ascentis Express RP-Amide kolonu ile karşılaştırıldığında, PMP kolonunun ayırma performansının ayırma verimliliği ve çözünürlüğü açısından ticari kolondan daha üstün olduğu gözlenmiştir.
Son yıllarda, biyofarmasötik endüstrisi pazar payında önemli bir artışla genişleyen küresel bir pazar haline gelmiştir. Biyofarmasötik endüstrisinin patlayıcı büyümesiyle1,2,3, peptit ve proteinlerin analizi oldukça arzu edilmektedir. Hedef peptide ek olarak, peptit sentezi sırasında çeşitli safsızlıklar oluşur ve bu nedenle istenen saflıkta peptitler elde etmek için kromatografik saflaştırma gerekir. Vücut sıvıları, dokular ve hücrelerdeki proteinlerin analizi ve karakterizasyonu, tek bir numunede potansiyel olarak tespit edilebilir çok sayıda tür olması nedeniyle son derece zorlu bir görevdir. Kütle spektrometrisi peptit ve protein dizilimi için etkili bir araç olmasına rağmen, bu tür numuneler tek geçişte kütle spektrometresine enjekte edilirse, ayırma ideal olmayacaktır. Bu sorun, MS analizinden önce sıvı kromatografisi (LC) ayırmaları uygulanarak hafifletilebilir; bu, belirli bir zamanda kütle spektrometresine giren analit sayısını azaltacaktır4,5,6. Ek olarak, sıvı faz ayırma sırasında, analitler dar bölgelere odaklanabilir ve böylece bu Analitler ve MS tespit hassasiyetinin iyileştirilmesi. Sıvı kromatografisi (LC) son on yılda önemli ölçüde ilerlemiş ve proteomik analizde popüler bir teknik haline gelmiştir7,8,9,10.
Ters fazlı sıvı kromatografisi (RP-LC), sabit faz olarak oktadeasil modifiye silika (ODS) kullanılarak peptit karışımlarının saflaştırılması ve ayrılması için yaygın olarak kullanılır11,12,13. Bununla birlikte, RP sabit fazları karmaşık yapıları ve amfifilik doğaları nedeniyle peptitlerin ve proteinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlamaz14,15. Bu nedenle, polar ve polar olmayan kısımlara sahip peptitleri ve proteinleri analiz etmek ve bu analitlerle etkileşime girmek ve bunları tutmak için özel olarak tasarlanmış sabit fazlara ihtiyaç vardır16. Çok modlu etkileşimler sağlayan karışık modlu kromatografi, peptitlerin, proteinlerin ve diğer karmaşık karışımların ayrılması için RP-LC'ye bir alternatif olabilir. Birkaç karışık modlu sabit faz hazırlanmıştır ve bu fazlarla dolu kolonlar peptit ve protein ayırmaları için kullanılmıştır17,18,19,20,21. Karışık modlu sabit fazlar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar interkalasyon/RPLC) hem polar hem de polar olmayan grupların varlığı nedeniyle peptit ve protein ayrımları için uygundur22,23,24,25,26,27,28. Benzer şekilde, kovalent olarak bağlı polar gruplara sahip polar interkalasyonlu sabit fazlar, ayırma analit ile sabit faz arasındaki etkileşime bağlı olduğundan, polar ve polar olmayan analitler için iyi bir ayırma gücü ve benzersiz seçicilik gösterir. Çok modlu etkileşimler 29, 30, 31, 32. Son zamanlarda, Zhang ve ark. 30 dodesil sonlandırılmış bir poliamin sabit fazı hazırladı ve hidrokarbonları, antidepresanları, flavonoidleri, nükleozitleri, östrojenleri ve diğer birkaç analiti başarıyla ayırdı. Polar ara katlayıcı hem polar hem de polar olmayan gruplara sahiptir, bu nedenle hem hidrofobik hem de hidrofilik kısımlara sahip peptitleri ve proteinleri ayırmak için kullanılabilir. Polar gömülü kolonlar (örneğin, amid gömülü C18 kolonlar) Ascentis Express RP-Amide kolonları ticari adı altında ticari olarak mevcuttur, ancak bu kolonlar yalnızca amin 33 analizi için kullanılır.
Mevcut çalışmada, polar gömülü sabit faz (N-fenilmaleimid gömülü polistiren) hazırlandı ve HSA'nın peptit ve tripsin sindirimlerinin ayrılması için değerlendirildi. Sabit faz aşağıdaki strateji kullanılarak hazırlandı. Gözenekli silika parçacıkları, hazırlama protokolünde bazı değişiklikler yapılarak önceki yayınımızda verilen prosedüre göre hazırlandı. Üre, polietilen glikol (PEG), TMOS, su asetik asit oranı, büyük gözenek boyutuna sahip silika parçacıkları hazırlamak için ayarlandı. İkinci olarak, yeni bir ligand olan fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat sentezlendi ve polar gömülü sabit faz hazırlamak için silika parçacıklarını türetmek için kullanıldı. Elde edilen sabit faz, optimize edilmiş paketleme şeması kullanılarak paslanmaz çelik bir kolona (100 × 1,8 mm iç çap) dolduruldu. Kolon paketlemesi, kolon içinde homojen bir yatak oluşmasını sağlamak için mekanik titreşimle desteklenir. Beş peptitten oluşan peptit karışımlarının paketlenmiş kolon ayrımını değerlendirin; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Lösin Enkefalin) ve insan serum albümininin (HAS) Tripsin sindirimi. HSA'nın peptit karışımı ve tripsin sindiriminin iyi çözünürlük ve verimlilikle ayrıldığı gözlemlendi. PMP kolonunun ayırma performansı Ascentis Express RP-Amide kolonunun performansıyla karşılaştırıldı. Hem peptitlerin hem de proteinlerin PMP kolonunda iyi çözünürlük ve verimlilikle gözlemlendiği, bunun Ascentis Express RP-Amide kolonundan daha verimli olduğu görüldü.
PEG (Polietilen Glikol), Üre, Asetik Asit, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilan (TMCS), Tripsin, İnsan Serumu Albümini (HSA), Amonyum Klorür, Üre, Hekzan Metildisilazan (HMDS), Metakriloil Klorür (MC), Stiren, 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoil Peroksit (BPO), HPLC Sınıfı Asetonitril (ACN), Metanol, 2-Propanol ve Aseton Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) satın alındı.
Üre (8 g), polietilen glikol (8 g) ve 8 mL 0,01 N asetik asit karışımı 10 dakika karıştırıldı ve daha sonra buna buz gibi soğuk koşullar altında 24 mL TMOS eklendi. Reaksiyon karışımı paslanmaz çelik bir otoklavda 40 °C'de 6 saat ve ardından 120 °C'de 8 saat ısıtıldı. Su döküldü ve kalan malzeme 70 °C'de 12 saat kurutuldu. Kurutulmuş yumuşak kütle bir fırında pürüzsüz öğütüldü ve 550 °C'de 12 saat kalsine edildi. Üç parti hazırlandı ve parçacık boyutu, gözenek boyutu ve yüzey alanındaki tekrarlanabilirliği incelemek için karakterize edildi.
Silika parçacıklarının önceden sentezlenmiş ligand fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) ile yüzey modifikasyonu ve ardından stiren ile radyal polimerizasyon ile polar grup içeren bir bileşik hazırlandı. Agregalar ve polistiren zincirleri için sabit faz. Hazırlama süreci aşağıda açıklanmıştır.
N-fenilmaleimid (200 mg) ve metil vinil izosiyanat (100 mg) kuru toluende çözüldü ve fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat kopolimeri (PMCP) hazırlamak için reaksiyon kabına 0,1 mL 2,2'-azoizobutironitril (AIBN) eklendi. Karışım 60°C'de 3 saat ısıtıldı, süzüldü ve 40°C'de bir fırında 3 saat kurutuldu.
Kurutulmuş silika parçacıkları (2 g) kuru toluende (100 mL) dağıtıldı, karıştırıldı ve 500 mL'lik yuvarlak tabanlı bir balonda 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutuldu. PMCP (10 mg) toluende çözüldü ve bir damlatma hunisi aracılığıyla reaksiyon balonuna damla damla eklendi. Karışım 100 °C'de 8 saat geri akıtıldı, süzüldü ve asetonla yıkandı ve 60 °C'de 3 saat kurutuldu. Daha sonra, PMCP ile bağlı silika parçacıkları (100 g) toluende (200 ml) çözüldü ve katalizör olarak 100 µL dibutiltin dilaurat varlığında 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) eklendi. Karışım 50 °C'de 8 saat karıştırıldı, süzüldü ve 50 °C'de 3 saat kurutuldu.
Stiren (1 mL), benzoil peroksit BPO (0,5 mL) ve TEMPO-PMCP bağlı silika parçacıkları (1,5 g) toluen içinde dağıtıldı ve nitrojenle temizlendi. Stirenin polimerizasyonu 100°C'de 12 saat gerçekleştirildi. Elde edilen ürün metanol ile yıkandı ve 60°C'de bir gece kurutuldu. Genel reaksiyon şeması Şekil 1'de gösterilmektedir.
Numuneler, 10-3 Torr'dan daha düşük bir kalıntı basınç elde etmek için 1 saat boyunca 393 K'de gazı alındı. P/P0 = 0,99'luk bir bağıl basınçta adsorbe edilen N2 miktarı, toplam gözenek hacmini belirlemek için kullanıldı. Çıplak ve ligand bağlı silika parçacıklarının morfolojisi, taramalı elektron mikroskobu (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japonya) ile incelendi. Kurutulmuş numuneler (çıplak silika ve ligand bağlı silika parçacıkları), yapışkan karbon bant kullanılarak bir alüminyum kolona yerleştirildi. Numuneler üzerine Q150T püskürtme kaplayıcı kullanılarak altın kaplandı ve numuneler üzerine 5 nm Au tabakası biriktirildi. Bu, düşük voltajlar kullanılarak işlem verimliliğini artırır ve ince taneli, soğuk püskürtme sağlar. Element analizi için bir Thermo Electron (Waltham, MA, ABD) Flash EA1112 element analizörü kullanıldı. Parçacık boyutunu elde etmek için bir Malvern (Worcestershire, İngiltere) Mastersizer 2000 parçacık boyutu analizörü kullanıldı Dağıtım. Çıplak silika parçacıkları ve ligand bağlı silika parçacıkları (her biri 5 mg), 5 mL izopropanol içinde dağıtıldı, 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutuldu, 5 dakika boyunca vortekslendi ve Mastersizer'ın optik tezgahına yerleştirildi. Termogravimetrik analiz, 30 ila 800 °C'lik bir sıcaklık aralığında dakikada 5 °C'lik bir hızla gerçekleştirildi.
Boyutları (100 × 1,8 mm iç çap) olan cam astarlı paslanmaz çelik dar delikli kolonlar, Ref. 1'de kullanılan aynı prosedür uygulanarak bulamaç paketleme yöntemi kullanılarak paketlendi. 31. 1 µm frit içeren bir çıkış bağlantısına sahip paslanmaz çelik bir kolon (cam astarlı, 100 × 1,8 mm iç çap) bir bulamaç paketleyiciye (Alltech Deerfield, IL, ABD) bağlandı. 1,2 mL metanolde 150 mg sabit faz süspanse ederek sabit faz bulamacı hazırlayın ve depolama kolonuna gönderin. Metanol, bulamaç çözücüsü ve itici çözücü olarak kullanıldı. Kolonu sırayla 10 dakika boyunca 100 MP, 15 dakika boyunca 80 MP ve 30 dakika boyunca 60 MP basınç uygulayarak doldurun. Paketleme sırasında, kolonun düzgün bir şekilde paketlenmesini sağlamak için iki GC kolon sallayıcısı (Alltech, Deerfield, IL, ABD) ile mekanik titreşim uygulandı. Bulamaç paketleyiciyi kapatın ve kolonda herhangi bir hasar oluşmasını önlemek için basıncı yavaşça serbest bırakın. Kolonu bulamaç paketleme ünitesinden ayırın ve başka bir Girişe ve LC sistemine takılarak performansının kontrol edilmesi.
Bir LC pompası (10AD Shimadzu, Japonya), 50nL enjeksiyon halkalı enjektör (Valco (ABD) C14 W.05), membran gaz giderici (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kılcal pencere, Özel µLC cihaz dedektörü (UV-2075) ve cam astarlı mikrokolonlar oluşturuldu. Ekstra kolon bandı genişlemesinin etkisini en aza indirmek için çok dar ve kısa bağlantı boruları kullanın. Paketlemeden sonra, kılcal damarlar (50 μm id 365 ve indirgeyici birleşim kılcal damarları (50 μm), indirgeyici birleşim noktasının 1/16″ çıkışına yerleştirildi. Veri toplama ve kromatografik işleme Multichro 2000 yazılımı kullanılarak yapıldı. 254 nm'de izleme Analitler UV absorbansı açısından test edildi. Kromatografik veriler OriginPro8 (Northampton, MA) ile analiz edildi.
İnsan serumundan albumin, liyofilize toz, ≥ %96 (agaros jel elektroforezi) 3 mg, tripsin (1,5 mg), 4,0 M üre (1 mL) ve 0,2 M amonyum bikarbonat (1 mL) ile karıştırıldı. Çözelti 10 dakika karıştırıldı ve 6 saat boyunca 37 °C'de bir su banyosunda tutuldu, ardından 1 mL %0,1 TFA ile söndürüldü. Çözeltiyi süzün ve 4 °C'nin altında saklayın.
Peptit karışımlarının ve HSA tripsin özetlerinin ayrılması PMP kolonlarında ayrı ayrı değerlendirildi. HSA'nın peptit karışımı ve tripsin özetinin PMP kolonu ile ayrılmasını kontrol edin ve sonuçları Ascentis Express RP-Amide kolonu ile karşılaştırın. Teorik plaka numarası aşağıdaki şekilde hesaplanır:
Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının SEM görüntüleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Çıplak silika parçacıklarının (A, B) SEM görüntüleri, önceki çalışmalarımızın aksine, bu parçacıkların parçacıkların uzamış olduğu veya düzensiz simetriye sahip olduğu küresel olduğunu göstermektedir. Ligand bağlı silika parçacıklarının (C, D) yüzeyi, çıplak silika parçacıklarının yüzeyinden daha pürüzsüzdür; bu, silika parçacıklarının yüzeyindeki polistiren zincirlerinin kaplamasından kaynaklanıyor olabilir.
Çıplak silika parçacıklarının (A, B) ve ligand bağlı silika parçacıklarının (C, D) taramalı elektron mikroskobu görüntüleri.
Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılımları Şekil 3(A)'da gösterilmiştir. Hacim bazlı parçacık boyutu dağılım eğrileri, silika parçacıklarının boyutunun kimyasal modifikasyondan sonra arttığını göstermiştir (Şekil 3A). Mevcut çalışmadan ve önceki çalışmadan elde edilen silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılım verileri Tablo 1(A)'da karşılaştırılmıştır. PMP'nin hacim bazlı parçacık boyutu, d(0,5), 3,05 μm'lik ad(0,5) değerine sahip önceki çalışmamıza kıyasla 3,36 μm'dir (polistiren bağlı silika parçacıkları)34. Bu parti, reaksiyon karışımındaki PEG, üre, TMOS ve asetik asitin değişen oranları nedeniyle önceki çalışmamıza kıyasla daha dar bir parçacık boyutu dağılımına sahipti. PMP fazının parçacık boyutu, daha önce incelediğimiz polistiren bağlı silika parçacık fazından biraz daha büyüktür. Bu, silika parçacıklarının stirenle yüzey fonksiyonelleştirilmesinin yalnızca bir polistiren tabakası (0,97 Silika yüzeyinde tabaka kalınlığı µm iken, PMP fazında tabaka kalınlığı 1,38 µm'dir.
Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılımı (A) ve gözenek boyutu dağılımı (B).
Mevcut çalışmada kullanılan silika parçacıklarının gözenek boyutu, gözenek hacmi ve yüzey alanı Tablo 1(B)'de verilmiştir. Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının PSD profilleri Şekil 3(B)'de gösterilmiştir. Sonuçlar önceki çalışmamızla karşılaştırılabilir. Çıplak ve ligand bağlı silika parçacıklarının gözenek boyutları sırasıyla 310 ve 241'dir; bu da Tablo 1(B)'de gösterildiği gibi kimyasal modifikasyondan sonra gözenek boyutunun %69 azaldığını ve eğrinin değişimi Şekil 3(B)'de gösterilmiştir. Benzer şekilde, kimyasal modifikasyondan sonra silika parçacıklarının gözenek hacmi 0,67'den 0,58 cm3/g'a düşmüştür. Mevcut olarak incelenen silika parçacıklarının özgül yüzey alanı 116 m2/g'dır; bu da önceki çalışmamızla (124 m2/g) karşılaştırılabilir. Tablo 1(B)'de gösterildiği gibi, silika parçacıklarının yüzey alanı (m2/g) da 116 m2/g'dan 105 Kimyasal modifikasyondan sonra m2/g.
Sabit fazın elementel analiz sonuçları Tablo 2'de gösterilmiştir. Mevcut sabit fazın karbon yüklemesi %6,35'tir ve bu önceki çalışmamızın karbon yüklemesinden (polistiren bağlı silika parçacıkları, sırasıyla %7,9335 ve %10,21) daha düşüktür 42. Mevcut sabit fazın karbon yüklemesi düşüktür, Çünkü mevcut SP'nin hazırlanmasında stirene ek olarak fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) ve 4-hidroksi-TEMPO gibi bazı polar ligandlar kullanılmıştır. Mevcut sabit fazın azot ağırlık yüzdesi, önceki çalışmalarda sırasıyla %0,1735 ve %0,85 ağırlıkla azot ile karşılaştırıldığında %2,21'dir. Bu, fenilmaleimid nedeniyle mevcut sabit fazda azot ağırlık yüzdesinin daha yüksek olduğu anlamına gelir. Benzer şekilde, (4) ve (5) ürünlerinin karbon yüklemeleri sırasıyla %2,7 ve %2,9 iken, Son ürün (6), Tablo 2'de gösterildiği gibi %6,35'ti. Ağırlık kaybı, PMP sabit fazı ile kontrol edildi ve TGA eğrisi Şekil 4'te gösterildi. TGA eğrisi, ligandların yalnızca C değil aynı zamanda N, O ve H de içermesi nedeniyle karbon yüklemesiyle (%6,35) iyi bir uyum içinde olan %8,6'lık bir ağırlık kaybı gösteriyor.
Fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat ligandı, polar fenilmaleimid grupları ve vinilizosiyanat grupları içerdiği için silika parçacıklarının yüzey modifikasyonu için seçilmiştir. Vinil izosiyanat grupları, yaşayan radikal polimerizasyonu yoluyla stiren ile daha fazla reaksiyona girebilir. İkinci neden, analit ile orta düzeyde etkileşime sahip olan ve analit ile durağan faz arasında güçlü bir elektrostatik etkileşimi olmayan bir grup eklemektir, çünkü fenilmaleimid kısmının normal pH'ta sanal yükü yoktur. Durağan fazın polaritesi, optimum stiren miktarı ve serbest radikal polimerizasyonunun reaksiyon süresi ile kontrol edilebilir. Reaksiyonun son adımı (serbest radikal polimerizasyonu) kritiktir ve durağan fazın polaritesini değiştirebilir. Bu durağan fazların karbon yüklemesini kontrol etmek için element analizi yapıldı. Stiren miktarının ve reaksiyon süresinin artırılmasının durağan fazın karbon yüklemesini artırdığı ve bunun tersinin de geçerli olduğu gözlemlendi. Farklı stiren konsantrasyonları ile hazırlanan SP'ler farklı karbon yüklemelerine sahiptir. Yine, bu durağan fazları yükleyin fazlar paslanmaz çelik kolonlara aktarılarak kromatografik performansları (seçicilik, çözünürlük, N değeri, vb.) kontrol edildi. Bu deneylere dayanarak, kontrollü polarite ve iyi analit tutulumu sağlamak için PMP sabit fazını hazırlamak üzere optimize edilmiş bir formülasyon seçildi.
Ayrıca, mobil faz kullanan bir PMP kolonu kullanılarak beş peptit karışımı (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin enkefalin) değerlendirildi; 80 μL/dk akış hızında 60/40 (h/h) asetonitril/su (%0,1 TFA).Optimum elüsyon koşulları altında, kolon başına (100 × 1,8 mm iç çap) teorik plaka sayısı (N) 20.000 ± 100'dür (200.000 plaka/m²).Tablo 3, üç PMP kolonu için N değerlerini verir ve kromatogramlar Şekil 5A'da gösterilir.Yüksek akış hızında (700 μL/dk) bir PMP kolonunda hızlı analiz, beş peptit bir dakika içinde elüe edildi, N değerleri çok iyiydi, kolon başına 13.500 ± 330 (100 × 1,8 mm iç çap), 135.000 plaka/m²'ye karşılık gelir (Şekil 5B).Üç aynı boyuttaki kolon (100 × 1,8 mm id) tekrarlanabilirliği kontrol etmek için üç farklı PMP sabit faz partisi ile paketlendi. Her kolon için analit konsantrasyonu, optimum elüsyon koşulları ve teorik plaka sayısı N ve her kolonda aynı test karışımını ayırmak için tutma süresi kullanılarak kaydedildi. PMP kolonları için tekrarlanabilirlik verileri Tablo 4'te gösterilmiştir. PMP kolonunun tekrarlanabilirliği, Tablo 3'te gösterildiği gibi çok düşük %RSD değerleriyle iyi bir korelasyon göstermektedir.
PMP kolonu (B) ve Ascentis Express RP-Amid kolonu (A) üzerinde peptit karışımının ayrılması; hareketli faz 60/40 ACN/H2O (TFA %0,1), PMP kolon boyutları (100 × 1,8 mm iç çap); analitik Bileşiklerin elüsyon sırası: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ve 5 (lösin) asit enkefalin)).
İnsan serum albümininin tripsin sindirimlerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisinde ayrılması için bir PMP kolonu (100 × 1,8 mm iç çap) değerlendirildi. Şekil 6'daki kromatogram, numunenin iyi ayrıldığını ve çözünürlüğün çok iyi olduğunu göstermektedir. HSA sindirimleri, 100 µL/dakika akış hızı, mobil faz 70/30 asetonitril/su ve %0,1 TFA kullanılarak analiz edildi. Kromatogramda (Şekil 6) görüldüğü gibi, HSA sindirimi 17 peptide karşılık gelen 17 tepe noktasına bölünmüştür. HSA sindirimindeki her tepe noktasının ayırma verimliliği hesaplanmış ve değerler Tablo 5'te verilmiştir.
HSA'nın tripsin sindirimi (100 × 1,8 mm iç çap) bir PMP kolonunda ayrıldı; akış hızı (100 µL/dak), mobil faz 0,1% TFA ile 60/40 asetonitril/su.
Burada L kolon uzunluğu, η hareketli fazın viskozitesi, ΔP kolon geri basıncı ve u hareketli fazın doğrusal hızıdır. PMP kolonunun geçirgenliği 2,5 × 10-14 m2, akış hızı 25 μL/dak idi ve 60/40 v/v ACN/su kullanıldı. PMP kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap) geçirgenliği önceki çalışmamız Ref.34'e benzerdi. Yüzeysel gözenekli parçacıklarla dolu kolonun geçirgenliği: 1,3 μm parçacıklar için 1,7 × 10-15, 1,7 μm parçacıklar için 3,1 × 10-15, 2,6 μm parçacıklar için 5,2 × 10-15 ve 2,5 × 10-14 m2'dir. 5 μm parçacıklar 43.Bu nedenle PMP fazının geçirgenliği 5 μm çekirdek-kabuk parçacıklarının geçirgenliğine benzerdir.
Burada Wx kloroformla doldurulmuş kolonun ağırlığı, Wy metanolle doldurulmuş kolonun ağırlığı ve ρ çözücünün yoğunluğudur. Metanol (ρ = 0,7866) ve kloroformun (ρ = 1,484) yoğunlukları. Daha önce incelediğimiz SİLİS PARÇACIKLARI-C18 kolonlarının (100 × 1,8 mm iç çap) 34 ve C18-Üre kolonlarının 31 toplam gözenekliliği sırasıyla 0,63 ve 0,55 idi. Bu, üre ligandlarının varlığının durağan fazın geçirgenliğini azalttığı anlamına gelir. Öte yandan, PMP kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap) toplam gözenekliliği 0,60'tır. PMP kolonlarının geçirgenliği, C18-bağlı silika parçacıklarıyla doldurulmuş kolonların geçirgenliğinden daha düşüktür çünkü C18 tipi durağan fazlarda C18 ligandları silikaya bağlıdır parçacıklar doğrusal zincirler halinde iken, polistiren tipi sabit fazlarda, etrafında nispeten kalın bir polimer tabakası oluşur. Tipik bir deneyde, kolon gözenekliliği şu şekilde hesaplanır:
Şekil 7A,B, aynı elüsyon koşulları (yani, %60/40 ACN/H2O ve %0,1 TFA) kullanılarak PMP kolonu (100 × 1,8 mm iç çap) ve Ascentis Express RP-Amide kolonu (100 × 1,8 mm iç çap) göstermektedir. Seçilmiş peptit karışımları (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Lösin Enkefalin) 20 µL/dak'da hazırlandı. Her iki kolon için minimum akış hızı 800 µL/dak'dır. Optimum akış hızında (80 µL/dak) PMP kolonu ve Ascentis Express RP-Amide kolonu için minimum HETP değerleri sırasıyla 2,6 µm ve 3,9 µm'dir. HETP değerleri, PMP kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap) ayırma verimliliğinin ticari olarak satılan Ascentis Express RP-Amide kolonundan (100 × 1,8 mm iç çap) çok daha iyi olduğunu göstermektedir. Şekil 7(A)'daki van Deemter grafiği, artan akışla birlikte N değerindeki azalmanın önceki çalışmamıza kıyasla önemli olmadığını göstermektedir. Çalışma. PMP kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap) Ascentis Express RP-Amide kolonuna kıyasla daha yüksek ayırma verimliliği, mevcut çalışmada kullanılan parçacık şekli, boyutu ve karmaşık kolon paketleme prosedürlerindeki gelişmelere dayanmaktadır34.
(A) 0,1% TFA içeren 60/40 ACN/H2O'da bir PMP kolonu (100 × 1,8 mm iç çap) kullanılarak elde edilen van Deemter grafiği (HETP'ye karşı mobil faz doğrusal hızı). (B) 0,1% TFA içeren 60/40 ACN/H2O'da bir Ascentis Express RP-Amide kolonu (100 × 1,8 mm iç çap) kullanılarak elde edilen van Deemter grafiği (HETP'ye karşı mobil faz doğrusal hızı).
Polar gömülü polistiren sabit fazı hazırlandı ve yüksek performanslı sıvı kromatografisinde sentetik peptit karışımlarının ve insan serum albümininin (HAS) tripsin sindirimlerinin ayrılması için değerlendirildi. Peptit karışımları için PMP kolonlarının kromatografik performansı, ayırma verimliliği ve çözünürlük açısından mükemmeldir. PMP kolonlarının gelişmiş ayırma performansı, silika parçacıklarının parçacık boyutu ve gözenek boyutu, sabit fazın kontrollü sentezi ve karmaşık kolon paketlemesi gibi çeşitli nedenlerden kaynaklanmaktadır. Yüksek ayırma verimliliğine ek olarak, yüksek akış hızlarında düşük kolon geri basıncı, bu sabit fazın bir diğer avantajıdır. PMP kolonları iyi tekrarlanabilirlik gösterir ve peptit karışımlarının ve çeşitli proteinlerin tripsin sindiriminin analizi için kullanılabilir. Bu kolonu, sıvı kromatografisinde doğal ürünlerin, tıbbi bitkilerden elde edilen biyoaktif bileşiklerin ve mantar özütlerinin ayrılması için kullanmayı amaçlıyoruz. Gelecekte, PMP kolonları proteinlerin ve monoklonal antikorların ayrılması için de değerlendirilecektir.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ve Petersson, P. Ters Faz Kromatografisi ile Peptit Ayırma Sistemleri Üzerine Araştırma, Bölüm I: Bir Kolon Karakterizasyon Protokolünün Geliştirilmesi.J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. ve diğerleri. Bulaşıcı hastalıkların tedavisi için tasarlanmış geliştirilmiş aktif peptitler. Biyoteknoloji. Gelişmiş. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ve Khrestchatisky, M. Sentetik terapötik peptitler: bilim ve pazar. İlaç keşfi. 15 (1-2) bugün, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ve Shen, Y. Gelişmiş Proteomik Sıvı Kromatografisi.J. Kromatografi.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ve diğerleri. Gelişmiş sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi, geniş hedefli metabolomik ve proteomiklerin dahil edilmesini sağlar. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM ve Salisbury, JJ İlaç geliştirmede UHPLC'nin rolü. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Hızlı ayırmalar için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA ve Tchelitcheff, P. İlaç geliştirmede ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinin uygulanması. J. Kromatografi. 1119 (1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma. 2006.02.052 (2006).
Gu, H. ve diğerleri. Enterovirüslerin etkili bir şekilde saflaştırılması için yağ-su yüksek iç faz emülsiyonlarından hazırlanan monolitik makrogözenekli hidrojeller. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ve Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü. J. Kromatografi. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Terapötik peptit ve proteinlerin ters fazlı sıvı kromatografisi ayrımlarında ortaya çıkan eğilimler: teori ve uygulamalar. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ve Gebler, JC Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH değerleri kullanılarak bir RP-RP-HPLC sistemi kullanılarak peptitlerin iki boyutlu ayrılması. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. ve diğerleri. C18 alt-2 μm tam ve yüzeysel gözenekli parçacıklarla doldurulmuş yüksek verimli kromatografik kolonların kütle transfer özellikleri ve kinetik performansı araştırıldı. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. ve diğerleri.Bitkisel biyoaktif peptitlerin izolasyonu, tanımlanması ve doğrulanmasında son eğilimler ve analitik zorluklar.anüs.biyolojik anüs.Kimyasal.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB ve diğerleri. Yaşam krallığının proteomik manzarası. Doğa 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. ve diğerleri. Preparatif sıvı kromatografisi ile terapötik peptitlerin aşağı akış işlenmesi. Molecule (Basel, İsviçre) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Karma modlu kromatografi ve biyopolimerlere uygulanması. J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Karışık modlu protein kromatografisi için ligandlar: ilke, karakterizasyon ve tasarım.J. Biyoteknoloji.144(1), 3-11 (2009).