Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Макропороздуу бөлүкчөлөрдү алуу үчүн тешиктүү кремний бөлүкчөлөрү бир аз өзгөртүүлөр менен золь-гель ыкмасы менен даярдалган. Бул бөлүкчөлөр полистиролдун (PMP) стационардык фазасынын N-фенилмалеимид интеркаляциясын даярдоо үчүн N-фенилмалеимид интеркаляциясын даярдоо үчүн N-фенилмалеимид (PMI) жана стирол менен кайтарымдуу кошумча фрагментация чынжырын өткөрүү (RAFT) полимерлештирүү жолу менен алынган. Кууш диаметрлүү дат баспас болоттон жасалган мамычалар (100 × 1,8 мм id) суспензия таңгагы менен таңгакталган. Беш пептидден (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) хроматографиялык көрсөткүчтөрүнөн жана адамдын кан сары суусу альбумининин (HAS) трипсин сиңирүү көрсөткүчтөрүнөн турган пептиддик аралашманын PMP мамычасынын бөлүнүшү бааланган. Оптималдуу элюция шарттарында пептиддик аралашманын теориялык пластина саны 280 000 пластина/м²ге чейин жетет. Иштелип чыккан бөлүү көрсөткүчтөрүн салыштыруу Коммерциялык Ascentis Express RP-Amide колонкасы менен салыштырганда, PMP колоннасынын бөлүү көрсөткүчү бөлүү натыйжалуулугу жана чечилиши жагынан коммерциялык колоннага караганда жогору экени байкалган.
Акыркы жылдары биофармацевтика тармагы рыноктук үлүшүнүн олуттуу өсүшү менен кеңейип жаткан дүйнөлүк рынокко айланды. Биофармацевтика тармагынын кескин өсүшү менен1,2,3 пептиддерди жана белокторду талдоо абдан зарыл. Максаттуу пептидден тышкары, пептид синтези учурунда бир нече кошулмалар пайда болот, ошондуктан каалаган тазалыктагы пептиддерди алуу үчүн хроматографиялык тазалоо талап кылынат. Дене суюктуктарындагы, ткандардагы жана клеткалардагы белокторду талдоо жана мүнөздөө бир үлгүдө потенциалдуу түрдө аныкталуучу түрлөрдүн көптүгүнөн улам өтө татаал милдет болуп саналат. Массалык спектрометрия пептиддерди жана белокторду ырааттуулукту аныктоо үчүн натыйжалуу курал болгону менен, эгерде мындай үлгүлөр массалык спектрометрге бир өтүүдө сайылса, бөлүү идеалдуу болбойт. Бул көйгөйдү MS анализине чейин суюк хроматографияны (LC) бөлүү менен чечүүгө болот, бул белгилүү бир убакта массалык спектрометрге кирген аналиттердин санын азайтат4,5,6. Мындан тышкары, суюк фазаны бөлүү учурунда аналиттерди тар аймактарга топтоого болот, ошону менен бул аналиттерди топтоого жана MS аныктоо сезгичтигин жакшыртууга болот. Суюктук Хроматография (ХХ) акыркы он жылдыкта бир топ өнүктү жана протеомдук анализде популярдуу ыкмага айланды7,8,9,10.
Тескери фазалуу суюк хроматография (RP-LC) стационардык фаза катары октадецил-модификацияланган кремнийди (ODS) колдонуу менен пептиддик аралашмаларды тазалоо жана бөлүү үчүн кеңири колдонулат11,12,13. Бирок, RP стационардык фазалары татаал түзүлүшүнө жана амфифилдик мүнөзүнө байланыштуу пептиддерди жана белокторду канааттандырарлык бөлүүнү камсыз кылбайт14,15. Ошондуктан, бул аналиттер менен өз ара аракеттенүү жана аларды сактоо үчүн полярдык жана полярдык эмес бөлүктөрү бар пептиддерди жана белокторду талдоо үчүн атайын иштелип чыккан стационардык фазалар талап кылынат16. Мультимодалдык өз ара аракеттенүүнү камсыз кылган аралаш режимдеги хроматография пептиддерди, белокторду жана башка татаал аралашмаларды бөлүү үчүн RP-LCге альтернатива боло алат. Бир нече аралаш режимдеги стационардык фазалар даярдалган жана бул фазалар менен толтурулган колонналар пептиддик жана белокторду бөлүү үчүн колдонулган17,18,19,20,21. Аралаш режимдеги стационардык фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярдык интеркаляция/RPLC) пептиддик жана белок үчүн ылайыктуу. полярдык жана полярдык эмес топтордун болушунан улам бөлүнүүлөр22,23,24,25,26,27,28. Ошо сыяктуу эле, коваленттик байланышы бар полярдык топтору бар полярдык аралык стационардык фазалар полярдык жана полярдык эмес аналиттер үчүн жакшы бөлүнүү күчүн жана уникалдуу селективдүүлүктү көрсөтөт, анткени бөлүнүү аналит менен стационардык фазанын ортосундагы өз ара аракеттенүүгө көз каранды. Мультимодалдык өз ара аракеттенүүлөр 29, 30, 31, 32. Жакында эле, Чжан ж.б. 30 додецил менен аяктаган полиамин стационардык фазасын даярдап, углеводороддорду, антидепрессанттарды, флавоноиддерди, нуклеозиддерди, эстрогендерди жана башка бир нече аналиттерди ийгиликтүү бөлүп алган. Полярдык интеркалатордо полярдык жана полярдык эмес топтор бар, ошондуктан аны гидрофобдук жана гидрофилдик бөлүктөргө ээ пептиддерди жана белокторду бөлүү үчүн колдонсо болот. Полярдык камтылган мамычалар (мисалы, амид менен камтылган C18 мамычалар) Ascentis Express RP-Amide мамычалар соода аталышы менен коммерциялык түрдө жеткиликтүү, бирок бул мамычалар 33 аминин анализдөө үчүн гана колдонулат.
Учурдагы изилдөөдө полярдык-ичилген стационардык фаза (N-фенилмалеимид-ичилген полистирол) даярдалып, HSAнын пептиддерин жана трипсин сиңирүүлөрүн бөлүү үчүн бааланган. Стационардык фаза төмөнкү стратегияны колдонуу менен даярдалган. Кеуектүү кремний бөлүкчөлөрү мурунку басылмабызда берилген процедурага ылайык, даярдоо протоколуна бир аз өзгөртүүлөр киргизилип даярдалган. Чоң тешикчелүү кремний бөлүкчөлөрүн даярдоо үчүн мочевинанын, полиэтиленгликолдун (PEG), TMOSтун, суу уксус кислотасынын катышы туураланган. Экинчиден, жаңы лиганд, фенилмалеимид-метилвинил изоцианат синтезделип, полярдык-ичилген стационардык фазаны даярдоо үчүн кремний бөлүкчөлөрүн алуу үчүн колдонулган. Алынган стационардык фаза оптималдаштырылган таңгактоо схемасын колдонуу менен дат баспас болоттон жасалган колоннага (100 × 1,8 мм id) таңгакталган. Колоннанын ичинде бир тектүү катмар пайда болушун камсыз кылуу үчүн колоннанын таңгагына механикалык титирөө жардам берет. Беш пептидден турган пептид аралашмаларынын таңгакталган колоннага бөлүнүшүн баалоо; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) жана адамдын кан сары суусу альбумининин (HAS) трипсин сиңирилиши. HSAнын пептиддик аралашмасы жана трипсин сиңирилиши жакшы чечилиште жана натыйжалуулукта бөлүнүп чыкканы байкалган. PMP тилкесинин бөлүү көрсөткүчү Ascentis Express RP-Amide тилкесинин бөлүү көрсөткүчү менен салыштырылган. Пептиддердин да, белоктордун да PMP тилкесинде жакшы чечилип, натыйжалуу экени байкалган, бул Ascentis Express RP-Amide тилкесине караганда натыйжалуураак болгон.
PEG (полиэтиленгликоль), мочевина, уксус кислотасы, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, адамдын кан сары суусунун альбумини (HSA), аммоний хлориди, мочевина, гексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоилдхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоил пероксиди (BPO), HPLC класстагы ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол жана ацетон Sigma-Aldrich компаниясынан (Сент-Луис, Миссури, АКШ) сатылып алынган.
Мочевина (8 г), полиэтиленгликоль (8 г) жана 8 мл 0,01 Н уксус кислотасынын аралашмасы 10 мүнөт аралаштырылып, андан кийин муздак шартта 24 мл TMOS кошулган. Реакциялык аралашма дат баспас болоттон жасалган автоклавда 40°C температурада 6 саат, андан кийин 120°C температурада 8 саат ысытылган. Суу куюлуп, калган материал 70°C температурада 12 саат кургатылган. Кургатылган жумшак масса меште жылмакай майдаланып, 550°C температурада 12 саат бою күйдүрүлгөн. Бөлүкчөлөрдүн өлчөмү, тешикчелердин өлчөмү жана беттик аянты боюнча кайталануучулугун изилдөө үчүн үч партия даярдалып, мүнөздөмө берилген.
Кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүн алдын ала синтезделген лиганд фенилмалеимид-метилвинилисоцианат (PCMP) менен беттик модификациялоо жана андан кийин стирол менен радиалдык полимерлөө аркылуу полярдык топту камтыган кошулма даярдалган. Агрегаттар жана полистирол чынжырлары үчүн стационардык фаза. Даярдоо процесси төмөндө баяндалган.
N-фенилмалеимид (200 мг) жана метилвинил изоцианат (100 мг) кургак толуолдо эритилип, фенилмалеимид-метилвинил изоцианат сополимерин (PMCP) даярдоо үчүн реакция колбасына 0,1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) кошулган. Аралашма 60°C температурада 3 саат ысытылып, чыпкаланып, 40°C температурада меште 3 саат кургатылган.
Кургатылган кремний бөлүкчөлөрү (2 г) кургак толуолго (100 мл) таркатылып, аралаштырылып, 500 мл тегерек түбүндөгү колбада 10 мүнөт ультраүн менен иштетилген. PMCP (10 мг) толуолдо эритилип, тамчылатуучу воронка аркылуу реакция колбасына тамчылатып кошулган. Аралашма 100°C температурада 8 саат бою кайра люкс кылынган, чыпкаланган жана ацетон менен жуулган жана 60°C температурада 3 саат кургатылган. Андан кийин PMCP менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү (100 г) толуолдо (200 мл) эритилип, катализатор катары 100 мкл дибутилтин дилауратынын катышуусунда 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) кошулган. Аралашма 50°C температурада 8 саат бою аралаштырылган, чыпкаланган жана 50°C температурада 3 саат бою кургатылган.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиди BPO (0,5 мл) жана TEMPO-PMCP менен байланышкан кремний кычкылынын бөлүкчөлөрү (1,5 г) толуолдо дисперстелип, азот менен тазаланышкан. Стиролдун полимерлениши 100°C температурада 12 саат бою жүргүзүлгөн. Алынган продукт метанол менен жуулуп, 60°C температурада түнү бою кургатылган. Жалпы реакция схемасы 1-сүрөттө көрсөтүлгөн.
Үлгүлөр 10-3 Торрдон аз калдык басым алуу үчүн 393 К температурада 1 саат бою дегазацияланган. P/P0 = 0,99 салыштырмалуу басымда адсорбцияланган N2 көлөмү жалпы тешикчелердин көлөмүн аныктоо үчүн колдонулган. Жылаңач жана лиганд менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн морфологиясы сканерлөөчү электрондук микроскопия (Hitachi High Technologies, Токио, Япония) менен изилденген. Кургатылган үлгүлөр (жылаңач кремний диоксиди жана лиганд менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрү) жабышчаак көмүртек лентасын колдонуп, алюминий мамычага жайгаштырылган. Q150T чачыратуучу каптоочуну колдонуп, үлгүлөргө алтын капталган жана үлгүлөргө 5 нм Au катмары төшөлгөн. Бул төмөнкү чыңалууларды колдонуу менен процесстин натыйжалуулугун жогорулатат жана майда дандуу, муздак чачырандылоону камсыз кылат. Элементтик анализ үчүн Thermo Electron (Уолтем, Массачусетс, АКШ) Flash EA1112 элементтик анализатору колдонулган. Бөлүкчөлөрдүн өлчөмүн алуу үчүн Malvern (Вустершир, Улуу Британия) Mastersizer 2000 бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүн анализатору колдонулган. бөлүштүрүү. Жылаңач кремний бөлүкчөлөрү жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү (ар бири 5 мг) 5 мл изопропанолдо эритилип, 10 мүнөт ультраүн менен иштетилип, 5 мүнөт вортекстелип, Mastersizerдин оптикалык стендине жайгаштырылган. Термогравиметриялык анализ 30дан 800 °Cге чейинки температура диапазонунда мүнөтүнө 5 °C ылдамдыкта жүргүзүлдү.
Өлчөмдөрү (100 × 1,8 мм) болгон айнек менен капталган дат баспас болоттон жасалган кууш диаметрлүү мамычалар, шилтемеде колдонулган ошол эле процедураны колдонуп, шлам менен таңгактоо ыкмасы менен таңгакталган. 31. 1 мкм фритти камтыган чыгуучу фитинги бар дат баспас болоттон жасалган колонна (айнек менен капталган, 100 × 1,8 мм ид) шлам таңгактоочуга (Alltech Deerfield, IL, АКШ) туташтырылган. 1,2 мл метанолго 150 мг стационардык фазаны суспензиялап, сактоочу колоннага жөнөтүү менен стационардык фазалык шламды даярдаңыз. Шлам эриткичи жана кыймылдаткыч эриткич катары метанол колдонулган. Колоннаны 10 мүнөткө 100 МП, 15 мүнөткө 80 МП жана 30 мүнөткө 60 МП басым жасап, ырааттуу түрдө толтуруңуз. Таңгактоо учурунда колоннанын бирдей таңгагын камсыз кылуу үчүн эки GC колонна чайкагычы (Alltech, Deerfield, IL, АКШ) менен механикалык титирөө колдонулган. Шлам таңгактоочуну жаап, колоннанын ичиндеги кандайдыр бир бузулуулардын алдын алуу үчүн басымды жай бошотуңуз. Колоннаны шлам таңгактоочу блоктон ажыратып, дагы бир фитингди кирүүчү жерге жана LC системасына туташтырыңыз. анын иштешин текшерүү үчүн.
LC насосу (10AD Shimadzu, Япония), 50 нл инжекциялык цикли бар инжектор (Valco (АКШ) C14 W.05), мембраналык дегазатор (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капиллярдык терезеси курулган. Атайын µLC түзүлүш детектору (UV-2075) жана айнек менен капталган микроколонкалар. Кошумча тилкелердин кеңейишинин таасирин азайтуу үчүн өтө кууш жана кыска туташтыруучу түтүктөрдү колдонуңуз. Таңгактоодон кийин, калыбына келтирүүчү бирикменин 1/16 дюймдук чыгышына капиллярлар (50 мкм id 365 жана калыбына келтирүүчү бирикме капиллярлары (50 мкм) орнотулган. Маалыматтарды чогултуу жана хроматографиялык иштетүү Multichro 2000 программасын колдонуу менен жүргүзүлдү. 254 нмдеги мониторинг Аналиттердин ультрафиолет нурларын сиңирүүсүнө текшерилди. Хроматографиялык маалыматтар OriginPro8 (Нортгемптон, MA) тарабынан талданды.
Адамдын кан сары суусунан алынган альбумин, лиофилизацияланган порошок, ≥ 96% (агароза гелинин электрофорези) 3 мг трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) жана 0,2 М аммоний бикарбонаты (1 мл) менен аралаштырылган. Эритме 10 мүнөт аралаштырылып, 37°C температурадагы суу мончосунда 6 саат кармалып, андан кийин 1 мл 0,1% TFA менен чыңалган. Эритмени чыпкалап, 4°C төмөн температурада сактаңыз.
Пептиддик аралашмаларды жана HSA трипсин дайджесттерин бөлүү PMP тилкелеринде өзүнчө бааланган. PMP тилкеси боюнча HSAнын пептиддик аралашмасын жана трипсин дайджестин бөлүүнү текшерип, жыйынтыктарды Ascentis Express RP-Amide тилкеси менен салыштырыңыз. Теориялык пластинанын номери төмөнкүдөй эсептелет:
Жылаңач кремний бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн SEM сүрөттөрү 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. Жылаңач кремний бөлүкчөлөрүнүн SEM сүрөттөрү (A, B) мурунку изилдөөлөрүбүздөн айырмаланып, бул бөлүкчөлөр тоголок формада экенин, бөлүкчөлөр узун же туура эмес симметрияга ээ экенин көрсөтөт. Лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн (C, D) бети жылаңач кремний бөлүкчөлөрүнө караганда жылмакай, бул кремний бөлүкчөлөрүнүн бетинде полистирол чынжырларынын капталышына байланыштуу болушу мүмкүн.
Жылаңач кремний бөлүкчөлөрүнүн (A, B) жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн (C, D) сканерлөөчү электрондук микроскоп сүрөттөрү.
Жылаңач кремний бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшү 3(A) сүрөттө көрсөтүлгөн. Көлөмгө негизделген бөлүкчөлөрдүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшү ийри сызыктары химиялык модификациядан кийин кремний бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү көбөйгөнүн көрсөттү (3A-сүрөт). Учурдагы изилдөөдөн жана мурунку изилдөөдөн алынган кремний бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшүнүн маалыматтары 1(A) таблицасында салыштырылган. PMPнин көлөмгө негизделген бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү, d(0.5), мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу 3,36 мкмди түзөт, ad(0.5) мааниси 3,05 мкм (полистирол менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү)34. Бул партия мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу бөлүкчөлөрдүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшүн куушураак кылган, анткени реакция аралашмасындагы PEG, мочевина, TMOS жана уксус кислотасынын катышы ар кандай болгон. PMP фазасынын бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү биз мурда изилдеген полистирол менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн фазасына караганда бир аз чоңураак. Бул кремний бөлүкчөлөрүнүн стирол менен беттик функционалдашуусу кремний бетине полистирол катмарын (0,97 мкм) гана жайгаштырганын билдирет, ал эми PMP фазасында... катмардын калыңдыгы 1,38 мкм болгон.
Жылаңач кремний бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшү (A) жана тешикчелердин өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшү (B).
Учурдагы изилдөөнүн кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин өлчөмү, тешикчелеринин көлөмү жана беттик аянты 1(B) таблицасында келтирилген. Жылаңач кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн PSD профилдери 3(B) сүрөттө көрсөтүлгөн. Жыйынтыктар мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу. Жылаңач жана лиганд менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин өлчөмдөрү тиешелүүлүгүнө жараша 310 жана 241 түзөт, бул химиялык модификациядан кийин тешикчелердин өлчөмү 69га азайганын көрсөтүп турат, 1(B) таблицасында көрсөтүлгөндөй, ал эми ийри сызыктын өзгөрүшү 3(B) сүрөттө көрсөтүлгөн. Ошо сыяктуу эле, химиялык модификациядан кийин кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин көлөмү 0,67ден 0,58 см3/гге чейин төмөндөгөн. Учурда изилденип жаткан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн салыштырма беттик аянты 116 м2/г түзөт, бул биздин мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу (124 м2/г). 1(B) таблицасында көрсөтүлгөндөй, кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн беттик аянты (м2/г) да 116 м2/гден 105ке чейин төмөндөгөн. химиялык модификациядан кийин м2/г.
Стационардык фазанын элементтик анализинин жыйынтыктары 2-таблицада көрсөтүлгөн. Учурдагы стационардык фазанын көмүртек жүктөмү 6,35% түзөт, бул биздин мурунку изилдөөбүздөгү көмүртек жүктөмүнөн төмөн (полистирол менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү, тиешелүүлүгүнө жараша 7,93%35 жана 10,21%) 42. Учурдагы стационардык фазанын көмүртек жүктөмү төмөн, анткени учурдагы SP даярдоодо стиролдон тышкары, фенилмалеимид-метилвинилисоцианат (PCMP) жана 4-гидрокси-TEMPO сыяктуу кээ бир полярдык лиганддар колдонулган. Учурдагы стационардык фазанын азоттун салмактык пайызы мурунку изилдөөлөрдөгү азоттун салмагы боюнча тиешелүүлүгүнө жараша 0,1735 жана 0,85%га салыштырмалуу 2,21% түзөт. Бул азоттун салмагынын пайызы учурдагы стационардык фазада фенилмалеимиддин айынан жогору экенин билдирет. Ошо сыяктуу эле, (4) жана (5) продуктуларынын көмүртек жүктөмү тиешелүүлүгүнө жараша 2,7% жана 2,9% түзгөн, ал эми акыркы продуктунун көмүртек жүктөмү (6) 2-таблицада көрсөтүлгөндөй 6,35% түздү. Салмактын жоголушу PMP стационардык фазасы менен текшерилген жана TGA ийри сызыгы 4-сүрөттө көрсөтүлгөн. TGA ийри сызыгы 8,6% салмактын жоголушун көрсөтөт, бул көмүртек жүктөмүнө (6,35%) жакшы дал келет, анткени лиганддарда C гана эмес, N, O жана H да бар.
Фенилмалеимид-метилвинилизоцианат лиганды кремний бөлүкчөлөрүнүн бетин модификациялоо үчүн тандалып алынган, анткени анын полярдык фенилмалеимид топтору жана винилизоцианат топтору бар. Винил изоцианат топтору тирүү радикалдык полимерлешүү аркылуу стирол менен андан ары реакцияга кирише алат. Экинчи себеп - аналит менен орточо өз ара аракеттенүүсү бар жана аналит менен стационардык фазанын ортосунда күчтүү электростатикалык өз ара аракеттенүүсү жок топту киргизүү, анткени фенилмалеимид бөлүгүнүн кадимки рН деңгээлинде виртуалдык заряды жок. Стационардык фазанын полярдуулугун стиролдун оптималдуу көлөмү жана эркин радикалдык полимерлешүүнүн реакция убактысы менен башкарууга болот. Реакциянын акыркы кадамы (эркин радикалдык полимерлешүү) абдан маанилүү жана стационардык фазанын полярдуулугун өзгөртө алат. Бул стационардык фазалардын көмүртек жүктөмүн текшерүү үчүн элементардык анализ жүргүзүлдү. Стиролдун көлөмүн жана реакция убактысын көбөйтүү стационардык фазанын көмүртек жүктөмүн көбөйткөнү жана тескерисинче байкалды. Стиролдун ар кандай концентрациялары менен даярдалган SPлердин көмүртек жүктөмү ар кандай. Дагы бир жолу, бул стационардык фазаларды дат баспас болоттон жасалган мамычаларга жүктөп, алардын хроматографиялык көрсөткүчтөр (тандоочулук, чечилиш, N мааниси ж.б.). Бул эксперименттердин негизинде, көзөмөлдөнгөн полярдуулукту жана аналиттин жакшы кармалышын камсыз кылуу үчүн PMP стационардык фазасын даярдоо үчүн оптималдаштырылган формула тандалып алынган.
Беш пептиддик аралашма (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) ошондой эле мобилдик фазаны колдонгон PMP тилкесинин жардамы менен бааланган; 60/40 (к/к) ацетонитрил/суу (0,1% TFA) 80 мкл/мин агым ылдамдыгында. Оптималдуу элюция шарттарында, ар бир тилкедеги теориялык пластинанын саны (N) (100 × 1,8 мм id) 20 000 ± 100 (200 000 пластина/м²). 3-таблицада үч PMP тилкеси үчүн N маанилери келтирилген жана хроматограммалар 5А-сүрөттө көрсөтүлгөн. Жогорку агым ылдамдыгында (700 мкл/м²) PMP тилкесинде тез анализ жүргүзүлдү, бир мүнөттүн ичинде беш пептид элюцияланды, N маанилери абдан жакшы болду, ар бир тилкеде 13 500 ± 330 (100 × 1,8 мм id), 135 000 пластина/м² туура келет (5B-сүрөт). Бирдей өлчөмдөгү үч тилкеге ​​(100 × 1,8 мм id) текшерүү үчүн үч башка партия PMP стационардык фазасы менен толтурулган. кайталануучулугу. Ар бир тилке үчүн аналиттин концентрациясы оптималдуу элюция шарттарын жана теориялык пластиналардын санын N жана ар бир тилкеде бир эле сыноо аралашмасын бөлүү үчүн кармоо убактысын колдонуу менен жазылган. PMP тилкелери үчүн кайталануучулук маалыматтары 4-таблицада көрсөтүлгөн. PMP тилкесинин кайталануучулугу 3-таблицада көрсөтүлгөндөй, өтө төмөн %RSD маанилери менен жакшы корреляцияланат.
ПМП тилкесинде (B) жана Ascentis Express RP-Amide тилкесинде (A) пептиддик аралашманы бөлүү; кыймылдуу фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), ПМП тилкесинин өлчөмдөрү (100 × 1.8 мм id); аналитикалык Кошулмалардын элюция тартиби: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) жана 5 (лейцин) кислотасы энкефалин)).
Жогорку натыйжалуу суюк хроматографияда адамдын кан сарысу альбумининин триптикалык дайджесттерин бөлүү үчүн PMP тилкеси (100 × 1,8 мм ид.) бааланган. 6-сүрөттөгү хроматограмма үлгү жакшы бөлүнгөнүн жана чечилиши абдан жакшы экенин көрсөтүп турат. HSA дайджесттери 100 мкл/мин агым ылдамдыгын, 70/30 ацетонитрил/суунун кыймылдуу фазасын жана 0,1% TFAны колдонуу менен талданган. Хроматограммада көрсөтүлгөндөй (6-сүрөт), HSA дайджести 17 пептидге туура келген 17 чокуга бөлүнгөн. HSA дайджестиндеги ар бир чокунун бөлүү эффективдүүлүгү эсептелген жана маанилери 5-таблицада келтирилген.
HSAнын триптикалык дайджести (100 × 1,8 мм ид.) PMP тилкесинде бөлүнгөн; агым ылдамдыгы (100 мкл/мин), кыймылдуу фаза 60/40 ацетонитрил/суу, 0,1% TFA менен.
мында L - мамычанын узундугу, η - кыймылдуу фазанын илешкектиги, ΔP - мамычанын артка басымы жана u - кыймылдуу фазанын сызыктуу ылдамдыгы. PMP мамычанын өткөрүмдүүлүгү 2,5 × 10-14 м2, агым ылдамдыгы 25 мкл/мин болгон жана 60/40 v/v ACN/суу колдонулган. PMP мамычанын өткөрүмдүүлүгү (100 × 1,8 мм id) биздин мурунку 34-шилтемедеги изилдөөбүзгө окшош болгон. Үстүртөн тешиктүү бөлүкчөлөр менен толтурулган мамычанын өткөрүмдүүлүгү: 1,3 мкм бөлүкчөлөр үчүн 1,7 × 10-15, 1,7 мкм бөлүкчөлөр үчүн 3,1 × 10-15, 5,2 × 10-15 жана 2,6 мкм бөлүкчөлөр үчүн 2,5 × 10-14 м2. 5 мкм бөлүкчөлөр үчүн 43. Ошондуктан, PMP фазасынын өткөрүмдүүлүгү 5 мкм өзөк-кабык өткөрүмдүүлүгүнө окшош. бөлүкчөлөр.
Мында Wx - хлороформ менен толтурулган колоннанын салмагы, Wy - метанол менен толтурулган колоннанын салмагы, ал эми ρ - эриткичтин тыгыздыгы. Метанолдун (ρ = 0.7866) жана хлороформдун (ρ = 1.484) тыгыздыктары. Биз мурда изилдеген КРЕМНИЙ БӨЛҮКЧӨЛӨРҮ-C18 колонналарынын (100 × 1.8 мм id) 34 жана C18-Мочевина колонналарынын 31 жалпы кеуектүүлүгү тиешелүүлүгүнө жараша 0.63 жана 0.55 болгон. Бул мочевина лиганддарынын болушу стационардык фазанын өткөрүмдүүлүгүн төмөндөтөт дегенди билдирет. Башка жагынан алганда, PMP колоннасынын жалпы кеуектүүлүгү (100 × 1.8 мм id) 0.60 түзөт. PMP колонналарынын өткөрүмдүүлүгү C18 менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү менен толтурулган колонналарга караганда төмөн, анткени C18 типтеги стационардык фазаларда C18 лиганддары кремний бөлүкчөлөрүнө сызыктуу чынжырлар катары туташат, ал эми полистирол типтеги стационардык фазаларда A салыштырмалуу калыңыраак. анын айланасында полимер катмары пайда болот. Типтүү экспериментте мамычанын кеуектүүлүгү төмөнкүдөй эсептелет:
7A, B сүрөттөрүндө Ван Демтердин графикасынын бирдей элюция шарттарын (б.а., 60/40 ACN/H2O жана 0,1% TFA) колдонуу менен PMP тилкеси (100 × 1,8 мм ид.) жана Ascentis Express RP-Amide тилкеси (100 × 1,8 мм ид.) көрсөтүлгөн. Тандалган пептиддик аралашмалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 мкл/де даярдалган. Эки мамычанын тең минималдуу агым ылдамдыгы 800 мкл/мин. PMP мамычасы жана Ascentis Express RP-Amide мамычасы үчүн оптималдуу агым ылдамдыгындагы (80 мкл/мин) HETP минималдуу маанилери тиешелүүлүгүнө жараша 2,6 мкм жана 3,9 мкм болгон. HETP маанилери PMP мамычасын бөлүү эффективдүүлүгүнүн (100 × 1,8 мм ид) коммерциялык жактан жеткиликтүү Ascentis Express RP-Amide мамычасын (100 × 1,8 мм ид) караганда алда канча жакшы экенин көрсөтүп турат. 7(A)-сүрөттөгү Ван Деемтердин графиги агымдын көбөйүшү менен N маанисинин төмөндөшү мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу анчалык деле маанилүү эмес экенин көрсөтүп турат. PMP мамычасын бөлүү эффективдүүлүгүнүн жогорулашы (100 × Ascentis Express RP-Amide мамычасына салыштырмалуу 1,8 мм id) өлчөмү учурдагы иште колдонулган бөлүкчөлөрдүн формасынын, өлчөмүнүн жана татаал мамычаларды таңгактоо процедураларынын жакшырышына негизделген34.
(A) 0,1% TFA менен 60/40 ACN/H2O ичиндеги PMP тилкесин (100 × 1,8 мм ид.) колдонуу менен алынган ван Димтердин графиги (HETP жана кыймылдуу фазанын сызыктуу ылдамдыгы).(B) 0,1% TFA менен 60/40 ACN/H2O ичиндеги Ascentis Express RP-Amide тилкесин (100 × 1,8 мм ид.) колдонуу менен алынган ван Димтердин графиги (HETP жана кыймылдуу фазанын сызыктуу ылдамдыгы).
Жогорку натыйжалуу суюк хроматографияда адамдын кан сары суусунун альбумининин (HAS) синтетикалык пептиддик аралашмаларын жана трипсин сиңирүүчүлөрүн бөлүү үчүн полярдык-көмүртөк полистирол стационардык фазасы даярдалып, бааланды. Пептиддик аралашмалар үчүн PMP мамычаларынын хроматографиялык көрсөткүчтөрү бөлүү натыйжалуулугу жана чечилиши боюнча эң сонун. PMP мамычаларынын бөлүү натыйжалуулугунун жакшырышы ар кандай себептерге байланыштуу, мисалы, кремний бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү жана тешикчелеринин өлчөмү, стационардык фазанын көзөмөлдөнгөн синтези жана мамычалардын татаал таңгагы. Жогорку бөлүү натыйжалуулугунан тышкары, жогорку агым ылдамдыгында мамычалардын төмөнкү артка басымы бул стационардык фазанын дагы бир артыкчылыгы болуп саналат. PMP мамычалары жакшы кайталануучулукту көрсөтөт жана пептиддик аралашмаларды жана ар кандай белоктордун трипсин сиңирүүсүн анализдөө үчүн колдонулушу мүмкүн. Биз бул мамычаларды суюк хроматографияда табигый продуктыларды, дары өсүмдүктөрүнөн алынган биоактивдүү кошулмаларды жана козу карын экстракттарын бөлүү үчүн колдонууну көздөп жатабыз. Келечекте PMP мамычалары белокторду жана моноклоналдык антителолорду бөлүү үчүн да бааланмакчы.
Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. жана Петерссон, П. Тескери фазалуу хроматография аркылуу пептиддерди бөлүү системаларын изилдөө I бөлүк: Мамыча мүнөздөмө протоколун иштеп чыгуу. Хроматография журналы. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. жана башкалар. Жугуштуу ооруларды дарылоо үчүн иштелип чыккан жакшыртылган активдүү пептиддер. Биотехнология. Өркүндөтүлгөн. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. жана Хрестчатиский, М. Синтетикалык терапиялык пептиддер: илим жана рынок. Дары-дармектерди ачуу. 15 (1-2) бүгүн, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Се, Ф., Смит, РД жана Шен, Ю. Өркүндөтүлгөн протеомдук суюк хроматография. J. Хроматография. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. жана башкалар. Өркүндөтүлгөн суюк хроматография-массалык спектрометрия кеңири максаттуу метаболомиканы жана протеомиканы киргизүүгө мүмкүндүк берет. anus. Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. жана Солсбери, Ж.Ж. Дары-дармектерди иштеп чыгууда UHPLC ролу. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. жана Клаузен, А.М. Тез бөлүү үчүн өтө жогорку басымдагы суюк хроматографиянын фундаменталдык жана практикалык аспектилери. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. жана Челитчефф, П. Дары-дармектерди иштеп чыгууда өтө жогорку натыйжалуу суюк хроматографияны колдонуу. Хроматография журналы. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. жана башкалар. Энтеровирустарды натыйжалуу тазалоо үчүн суудагы майдын жогорку ички фазалуу эмульсияларынан даярдалган монолиттик макропороздуу гидрогелдер. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. жана Уилкинс, Ж.А. Протеомикадагы суюк хроматографиянын ролу. Хроматография журналы. А 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вейтей, Ж.-Л. жана Гийарм, Д. Терапиялык пептиддерди жана белокторду тескери фазалуу суюк хроматографияда бөлүүдөгү жаңы тенденциялар: теория жана колдонмолор. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. жана Геблер, Ж.К. Биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН маанилерин колдонуу менен RP-RP-HPLC системасын колдонуп пептиддерди эки өлчөмдүү бөлүү. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. жана башкалар. Толугу менен жана үстүртөн тешиктүү C18 суб-2 мкм бөлүкчөлөрү менен толтурулган жогорку эффективдүү хроматографиялык колонкалардын масса алмашуу мүнөздөмөлөрү жана кинетикалык көрсөткүчтөрү изилденген. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. жана башкалар. Өсүмдүктөрдүн биоактивдүү пептиддерин бөлүп алуу, идентификациялоо жана валидациялоодогу акыркы тенденциялар жана аналитикалык кыйынчылыктар. анус. биологиялык анус. Химиялык.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Ж.Б. жана башкалар. Жашоо падышалыгынын протеомдук пейзажы. Жаратылыш 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, К. жана башкалар. Терапиялык пептиддерди даярдоочу суюк хроматография аркылуу кайра иштетүү. Molecule (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерге колдонулушу. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, Х.-Й. жана Сун, Й. Аралаш режимдеги белок хроматографиясы үчүн лиганддар: принцип, мүнөздөмө жана дизайн. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).