Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан серепчи версиясы CSS үчүн чектелген колдоого ээ. Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, колдоо үзгүлтүксүз болушу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Кеңээк кремнезем бөлүкчөлөрү макропороздуу бөлүкчөлөрдү алуу үчүн кээ бир модификациялар менен сол-гель ыкмасы менен даярдалган. Бул бөлүкчөлөр N-фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PMI) жана стирол менен N-фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PMI) менен реверсивдүү кошумча фрагментация чынжырын өткөрүп берүү (RAFT) жолу менен алынган. фаза.Тар көздүү дат баспас болоттон жасалган мамычалар (100 × 1,8 мм id) суспензия таңгактоосу менен таңгакталган. Беш пептидден турган пептиддик аралашманын бааланган PMP мамычасы бөлүнүшү (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ileucle-Arg, Tyr-Sleucle-Arg) хроматографиялык көрсөткүчтөр) жана адамдын сывороткасынын альбумининин трипсин сиңирүүсү. Оптималдуу элюция шарттарында пептиддик аралашманын теориялык пластинкасынын саны 280 000 пластинка/м²ге жетет. Иштелип чыккан колонна менен Ascentis Express RP-Amide коммерциялык колоннасынын бөлүү эффективдүүлүгүн салыштырганда, PMP колоннасынын коммерциялык эффективдүүлүгү же бөлүү колоннасынын коммерциялык көрсөткүчтөрүнөн айырмаланганы байкалды. резолюция.
Акыркы жылдары, биофармацевтика өнөр жайы рыноктун үлүшүнүн олуттуу өсүшү менен кеңейип жаткан дүйнөлүк рынокко айланды. Биофармацевтикалык өнөр жайдын1,2,3 жарылуучу өсүшү менен пептиддердин жана протеиндердин анализи абдан талап кылынат. Максаттуу пептидден тышкары, пептиддердин синтези учурунда бир нече аралашмалар пайда болот, ошондуктан пептиддердин хроматтын хроматографиясын алуу каалоосун талап кылат. тазалык. Дене суюктуктарындагы, ткандарындагы жана клеткаларындагы протеиндердин анализи жана мүнөздөмөсү бир үлгүдөгү потенциалдуу аныкталган түрлөрдүн көптүгүнө байланыштуу өтө татаал маселе. Масс-спектрометрия пептиддик жана протеиндик секвенирлөөнүн эффективдүү куралы болсо да, эгерде мындай үлгүлөр масс-спектрометрге бир өтүү менен сайылса, бул маселе суюктуктун, ткандардын жана клеткалардын бөлүнүшүн идеалдуу болбойт. MS анализине чейин бөлүү, бул белгилүү бир убакытта масс-спектрометрге кирген аналиттердин санын азайтат4,5,6. Мындан тышкары, суюк фазаны бөлүү учурунда, аналиттер тар аймактарда фокусталып, бул аналитиктер концентрацияланып, MS аныктоо сезгичтиги жакшырат. анализ7,8,9,10.
Тескери фазалуу суюк хроматография (RP-LC) стационардык фаза катары октадецил-модифицирленген кремнеземди (ODS) колдонуу менен пептиддик аралашмаларды тазалоо жана бөлүү үчүн кеңири колдонулат11,12,13. Бирок, RP стационардык фазалары татаал түзүлүшүнө жана amphilic түзүлүшүнө14 байланыштуу пептиддердин жана протеиндердин канааттандырарлык бөлүнүшүн камсыз кыла албайт14. атайын иштелип чыккан стационардык фазалар бул аналиттер менен өз ара аракеттенүү жана сактоо үчүн полярдуу жана полярдуу эмес бөлүктөргө ээ пептиддерди жана белокторду талдоо үчүн талап кылынат16. Мультимодалдык өз ара аракеттенүүнү камсыз кылган аралаш режимдеги хроматография пептиддерди, белокторду жана башка татаал аралашмалар менен RP-LCге альтернатива боло алат. пептиддик жана протеиндик бөлүнүштөр үчүн колдонулган17,18,19,20,21. Аралаш режимдеги стационардык фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярдык интеркалация/RPLC) полярдык жана полярдуу эмес топтордун катышуусуна байланыштуу пептиддик жана протеиндик бөлүү үчүн ылайыктуу. коваленттик байланыштагы полярдык топтору бар фазалар жакшы бөлүү күчүн жана полярдуу жана полярдуу эмес аналиттер үчүн уникалдуу тандалмалыгын көрсөтөт, анткени бөлүү талдануучу зат менен стационардык фазанын өз ара аракеттенүүсүнөн көз каранды. Multimodal өз ара 29, 30, 31, 32.Recently, Zhang et al. Додецил менен аяктаган полиамин стационардык фазасын даярдап, углеводороддорду, антидепрессанттарды, флавоноиддерди, нуклеозиддерди, эстрогендерди жана башка бир нече аналиттерди ийгиликтүү ажыратты. Полярдык интеркалатор полярдуу жана полярдуу эмес топторго ээ, ошондуктан аны гидрофобдук жана гидрофобдук, гидрофобдук колоннага ээ болгон пептиддерди жана протеиндерди бөлүү үчүн колдонсо болот. амиддик камтылган C18 мамычалары) Ascentis Express RP-Amide мамычалары соода аталышы менен коммерциялык жактан жеткиликтүү, бирок бул мамычалар амин 33 анализи үчүн гана колдонулат.
Учурдагы изилдөөдө, полярдык камтылган стационардык фаза (N-phenylmaleimide-камтылган полистирол) даярдалган жана HSAнын пептиддерин жана трипсинди бөлүү үчүн бааланган. Стационардык фаза төмөнкү стратегияны колдонуу менен даярдалган. Poroz кремний диоксиди бөлүкчөлөрү биздин мурунку басылмада берилген жол-жоболорго ылайык даярдалган, кээ бир modifications менен полиэтилендердин катышы. гликол (PEG), TMOS, суу уксус кислотасы чоң тешикче өлчөмү менен кремнезем бөлүкчөлөрүн даярдоо үчүн жөндөлдү. Экинчиден, жаңы лиганд, фенилмалеимид-метил винил изоцианат синтезделди жана полярдык орнотулган стационардык фазаны даярдоо үчүн кремний диоксиди бөлүкчөлөрүн алуу үчүн колдонулду. 1,8 мм id) оптималдаштырылган таңгак схемасын колдонуу менен. Колонканын ичинде бир тектүү керебеттин пайда болушун камсыз кылуу үчүн мамычаларды таңгактоо механикалык титирөө менен жардамдашат. Беш пептидден турган пептиддик аралашмалардын таңгакталган мамыча бөлүнүшүн баалоо; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) жана адамдын сывороткасы альбумининин трипсин дайджести (HAS). HSAнын пептиддик аралашмасы жана трипсин дайджести жакшы чечилиши жана эффективдүүлүгү менен айырмаланганы байкалды. RP-Amide колоннасы. Both пептиддер жана белоктор Ascentis Express RP-Amide мамычасына караганда натыйжалуураак болгон PMP тилкесинде жакшы чечилип, эффективдүү экени байкалды.
PEG (полиэтиленгликол), карбамид, уксус кислотасы, триметокси ортосиликат (TMOS), триметил хлорсилан (TMCS), трипсин, адамдын сывороткасы альбумин (HSA), аммоний хлориди, мочевина, гексан-метилдисилазан (HMDS), хлорид, метакрил, ст. 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitril (ACN), Метанол, 2-Пропанол жана Ацетон Сигма-Олдрихтен (Сент-Луис, MO, АКШ) сатып алынган.
Карбамид (8 г), полиэтиленгликол (8 г) жана 8 мл 0,01 Н уксус кислотасынын аралашмасы 10 мүнөт аралаштырылды, андан кийин муздак муздак шарттарда ага 24 мл TMOS кошулду. Реакция аралашмасы 40°C температурада 6 саат ысытылды, андан кийин 120°C болоттон 8 саат бою болот. куюлуп, калдык материал 70°C температурада 12 саат кургатылган. Кургатылган жумшак масса меште жылмакай майдаланган жана 550°C температурада 12 саат бою кальциленген. Үч партия даярдалган жана бөлүкчөлөрдүн өлчөмү, тешикчелердин өлчөмү жана беттик аянты боюнча кайра жаралуу мүмкүнчүлүгүн текшерүү үчүн мүнөздөлгөн.
Кремний диоксиди бөлүкчөлөрүн алдын ала синтезделген фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) менен беттик модификациялоо, андан кийин стирол менен радиалдык полимерлөө жолу менен полярдык топту камтыган кошулма даярдалды. Агрегаттар жана полистирол чынжырлары үчүн стационардык фаза. Даярдоо процесси төмөндө сүрөттөлөт.
N-фенилмалеймид (200 мг) жана метил винил изоцианат (100 мг) кургак толуолдо эритилип, фенилмалеймид-метиланат винилполимер аралашмасын даярдоо үчүн реакция колбасына 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) кошулду. 60°С температурада 3 саат, чыпкаланып, духовкада 40°С температурада 3 саат кургатылган.
Кургатылган кремнезем бөлүкчөлөрү (2 г) кургак толуолдо (100 мл) дисперсацияланды, 500 мл тегерек түбү бар колбада 10 мүнөт бою аралаштырылды жана sonicated. PMCP (10 мг) толуолдо эриди жана тамчылатуучу воронка аркылуу реакциялык колбага тамчылатып кошулду. Аралашма 1 саат бою чыпкаланган жана чыпкаланган ацетон жана 60°C температурада 3 саат кургатылган. Андан кийин, PMCP менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрү (100 г) толуолдо (200 мл) эритилген жана 4-гидрокси-ТЕМПО (2 мл) 100 мкл дибутилтин дилураттын катышуусунда кошулган, аралашма 5°C чыпкаланып, катализатор катары чыпкаланган. жана 50°С температурада 3 саат кургатат.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиди BPO (0,5 мл) жана TEMPO-PMCP-тиркелген кремний диоксиди бөлүкчөлөрү (1,5 г) толуолдо таркатылып, азот менен тазаланды. Стиролдун полимеризациясы 100°C температурада 12 саат бою жүргүзүлдү. реакциянын жалпы схемасы 1-сүрөттө көрсөтүлгөн.
Үлгүлөр 10-3 Torrдан аз калдык басымды алуу үчүн 1 саат бою 393 К дегазацияланган. P/P0 = 0,99 салыштырмалуу басымда адсорбцияланган N2 өлчөмү жалпы тешикчелердин көлөмүн аныктоо үчүн колдонулган. Жылаңач жана лиганд-байланыштуу кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн морфологиясы микротехнологиялар менен текшерилген. Токио, Япония).Кургатылган үлгүлөр (жылаңач кремнезем жана лиганд-байланыштуу кремнезем бөлүкчөлөрү) жабышчаак көмүртек лентасын колдонуу менен алюминий мамычасына жайгаштырылды. Алтын Q150T чачкыч каптоочуну колдонуу менен үлгүлөргө капталган жана 5 нм Au катмары samples.This . (Waltham, MA, USA) Элементтик анализ үчүн Flash EA1112 элементтик анализатор колдонулган. Бөлүкчөлөрдүн өлчөмүн бөлүштүрүүнү алуу үчүн Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 бөлүкчөлөрдүн өлчөмү анализатору колдонулган. Жылаңач кремний бөлүкчөлөрү жана лиганд-байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрү (ар бири 5 мг) 100,000000000000000000000000000000 5 мүнөт вуралдалып, Mastersizerдин оптикалык отургучуна коюлду. Термогравиметриялык анализ 30дан 800 °Cге чейинки температура диапазонунда мүнөтүнө 5 °C ылдамдыкта аткарылды.
Өлчөмдөрүндөгү (100 × 1,8 мм id) айнек менен капталган дат баспас болоттон жасалган кууш көздүү мамычалар шламды таңгактоо ыкмасын колдонуу менен таңгакталган. 31. Дат баспас болоттон жасалган колонка (айнек менен капталган, 100 × 1,8 мм id) 1 мкм фритти камтыган чыгуучу арматура менен туташтырылган (Alltech Deerfield, IL, АКШ). 150 мг стационардык фазага 150 мг кармап туруу менен стационардык фазалык шламды даярдаңыз жана аны L met.han 2 стационардык фазага жөнөтүңүз. колонка. Метанол шламды эриткич катары, ошондой эле кыймылдаткыч эриткич катары колдонулган. Колонканы ырааттуу түрдө 100 МП, 15 мүнөткө 80 МП жана 30 мүнөткө 60 МП басым менен толтуруңуз. Таңгактоодо эки GC колонка чайкагычы менен механикалык титирөө колдонулган (All tech, USA, Packing формасынын бир түрдүүлүгүн камсыз кылуу) колонна. Шламды таңгычты жаап, колонканын ичинде кандайдыр бир бузулууларга жол бербөө үчүн басымды акырын бошотуңуз. Колонканы суспензия таңгактоо бөлүгүнөн ажыратып, анын иштешин текшерүү үчүн кире беришке жана LC системасына башка фитингди туташтырыңыз.
LC насосу (10AD Shimadzu, Япония), инжектор (Valco (АКШ) C14 W.05), 50nL инъекциялык цикл, мембрана дегазатору (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капиллярдык терезеси атайын µLC аппаратынын детектору (UV-2075) курулган жана туташтыргычты микрокоюп кичирейтүүчү. кошумча тилке тилкесин кеңейтүүнүн таасири. Таңгакталгандан кийин капиллярлар (50 мкм id 365 жана редукциялоочу капиллярлар (50 мкм) кыскартуу бирикмесинин 1/16" розеткасына орнотулду. Маалыматтарды чогултуу жана хроматографиялык иштетүү Multichro 2000 программасы аркылуу ишке ашты. Chromatographic Absorting Ana2V5 тестирлөөдөн өттү. маалыматтар OriginPro8 (Northampton, MA) тарабынан талдоого алынган.
Адамдын сывороткасынан альбумин, лиофилизацияланган порошок, ≥ 96% (агароза гелинин электрофорези) 3 мг трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) жана 0,2 М аммоний бикарбонаты (1 мл) менен аралаштырылган. Эритме 10 мүнөт аралаштырылып, андан кийин суу мончосунда 10 мүнөт аралаштырылды, андан кийин 6°C суу мончосунда кармалат. мл 0,1% TFA. Эритмени чыпкалап, 4 °C төмөн температурада сактаңыз.
Пептиддик аралашмаларды жана HSA трипсин дайджесттерин бөлүү PMP мамычаларында өзүнчө бааланды. HSAнын пептиддик аралашмасынын жана трипсин дайджестинин PMP мамычасынын бөлүнүшүн текшериңиз жана натыйжаларды Ascentis Express RP-Amide мамычасына салыштырыңыз. Теориялык плитанын номери төмөнкүдөй эсептелет:
Жылаңач кремнезем бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд-байланыштуу кремнезем бөлүкчөлөрүнүн SEM сүрөттөрү сүрөттө көрсөтүлгөн. Жылаңач кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн 2 .SEM сүрөттөрү (A, B) биздин мурунку изилдөөлөрдөн айырмаланып, бул бөлүкчөлөр тоголок, анда бөлүкчөлөр узартылган же туура эмес симметрияга ээ экенин көрсөтүп турат. кремний бөлүкчөлөрүнүн бети.
Жылаңач кремнезем бөлүкчөлөрүнүн (A, B) жана лиганд-байланыштуу кремний бөлүкчөлөрүнүн (C, D) сканерлөөчү электрондук микроскоптун сүрөттөрү.
Жылаңач кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд-байланыштуу кремнезем бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн көлөмүнүн бөлүштүрүлүшү 3 (A) .Көлөмүнө негизделген бөлүкчөлөрдүн көлөмү бөлүштүрүү ийри сызыгы химиялык модификациядан кийин көбөйгөнүн көрсөттү (3A). d(0,5), PMP 3,36 мкм, биздин мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу ad(0,5) мааниси 3,05 мкм (полистирол менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрү) 34. Бул партияда PEG, мочевина, TMOS бөлүкчөлөрүнүн катышы ар түрдүү болгондуктан, биздин мурунку изилдөөгө салыштырмалуу тар бөлүкчөлөрдүн көлөмү бөлүштүрүлгөн. биз мурда изилдеген полистирол менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрүнүн фазасынан чоңураак. Бул кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн стирол менен беттик функционализациясы кремнеземдин бетине полистирол катмарын (0,97 мкм) гана калтырганын билдирет, ал эми PMP фазасында катмардын калыңдыгы 1,38 мкм болгон.
Жылаңач кремнезем бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд-байланыштуу кремнезем бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүн бөлүштүрүү (A) жана тешикчелердин өлчөмүн бөлүштүрүү (B).
Учурдагы изилдөөнүн кремнезем бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин өлчөмү, тешикчелеринин көлөмү жана бетинин аянты 1(B) таблицада келтирилген. Жылаңач кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд-байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн PSD профилдери 3(B)-сүрөттө көрсөтүлгөн. Натыйжалар биздин мурунку изилдөөбүз менен салыштырууга болот. тиешелүүлүгүнө жараша, бул 1(В) таблицада көрсөтүлгөндөй, химиялык модификациядан кийин тешикчелердин өлчөмү 69га азайгандыгын көрсөтүп турат, ал эми ийри сызыктын өзгөрүшү 3(B)-сүрөттө көрсөтүлгөн. Ошо сыяктуу эле, кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин көлөмү химиялык модификациядан кийин 0,67ден 0,58 см3/г чейин азайган. м2/г, бул биздин мурунку изилдөөбүзгө (124 м2/г) салыштырууга болот. 1-таблицада (B) көрсөтүлгөндөй, кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн бетинин аянты (м2/г) химиялык модификациядан кийин 116 м2/гдан 105 м2/г чейин азайган.
Стационардык фазанын элементардык анализинин натыйжалары 2-таблицада көрсөтүлгөн. Учурдагы стационардык фазанын көмүртек жүктөөсү 6,35%ды түзөт, бул биздин мурунку изилдөөбүздөгү көмүртек жүктөөсүнөн төмөн (полистирол менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрү, тиешелүүлүгүнө жараша 7,93%35 жана 10,21%). SP, стиролдон тышкары, кээ бир полярдык лиганддар, мисалы, фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PCMP) жана 4-гидрокси-ТЕМПО колдонулган. Азыркы стационардык фазадагы азоттун салмагынын пайызы 2,21%ды түзөт, мурунку изилдөөлөрдөгү 0,1735 жана 0,85% салыштырганда. азот азыркы стационардык фазада фенилмалеймддин эсебинен жогору. Ошо сыяктуу эле, азыктардын (4) жана (5) көмүртектеринин жүктөмдөрү тиешелүүлүгүнө жараша 2,7% жана 2,9% түздү, ал эми акыркы продуктунун (6) көмүртек жүктөөсү 6,35%ды түздү, таблица 2де көрсөтүлгөндөй. Салмагын жоготуу фазасы PGA 4 менен текшерилди. ийри сызык 8,6% салмак жоготуусун көрсөтөт, бул көмүртектин жүктөлүшүнө (6,35%) туура келет, анткени лиганддарда C гана эмес, N, O жана H да бар.
Phenylmaleimide-methylvinylisocyanate лиганд кремнезем бөлүкчөлөрүнүн беттик өзгөртүү үчүн тандалып алынган, анткени ал полярдык фенилмалеймид топтору жана vinilisocyanate топтору бар. Винил изоцианат топтору андан ары тирүү радикалдык полимеризация аркылуу стирол менен реакцияга киришет. Экинчи себеби, күчтүү аналитикалык жана электростатикалык өз ара аракеттенүүсү жок топту киргизүү. аналит жана стационардык фаза, анткени фенилмалеимид бөлүгү нормалдуу рНда виртуалдык зарядга ээ эмес. Стационардык фазанын полярдуулугу стиролдун оптималдуу өлчөмү жана эркин радикалдык полимеризациянын реакция убактысы менен башкарылышы мүмкүн. Реакциянын акыркы кадамы (эркин радикалдык полимеризация) критикалык болуп саналат жана стационардык фазанын полярдуулугун өзгөртө алат. стиролдун көлөмүн жана реакция убактысын көбөйтүү стационардык фазага көмүр жүктөө көбөйгөнүн жана тескерисинче. Стиролдун ар кандай концентрациясы менен даярдалган СПлар ар кандай көмүртек жүктөмүнө ээ болоорун байкашкан. Дагы, бул стационардык фазаларды дат баспас болоттон жасалган мамычаларга жүктөңүз жана алардын хроматографиялык көрсөткүчтөрүн текшериңиз (тандоочулук, чечүүчүлүк, N мааниси, ж.б.). контролдонуучу полярдуулук жана жакшы аналитти кармоо.
Беш пептиддик аралашмалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) ошондой эле мобилдик фазаны колдонуу менен PMP колоннасын колдонуу менен бааланган; 60/40 (v/v) ацетонитрил/суу (0,1% TFA) агымы 80 мкЛ/мин. Оптималдуу эритүү шарттарында ар бир мамычага теориялык плитанын саны (N) (100 × 1,8 мм идентификация) 20,000 ± 100 (200,000 ± 100 P/m²T үчүн P/m²T үчүн үч маанини берет). мамычалар жана хроматограммалар 5А-сүрөттө көрсөтүлгөн. PMP мамычасында жогорку агымдын ылдамдыгы (700 мкл/мин), беш пептиддер бир мүнөттүн ичинде элюцияланган, N маанилери абдан жакшы, ар бир колонка үчүн 13,500 ± 330 (100 × 1,8 мм id), 5 0 0 1 г туура келет. 5B).Үч бирдей өлчөмдөгү мамычалар (100 × 1,8 мм id) кайталануучулукту текшерүү үчүн PMP стационардык фазасынын үч түрдүү лоттору менен таңгакталган. Ар бир колонна үчүн аналиттин концентрациясы оптималдуу элюциялык шарттарды жана теориялык плиталардын N санын жана ар бир колоннада бир эле сыноо аралашмасын бөлүү үчүн кармоо убактысын колдонуу менен жазылган. 3-таблицада көрсөтүлгөндөй, PMP тилкесинин кайра жаралуусу өтө төмөн %RSD маанилери менен жакшы корреляцияланат.
PMP тилкесинде (B) жана Ascentis Express RP-Amide тилкесинде (A) пептиддик аралашманы бөлүү; мобилдик фазасы 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP мамычасынын өлчөмдөрү (100 × 1,8 мм ID); Аналитикалык Кошулмалардын элюциялык тартиби: 1 (Гли-Тир), 2 (Гли-Леу-Тир), 3 (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) жана 5 (лейцин) кислотасы энкефалин)).
PMP мамычасы (100 × 1,8 мм id) адамдын сывороткасынын альбумининин триптикалык дайджесттерин жогорку натыйжалуу суюк хроматографияда бөлүү үчүн бааланган. 6-сүрөттөгү хроматограмма үлгү жакшы бөлүнгөнүн жана резолюция абдан жакшы экенин көрсөтүп турат. HSA дайджесттери 100 мкЛ/суу/мин агымынын ылдамдыгы менен анализденген. 0,1% TFA. Хроматограммада көрсөтүлгөндөй (6-сүрөт), HSA сиңирүү 17 пептидге туура келген 17 чокуга бөлүнгөн. HSA дайджестиндеги ар бир чокунун бөлүнүү эффективдүүлүгү эсептелген жана баалуулуктар 5-таблицада берилген.
HSA бир триптикалык дайджест (100 × 1,8 мм id) PMP тилкесинде бөлүнгөн; агымынын ылдамдыгы (100 мкл/мин), мобилдик фаза 60/40 ацетонитрил/суу 0,1% TFA менен.
мында L - мамычанын узундугу, η - мобилдик фазанын илешкектүүлүгү, ΔP - мамычанын арткы басымы, ал эми u - мобилдик фазанын сызыктуу ылдамдыгы. PMP мамычасынын өткөргүчтүгү 2,5 × 10-14 м2, агымынын ылдамдыгы 25 мкЛ/мин, жана 60/40 мкЛ/мин, жана суунун 60/40 v/v AC0M колоннага колдонулган. 1,8 мм id) биздин мурунку изилдөөбүзгө окшош болгон Ref.34. Үстүртөн тешиктүү бөлүкчөлөр менен капталган мамычанын өткөрүмдүүлүгү: 1,3 мкм бөлүкчөлөр үчүн 1,7 × 10-15, 1,7 мкм бөлүкчөлөр үчүн 3,1 × 10-15, 5,2 × 10-5 жана 5,2 ×14 м2 үчүн 2,6 мкм бөлүкчөлөр 5 мкм бөлүкчөлөр үчүн 43.Ошондуктан, PMP фазасынын өткөргүчтүгү 5 мкм өзөктүү кабык бөлүкчөлөрүнө окшош.
мында Wx хлороформ менен таңгакталган колонканын салмагы, Wy - метанол менен таңгакталган колонканын салмагы, ρ - эриткичтин тыгыздыгы. Метанолдун (ρ = 0,7866) жана хлороформдун (ρ = 1,484) тыгыздыгы). id) 34 жана C18-Мочевина мамычалары 31, биз мурда изилдеген, тиешелүүлүгүнө жараша, 0,63 жана 0,55 болгон. Бул карбамид лиганддарынын болушу стационардык фазанын өткөрүмдүүлүгүн азайтат дегенди билдирет. Башка жагынан алганда, PMP мамычасынын жалпы көзөнөктүүлүгү (100 × 1,8) PMP мамычасынын id60 төмөн болушу P. С18-типтеги кремний диоксиди бөлүкчөлөрү менен таңгакталган колонналардын, анткени C18 тибиндеги стационардык фазаларда C18 лиганддары кремнезем бөлүкчөлөрүнө сызыктуу чынжырчалар катары кошулат, ал эми полистирол тибиндеги стационардык фазаларда анын айланасында салыштырмалуу калың полимер катмары пайда болот. Кадимки экспериментте мамычанын көзөнөктүүлүгү төмөнкүдөй эсептелет:
7A,B сүрөтүндө PMP тилкеси (100 × 1,8 мм id) жана Ascentis Express RP-Amide тилкеси (100 × 1,8 мм id) бирдей элелюция шарттарында (б.а. 60/40 ACN/H2O жана 0,1% TFA) көрсөтүлгөн. ) van Deemter участогу. Тандалган пептиддик аралашмалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 μL даярдалган/ Эки мамычалар үчүн минималдуу агымдын ылдамдыгы 800 мкЛ/мин. мамыча жана Ascentis Express RP-Amide мамычасы тиешелүүлүгүнө жараша 2,6 мкм жана 3,9 мкм болгон. HETP маанилери PMP мамычасынын бөлүү эффективдүүлүгү (100 × 1,8 мм id) коммерциялык Ascentis Express RP-Amide мамычасынан алда канча жакшыраак экенин көрсөтүп турат (100 × 1,8 ммA7-де). агымдын көбөйүшү менен N маанисинин төмөндөшү биздин мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу олуттуу эмес. Ascentis Express RP-Amide мамычасына салыштырмалуу PMP мамычасынын (100 × 1,8 мм id) жогорку бөлүү эффективдүүлүгү бөлүкчөлөрдүн формасын, өлчөмүн жана учурдагы жумушта колдонулган мамычаларды таңгактоо процедураларын жакшыртууга негизделген34.
(A) 0,1% TFA менен 60/40 ACN/H2Oдо PMP мамычасынын (100 × 1,8 мм id) жардамы менен алынган ван Димтердин графиги (HETP менен мобилдик фаза сызыктуу ылдамдыгы).(B) ван Димтер графиги (HETP менен мобилдик фазанын сызыктуу ылдамдыгына каршы) Экспресс RP-01 мамычасынын жардамы менен алынган. id) 60/40 ACN/H2O 0,1% TFA менен.
Полярдык камтылган полистирол стационардык фазасы даярдалган жана синтетикалык пептиддик аралашмаларды жана адамдын сывороткасынын альбумининин (HAS) трипсин дайджесттерин жогорку натыйжалуу суюк хроматографияда бөлүү үчүн бааланган. Пептиддик аралашмалар үчүн PMP мамычаларынын хроматографиялык көрсөткүчтөрү бөлүү эффективдүүлүгү жана чечүүчүлүгү боюнча эң сонун. кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү, стационардык фазанын контролдонуучу синтези жана комплекстүү мамычаларды таңгактоо. Жогорку бөлүү эффективдүүлүгүнөн тышкары, жогорку агым ылдамдыгында колонканын арткы басымынын төмөн болушу бул стационардык фазанын дагы бир артыкчылыгы. суюк хроматографияда дары өсүмдүктөр жана козу карындын экстракттары. Келечекте PMP мамычалары белокторду жана моноклоналдык антителолорду бөлүү үчүн да бааланат.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Reversed фазалык хроматография аркылуу пептиддик бөлүү системалары боюнча изилдөө I Бөлүм: Колонналарды мүнөздөмө протоколун иштеп чыгуу.J. Хроматография.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Жугуштуу ооруларды дарылоо үчүн иштелип чыккан жакшыртылган активдүү пептиддер.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетикалык терапиялык пептиддер: илим жана базар. дары ачылыш.15 (1-2) бүгүн, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2010. (1010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Хроматография.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.Advanced суюк хроматография-массалык спектрометрия кеңири максаттуу метаболомиканы жана протеомиканы киргизүүгө мүмкүндүк берет.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Дары-дармектерди иштеп чыгууда UHPLCтин ролу. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM. Тез бөлүнүү үчүн өтө жогорку басымдагы суюк хроматографиянын фундаменталдык жана практикалык аспектилери. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Ультра жогорку натыйжалуу суюк хроматографияны дарыларды иштеп чыгууда колдонуу. Хроматография.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolithic macroporous hydrogels enteroviruses.Chemical.Britain.J натыйжалуу тазалоо үчүн суудагы май жогорку ички фаза эмульсиялар даярдалган. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Суюк хроматографиянын протеомикада ролу. Хроматография.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Терапевтикалык пептиддердин жана протеиндердин тескери фазалуу суюк хроматографиялык бөлүктөрүндө пайда болгон тенденциялар: теория жана колдонмолор. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН баалуулуктарын колдонуу менен RP-RP-HPLC тутумунун жардамы менен пептиддердин эки өлчөмдүү бөлүнүшү.J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. The массалык берүү мүнөздөмөлөрү жана C18 суб-2 мкм толук жана үстүртөн тешиктүү бөлүкчөлөр менен таңгакталган жогорку натыйжалуу хроматографиялык колонналардын кинетикалык көрсөткүчтөрү investigated.J. Сентябрь Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Өсүмдүк биоактивдүү пептиддерин изоляциялоо, идентификациялоо жана валидациялоодогу акыркы тенденциялар жана аналитикалык кыйынчылыктар.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s002168-02 (s00216015).
Mueller, JB et al. The proteomic пейзаждын жашоо падышалыгы. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Preparative суюк хроматографиясы менен терапиялык пептиддерди ылдый иштетүү. Молекула (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Аралаш режимдеги хроматография жана аны биополимерлерге колдонуу. Хроматография.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.-Y.& Sun, Y. Аралаш режимдеги белок хроматографиясы үчүн лиганддар: принцип, мүнөздөмө жана дизайн. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).