Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü CSS için sınırlı desteğe sahiptir. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Makrogözenekli parçacıklar elde etmek için bazı modifikasyonlarla sol-jel yöntemi kullanılarak gözenekli silika parçacıkları hazırlandı. Bu parçacıklar, N-fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PMI) ve stiren ile tersinir ilave parçalanma zincir transferi (RAFT) polimerizasyonu ile türevlendirilerek N-fenilmaleimid interkalasyonlu polistiren (PMP) sabit fazı hazırlandı. Dar çaplı paslanmaz çelik kolonlar (100 × 1,8 mm iç çap) bulamaç paketleme yöntemiyle dolduruldu. Beş peptitten (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin enkefalin) oluşan bir peptit karışımının PMP kolon ayırma performansı ve insan serum albüminin (HAS) tripsin sindirimi değerlendirildi. Optimal elüsyon koşulları altında, peptit karışımının teorik plaka sayısı 280.000'e kadar çıkmaktadır. Plaka/m². Geliştirilen kolonun ayırma performansını ticari Ascentis Express RP-Amide kolonuyla karşılaştırdığımızda, PMP kolonunun ayırma verimliliği ve çözünürlük açısından ticari kolona göre daha üstün bir performans sergilediği gözlemlenmiştir.
Son yıllarda, biyofarmasötik endüstrisi, pazar payında önemli bir artışla birlikte genişleyen küresel bir pazar haline gelmiştir. Biyofarmasötik endüstrisinin patlayıcı büyümesiyle birlikte1,2,3, peptit ve protein analizi son derece arzu edilir hale gelmiştir. Hedef peptitin yanı sıra, peptit sentezi sırasında çeşitli safsızlıklar oluşur ve bu nedenle istenen saflıkta peptitler elde etmek için kromatografik saflaştırma gereklidir. Vücut sıvılarında, dokularda ve hücrelerdeki proteinlerin analizi ve karakterizasyonu, tek bir örnekte potansiyel olarak tespit edilebilir çok sayıda tür nedeniyle son derece zorlu bir görevdir. Kütle spektrometresi, peptit ve protein dizilemesi için etkili bir araç olmasına rağmen, bu tür örnekler kütle spektrometresine tek seferde enjekte edilirse, ayırma ideal olmayacaktır. Bu sorun, MS analizinden önce sıvı kromatografisi (LC) ayırmaları uygulanarak hafifletilebilir; bu da belirli bir zamanda kütle spektrometresine giren analit sayısını azaltacaktır4,5,6. Ayrıca, sıvı faz ayırma sırasında analitler dar bölgelerde yoğunlaştırılabilir, böylece bu analitler konsantre edilir ve analiz iyileştirilir. MS algılama hassasiyeti. Sıvı kromatografisi (LC) son on yılda önemli ölçüde gelişti ve proteomik analizde popüler bir teknik haline geldi7,8,9,10.
Ters fazlı sıvı kromatografisi (RP-LC), oktadesil modifiye silika (ODS) sabit faz olarak kullanılarak peptit karışımlarının saflaştırılması ve ayrılması için yaygın olarak kullanılmaktadır11,12,13. Bununla birlikte, RP sabit fazları, karmaşık yapıları ve amfifilik doğaları nedeniyle peptitlerin ve proteinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlamaz14,15. Bu nedenle, peptitleri ve proteinleri analiz etmek için polar ve polar olmayan kısımlara sahip, bu analitlerle etkileşime giren ve onları tutan özel olarak tasarlanmış sabit fazlara ihtiyaç duyulmaktadır16. Çok modlu etkileşimler sağlayan karışık modlu kromatografi, peptitlerin, proteinlerin ve diğer karmaşık karışımların ayrılması için RP-LC'ye bir alternatif olabilir. Birçok karışık modlu sabit faz hazırlanmış ve bu fazlarla doldurulmuş kolonlar peptit ve protein ayrımı için kullanılmıştır17,18,19,20,21. Karışık modlu sabit fazlar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar) İnterkalasyon/RPLC) hem polar hem de polar olmayan grupların varlığı nedeniyle peptit ve protein ayrımı için uygundur22,23,24,25,26,27,28. Benzer şekilde, kovalent olarak bağlanmış polar gruplara sahip polar interkalasyon sabit fazları, analit ve sabit faz arasındaki etkileşime bağlı olarak ayrımın gerçekleşmesi nedeniyle, polar ve polar olmayan analitler için iyi bir ayırma gücü ve benzersiz seçicilik gösterir. Çok modlu etkileşimler 29, 30, 31, 32. Son zamanlarda Zhang ve ark. 30, dodesil uçlu bir poliamin sabit fazı hazırladı ve hidrokarbonları, antidepresanları, flavonoidleri, nükleositleri, östrojenleri ve diğer birçok analitiği başarıyla ayırdı. Polar interkalatör hem polar hem de polar olmayan gruplara sahip olduğundan, hem hidrofobik hem de hidrofilik kısımlara sahip peptitleri ve proteinleri ayırmak için kullanılabilir. Polar gömülü kolonlar (örneğin, amid gömülü C18 kolonları) Ascentis Express RP-Amide kolonları ticari adı altında piyasada mevcuttur, ancak bu kolonlar yalnızca amin 33'ün analizi için kullanılır.
Bu çalışmada, HSA'nın peptitlerinin ve tripsin sindirim ürünlerinin ayrılması için polar gömülü bir sabit faz (N-fenilmaleimid gömülü polistiren) hazırlanmış ve değerlendirilmiştir. Sabit faz aşağıdaki strateji kullanılarak hazırlanmıştır: Gözenekli silika parçacıkları, önceki yayınımızda verilen prosedüre göre, hazırlama protokolünde bazı değişiklikler yapılarak hazırlanmıştır. Üre, polietilen glikol (PEG), TMOS, su ve asetik asit oranı, geniş gözenek boyutuna sahip silika parçacıkları hazırlamak için ayarlanmıştır. İkinci olarak, yeni bir ligand olan fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat sentezlenmiş ve polar gömülü bir sabit faz hazırlamak için silika parçacıklarını türevlendirmek için kullanılmıştır. Elde edilen sabit faz, optimize edilmiş paketleme şeması kullanılarak paslanmaz çelik bir kolona (100 × 1,8 mm iç çap) paketlenmiştir. Kolon paketlemesi, kolon içinde homojen bir yatak oluşmasını sağlamak için mekanik titreşimle desteklenmiştir. Beş peptitten oluşan peptit karışımlarının paketlenmiş kolonda ayrılması değerlendirilmiştir; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Lösin Enkefalin) ve insan serum albüminin (HAS) tripsin sindirimi. Peptit karışımı ve HSA'nın tripsin sindiriminin iyi bir çözünürlük ve verimlilikle ayrıldığı gözlemlendi. PMP kolonunun ayırma performansı, Ascentis Express RP-Amide kolonu ile karşılaştırıldı. Hem peptitlerin hem de proteinlerin PMP kolonunda iyi bir şekilde ayrıştığı ve verimli olduğu gözlemlendi; bu da Ascentis Express RP-Amide kolonundan daha verimliydi.
PEG (Polietilen Glikol), Üre, Asetik Asit, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilane (TMCS), Tripsin, İnsan Serum Albümini (HSA), Amonyum Klorür, Üre, Heksan Metildisilazan (HMDS), Metakriloil Klorür (MC), Stiren, 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoil Peroksit (BPO), HPLC Sınıfı Asetonitril (ACN), Metanol, 2-Propanol ve Aseton, Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) satın alınmıştır.
8 g üre, 8 g polietilen glikol ve 8 mL 0,01 N asetik asit karışımı 10 dakika karıştırıldıktan sonra, buz gibi soğuk ortamda 24 mL TMOS ilave edildi. Reaksiyon karışımı, paslanmaz çelik bir otoklavda 40°C'de 6 saat ve ardından 120°C'de 8 saat ısıtıldı. Su süzüldü ve kalan malzeme 70°C'de 12 saat kurutuldu. Kurutulmuş yumuşak kütle fırında pürüzsüz hale getirildi ve 550°C'de 12 saat kalsine edildi. Parçacık boyutu, gözenek boyutu ve yüzey alanındaki tekrarlanabilirliği incelemek için üç parti hazırlandı ve karakterize edildi.
Silika parçacıklarının önceden sentezlenmiş ligand fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) ile yüzey modifikasyonu ve ardından stiren ile radyal polimerizasyon yoluyla, polar grup içeren bir bileşik hazırlandı. Bu bileşik, agregatlar ve polistiren zincirleri için sabit bir faz oluşturmaktadır. Hazırlama süreci aşağıda açıklanmıştır.
200 mg N-fenilmaleimid ve 100 mg metil vinil izosiyanat kuru toluende çözüldü ve reaksiyon kabına 0,1 mL 2,2′-azoizobütironitril (AIBN) eklenerek fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat kopolimeri (PMCP) hazırlandı. Karışım 60°C'de 3 saat ısıtıldı, süzüldü ve 40°C'de 3 saat fırında kurutuldu.
Kurutulmuş silika parçacıkları (2 g), 500 mL'lik yuvarlak tabanlı bir balonda 10 dakika boyunca kuru toluen (100 mL) içinde dağıtıldı, karıştırıldı ve ultrasonik işlemden geçirildi. PMCP (10 mg) toluen içinde çözüldü ve damlama hunisi yardımıyla reaksiyon balonuna damla damla eklendi. Karışım 100°C'de 8 saat boyunca geri akışa bırakıldı, süzüldü, asetonla yıkandı ve 60°C'de 3 saat kurutuldu. Daha sonra, PMCP bağlı silika parçacıkları (100 g) toluen (200 ml) içinde çözüldü ve katalizör olarak 100 µL dibutiltin dilaurat varlığında 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) eklendi. Karışım 50°C'de 8 saat boyunca karıştırıldı, süzüldü ve 50°C'de 3 saat kurutuldu.
Stiren (1 mL), benzoil peroksit BPO (0,5 mL) ve TEMPO-PMCP bağlı silika parçacıkları (1,5 g) toluen içinde dağıtıldı ve azot ile arındırıldı. Stirenin polimerizasyonu 100°C'de 12 saat boyunca gerçekleştirildi. Elde edilen ürün metanol ile yıkandı ve gece boyunca 60°C'de kurutuldu. Genel reaksiyon şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Numuneler, 10-3 Torr'dan daha düşük bir artık basınç elde etmek için 393 K'de 1 saat süreyle gazdan arındırıldı. Toplam gözenek hacmini belirlemek için P/P0 = 0,99 bağıl basıncında adsorbe edilen N2 miktarı kullanıldı. Çıplak ve ligand bağlı silika parçacıklarının morfolojisi, taramalı elektron mikroskobu (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japonya) ile incelendi. Kurutulmuş numuneler (çıplak silika ve ligand bağlı silika parçacıkları), yapışkan karbon bant kullanılarak bir alüminyum kolona yerleştirildi. Numuneler üzerine Q150T püskürtme kaplama cihazı kullanılarak altın kaplandı ve numuneler üzerine 5 nm'lik bir Au tabakası biriktirildi. Bu, düşük voltajlar kullanarak işlem verimliliğini artırır ve ince taneli, soğuk püskürtme sağlar. Elementel analiz için Thermo Electron (Waltham, MA, ABD) Flash EA1112 elementel analiz cihazı kullanıldı. Parçacık boyutunu elde etmek için Malvern (Worcestershire, İngiltere) Mastersizer 2000 parçacık boyutu analiz cihazı kullanıldı. Dağıtım. Çıplak silika parçacıkları ve ligand bağlı silika parçacıkları (her biri 5 mg) 5 mL izopropanol içinde dağıtıldı, 10 dakika boyunca ultrasonik işlemden geçirildi, 5 dakika boyunca vorteks ile karıştırıldı ve Mastersizer'ın optik tezgahına yerleştirildi. Termogravimetrik analiz, 30 ila 800 °C sıcaklık aralığında dakikada 5 °C hızla gerçekleştirildi.
(100 × 1,8 mm iç çap) boyutlarında, cam kaplı paslanmaz çelik dar çaplı kolonlar, Ref.'te kullanılan aynı prosedür uygulanarak bulamaç paketleme yöntemiyle paketlenmiştir. 31. 1 µm'lik bir filtre içeren çıkış bağlantı parçasına sahip paslanmaz çelik bir kolon (cam kaplı, 100 × 1,8 mm iç çap), bir bulamaç paketleyiciye (Alltech, Deerfield, IL, ABD) bağlandı. 150 mg sabit fazı 1,2 mL metanolde süspansiyon haline getirerek sabit faz bulamacı hazırlayın ve depolama kolonuna gönderin. Metanol, bulamaç çözücüsü ve itici çözücü olarak kullanıldı. Kolonu sırasıyla 10 dakika boyunca 100 MP, 15 dakika boyunca 80 MP ve 30 dakika boyunca 60 MP basınç uygulayarak doldurun. Paketleme sırasında, kolonun düzgün bir şekilde paketlenmesini sağlamak için iki GC kolon çalkalayıcı (Alltech, Deerfield, IL, ABD) ile mekanik titreşim uygulandı. Kolon içindeki herhangi bir hasarı önlemek için bulamaç paketleyiciyi kapatın ve basıncı yavaşça serbest bırakın. Kolonu bulamaç paketleme ünitesinden ayırın ve başka bir bağlantı parçasını bağlayın. Giriş ve LC sistemine performansını kontrol etmek için.
LC pompası (10AD Shimadzu, Japonya), 50 nL enjeksiyon döngüsüne sahip enjektör (Valco (ABD) C14 W.05), membran gaz giderici (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kılcal pencere, özel µLC cihaz dedektörü (UV-2075) ve cam kaplı mikrokolonlar kullanılarak bir sistem oluşturuldu. Ek kolon bant genişlemesinin etkisini en aza indirmek için çok dar ve kısa bağlantı boruları kullanıldı. Paketlemeden sonra, kılcal borular (50 μm iç çap 365) ve indirgeyici rakor kılcal boruları (50 μm), indirgeyici rakorun 1/16″ çıkışına takıldı. Veri toplama ve kromatografik işleme Multichro 2000 yazılımı kullanılarak yapıldı. 254 nm'de izleme yapıldı. Analitler UV absorbansı açısından test edildi. Kromatografik veriler OriginPro8 (Northampton, MA) ile analiz edildi.
İnsan serumundan elde edilen liyofilize albümin tozu (agaroz jel elektroforezi ile ≥ %96 saflıkta), 3 mg tripsin (1,5 mg), 4,0 M üre (1 mL) ve 0,2 M amonyum bikarbonat (1 mL) ile karıştırıldı. Çözelti 10 dakika karıştırıldı ve 37°C'de su banyosunda 6 saat bekletildi, ardından 1 mL %0,1 TFA ile reaksiyon durduruldu. Çözelti süzüldü ve 4 °C'nin altında saklandı.
Peptit karışımlarının ve HSA tripsin sindirim ürünlerinin ayrılması, PMP kolonlarında ayrı ayrı değerlendirildi. Peptit karışımının ve HSA tripsin sindirim ürününün PMP kolonu ile ayrılması kontrol edildi ve sonuçlar Ascentis Express RP-Amide kolonu ile karşılaştırıldı. Teorik plaka sayısı aşağıdaki gibi hesaplanır:
Şekil 2'de çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının SEM görüntüleri gösterilmektedir. Çıplak silika parçacıklarının SEM görüntüleri (A, B), önceki çalışmalarımızın aksine, bu parçacıkların küresel olduğunu, parçacıkların uzamış veya düzensiz simetriye sahip olduğunu göstermektedir. Ligand bağlı silika parçacıklarının yüzeyi (C, D), çıplak silika parçacıklarının yüzeyinden daha pürüzsüzdür; bu durum, silika parçacıklarının yüzeyine polistiren zincirlerinin kaplanmasından kaynaklanıyor olabilir.
Çıplak silika parçacıklarının (A, B) ve ligand bağlı silika parçacıklarının (C, D) taramalı elektron mikroskobu görüntüleri.
Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılımları Şekil 3(A)'da gösterilmiştir. Hacim bazlı parçacık boyutu dağılım eğrileri, kimyasal modifikasyondan sonra silika parçacıklarının boyutunun arttığını göstermiştir (Şekil 3A). Mevcut çalışma ve önceki çalışmadan elde edilen silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılım verileri Tablo 1(A)'da karşılaştırılmıştır. PMP'nin hacim bazlı parçacık boyutu, d(0.5), 3,36 μm iken, önceki çalışmamızda ad(0.5) değeri 3,05 μm (polistiren bağlı silika parçacıkları) idi.34 Bu parti, reaksiyon karışımındaki PEG, üre, TMOS ve asetik asit oranlarının değişmesi nedeniyle önceki çalışmamıza göre daha dar bir parçacık boyutu dağılımına sahipti. PMP fazının parçacık boyutu, daha önce incelediğimiz polistiren bağlı silika parçacık fazınınkinden biraz daha büyüktür. Bu, silika parçacıklarının stiren ile yüzey fonksiyonelleştirilmesinin yalnızca üzerine bir polistiren tabakası (0,97 µm) biriktirdiği anlamına gelir. Silika yüzeyinde, PMP fazında ise katman kalınlığı 1,38 µm idi.
Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılımı (A) ve gözenek boyutu dağılımı (B).
Bu çalışmada kullanılan silika parçacıklarının gözenek boyutu, gözenek hacmi ve yüzey alanı Tablo 1(B)'de verilmiştir. Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının PSD profilleri Şekil 3(B)'de gösterilmiştir. Sonuçlar önceki çalışmamızla karşılaştırılabilir. Çıplak ve ligand bağlı silika parçacıklarının gözenek boyutları sırasıyla 310 ve 241'dir; bu da kimyasal modifikasyondan sonra gözenek boyutunun 69 azaldığını göstermektedir (Tablo 1(B)) ve eğrideki değişim Şekil 3(B)'de gösterilmiştir. Benzer şekilde, silika parçacıklarının gözenek hacmi kimyasal modifikasyondan sonra 0,67'den 0,58 cm3/g'ye düşmüştür. Bu çalışmada incelenen silika parçacıklarının özgül yüzey alanı 116 m2/g'dir ve bu da önceki çalışmamızla (124 m2/g) karşılaştırılabilir. Tablo 1(B)'de gösterildiği gibi, silika parçacıklarının yüzey alanı (m2/g) da kimyasal modifikasyondan sonra 116 m2/g'den 105 m2/g'ye düşmüştür. değişiklik.
Sabit fazın elementel analiz sonuçları Tablo 2'de gösterilmiştir. Mevcut sabit fazın karbon yükü %6,35 olup, önceki çalışmamızdaki (polistiren bağlı silika parçacıkları, sırasıyla %7,9335 ve %10,21)42 karbon yükünden daha düşüktür. Mevcut sabit fazın karbon yükü düşüktür çünkü mevcut SP'nin hazırlanmasında stirene ek olarak fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) ve 4-hidroksi-TEMPO gibi bazı polar ligandlar kullanılmıştır. Mevcut sabit fazın azot ağırlık yüzdesi %2,21 olup, önceki çalışmalardaki azot ağırlık yüzdeleri sırasıyla %0,1735 ve %0,85'tir. Bu, fenilmaleimid nedeniyle mevcut sabit fazda azot ağırlık yüzdesinin daha yüksek olduğu anlamına gelir. Benzer şekilde, ürünler (4) ve (5)'in karbon yükleri sırasıyla %2,7 ve %2,9 iken, nihai ürünün karbon yükü daha düşüktür. (6) Tablo 2'de gösterildiği gibi %6,35 idi. Ağırlık kaybı PMP sabit fazı ile kontrol edildi ve TGA eğrisi Şekil 4'te gösterilmiştir. TGA eğrisi %8,6'lık bir ağırlık kaybı göstermektedir ki bu, ligandların sadece C değil aynı zamanda N, O ve H de içermesi nedeniyle karbon yüklemesi (%6,35) ile iyi bir uyum içindedir.
Silika parçacıklarının yüzey modifikasyonu için fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat ligandı seçilmiştir çünkü polar fenilmaleimid grupları ve vinilizosiyanat grupları içerir. Vinilizosiyanat grupları, canlı radikal polimerizasyon yoluyla stiren ile daha fazla reaksiyona girebilir. İkinci neden ise, fenilmaleimid kısmı normal pH'da sanal yüke sahip olmadığından, analit ile orta derecede etkileşime giren ve analit ile sabit faz arasında güçlü bir elektrostatik etkileşime sahip olmayan bir grup eklemektir. Sabit fazın polaritesi, optimum stiren miktarı ve serbest radikal polimerizasyon reaksiyon süresi ile kontrol edilebilir. Reaksiyonun son adımı (serbest radikal polimerizasyon) kritiktir ve sabit fazın polaritesini değiştirebilir. Bu sabit fazların karbon yüklemesini kontrol etmek için elementel analiz yapılmıştır. Stiren miktarının ve reaksiyon süresinin artmasının sabit fazın karbon yüklemesini artırdığı ve bunun tersinin de geçerli olduğu gözlemlenmiştir. Farklı stiren konsantrasyonlarıyla hazırlanan sabit fazların farklı karbon yüklemeleri vardır. Tekrar belirtmek gerekirse, bu sabit fazları yükleyin. Paslanmaz çelik kolonlar kullanılarak kromatografik performansları (seçicilik, çözünürlük, N değeri vb.) kontrol edildi. Bu deneylere dayanarak, kontrollü polarite ve iyi analit tutunmasını sağlamak için PMP sabit fazını hazırlamak üzere optimize edilmiş bir formülasyon seçildi.
Beş farklı peptit karışımı (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin enkefalin) ayrıca bir mobil faz kullanılarak PMP kolonu ile değerlendirildi; 80 μL/min akış hızında 60/40 (v/v) asetonitril/su (%0,1 TFA) kullanıldı. Optimal elüsyon koşullarında, kolon başına teorik plaka sayısı (N) (100 × 1,8 mm iç çap) 20.000 ± 100'dür (200.000 plaka/m²). Tablo 3, üç PMP kolonu için N değerlerini vermekte ve kromatogramlar Şekil 5A'da gösterilmektedir. Yüksek akış hızında (700 μL/min) bir PMP kolonunda hızlı analizde, bir dakika içinde beş peptit elüe edildi, N değerleri çok iyiydi, kolon başına 13.500 ± 330 (100 × 1,8 mm iç çap), bu da 135.000 plaka/m'ye karşılık gelir (Şekil 5B). Üç özdeş boyutlu kolon (100 × 1,8 mm) (id) numaralı kolonlar, tekrarlanabilirliği kontrol etmek amacıyla üç farklı PMP sabit faz partisiyle paketlenmiştir. Her kolon için analit konsantrasyonu, optimum elüsyon koşulları ve teorik plaka sayısı N ve aynı test karışımını her kolonda ayırmak için gereken tutma süresi kullanılarak kaydedilmiştir. PMP kolonlarının tekrarlanabilirlik verileri Tablo 4'te gösterilmiştir. PMP kolonunun tekrarlanabilirliği, Tablo 3'te gösterildiği gibi çok düşük %RSD değerleriyle iyi bir korelasyon göstermektedir.
Peptit karışımının PMP kolonunda (B) ve Ascentis Express RP-Amide kolonunda (A) ayrılması; hareketli faz 60/40 ACN/H2O (TFA %0,1), PMP kolon boyutları (100 × 1,8 mm iç çap); analitik. Bileşiklerin elüsyon sırası: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ve 5 (lösin) asit enkefalin).
İnsan serum albüminin tripsin sindirim ürünlerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisinde ayrılması için bir PMP kolonu (100 × 1,8 mm iç çap) değerlendirildi. Şekil 6'daki kromatogram, numunenin iyi ayrıldığını ve çözünürlüğün çok iyi olduğunu göstermektedir. HSA sindirim ürünleri, 100 µL/dakika akış hızı, %70 asetonitril/%30 su ve %0,1 TFA içeren mobil faz kullanılarak analiz edildi. Kromatogramda (Şekil 6) gösterildiği gibi, HSA sindirim ürünü 17 peptite karşılık gelen 17 pik halinde ayrılmıştır. HSA sindirim ürünündeki her bir pik için ayırma verimliliği hesaplandı ve değerler Tablo 5'te verilmiştir.
HSA'nın (100 × 1,8 mm iç çap) tripsinle sindirilmiş örneği, PMP kolonunda ayrıştırıldı; akış hızı (100 µL/dak), hareketli faz %0,1 TFA içeren 60/40 asetonitril/su karışımı.
Burada L kolon uzunluğu, η hareketli fazın viskozitesi, ΔP kolon geri basıncı ve u hareketli fazın doğrusal hızıdır. PMP kolonunun geçirgenliği 2,5 × 10⁻¹⁴ m², akış hızı 25 μL/dak ve 60/40 v/v ACN/su kullanılmıştır. PMP kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap) geçirgenliği, önceki çalışmamızdaki (Ref.34) ile benzerdir. Yüzeysel olarak gözenekli parçacıklarla doldurulmuş kolonun geçirgenliği şöyledir: 1,3 μm parçacıklar için 1,7 × 10⁻¹⁵, 1,7 μm parçacıklar için 3,1 × 10⁻¹⁵, 2,6 μm parçacıklar için 5,2 × 10⁻¹⁵ ve 2,5 × 10⁻¹⁴ m². 5 μm parçacıklar için... 43. Bu nedenle, PMP fazının geçirgenliği 5 μm çekirdek-kabuk parçacıklarının geçirgenliğine benzerdir.
Burada Wx, kloroformla doldurulmuş kolonun ağırlığı, Wy, metanolle doldurulmuş kolonun ağırlığı ve ρ, çözücünün yoğunluğudur. Metanolün yoğunluğu (ρ = 0,7866) ve kloroformun yoğunluğu (ρ = 1,484) sırasıyla 0,63 ve 0,55'tir. Daha önce incelediğimiz SILICA PARTICLES-C18 kolonlarının (100 × 1,8 mm iç çap) 34 ve C18-Üre kolonlarının 31 toplam gözenekliliği sırasıyla 0,63 ve 0,55'tir. Bu, üre ligandlarının varlığının sabit fazın geçirgenliğini azalttığı anlamına gelir. Öte yandan, PMP kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap) toplam gözenekliliği 0,60'tır. PMP kolonlarının geçirgenliği, C18 bağlı silika parçacıklarıyla doldurulmuş kolonlardan daha düşüktür çünkü C18 tipi sabit fazlarda C18 ligandları silika parçacıklarına doğrusal olarak bağlanır. Polistiren tipi sabit fazlarda ise zincirler oluşurken, etrafında nispeten kalın bir polimer tabakası oluşur. Tipik bir deneyde, kolon gözenekliliği şu şekilde hesaplanır:
Şekil 7A ve 7B, aynı elüsyon koşulları (yani, 60/40 ACN/H2O ve %0,1 TFA) kullanılarak elde edilen van Deemter grafiğinin PMP kolonunu (100 × 1,8 mm iç çap) ve Ascentis Express RP-Amide kolonunu (100 × 1,8 mm iç çap) göstermektedir. Seçilen peptit karışımları (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Lösin Enkefalin) 20 µL/min hacimde hazırlandı. Her iki kolon için minimum akış hızı 800 µL/min'dir. PMP kolonu ve Ascentis Express RP-Amide kolonu için optimum akış hızında (80 µL/min) minimum HETP değerleri sırasıyla 2,6 µm ve 3,9 µm idi. HETP değerleri, PMP kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap) ayırma verimliliğinin, piyasada bulunan Ascentis Express RP-Amide kolonundan (100 × 1,8 mm iç çap) çok daha iyi olduğunu göstermektedir. Şekil 7(A)'daki van Deemter grafiği, artan akışla N değerindeki azalmanın önceki çalışmamıza kıyasla önemli olmadığını göstermektedir. Daha yüksek PMP kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap) Ascentis Express RP-Amide kolonuna kıyasla ayırma verimliliği, mevcut çalışmada kullanılan parçacık şekli, boyutu ve karmaşık kolon paketleme prosedürlerindeki iyileştirmelere dayanmaktadır34.
(A) 0.1% TFA içeren 60/40 ACN/H2O çözeltisinde PMP kolonu (100 × 1,8 mm iç çap) kullanılarak elde edilen van Deemter grafiği (HETP'ye karşı hareketli faz doğrusal hızı). (B) 0.1% TFA içeren 60/40 ACN/H2O çözeltisinde Ascentis Express RP-Amide kolonu (100 × 1,8 mm iç çap) kullanılarak elde edilen van Deemter grafiği (HETP'ye karşı hareketli faz doğrusal hızı).
Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde sentetik peptit karışımlarının ve insan serum albüminin (HAS) tripsin sindirim ürünlerinin ayrılması için polar gömülü polistiren (PMP) sabit faz hazırlanmış ve değerlendirilmiştir. PMP kolonlarının peptit karışımları için kromatografik performansı, ayırma verimliliği ve çözünürlük açısından mükemmeldir. PMP kolonlarının iyileştirilmiş ayırma performansı, silika parçacıklarının partikül boyutu ve gözenek boyutu, sabit fazın kontrollü sentezi ve karmaşık kolon paketlemesi gibi çeşitli nedenlerden kaynaklanmaktadır. Yüksek ayırma verimliliğine ek olarak, yüksek akış hızlarında düşük kolon geri basıncı da bu sabit fazın bir diğer avantajıdır. PMP kolonları iyi tekrarlanabilirlik sergiler ve peptit karışımlarının ve çeşitli proteinlerin tripsin sindirim ürünlerinin analizi için kullanılabilir. Bu kolonu, sıvı kromatografisinde doğal ürünlerin, tıbbi bitkilerden elde edilen biyoaktif bileşiklerin ve mantar özütlerinin ayrılması için kullanmayı planlıyoruz. Gelecekte, PMP kolonları proteinlerin ve monoklonal antikorların ayrılması için de değerlendirilecektir.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters Faz Kromatografisi ile Peptit Ayırma Sistemleri Üzerine Araştırma Bölüm I: Kolon Karakterizasyon Protokolünün Geliştirilmesi. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. ve diğerleri. Bulaşıcı hastalıkların tedavisi için tasarlanmış geliştirilmiş aktif peptitler. Biyoteknoloji. Gelişmiş. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sentetik terapötik peptitler: bilim ve pazar. ilaç keşfi.15 (1-2) bugün, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gelişmiş Proteomik Sıvı Kromatografisi. J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ve diğerleri. Gelişmiş sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi, geniş kapsamlı hedefli metabolomik ve proteomiklerin entegrasyonunu mümkün kılar.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC'nin ilaç geliştirmedeki rolü. J. Eylül Bilimleri. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Hızlı ayırmalar için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. İlaç geliştirmede ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinin uygulaması. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. ve diğerleri. Enterovirüslerin etkin bir şekilde saflaştırılması için yağ-su yüksek iç faz emülsiyonlarından hazırlanan monolitik makrogözenekli hidrojeller. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü. J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Terapötik peptitlerin ve proteinlerin ters fazlı sıvı kromatografisi ile ayrılmasında ortaya çıkan eğilimler: teori ve uygulamalar. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH değerleri kullanılarak bir RP-RP-HPLC sistemi ile peptitlerin iki boyutlu ayrılması. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. ve diğerleri. C18 alt-2 μm tam ve yüzeysel gözenekli parçacıklarla doldurulmuş yüksek verimli kromatografik kolonların kütle transfer özellikleri ve kinetik performansı araştırıldı. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. ve diğerleri. Bitkisel biyoaktif peptitlerin izolasyonu, tanımlanması ve doğrulanmasında son trendler ve analitik zorluklar. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB ve diğerleri. Yaşam krallığının proteomik manzarası. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. ve diğerleri. Hazırlayıcı sıvı kromatografisi ile terapötik peptitlerin aşağı akış işlenmesi. Molecule (Basel, İsviçre) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Karışık modlu kromatografi ve biyopolimerlere uygulanması. J. Kromatografi.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Karışık modlu protein kromatografisi için ligandlar: prensip, karakterizasyon ve tasarım. J. Biyoteknoloji. 144(1), 3-11 (2009).