Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS üçin çäkli goldaw bar. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de utgaşyklylyk režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, goldawy dowam etdirmegi üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezeris.
Gözenekli kremniý bölejikleri makrogözenekli bölejikleri almak üçin käbir üýtgetmeler bilen sol-gel usuly bilen taýýarlanyldy. Bu bölejikler N-fenilmaleimid-metilwinilizosiýanat (PMI) we stirol bilen yzyna gaýtýan goşulma parçalanma zynjyrynyň geçirilmegi (RAFT) polimerleşmesi arkaly polistirolyň (PMP) stasionar fazasynyň N-fenilmaleimid interkalasiýasyny taýýarlamak üçin alyndy. Dar diametrli polat sütunlar (100 × 1.8 mm id) şlam gaplamak arkaly gaplandy. Bäş peptidden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leýsin enkefalin) hromatografik görkezijisinden we adam syworotkasynyň albumininiň (HAS) tripsin siňdirilişinden ybarat bolan peptid garyndysynyň PMP sütun bölünişi bahalandyryldy. Optimal elusiýa şertlerinde peptid garyndysynyň nazaryýet plastinka sany 280,000 plastinka/m² çenli ýokarydyr. Işlenip düzülen bölmek görkezijilerini deňeşdirmek täjirçilik Ascentis Express RP-Amide sütünli sütün bilen ulanylanda, PMP sütüniniň bölmek işiniň bölmek netijeliligi we çözgüdi babatda täjirçilik sütüninden has gowy bolandygy bellenildi.
Soňky ýyllarda biofarmasewtika senagaty bazar paýynyň ep-esli artmagy bilen giňelýän global bazara öwrüldi. Biofarmasewtika senagatynyň partlama ösüşi bilen1,2,3 peptidleriň we beloklaryň analizi örän zerurdyr. Maksatly peptidden başga-da, peptid sintezi wagtynda birnäçe hapaçylyklar emele gelýär, şonuň üçin islenýän arassalykdaky peptidleri almak üçin hromatografiki arassalamak gerek bolýar. Bedeniň suwuklyklaryndaky, dokumalaryndaky we öýjüklerdäki beloklaryň analizi we häsiýetlendirilmegi, bir nusgada ýüze çykarylyp bilinýän görnüşleriň köp bolmagy sebäpli örän kyn işdir. Mass spektrometriýasy peptid we belok yzygiderligini kesgitlemek üçin netijeli gural bolsa-da, şeýle nusgalar bir gezekde massa spektrometrine girizilse, bölüniş ideal bolmaz. Bu meseläni MS analizinden öň suwuk hromatografiýasyny (LC) bölmek arkaly çözüp bolýar, bu bolsa belli bir wagtda massa spektrometrine girýän analitleriň sanyny azaldar4,5,6. Mundan başga-da, suwuk faza bölünişi wagtynda analitler dar sebitlere gönükdirilip, şeýlelik bilen bu analitleri jemlemek we MS anyklaýyş duýgurlygyny ýokarlandyrmak mümkin. Suwuklyk hromatografiýa (LC) soňky onýyllykda ep-esli ösüş gazandy we proteomik analizde meşhur usula öwrüldi7,8,9,10.
Ters fazaly suwuk hromatografiýa (RP-LC) stasionar faza hökmünde oktadesil-modifikasiýa edilen kremniý dioksidini (ODS) ulanyp, peptid garyndylaryny arassalamak we bölmek üçin giňden ulanylýar11,12,13. Şeýle-de bolsa, RP stasionar fazalary çylşyrymly gurluşy we amfifil tebigaty sebäpli peptidleriň we beloklaryň kanagatlanarly bölünmegini üpjün etmeýär14,15. Şonuň üçin, bu analizatorlar bilen özara täsirleşmek we saklamak üçin polýar we polýar däl bölekleri bolan peptidleri we beloklary seljermek üçin ýörite işlenip düzülen stasionar fazalar gerek16. Köp modal özara täsirleri üpjün edýän garyşyk re mode hromatografiýasy peptidleri, beloklary we beýleki çylşyrymly garyndylary bölmek üçin RP-LC-e alternatiwa bolup biler. Birnäçe garyşyk re mode stasionar fazalar taýýarlanyldy we bu fazalar bilen doldurylan sütunlar peptid we belok bölmek üçin ulanyldy17,18,19,20,21. Garyşyk re mode stasionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polýar interkalasiýa/RPLC) peptid we belok üçin amatlydyr. polýar we polýar däl toparlaryň bolmagy sebäpli bölünmeler22,23,24,25,26,27,28. Şonuň ýaly-da, kowalent taýdan baglanyşykly polýar toparlar bilen polýar aralykly hereketsiz fazalar polýar we polýar däl analitler üçin gowy bölünme güýjüni we özboluşly selektiwligi görkezýär, sebäbi bölünme analit bilen hereketsiz fazanyň arasyndaky özara täsire baglydyr. Multimodal özara täsirler 29, 30, 31, 32. Ýakynda, Çžan we beýlekiler. 30 dodesil bilen gutaran poliamin stasionar fazasyny taýýarlady we uglewodorodlary, antidepressantlary, flavonoidleri, nukleozidleri, estrogenleri we başga-da birnäçe analitleri üstünlikli böldi. Polýar interkalatoryň hem polýar, hem-de polýar däl toparlary bar, şonuň üçin ony gidrofob we gidrofil bölekleri bolan peptidleri we beloklary bölmek üçin ulanyp bolýar. Polýar gömülen sütunlar (meselem, amid gömülen C18 sütunlary) Ascentis Express RP-Amide sütunlary söwda ady bilen satylýar, ýöne bu sütunlar diňe amin 33-iň analizi üçin ulanylýar.
Häzirki gözlegde, HSA-nyň peptidlerini we tripsin digestlerini bölmek üçin polýar goşulan stasionar faza (N-fenilmaleimid goşulan polistirol) taýýarlanyldy we bahalandyryldy. Stasionar faza aşakdaky strategiýa arkaly taýýarlanyldy. Gözenekli kremniý bölejikleri öňki neşirimizde berlen prosedura laýyklykda taýýarlanyldy, taýýarlyk protokolyna käbir üýtgetmeler girizildi. Uly gözenek ölçegli kremniý bölejiklerini taýýarlamak üçin karbamid, polietilen glikol (PEG), TMOS, suw sirke kislotasynyň gatnaşygy sazlandy. Ikinjiden, täze ligand, fenilmaleimid-metil winil izosiýanat, sintez edildi we polýar goşulan stasionar faza taýýarlamak üçin kremniý bölejiklerini öndürmek üçin ulanyldy. Netijede dörän stasionar faza optimizirlenen gaplama shemasy arkaly poslamaýan polat sütüne (100 × 1,8 mm id) gaplandy. Sütüniň gaplamasy sütüniň içinde birmeňzeş gatlagyň emele gelmegini üpjün etmek üçin mehaniki titreme bilen kömek edilýär. Bäş peptidden ybarat bolan peptid garyndylarynyň gaplanan sütüniň bölünmegini bahalandyryň; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) we adam serum albumininiň (HAS) tripsin digesti. HSA-nyň peptid garyndysynyň we tripsin digestiniň gowy çözgüt we netijelilik bilen bölünýändigine syn edildi. PMP sütunynyň bölüniş netijeliligi Ascentis Express RP-Amide sütunynyňky bilen deňeşdirildi. Peptidleriň we beloklaryň PMP sütunynda gowy çözülendigi we netijelidigi syn edildi, bu bolsa Ascentis Express RP-Amide sütunyndan has netijeli boldy.
PEG (Polietilen Glikol), Karbamid, Sirke Kislotasy, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Hlorosilan (TMCS), Tripsin, Adam Syworotka Albumin (HSA), Ammoniý Hlorid, Karbamid, Geksan Metildisilazan (HMDS), Metakriloil Hlorid (MC), Stirol, 4-Gidroksi-TEMPO, Benzoil Peroksid (BPO), HPLC Derejeli Asetonitril (ACN), Metanol, 2-Propanol we Sigma-Aldrich (Sent-Luis, MO, ABŞ) kompaniýasyndan satyn alnan aseton.
Karbamid (8 g), polietilen glikol (8 g) we 8 ml 0,01 N sirke kislotasynyň garyndysy 10 minutlap garyşdyryldy, soňra buz ýaly sowuk şertlerde oňa 24 ml TMOS goşuldy. Reaksiýa garyndysy 40°C-da 6 sagat, soňra 120°C-da 8 sagatlap poslamaýan polat awtoklawda gyzdyryldy. Suw döküldi we galan material 70°C-da 12 sagatlap guradyldy. Guradylan ýumşak massa peçde ýumşak üweldi we 550°C-da 12 sagatlap kalsirlenen. Bölejikleriň ululygynda, gözenekleriň ululygynda we ýüz meýdanynda gaýtalanmagy öwrenmek üçin üç tapgyr taýýarlanyldy we häsiýetlendirildi.
Kwarts bölejikleriniň öňünden sintezlenen ligand fenilmaleimid-metilwinilizosiýanat (PCMP) bilen ýüzleý modifikasiýasy we soňra stirol bilen radial polimerleşme arkaly polýar topary öz içine alýan birleşme taýýarlanyldy. Agregatlar we polistirol zynjyrlary üçin stasionar faza. Taýýarlamak prosesi aşakda beýan edilýär.
N-fenilmaleimid (200 mg) we metil winil izosiýanat (100 mg) gurak toluolda eredildi we fenilmaleimid-metil winil izosiýanat kopolimerini (PMCP) taýýarlamak üçin reaksiýa kolbasyna 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) goşuldy. Garyndy 60°C-da 3 sagatlap gyzdyryldy, süzüldi we 40°C-da 3 sagatlap peçde guradyldy.
Gury kremniý bölejikleri (2 g) gurak toluolda (100 ml) eredildi, garyşdyryldy we 500 ml tegelek aşaky kolbada 10 minutlap seslendirildi. PMCP (10 mg) toluolda eredildi we damjalaýjy huni arkaly reaksiýa kolbasyna damja goşuldy. Garyndy 100°C-da 8 sagatlap gaýtadan ýuksaldy, süzgüçden geçirildi we aseton bilen ýuwuldy we 60°C-da 3 sagatlap guradyldy. Soňra PMCP bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri (100 g) toluolda (200 ml) eredildi we katalizator hökmünde 100 µL dibutiltin dilauratyň gatnaşmagynda 4-gidroksi-TEMPO (2 ml) goşuldy. Garyndy 50°C-da 8 sagatlap garyşdyryldy, süzgüçden geçirildi we 50°C-da 3 sagatlap guradyldy.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) we TEMPO-PMCP bilen birikdirilen kremniý bölejikleri (1,5 g) toluolda eredildi we azot bilen arassalandy. Stirolyň polimerleşmesi 100°C-da 12 sagatlap geçirildi. Netijede alnan önüm metanol bilen ýuwuldy we 60°C-da gije guradyldy. Umumy reaksiýa shemasy 1-nji suratda görkezilen.
Nusgalar 10-3 Torr-dan az galyndy basyş almak üçin 393 K-da 1 sagatlap gazsyzlandyryldy. P/P0 = 0.99 deňeşdirme basyşynda adsorbsiýa edilen N2 mukdary umumy gözenek göwrümini kesgitlemek üçin ulanyldy. Açyk we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň morfologiýasy skanerleýji elektron mikroskopiýasy (Hitachi High Technologies, Tokio, Ýaponiýa) bilen barlandy. Guradylan nusgalar (açyk kremniý we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri) ýelimleýji uglerod lentasy ulanylyp alýumin sütüniň üstüne goýuldy. Nusgalaryň üstüne Q150T püskürtme örtügi ulanylyp altyn örtüldi we nusgalaryň üstüne 5 nm Au gatlagy goýuldy. Bu pes woltlylygy ulanyp prosesiň netijeliligini ýokarlandyrýar we inçe däneli, sowuk püskürtme üpjün edýär. Element analizi üçin Thermo Electron (Waltham, MA, ABŞ) Flash EA1112 element analizatory ulanyldy. Bölejikleriň ölçegini almak üçin Malvern (Worcestershire, Beýik Britaniýa) Mastersizer 2000 bölejik ölçeg analizatory ulanyldy. paýlanyşy. Ýalaňaç kremniý bölejikleri we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri (her biri 5 mg) 5 ml izopropanolda eredildi, 10 minutlap unikasiýa edildi, 5 minutlap workes edildi we Mastersizer-iň optiki skameýkasyna goýuldy. Termograwimetriki analiz 30-dan 800 °C-a çenli temperatura aralygynda minutda 5 °C tizlikde geçirildi.
Ölçegleri (100 × 1.8 mm id) bolan aýna bilen örtülen polatdan ýasalan dar deşikli sütunlar, Salgylanmada ulanylan şol bir prosedura ulanylyp, şlam gaplama usuly bilen gaplandy. 31. 1 µm frit saklaýan çykyş armaturasy bolan poslamaýan polat sütun (aýna bilen örtülen, 100 × 1.8 mm ölçegli) şlam gaplaýjy enjama (Alltech Deerfield, IL, ABŞ) birikdirildi. 1,2 ml metanola 150 mg hereketsiz fazany goýup, ony saklamak sütunyna iberip, hereketsiz fazaly şlam taýýarlaň. Şlam eriji hökmünde metanol, şeýle hem itekleýji ergin hökmünde ulanyldy. 10 minutlap 100 MP, 15 minutlap 80 MP we 30 minutlap 60 MP basyş ulanyp, sütün yzygiderli dolduryň. Gaplama wagtynda, sütünleriň deň derejede gaplanmagyny üpjün etmek üçin iki sany GC sütun silkdirijisi (Alltech, Deerfield, IL, ABŞ) bilen mehaniki titreme ulanyldy. Şlam gaplaýjy enjamyň içindäki zeper ýetmeginiň öňüni almak üçin şlam gaplaýjy enjamyny ýapyň we basyşy ýuwaşlyk bilen goýberiň. Sütüni şlam gaplaýjy enjamdan aýryň we başga bir armaturany girişe we LC ulgamyna birikdiriň. onuň işini barlamak üçin.
LC nasosy (10AD Shimadzu, Ýaponiýa), 50nL inýeksiýa halkasy bolan inýektor (Valco (ABŞ) C14 W.05), membrana degasseri (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillýar penjiresi guruldy. Ýörite µLC enjam detektory (UV-2075) we aýna bilen örtülen mikrokolonlar guruldy. Goşmaça sütün zolagynyň giňelmeginiň täsirini azaltmak üçin örän dar we gysga birleşdiriji turbalar ulanyň. Gaplamadan soň, reduksiýa birleşmesiniň 1/16 дюйm çykyşyna kapillýar damarlar (50 μm id 365 we reduksiýa birleşme kapillýar damarlar (50 μm) gurnaldy. Maglumatlary ýygnamak we hromatografiki işläp düzmek Multichro 2000 programma üpjünçiligi arkaly amala aşyryldy. 254 nm-de gözegçilik Analitler UV siňdirişine synagdan geçirildi. Hromatografiki maglumatlar OriginPro8 (Northampton, MA) tarapyndan seljerildi.
Adam syworotkasyndan alnan albumin, liofilizlenen poroşok, ≥ 96% (agaroza gel elektroforez) 3 mg tripsin (1.5 mg), 4.0 M karbamid (1 ml) we 0.2 M ammonium bikarbonaty (1 ml) bilen garyşdyryldy. Eritme 10 minutlap garyşdyryldy we 37°C-de 6 sagatlap suw hammamynda saklandy, soňra 1 ml 0.1% TFA bilen öçürildi. Eritmäni süzüň we 4°C-den aşak temperaturada saklaň.
Peptid garyndylarynyň we HSA tripsin digestleriniň bölünmegi PMP sütunlarynda aýratynlykda bahalandyryldy. PMP sütuny tarapyndan HSA-nyň peptid garyndysynyň we tripsin digestiniň bölünmegini barlaň we netijeleri Ascentis Express RP-Amide sütuny bilen deňeşdiriň. Nazaryýet plastinkasynyň sany aşakdaky ýaly hasaplanýar:
Ýalaňaç kremniý bölejikleriniň we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň SEM suratlary 2-nji suratda görkezilen. Ýalaňaç kremniý bölejikleriniň SEM suratlary (A, B) öňki gözleglerimizden tapawutlylykda, bu bölejikleriň sferikidigini we bölejikleriň uzalyp ýa-da düzgünsiz simmetriýa eýedigini görkezýär. Ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň (C, D) ýüzi ýalaňaç kremniý bölejikleriniň ýüzüne garanyňda has ýumşakdyr, bu bolsa kremniý bölejikleriniň ýüzünde polistirol zynjyrlarynyň örtülmegi bilen baglanyşykly bolup biler.
Ýalaňaç kremniý bölejikleriniň (A, B) we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň (C, D) elektron mikroskop suratlaryny skanirleýän.
Ýalaňaç kremniý bölejikleriniň we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň bölejik ölçegleriniň paýlanyşy 3(A) suratda görkezilen. Göwrüme esaslanýan bölejik ölçegleriniň paýlanyş egrileri himiki modifikasiýadan soň kremniý bölejikleriniň ölçegleriniň artandygyny görkezdi (3A surat). Häzirki gözlegden we öňki gözlegden alnan kremniý bölejikleriniň bölejik ölçegleriniň paýlanyş maglumatlary 1(A) tablisasynda deňeşdirilýär. PMP-niň göwrüme esaslanýan bölejik ölçegleri, d(0.5), öňki gözlegimiz bilen deňeşdirilende 3.36 μm, ad(0.5) gymmaty 3.05 μm (polistirol bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri)34 bilen deňeşdirilende. Bu partiýanyň öňki gözlegimiz bilen deňeşdirilende bölejik ölçegleriniň paýlanyşy has dar boldy, sebäbi reaksiýa garyndysynda PEG, karbamid, TMOS we sirke turşusynyň dürli gatnaşyklary bar. PMP fazasynyň bölejik ölçegleri, öň öwrenen polistirol bilen baglanyşykly kremniý bölejik fazasyndan birneme uly. Bu, kremniý bölejikleriniň stirol bilen ýüzleý funksionalizasiýasynyň kremniý ýüzünde diňe polistirol gatlagyny (0.97 µm) goýandygyny aňladýar, PMP fazasynda bolsa gatlagyň galyňlygy 1,38 µm boldy.
Ýalaňaç kremniý bölejikleriniň we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň bölejik ölçegleriniň paýlanyşy (A) we gözenek ölçegleriniň paýlanyşy (B).
Häzirki gözlegiň kremniý bölejikleriniň gözenek ölçegi, gözenek göwrümi we ýüz meýdany 1(B) tablisasynda görkezilen. Ýalaňaç kremniý bölejikleriniň we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň PSD profilleri 3(B) suratda görkezilen. Netijeler öňki gözlegimiz bilen deňeşdirilip bilner. Ýalaňaç we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň gözenek ölçegleri degişlilikde 310 we 241, bu bolsa himiki modifikasiýadan soň gözenek ölçeginiň 69 azalýandygyny görkezýär, 1(B) tablisasynda görkezilişi ýaly we egriniň üýtgemegi 3(B) suratda görkezilen. Şonuň ýaly-da, himiki modifikasiýadan soň kremniý bölejikleriniň gözenek göwrümi 0,67-den 0,58 sm3/g çenli azaldy. Häzirki öwrenilýän kremniý bölejikleriniň hususy ýüz meýdany 116 m2/g, bu bolsa öňki gözlegimiz bilen deňeşdirilip bilner (124 m2/g). 1(B) tablisasynda görkezilişi ýaly, kremniý bölejikleriniň ýüz meýdany (m2/g) hem 116 m2/g-den 105-e çenli azaldy. himiki modifikasiýadan soň m2/g.
Stasionar fazanyň elementar analiziniň netijeleri 2-nji tablisada görkezilen. Häzirki stasionar fazanyň uglerod ýüklenmesi 6,35%, bu bolsa öňki gözlegimiziň uglerod ýüklenmesinden pes (polistirol bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri, degişlilikde 7,93%35 we 10,21%) 42. Häzirki stasionar fazanyň uglerod ýüklenmesi pes, sebäbi häzirki SP-ni taýýarlamakda stiroldan başga-da, fenilmaleimid-metilwinilizosiýanat (PCMP) we 4-gidroksi-TEMPO ýaly käbir polýar ligandlar ulanyldy. Häzirki stasionar fazanyň azot agramynyň göterimi öňki gözleglerde degişlilikde 0,1735 we 0,85% azot bilen deňeşdirilende 2,21% -dir. Bu, häzirki stasionar fazada fenilmaleimid sebäpli azotyň agramynyň göteriminiň has ýokarydygyny aňladýar. Şonuň ýaly-da, (4) we (5) önümleriniň uglerod ýüklenmesi degişlilikde 2,7% we 2,9% boldy, soňky önümiň uglerod ýüklenmesi bolsa... (6) 2-nji tablisada görkezilişi ýaly 6,35% boldy. Agramyň ýitmegi PMP stasionar fazasy bilen barlandy we TGA egrisi 4-nji suratda görkezildi. TGA egrisi 8,6% agramyň ýitmegini görkezýär, bu bolsa uglerod ýüklenmesi (6,35%) bilen gowy gabat gelýär, sebäbi ligandlar diňe C-ni däl, eýsem N, O we H-ni hem öz içine alýar.
Fenilmaleimid-metilwinilizosiýanat ligandi kremniý bölejikleriniň ýüzleý modifikasiýa üçin saýlandy, sebäbi onuň polýar fenilmaleimid toparlary we winilizosýanat toparlary bar. Winil izosiýanat toparlary stirol bilen diri radikal polimerleşme arkaly has reaksiýa girip bilerler. Ikinji sebäp, analit bilen ortaça özara täsirleşýän we analit bilen hereketsiz fazanyň arasynda güýçli elektrostatik özara täsirleşme bolmadyk topary goşmakdyr, sebäbi fenilmaleimid böleginiň normal pH-da wirtual zarýady ýok. Hereketsiz fazanyň polýarlygy stirolyň optimal mukdary we erkin radikal polimerleşmesiniň reaksiýa wagty bilen dolandyrylyp bilner. Reaksiýanyň soňky ädimi (erkin radikal polimerleşme) örän möhümdir we hereketsiz fazanyň polýarlygyny üýtgedip biler. Bu hereketsiz fazalaryň uglerod ýüklenmesini barlamak üçin elementar analiz geçirildi. Stirolyň mukdaryny we reaksiýa wagtyny köpeltmegiň hereketsiz fazanyň uglerod ýüklenmesini köpeltýändigi we tersine bolandygy bellenildi. Stirolyň dürli konsentrasiýalary bilen taýýarlanan SP-leriň dürli uglerod ýüklenmeleri bar. Bu hereketsiz fazalary ýene-de poslamaýan polat sütunlara ýükleň we olary barlaň. hromatografiki görkeziji (seçijilik, çözgüt, N gymmaty we ş.m.). Bu tejribelere esaslanyp, gözegçilik edilýän polýarlygy we analiz maddalarynyň gowy saklanmagyny üpjün etmek üçin PMP stasionar fazasyny taýýarlamak üçin optimizirlenen formula saýlanyldy.
Bäş peptid garyndysy (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leýsin enkefalin) hem ykjam faza ulanylýan PMP sütüniniň kömegi bilen bahalandyryldy; 80 μL/min akym tizliginde 60/40 (h/h) asetonitril/suw (0.1% TFA). Optimal elusiýa şertlerinde, her sütün üçin nazaryýet plastinkasynyň sany (N) (100 × 1.8 mm id) 20,000 ± 100 (200,000 plastinka/m²). 3-nji tablisada üç PMP sütün üçin N gymmatlyklary berilýär we hromatogrammalar 5A suratda görkezilen. Ýokary akym tizliginde (700 μL/min) PMP sütüninde çalt analiz, bir minutda bäş peptid elusiýa edildi, N gymmatlyklary örän gowy boldy, her sütün üçin 13,500 ± 330 (100 × 1.8 mm id), 135,000 plastinka/m2-e gabat gelýär (5B surat). Barlamak üçin üç sany birmeňzeş ululykdaky sütün (100 × 1.8 mm id) üç dürli PMP stasionar fazasy bilen dolduryldy. gaýtalanmagy. Her sütün üçin analit konsentrasiýasy iň gowy elusiýa şertlerini we nazary plastinkalaryň sanyny N we her sütündäki şol bir synag garyndysyny bölmek üçin saklanyş wagtyny ulanyp ýazylyp alyndy. PMP sütünleri üçin gaýtalanmagy maglumatlary 4-nji tablisada görkezilen. PMP sütüniniň gaýtalanmagy 3-nji tablisada görkezilişi ýaly, örän pes %RSD gymmatlyklary bilen gowy baglanyşyklydyr.
PMP sütüninde (B) we Ascentis Express RP-Amide sütüninde (A) peptid garyndysynyň bölünmegi; ykjam faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP sütün ölçegleri (100 × 1.8 mm id); analitiki Birleşmeleriň elusiýa tertibi: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) we 5 (leýsin) kislotasy enkefalin)).
Ýokary netijeli suwuk hromatografiýada adam serum albumininiň triptik digestlerini bölmek üçin PMP sütün (100 × 1.8 mm id) bahalandyryldy. 6-njy suratdaky hromatogramma nusganyň gowy bölünendigini we çözgüdiň örän gowydygyny görkezýär. HSA digestleri 100 µL/min akym tizligi, hereketli faza 70/30 asetonitril/suw we 0.1% TFA ulanylyp seljerildi. Hromatogrammada görkezilişi ýaly (6-njy surat), HSA digest 17 peptide laýyk gelýän 17 depelere bölündi. HSA digestdäki her depeleriň bölüniş netijeliligi hasaplandy we gymmatlyklar 5-nji tablisada berildi.
HSA-nyň triptik digesti (100 × 1.8 mm id) PMP sütüninde bölünip alyndy; akym tizligi (100 µL/min), hereketli faza 60/40 asetonitril/suw, 0.1% TFA bilen.
bu ýerde L sütün uzynlygy, η hereketli fazanyň ýapyşganlygy, ΔP sütün yzyna basyşy we u hereketli fazanyň çyzykly tizligidir. PMP sütüniniň geçirijiligi 2,5 × 10-14 m2, akym tizligi 25 μL/min we 60/40 v/v ACN/suw ulanyldy. PMP sütüniniň geçirijiligi (100 × 1,8 mm id) öňki gözlegimiziň 34-nji salgylanmasyna meňzeşdi. Ýüzleý gözenekli bölejikler bilen doldurylan sütüniniň geçirijiligi: 1,3 μm bölejikler üçin 1,7 × 10-15, 1,7 μm bölejikler üçin 3,1 × 10-15, 2,6 μm bölejikler üçin 5,2 × 10-15 we 2,5 × 10-14 m2 5 μm bölejikler üçin 43. Şonuň üçin PMP fazasynyň geçirijiligi 5 μm özen-gabyk geçirijiligine meňzeşdir. bölejikler.
bu ýerde Wx hloroform bilen doldurylan sütün agramy, Wy metanol bilen doldurylan sütün agramy we ρ erijiniň dykyzlygydyr. Metanolyň (ρ = 0.7866) we hloroformyň (ρ = 1.484) dykyzlyklary. Öň öwrenen KREMINIS BÖLEKÇELERI-C18 sütünleriniň (100 × 1.8 mm id) 34 we C18-Karbamid sütünleriniň 31 umumy gözenekliligi degişlilikde 0.63 we 0.55 boldy. Bu, karbamid ligandlarynyň bolmagynyň hereketsiz fazanyň geçirijiligini peseldýändigini aňladýar. Beýleki tarapdan, PMP sütüniniň umumy gözenekliligi (100 × 1.8 mm id) 0.60-a deňdir. PMP sütünleriniň geçirijiligi C18 bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri bilen doldurylan sütünleriňkiden pes, sebäbi C18 görnüşli hereketsiz fazalarda C18 ligandlary kremniý bölejiklerine çyzykly zynjyrlar hökmünde birikdirilýär, polistirol görnüşli hereketsiz fazalarda bolsa, A deňeşdirme boýunça galyň onuň daşynda polimer gatlagy emele gelýär. Adaty tejribede sütün gözenekliligi aşakdaky ýaly hasaplanýar:
7A, B suratlarynda wan Deemter diagrammasynyň şol bir elusiýa şertlerini (ýagny 60/40 ACN/H2O we 0.1% TFA) ulanyp, PMP sütüni (100 × 1.8 mm id) we Ascentis Express RP-Amide sütüni (100 × 1.8 mm id) görkezilýär. Saýlanan peptid garyndylary (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL/-de taýýarlanyldy. Iki sütün üçin hem minimal akym tizligi 800 µL/min. PMP sütün we Ascentis Express RP-Amide sütünleri üçin optimal akym tizliginde (80 µL/min) minimal HETP gymmatlyklary degişlilikde 2.6 µm we 3.9 µm boldy. HETP gymmatlyklary PMP sütüniniň (100 × 1.8 mm id) bölüniş netijeliliginiň satuwda elýeterli Ascentis Express RP-Amide sütüninden (100 × 1.8 mm id) has gowydygyny görkezýär. 7-nji suratdaky (A) wan Deemter diagrammasy, akym artýança N gymmatynyň azalmagynyň öňki gözlegimize garanyňda möhüm däldigini görkezýär. PMP sütüniniň (100 ×) ýokary bölüniş netijeliligi Ascentis Express RP-Amide sütünine deňeşdirilende 1.8 mm id) häzirki işde ulanylýan bölejikleriň görnüşindäki, ölçegindäki we sütünleri gaplamak boýunça çylşyrymly proseduralaryň gowulandyrylmagyna esaslanýar34.
(A) 0.1% TFA bilen 60/40 ACN/H2O-da PMP sütünini (100 × 1.8 mm id) ulanyp alnan van Deemter grafigi (HETP we hereketli faza çyzykly tizligi).(B) 0.1% TFA bilen 60/40 ACN/H2O-da Ascentis Express RP-Amide sütünini (100 × 1.8 mm id) ulanyp alnan van Deemter grafigi (HETP we hereketli faza çyzykly tizligi).
Polýar gömülýän polistirol stasionar fazasy taýýarlanyldy we ýokary netijeli suwuklyk hromatografiýasynda adam serum albumininiň (HAS) sintetiki peptid garyndylaryny we tripsin digestlerini aýyrmak üçin bahalandyryldy. Peptid garyndylary üçin PMP sütunlarynyň hromatografik görkezijileri bölmek netijeliligi we çözgüdi babatda ajaýypdyr. PMP sütunlarynyň bölünmek netijeliliginiň ýokarlanmagy dürli sebäplere, mysal üçin, kremniý bölejikleriniň bölejikleriniň ululygyna we gözenekleriniň ululygyna, stasionar fazanyň gözegçilikli sintezine we sütunlaryň çylşyrymly gaplamasyna baglydyr. Ýokary bölünmek netijeliliginden başga-da, ýokary akym tizliginde sütunlaryň pes basyşy bu stasionar fazanyň ýene bir artykmaçlygydyr. PMP sütunlary gowy gaýtalanmagy görkezýär we dürli beloklaryň peptid garyndylaryny we tripsin digestasiýasyny seljermek üçin ulanylyp bilner. Biz bu sütuny suwuklyk hromatografiýasynda tebigy önümleri, dermanlyk ösümliklerden bioaktiw birleşmeleri we kömelek ekstraktlaryny aýyrmak üçin ulanmagy meýilleşdirýäris. Geljekde PMP sütunlary beloklary we monoklonal antitelalary aýyrmak üçin hem bahalandyrylar.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. we Petersson, P. Ters fazaly hromatografiýa arkaly peptid bölmek ulgamlary boýunça ylmy barlaglar I bölüm: Sütünleriň häsiýetnamasynyň protokolyny işläp düzmek. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. we başg. Ýokanç keselleri bejermek üçin döredilen gowulandyrylan işjeň peptidler. Biotehnologiýa. Öňdebaryjy.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. we Khrestchatisky, M. Sintetiki terapewtiki peptidler: ylym we bazar. Derman açyşy.15 (1-2) şu gün, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Öňdebaryjy Proteomik Suwuklyk Hromatografiýasy. J. Hromatografiýasy. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. we beýlekiler. Ösen suwuklyk hromatografiýasy-mass spektrometriýasy giň maksatly metabolomikany we proteomikany goşmaga mümkinçilik berýär. anus. Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Çesnut, SM we Salisbury, JJ Derman işläp düzmekde UHPLC-niň roly. J. Sentýabr. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. we Klauzen, AM Çalt bölünip almak üçin ultra ýokary basyşly suwuklyk hromatografiýasynyň esasy we amaly taraplary. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA we Tchelitcheff, P. Derman işläp düzmekde örän ýokary netijeli suwuk hromatografiýasynyň ulanylyşy. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. we başg. Enterowiruslary netijeli arassalamak üçin suwdaky ýagyň ýokary içki fazaly emulsiýalaryndan taýýarlanan monolit makrogözenekli gidrogeller. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Şi, Ý., Xiang, R., Horvat, C. we Wilkins, JA Suwuk hromatografiýanyň proteomikadaky roly. J. Hromatografiýa. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Terapewtiki peptidleriň we beloklaryň tersine fazaly suwuklyk hromatografiýasyny bölmekde täze tendensiýalar: teoriýa we ulanylyşlar. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE we Gebler, JC Birinji we ikinji bölmek ölçeglerinde dürli pH gymmatlyklaryny ulanyp, RP-RP-HPLC ulgamyny ulanyp peptidleriň iki ölçegli bölünişi. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. we beýlekiler. C18 sub-2 μm doly we ýüzleý gözenekli bölejikler bilen doldurylan ýokary netijeli hromatografik sütünleriň massa geçirijilik häsiýetnamalary we kinetiki görkezijileri öwrenildi. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. we beýlekiler. Ösümlik bioaktiw peptidlerini bölüp almakda, kesgitlemekde we tassyklamakda soňky tendensiýalar we analitiki kynçylyklar. anus.biologik anus. Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB we beýlekiler. Ýaşaýyş patyşalygynyň proteomik landşafty. Tebigat 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. we başg. Terapewtiki peptidleriň taýýarlyk suwuk hromatografiýasy arkaly aşaky akymda işlenilmegi. Molecule (Bazel, Şweýsariýa) 26(15), 4688(2021).
Ýang, Y. we Geng, X. Gatyşyk režimli hromatografiýa we onuň biopolimerlere ulanylyşy. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. we Sun, Y. Garyşyk režimli belok hromatografiýasy üçin ligandlar: prinsip, häsiýetlendirme we dizaýn. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).