Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom afișa site-ul fără stiluri și JavaScript.
Particulele poroase de silice au fost preparate printr-o metodă sol-gel cu unele modificări pentru a obține particule macroporoase. Aceste particule au fost derivatizate prin polimerizare cu adiție reversibilă și transfer de fragmentare a lanțului (RAFT) cu N-fenilmaleimidă-metilvinilizocianat (PMI) și stiren pentru a prepara intercalarea N-fenilmaleimidă a fazei staționare de polistiren (PMP). Coloanele din oțel inoxidabil cu diametru îngust (100 × 1,8 mm id) au fost umplute prin umplutură în suspensie. A fost evaluată separarea pe coloană PMP a unui amestec de peptide format din cinci peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucină enkefalină) (performanța cromatografică) și digestia cu tripsină a albuminei serice umane (HAS). În condiții optime de eluție, numărul teoretic de plăci ale amestecului de peptide este de până la 280.000 de plăci/m². Comparând performanța de separare a coloanei dezvoltate cu cea comercială... Cu coloana Ascentis Express RP-Amide, s-a observat că performanța de separare a coloanei PMP a fost superioară coloanei comerciale în ceea ce privește eficiența separării și rezoluția.
În ultimii ani, industria biofarmaceutică a devenit o piață globală în expansiune, cu o creștere substanțială a cotei de piață. Odată cu creșterea explozivă a industriei biofarmaceutice1,2,3, analiza peptidelor și proteinelor este extrem de dorită. Pe lângă peptida țintă, în timpul sintezei peptidelor sunt generate mai multe impurități, necesitând astfel purificare cromatografică pentru a obține peptide de puritatea dorită. Analiza și caracterizarea proteinelor din fluidele corporale, țesuturi și celule reprezintă o sarcină extrem de dificilă datorită numărului mare de specii potențial detectabile într-o singură probă. Deși spectrometria de masă este un instrument eficient pentru secvențierea peptidelor și proteinelor, dacă astfel de probe sunt injectate în spectrometrul de masă într-o singură trecere, separarea nu va fi ideală. Această problemă poate fi atenuată prin implementarea separărilor prin cromatografie lichidă (LC) înainte de analiza MS, ceea ce va reduce numărul de analiți care intră în spectrometrul de masă la un moment dat4,5,6. În plus, în timpul separării fazei lichide, analiții pot fi focalizați în regiuni înguste, concentrând astfel acești analiți și îmbunătățind sensibilitatea detecției MS. Cromatografia lichidă (LC) a avansat semnificativ în ultimul deceniu și a devenit o... tehnică populară în analiza proteomică7,8,9,10.
Cromatografia lichidă în fază inversată (RP-LC) este utilizată pe scară largă pentru purificarea și separarea amestecurilor de peptide folosind silice modificată cu octadecil (ODS) ca fază staționară11,12,13. Cu toate acestea, fazele staționare RP nu oferă o separare satisfăcătoare a peptidelor și proteinelor datorită structurii lor complexe și naturii amfifile14,15. Prin urmare, sunt necesare faze staționare special concepute pentru a analiza peptidele și proteinele cu grupări polare și nepolare pentru a interacționa cu acești analiți și a-i reține16. Cromatografia în mod mixt, care oferă interacțiuni multimodale, poate fi o alternativă la RP-LC pentru separarea peptidelor, proteinelor și altor amestecuri complexe. Au fost preparate mai multe faze staționare în mod mixt, iar coloanele umplute cu aceste faze au fost utilizate pentru separarea peptidelor și proteinelor17,18,19,20,21. Fazele staționare în mod mixt (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalare polară/RPLC) sunt potrivite pentru separarea peptidelor și proteinelor datorită prezenței atât a componentelor polare, cât și a celor nepolare. Grupuri22,23,24,25,26,27,28. În mod similar, fazele staționare intercalante polare cu grupări polare legate covalent prezintă o bună putere de separare și o selectivitate unică pentru analiții polari și nepolari, deoarece separarea depinde de interacțiunea dintre analit și faza staționară. Interacțiuni multimodale29, 30, 31, 32. Recent, Zhang și colab.30 au preparat o fază staționară de poliamină terminată cu dodecil și au separat cu succes hidrocarburi, antidepresive, flavonoide, nucleozide, estrogeni și alți câțiva analiți. Intercalatorul polar are atât grupări polare, cât și nepolare, astfel încât poate fi utilizat pentru a separa peptide și proteine ​​care au atât grupări hidrofobe, cât și hidrofile. Coloanele încorporate polare (de exemplu, coloanele C18 încorporate în amidă) sunt disponibile comercial sub denumirea comercială de coloane Ascentis Express RP-Amide, dar aceste coloane sunt utilizate numai pentru analiza aminei 33.
În studiul actual, a fost preparată și evaluată o fază staționară încorporată polar (polistiren încorporat în N-fenilmaleimidă) pentru separarea peptidelor și a digestelor de tripsină ale HSA. Faza staționară a fost preparată utilizând următoarea strategie. Particulele poroase de silice au fost preparate conform procedurii prezentate în publicația noastră anterioară, cu unele modificări ale protocolului de preparare. Raportul dintre uree, polietilen glicol (PEG), TMOS, apă și acid acetic a fost ajustat pentru a prepara particule de silice cu dimensiuni mari ale porilor. În al doilea rând, a fost sintetizat un nou ligand, fenilmaleimidă-metil vinil izocianat, și utilizat pentru a derivatiza particulele de silice pentru a prepara o fază staționară încorporată polar. Faza staționară rezultată a fost umplută într-o coloană de oțel inoxidabil (100 × 1,8 mm id) utilizând schema de umplutură optimizată. Umplerea coloanei este asistată de vibrații mecanice pentru a asigura formarea unui pat omogen în coloană. Evaluați separarea prin coloană umplută a amestecurilor de peptide constând din cinci peptide; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucină Enkefalină) și digest cu tripsină din albumina serică umană (HAS). S-a observat că amestecul de peptide și digestul cu tripsină din HSA se separă cu o rezoluție și o eficiență bune. Performanța de separare a coloanei PMP a fost comparată cu cea a coloanei Ascentis Express RP-Amide. Atât peptidele, cât și proteinele au fost bine separate și eficiente pe coloana PMP, care a fost mai eficientă decât coloana Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glicol), uree, acid acetic, trimetoxi ortosilicat (TMOS), trimetilclorosilan (TMCS), tripsină, albumină serică umană (HSA), clorură de amoniu, uree, hexan metildisilazan (HMDS), clorură de metacriloil (MC), stiren, 4-hidroxi-TEMPO, peroxid de benzoil (BPO), acetonitril de calitate HPLC (ACN), metanol, 2-propanol și acetonă. Achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA).
Un amestec de uree (8 g), polietilen glicol (8 g) și 8 mL de acid acetic 0,01 N a fost agitat timp de 10 minute, apoi s-au adăugat 24 mL de TMOS în condiții de răcire ca gheața. Amestecul de reacție a fost încălzit la 40°C timp de 6 ore și apoi la 120°C timp de 8 ore într-o autoclavă din oțel inoxidabil. Apa a fost turnată, iar materialul rezidual a fost uscat la 70°C timp de 12 ore. Masa moale uscată a fost măcinată neted într-un cuptor și calcinată la 550°C timp de 12 ore. Au fost preparate și caracterizate trei loturi pentru a examina reproductibilitatea în ceea ce privește dimensiunea particulelor, dimensiunea porilor și aria suprafeței.
Prin modificarea suprafeței particulelor de silice cu ligandul fenilmaleimidă-metilvinilizocianat (PCMP) pre-sintetizat, urmată de polimerizare radială cu stiren, s-a preparat un compus care conține o grupare polară. Fază staționară pentru agregate și lanțuri de polistiren. Procesul de preparare este descris mai jos.
N-fenilmaleimidă (200 mg) și izocianat de metilvinil (100 mg) au fost dizolvate în toluen anhidru și s-au adăugat 0,1 mL de 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) în balonul de reacție pentru a prepara copolimerul fenilmaleimidă-izocianat de metilvinil (PMCP). Amestecul a fost încălzit la 60°C timp de 3 ore, filtrat și uscat într-o etuvă la 40°C timp de 3 ore.
Particulele de silice uscate (2 g) au fost dispersate în toluen uscat (100 mL), agitate și sonicate într-un balon cu fund rotund de 500 mL timp de 10 minute. PMCP (10 mg) a fost dizolvat în toluen și adăugat picătură cu picătură în balonul de reacție printr-o pâlnie de picurare. Amestecul a fost refluxat la 100°C timp de 8 ore, filtrat și spălat cu acetonă și uscat la 60°C timp de 3 ore. Apoi, particulele de silice legate de PMCP (100 g) au fost dizolvate în toluen (200 ml) și s-a adăugat 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) în prezența a 100 µL de dilaurat de dibutilstaniu ca și catalizator. Amestecul a fost agitat la 50°C timp de 8 ore, filtrat și uscat la 50°C timp de 3 ore.
Stirenul (1 mL), peroxidul de benzoil BPO (0,5 mL) și particulele de silice atașate la TEMPO-PMCP (1,5 g) au fost dispersate în toluen și purjate cu azot. Polimerizarea stirenului a fost efectuată la 100°C timp de 12 ore. Produsul rezultat a fost spălat cu metanol și uscat la 60°C peste noapte. Schema generală de reacție este prezentată în Figura 1.
Probele au fost degazate la 393 K timp de 1 oră pentru a obține o presiune reziduală mai mică de 10-3 Torr. Cantitatea de N2 adsorbită la o presiune relativă de P/P0 = 0,99 a fost utilizată pentru a determina volumul total al porilor. Morfologia particulelor de silice goale și legate de ligand a fost examinată cu microscopie electronică cu scanare (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japonia). Probele uscate (silice goală și particule de silice legate de ligand) au fost plasate pe o coloană de aluminiu folosind bandă adezivă de carbon. Aurul a fost placat pe probe folosind un aparat de acoperire prin pulverizare catodică Q150T, iar pe probe a fost depus un strat de Au de 5 nm. Acest lucru îmbunătățește eficiența procesului utilizând tensiuni joase și asigură o pulverizare rece cu granulație fină. Pentru analiza elementară s-a utilizat un analizor elementar Thermo Electron (Waltham, MA, SUA) Flash EA1112. Pentru a obține distribuția dimensiunii particulelor s-a utilizat un analizor de dimensiune a particulelor Malvern (Worcestershire, Marea Britanie) Mastersizer 2000. Particulele de silice goale și Particulele de silice legate de ligand (câte 5 mg fiecare) au fost dispersate în 5 mL de izopropanol, sonicate timp de 10 minute, vortexate timp de 5 minute și plasate pe banca optică a Mastersizer. Analiza termogravimetrică a fost efectuată la o viteză de 5 °C pe minut pe un interval de temperatură de la 30 la 800 °C.
Coloane cu alezaj îngust din oțel inoxidabil căptușit cu sticlă, cu dimensiuni (100 × 1,8 mm id), au fost umplete folosind metoda de umplere în suspensie, aplicând aceeași procedură utilizată în Ref. 31. O coloană din oțel inoxidabil (căptușită cu sticlă, 100 × 1,8 mm diametru interior) cu un racord de ieșire conținând o frită de 1 µm a fost conectată la un dispozitiv de umplutură a suspensiei (Alltech Deerfield, IL, SUA). Se prepară o suspensie de fază staționară prin suspendarea a 150 mg de fază staționară în 1,2 mL de metanol și se trimite în coloana de stocare. S-a utilizat metanol ca solvent pentru suspensie, precum și ca solvent propulsor. Se umple coloana secvențial aplicând presiuni de 100 MP timp de 10 minute, 80 MP timp de 15 minute și 60 MP timp de 30 de minute. În timpul umplerii, s-au aplicat vibrații mecanice cu două agitatoare de coloană GC (Alltech, Deerfield, IL, SUA) pentru a asigura o umplere uniformă a coloanei. Se închide dispozitivul de umplutură a suspensiei și se eliberează presiunea încet pentru a preveni orice deteriorare în interiorul coloanei. Se deconectează coloana de la unitatea de umplere a suspensiei și se conectează un alt racord la intrare și la sistemul LC pentru a-i verifica performanța.
A fost construită o pompă LC (10AD Shimadzu, Japonia), un injector (Valco (SUA) C14 W.05) cu buclă de injecție de 50nL, un degazor cu membrană (Shimadzu DGU-14A), o fereastră capilară UV-VIS, un dispozitiv special de detectare µLC (UV-2075) și microcoloane căptușite cu sticlă. S-au utilizat tuburi de conectare foarte înguste și scurte pentru a minimiza efectul lărgirii suplimentare a benzii coloanei. După ambalare, s-au instalat capilare (50 μm id 365) și capilare cu uniune reducătoare (50 μm) la ieșirea de 1/16″ a uniunii reducătoare. Colectarea datelor și procesarea cromatografică s-au efectuat folosind software-ul Multichro 2000. Monitorizarea la 254 nm. Analiții au fost testați pentru absorbanța UV. Datele cromatografice au fost analizate de OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumină din ser uman, pulbere liofilizată, ≥ 96% (electroforeză pe gel de agaroză) 3 mg amestecată cu tripsină (1,5 mg), uree 4,0 M (1 mL) și bicarbonat de amoniu 0,2 M (1 mL). Soluția a fost agitată timp de 10 minute și menținută într-o baie de apă la 37°C timp de 6 ore, apoi stinsă cu 1 mL de TFA 0,1%. Se filtrează soluția și se depozitează sub 4°C.
Separarea amestecurilor de peptide și a digestelor cu tripsină HSA a fost evaluată separat pe coloane PMP. Verificați separarea amestecului de peptide și a digestului cu tripsină HSA prin coloana PMP și comparați rezultatele cu cele obținute pe coloana Ascentis Express RP-Amide. Numărul teoretic al plăcilor se calculează după cum urmează:
Imaginile SEM ale particulelor de silice goale și ale particulelor de silice legate de ligand sunt prezentate în FIG. 2. Imaginile SEM ale particulelor de silice goale (A, B) arată că, spre deosebire de studiile noastre anterioare, aceste particule sunt sferice, fiind alungite sau având simetrie neregulată. Suprafața particulelor de silice legate de ligand (C, D) este mai netedă decât cea a particulelor de silice goale, ceea ce se poate datora acoperirii cu lanțuri de polistiren pe suprafața particulelor de silice.
Imagini obținute la microscopul electronic cu scanare ale particulelor de silice goale (A, B) și ale particulelor de silice legate de ligand (C, D).
Distribuțiile dimensiunii particulelor particulelor de silice goale și ale particulelor de silice legate de ligand sunt prezentate în Figura 3(A). Curbele de distribuție a dimensiunii particulelor bazate pe volum au arătat că dimensiunea particulelor de silice a crescut după modificarea chimică (Fig. 3A). Datele privind distribuția dimensiunii particulelor particulelor de silice din studiul actual și din studiul anterior sunt comparate în Tabelul 1(A). Dimensiunea particulelor bazată pe volum, d(0,5), a PMP este de 3,36 μm, comparativ cu studiul nostru anterior cu o valoare ad(0,5) de 3,05 μm (particule de silice legate de polistiren)34. Acest lot a avut o distribuție a dimensiunii particulelor mai restrânsă în comparație cu studiul nostru anterior datorită raporturilor variabile de PEG, uree, TMOS și acid acetic din amestecul de reacție. Dimensiunea particulelor fazei PMP este puțin mai mare decât cea a fazei de particule de silice legate de polistiren pe care am studiat-o anterior. Aceasta înseamnă că funcționalizarea de suprafață a particulelor de silice cu stiren a depus doar un strat de polistiren (0,97 µm) pe suprafața silicei, în timp ce în faza PMP Grosimea stratului a fost de 1,38 µm.
Distribuția dimensiunii particulelor (A) și distribuția dimensiunii porilor (B) ale particulelor de silice goale și ale particulelor de silice legate de ligand.
Dimensiunea porilor, volumul porilor și aria suprafeței particulelor de silice din studiul actual sunt prezentate în Tabelul 1(B). Profilurile PSD ale particulelor de silice goale și ale particulelor de silice legate de ligand sunt prezentate în Figura 3(B). Rezultatele sunt comparabile cu studiul nostru anterior. Dimensiunile porilor particulelor de silice goale și legate de ligand sunt de 310 și respectiv 241, ceea ce indică faptul că dimensiunea porilor scade cu 69 după modificarea chimică, așa cum se arată în Tabelul 1(B), iar modificarea curbei este prezentată în Fig. 3(B). În mod similar, volumul porilor particulelor de silice a scăzut de la 0,67 la 0,58 cm3/g după modificarea chimică. Aria suprafeței specifice a particulelor de silice studiate în prezent este de 116 m2/g, ceea ce este comparabil cu studiul nostru anterior (124 m2/g). După cum se arată în Tabelul 1(B), aria suprafeței (m2/g) a particulelor de silice a scăzut, de asemenea, de la 116 m2/g la 105 m2/g după modificarea chimică. modificare.
Rezultatele analizei elementare a fazei staționare sunt prezentate în Tabelul 2. Încărcarea cu carbon a fazei staționare actuale este de 6,35%, ceea ce este mai mică decât încărcarea cu carbon a studiului nostru anterior (particule de silice legate de polistiren, 7,93%35 și respectiv 10,21%)42. Încărcarea cu carbon a fazei staționare actuale este scăzută, deoarece în prepararea SP actuale, pe lângă stiren, s-au utilizat și alți liganzi polari, cum ar fi fenilmaleimidă-metilvinilizocianat (PCMP) și 4-hidroxi-TEMPO. Procentul de azot în greutate al fazei staționare actuale este de 2,21%, comparativ cu 0,1735 și, respectiv, 0,85% în greutate azot în studiile anterioare. Aceasta înseamnă că procentul de azot în greutate este mai mare în faza staționară actuală datorită fenilmaleimidei. În mod similar, încărcăturile de carbon ale produselor (4) și (5) au fost de 2,7% și, respectiv, 2,9%, în timp ce încărcarea cu carbon a fazei finale... Produsul (6) a fost de 6,35%, așa cum se arată în Tabelul 2. Pierderea în greutate a fost verificată cu fază staționară PMP, iar curba TGA este prezentată în Figura 4. Curba TGA arată o pierdere în greutate de 8,6%, ceea ce este în bună concordanță cu încărcătura de carbon (6,35%) deoarece liganzii conțin nu numai C, ci și N, O și H.
Ligandul fenilmaleimidă-metilvinilizocianat a fost ales pentru modificarea suprafeței particulelor de silice deoarece are grupări fenilmaleimidice polare și grupări viniizocianat. Grupările izocianat de vinil pot reacționa în continuare cu stirenul prin polimerizare radicalică vie. Al doilea motiv este de a insera un grup care are o interacțiune moderată cu analitul și nicio interacțiune electrostatică puternică între analit și faza staționară, deoarece gruparea fenilmaleimidă nu are sarcină virtuală la pH normal. Polaritatea fazei staționare poate fi controlată prin cantitatea optimă de stiren și timpul de reacție al polimerizării radicalice libere. Ultima etapă a reacției (polimerizarea radicalică liberă) este critică și poate schimba polaritatea fazei staționare. A fost efectuată o analiză elementară pentru a verifica încărcătura de carbon a acestor faze staționare. S-a observat că creșterea cantității de stiren și a timpului de reacție a crescut încărcătura de carbon a fazei staționare și invers. SP-urile preparate cu diferite concentrații de stiren au încărcături de carbon diferite. Din nou, încărcați aceste faze staționare în coloane de oțel inoxidabil și verificați-le cromatografia. performanță (selectivitate, rezoluție, valoare N etc.). Pe baza acestor experimente, a fost selectată o formulă optimizată pentru prepararea fazei staționare PMP, pentru a asigura o polaritate controlată și o bună retenție a analitului.
Cinci amestecuri de peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucină enkefalină) au fost, de asemenea, evaluate utilizând o coloană PMP cu o fază mobilă; 60/40 (v/v) acetonitril/apă (0,1% TFA) la un debit de 80 μL/min. În condiții optime de eluție, numărul teoretic de plăci (N) per coloană (100 × 1,8 mm id) este de 20.000 ± 100 (200.000 plăci/m²). Tabelul 3 prezintă valorile N pentru cele trei coloane PMP, iar cromatogramele sunt prezentate în Figura 5A. Analiză rapidă pe o coloană PMP la debit mare (700 μL/min), cinci peptide au fost eluate în decurs de un minut, valorile N au fost foarte bune, 13.500 ± 330 per coloană (100 × 1,8 mm id), corespunzând la 135.000 plăci/m (Figura 5B). Trei coloane de dimensiuni identice (100 × 1,8 mm id) au fost umplute cu trei loturi diferite de fază staționară PMP pentru a verifica reproductibilitatea. Concentrația analitului pentru fiecare coloană a fost înregistrată utilizând condițiile optime de eluție și numărul de talere teoretice N, precum și timpul de retenție pentru a separa același amestec de testare pe fiecare coloană. Datele de reproductibilitate pentru coloanele PMP sunt prezentate în Tabelul 4. Reproductibilitatea coloanei PMP se corelează bine cu valori foarte scăzute ale %RSD, așa cum se arată în Tabelul 3.
Separarea amestecului de peptide pe coloana PMP (B) și coloana Ascentis Express RP-Amide (A); fază mobilă 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensiunile coloanei PMP (100 × 1,8 mm id); analitic Ordinea de eluție a compușilor: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) și 5 (leucină) (encefalină acidă).
O coloană PMP (100 × 1,8 mm diametru interior) a fost evaluată pentru separarea digestelor triptice de albumină serică umană în cromatografie lichidă de înaltă performanță. Cromatograma din Figura 6 arată că proba este bine separată, iar rezoluția este foarte bună. Digestele HSA au fost analizate utilizând un debit de 100 µL/min, fază mobilă 70/30 acetonitril/apă și 0,1% TFA. După cum se arată în cromatogramă (Figura 6), digestia HSA a fost împărțită în 17 vârfuri corespunzătoare a 17 peptide. Eficiența de separare a fiecărui vârf din digestia HSA a fost calculată, iar valorile sunt prezentate în Tabelul 5.
Un digest triptic de HSA (100 × 1,8 mm diametru interior) a fost separat pe o coloană PMP; debit (100 µL/min), fază mobilă 60/40 acetonitril/apă cu 0,1% TFA.
unde L este lungimea coloanei, η este vâscozitatea fazei mobile, ΔP este contrapresiunea coloanei, iar u este viteza liniară a fazei mobile. Permeabilitatea coloanei PMP a fost de 2,5 × 10⁻¹⁴ m², debitul a fost de 25 μL/min și s-a utilizat ACN/apă 60/40 v/v. Permeabilitatea coloanei PMP (100 × 1,8 mm id) a fost similară cu cea din studiul nostru anterior Ref.34. Permeabilitatea coloanei umplute cu particule superficial poroase este: 1,7 × 10⁻¹⁵ pentru particule de 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁵ pentru particule de 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁵ și 2,5 × 10⁻¹⁴ m² pentru particule de 2,6 μm. Pentru particulele de 5 μm 43. Prin urmare, permeabilitatea fazei PMP este similară cu cea a particulelor miez-coajă de 5 μm.
unde Wx este greutatea coloanei umplute cu cloroform, Wy este greutatea coloanei umplute cu metanol, iar ρ este densitatea solventului. Densitățile metanolului (ρ = 0,7866) și cloroformului (ρ = 1,484). Porozitatea totală a coloanelor SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 și a coloanelor C18-Uree 31 pe care le-am studiat anterior a fost de 0,63 și respectiv 0,55. Aceasta înseamnă că prezența liganzilor uree reduce permeabilitatea fazei staționare. Pe de altă parte, porozitatea totală a coloanei PMP (100 × 1,8 mm id) este de 0,60. Permeabilitatea coloanelor PMP este mai mică decât cea a coloanelor umplute cu particule de silice legate de C18, deoarece în fazele staționare de tip C18 liganzii C18 sunt atașați de particulele de silice sub formă de lanțuri liniare, în timp ce în fazele staționare de tip polistiren, stratul de polimer relativ gros este format în jurul acesteia. Într-un experiment tipic, porozitatea coloanei este calculată ca:
Figura 7A și B prezintă coloana PMP (100 × 1,8 mm id) și coloana Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) utilizând aceleași condiții de eluție (adică 60/40 ACN/H2O și 0,1% TFA). ) din graficul van Deemter. Amestecurile de peptide selectate (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucină Enkefalină) au fost preparate în 20 µL/. Debitul minim pentru ambele coloane este de 800 µL/min. Valorile minime HETP la debitul optim (80 µL/min) pentru coloana PMP și coloana Ascentis Express RP-Amide au fost de 2,6 µm și respectiv 3,9 µm. Valorile HETP indică faptul că eficiența de separare a coloanei PMP (100 × 1,8 mm id) este mult mai bună decât cea a coloanei Ascentis Express RP-Amide disponibilă comercial (100 × 1,8 mm id). Diagrama van Deemter din Fig. 7(A) arată că scăderea valorii N odată cu creșterea debitului nu este semnificativă în comparație cu studiul nostru anterior. Eficiența de separare mai mare a coloanei PMP (100 × 1,8 mm id) comparativ la coloana Ascentis Express RP-Amide se bazează pe îmbunătățirile aduse formei și dimensiunii particulelor și procedurilor complexe de umplure a coloanei utilizate în lucrarea actuală34.
(A) Diagramă van Deemter (HETP versus viteza liniară a fazei mobile) obținută utilizând o coloană PMP (100 × 1,8 mm id) în 60/40 ACN/H2O cu 0,1% TFA. (B) Diagramă van Deemter (HETP versus viteza liniară a fazei mobile) obținută utilizând o coloană Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) în 60/40 ACN/H2O cu 0,1% TFA.
O fază staționară din polistiren încorporat polar a fost preparată și evaluată pentru separarea amestecurilor de peptide sintetice și a digestelor cu tripsină din albumina serică umană (HAS) în cromatografie lichidă de înaltă performanță. Performanța cromatografică a coloanelor PMP pentru amestecurile de peptide este excelentă în ceea ce privește eficiența și rezoluția separării. Performanța îmbunătățită de separare a coloanelor PMP se datorează unei varietăți de motive, cum ar fi dimensiunea particulelor și dimensiunea porilor particulelor de silice, sinteza controlată a fazei staționare și umplutura complexă a coloanei. Pe lângă eficiența ridicată de separare, contrapresiunea scăzută a coloanei la debite mari este un alt avantaj al acestei faze staționare. Coloanele PMP prezintă o bună reproductibilitate și pot fi utilizate pentru analiza amestecurilor de peptide și digestia cu tripsină a diferitelor proteine. Intenționăm să folosim această coloană pentru separarea produselor naturale, a compușilor bioactivi din plante medicinale și a extractelor fungice în cromatografie lichidă. În viitor, coloanele PMP vor fi evaluate și pentru separarea proteinelor și a anticorpilor monoclonali.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. și Petersson, P. Cercetare privind sistemele de separare a peptidelor prin cromatografie în fază inversă Partea I: Dezvoltarea unui protocol de caracterizare a coloanei. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. și colab. Peptide active îmbunătățite concepute pentru tratamentul bolilor infecțioase. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. și Khrestchatisky, M. Peptide terapeutice sintetice: știința și piața. Descoperirea de medicamente. 15 (1-2) astăzi, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD și Shen, Y. Cromatografie lichidă proteomică avansată. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. și colab. Cromatografia lichidă avansată cu spectrometrie de masă permite încorporarea metabolomicii și proteomicii cu țintă largă. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM și Salisbury, JJ Rolul UHPLC în dezvoltarea medicamentelor. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. și Clausen, AM Aspecte fundamentale și practice ale cromatografiei lichide la presiune ultra-înaltă pentru separări rapide. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA și Tchelitcheff, P. Aplicarea cromatografiei lichide de ultra-înaltă performanță în dezvoltarea medicamentelor. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. și colab. Hidrogeluri macroporoase monolitice preparate din emulsii cu fază internă înaltă ulei-în-apă pentru purificarea eficientă a enterovirusurilor. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. și Wilkins, JA. Rolul cromatografiei lichide în proteomică. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. și Guillarme, D. Tendințe emergente în separările prin cromatografie lichidă în fază inversă ale peptidelor și proteinelor terapeutice: teorie și aplicații. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE și Gebler, JC Separarea bidimensională a peptidelor folosind un sistem RP-RP-HPLC folosind diferite valori ale pH-ului în prima și a doua dimensiune de separare. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. și colab. Au fost investigate caracteristicile transferului de masă și performanța cinetică a coloanelor cromatografice de înaltă eficiență umplute cu particule C18 sub 2 μm complet și superficial poroase. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. și colab. Tendințe recente și provocări analitice în izolarea, identificarea și validarea peptidelor bioactive din plante. anus. anus biologic. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB și colab. Peisajul proteomic al regnului vieții. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. și colab. Prelucrarea în aval a peptidelor terapeutice prin cromatografie lichidă preparativă. Molecule (Basel, Elveția) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. și Geng, X. Cromatografia în mod mixt și aplicarea sa la biopolimeri. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. și Sun, Y. Liganzi pentru cromatografia proteică în mod mixt: principiu, caracterizare și design. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).