Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte ondersteuning vir CSS. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer afskakel). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript vertoon.
Poreuse silikadeeltjies is voorberei deur 'n sol-gel-metode met 'n paar wysigings om makroporeuse deeltjies te verkry. Hierdie deeltjies is gederivatiseer deur omkeerbare addisiefragmentasiekettingoordrag (RAFT) polimerisasie met N-fenielmaleïmied-metielvinielisosianaat (PMI) en stireen om N-fenielmaleïmied-interkalasie van polistireen (PMP) stasionêre fase voor te berei. Smalboring vlekvrye staalkolomme (100 × 1.8 mm id) is gepak deur slurrypakking. Geëvalueerde PMP-kolomskeiding van 'n peptiedmengsel bestaande uit vyf peptiede (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusien-enkefalien) chromatografiese prestasie) en tripsinvertering van menslike serumalbumien (HAS). Onder optimale elueringstoestande is die teoretiese plaattelling van die peptiedmengsel so hoog as 280 000 plate/m². Vergelyking van die skeidingsprestasie van die ontwikkelde kolom met die kommersiële Ascentis Express. RP-Amiedkolom, is waargeneem dat die skeidingsprestasie van die PMP-kolom beter was as die kommersiële kolom in terme van skeidingsdoeltreffendheid en resolusie.
In onlangse jare het die biofarmaseutiese industrie 'n groeiende globale mark geword met 'n aansienlike toename in markaandeel. Met die plofbare groei van die biofarmaseutiese industrie1,2,3 is die analise van peptiede en proteïene hoogs gewild. Benewens die teikenpeptied word verskeie onsuiwerhede tydens peptiedsintese gegenereer, wat chromatografiese suiwering vereis om peptiede van die verlangde suiwerheid te verkry. Die analise en karakterisering van proteïene in liggaamsvloeistowwe, weefsels en selle is 'n uiters uitdagende taak as gevolg van die groot aantal potensieel opspoorbare spesies in 'n enkele monster. Alhoewel massaspektrometrie 'n effektiewe instrument vir peptied- en proteïenvolgordebepaling is, sal die skeiding nie ideaal wees as sulke monsters in een deurgang in die massaspektrometer ingespuit word nie. Hierdie probleem kan versag word deur vloeistofchromatografie (LC) skeidings voor MS-analise te implementeer, wat die aantal analiete wat die massaspektrometer op 'n gegewe tydstip binnedring, sal verminder4,5,6. Daarbenewens kan analiete tydens vloeistoffaseskeiding in nou streke gefokus word, waardeur hierdie analiete gekonsentreer word en MS-opsporingsgevoeligheid verbeter word. Vloeistofchromatografie (LC) het die afgelope dekade aansienlik gevorder en het 'n gewilde ... geword. tegniek in proteomiese analise7,8,9,10.
Omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (RP-LC) word wyd gebruik vir die suiwering en skeiding van peptiedmengsels met behulp van oktadecyl-gemodifiseerde silika (ODS) as die stasionêre fase11,12,13. RP stasionêre fases bied egter nie bevredigende skeiding van peptiede en proteïene nie as gevolg van hul komplekse struktuur en amfifiele aard14,15. Daarom is spesiaal ontwerpte stasionêre fases nodig om peptiede en proteïene met polêre en nie-polêre groepe te analiseer om met hierdie analiete te interaksie te hê en dit te behou16. Gemengde-modus chromatografie, wat multimodale interaksies bied, kan 'n alternatief vir RP-LC wees vir die skeiding van peptiede, proteïene en ander komplekse mengsels. Verskeie gemengde-modus stasionêre fases is voorberei, en kolomme gepak met hierdie fases is gebruik vir peptied- en proteïenskeidings17,18,19,20,21. Gemengde-modus stasionêre fases (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polêre interkalasie/RPLC) is geskik vir peptied- en proteïenskeidings as gevolg van die teenwoordigheid van beide polêre en nie-polêre groepe22,23,24,25,26,27,28. Net so toon polêre interkalerende stasionêre fases met kovalent gebonde polêre groepe goeie skeidingskrag en unieke selektiwiteit vir polêre en nie-polêre analiete, aangesien skeiding afhang van die interaksie tussen analiet en stasionêre fase. Multimodale interaksies29, 30, 31, 32. Onlangs het Zhang et al.30 'n dodeksiel-getermineerde poliamien stasionêre fase voorberei en koolwaterstowwe, antidepressante, flavonoïede, nukleosiede, estrogeen en verskeie ander analiete suksesvol geskei.Die polêre interkalator het beide polêre en nie-polêre groepe, dus kan dit gebruik word om peptiede en proteïene te skei wat beide hidrofobiese en hidrofiliese dele het.Pool-ingebedde kolomme (bv. amied-ingebedde C18-kolomme) is kommersieel beskikbaar onder die handelsnaam Ascentis Express RP-Amied-kolomme, maar hierdie kolomme word slegs vir die analise van amien 33 gebruik.
In die huidige studie is 'n polêr-ingebedde stasionêre fase (N-fenielmaleïmied-ingebedde polistireen) voorberei en geëvalueer vir die skeiding van peptiede en tripsin-verteer van HSA. Die stasionêre fase is voorberei met behulp van die volgende strategie. Poreuse silika-deeltjies is voorberei volgens die prosedure wat in ons vorige publikasie gegee is, met 'n paar wysigings aan die voorbereidingsprotokol. Die verhouding van ureum, poliëtileenglikol (PEG), TMOS, water en asynsuur is aangepas om silika-deeltjies met 'n groot poriegrootte voor te berei. Tweedens is 'n nuwe ligand, fenielmaleïmied-metielvinielisosianaat, gesintetiseer en gebruik om silika-deeltjies te derivatiseer om 'n polêr ingebedde stasionêre fase voor te berei. Die gevolglike stasionêre fase is in 'n vlekvrye staalkolom (100 × 1.8 mm binnediameter) gepak met behulp van die geoptimaliseerde pakskema. Die kolompakking word bygestaan ​​met meganiese vibrasie om te verseker dat 'n homogene bed binne die kolom gevorm word. Evalueer gepakte kolomskeiding van peptiedmengsels wat uit vyf peptiede bestaan; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leusien Enkefalien) en Tripsienvertering van menslike serumalbumien (HAS). Daar is waargeneem dat die peptiedmengsel en tripsienvertering van HSA met goeie resolusie en doeltreffendheid skei. Die skeidingsprestasie van die PMP-kolom is vergelyk met dié van die Ascentis Express RP-Amied-kolom. Beide peptiede en proteïene is waargeneem as goed opgelos en doeltreffend op die PMP-kolom, wat meer doeltreffend was as die Ascentis Express RP-Amied-kolom.
PEG (Poliëtileenglikol), Ureum, Asynsuur, Trimetoksiortosilikaat (TMOS), Trimetielchlorosilaan (TMCS), Tripsien, Menslike Serumalbumien (HSA), Ammoniumchloried, Ureum, Heksaanmetieldisilazaan (HMDS), Metakriloïelchloried (MC), Styreen, 4-Hidroksi-TEMPO, Bensoïelperoksied (BPO), HPLC-graad asetonitriel (ACN), Metanol, 2-Propanol en Asetoon. Gekoop van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VSA).
'n Mengsel van ureum (8 g), poliëtileenglikol (8 g) en 8 ml 0.01 N asynsuur is vir 10 minute geroer, en toe is 24 ml TMOS onder yskoue toestande bygevoeg. Die reaksiemengsel is vir 6 uur by 40°C verhit en daarna vir 8 uur by 120°C in 'n vlekvrye staal-outoklaaf. Die water is afgegooi en die oorblywende materiaal is vir 12 uur by 70°C gedroog. Die gedroogde sagte massa is glad in 'n oond gemaal en vir 12 uur by 550°C gekalsineer. Drie bondels is voorberei en gekarakteriseer om die reproduceerbaarheid in deeltjiegrootte, poriegrootte en oppervlakarea te ondersoek.
Deur oppervlakmodifikasie van silikadeeltjies met voorafgesintetiseerde ligand fenielmaleïmied-metielvinielisosianaat (PCMP) gevolg deur radiale polimerisasie met stireen, is 'n polêre groepbevattende verbinding voorberei. Stasionêre fase vir aggregate en polistireenkettings. Die voorbereidingsproses word hieronder beskryf.
N-fenielmaleïmied (200 mg) en metielvinielisosianaat (100 mg) is in droë tolueen opgelos, en 0.1 mL 2,2'-azoisobutyronitriel (AIBN) is by die reaksiefles gevoeg om fenielmaleïmied-metielvinielisosianaat kopolimeer (PMCP) voor te berei. Die mengsel is vir 3 uur by 60°C verhit, gefiltreer en vir 3 uur in 'n oond by 40°C gedroog.
Gedroogde silikadeeltjies (2 g) is in droë tolueen (100 ml) versprei, geroer en vir 10 minute in 'n 500 ml rondebodemfles gesonikeer. PMCP (10 mg) is in tolueen opgelos en drupsgewys via 'n druppeltregter by die reaksiefles gevoeg. Die mengsel is vir 8 uur by 100 °C terugvloei, gefiltreer en met asetoon gewas en vir 3 uur by 60 °C gedroog. Daarna is PMCP-gebonde silikadeeltjies (100 g) in tolueen (200 ml) opgelos en 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) is bygevoeg in die teenwoordigheid van 100 µL dibutieltindilauraat as 'n katalisator. Die mengsel is vir 8 uur by 50 °C geroer, gefiltreer en vir 3 uur by 50 °C gedroog.
Stireen (1 ml), bensoïelperoksied BPO (0.5 ml), en TEMPO-PMCP-gehegte silikadeeltjies (1.5 g) is in tolueen versprei en met stikstof gesuiwer. Die polimerisasie van stireen is vir 12 uur by 100°C uitgevoer. Die gevolglike produk is met metanol gewas en oornag by 60°C gedroog. Die algehele reaksieskema word in Figuur 1 getoon.
Die monsters is vir 1 uur by 393 K ontgas om 'n residuele druk van minder as 10-3 Torr te verkry. Die hoeveelheid N2 wat by 'n relatiewe druk van P/P0 = 0.99 geadsorbeer is, is gebruik om die totale porievolume te bepaal. Die morfologie van kaal en ligandgebonde silikadeeltjies is ondersoek met skandeerelektronmikroskopie (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Gedroogde monsters (kaal silika en ligandgebonde silikadeeltjies) is met behulp van kleefkoolstofband op 'n aluminiumkolom geplaas. Goud is op die monsters geplateer met behulp van 'n Q150T-sputterbedekker, en 'n 5 nm Au-laag is op die monsters neergelê. Dit verbeter prosesdoeltreffendheid met behulp van lae spannings en bied fynkorrel-, koue sputtering. 'n Thermo Electron (Waltham, MA, VSA) Flash EA1112 elementontleder is gebruik vir elementontleding. 'n Malvern (Worcestershire, VK) Mastersizer 2000 deeltjiegrootte-ontleder is gebruik om die deeltjiegrootteverspreiding te verkry. Naakte silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies (5 mg elk) is in 5 mL isopropanol versprei, vir 10 min gesonikeer, vir 5 min gevortex en op die optiese bank van die Mastersizer geplaas. Termogravimetriese analise is teen 'n tempo van 5 °C per minuut oor 'n temperatuurreeks van 30 tot 800 °C uitgevoer.
Glasgevoerde vlekvrye staal smalloopkolomme met afmetings (100 × 1.8 mm binnediameter) is gepak met behulp van die slurrypakkingsmetode, met dieselfde prosedure as in Ref. 31. 'n Vlekvrye staalkolom (glasgevoerd, 100 × 1.8 mm binnediameter) met 'n uitlaatfitting wat 'n 1 µm frit bevat, is aan 'n slurrypakker (Alltech Deerfield, IL, VSA) gekoppel. Berei 'n stasionêre fase-slurry voor deur 150 mg stasionêre fase in 1.2 mL metanol op te suspendeer en dit na die stoorkolom te stuur. Metanol is as die slurryoplosmiddel sowel as die dryfmiddel gebruik. Vul die kolom opeenvolgend deur druk van 100 MP vir 10 minute, 80 MP vir 15 minute en 60 MP vir 30 minute toe te pas. Tydens pakking is meganiese vibrasie met twee GC-kolomskudders (Alltech, Deerfield, IL, VSA) toegepas om eenvormige pakking van die kolom te verseker. Maak die slurrypakker toe en laat die druk stadig vry om enige skade binne die kolom te voorkom. Ontkoppel die kolom van die slurrypakkingseenheid en koppel 'n ander fitting aan die inlaat en aan die LC-stelsel om die werkverrigting daarvan te kontroleer.
'n LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), inspuiter (Valco (VSA) C14 W.05) met 50nL inspuitlus, membraanontgasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillêre venster is gebou. Spesiale µLC-toesteldetektor (UV-2075) en glasgevoerde mikrokolomme. Gebruik baie nou en kort verbindingspype om die effek van ekstra kolombandverbreding te verminder. Na verpakking is kapillêre (50 μm id 365) en reduseerende unie-kapillêre (50 μm) by die 1/16″-uitlaat van die reduseerende unie geïnstalleer. Data-insameling en chromatografiese verwerking is gedoen met behulp van Multichro 2000-sagteware. Monitering teen 254 nm. Analiete is getoets vir UV-absorbansie. Chromatografiese data is geanaliseer deur OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumien van menslike serum, gevriesdroogde poeier, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg gemeng met tripsin (1.5 mg), 4.0 M ureum (1 mL), en 0.2 M ammoniumbikarbonaat (1 mL). Die oplossing is vir 10 minute geroer en vir 6 uur in 'n waterbad by 37°C gehou, en toe geblus met 1 mL 0.1% TFA. Filtreer die oplossing en bêre onder 4 °C.
Skeiding van peptiedmengsels en HSA-tripsinverte is afsonderlik op PMP-kolomme geëvalueer. Kontroleer die skeiding van die peptiedmengsel en tripsinverte van HSA deur die PMP-kolom en vergelyk die resultate met die Ascentis Express RP-Amied-kolom. Die teoretiese plaatgetal word soos volg bereken:
SEM-beelde van kaal silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies word in FIG. 2 getoon. SEM-beelde van kaal silikadeeltjies (A, B) toon dat, in teenstelling met ons vorige studies, hierdie deeltjies sferies is waarin die deeltjies verleng is of onreëlmatige simmetrie het. Die oppervlak van die ligandgebonde silikadeeltjies (C, D) is gladder as dié van die kaal silikadeeltjies, wat moontlik te wyte is aan die bedekking van polistireenkettings op die oppervlak van die silikadeeltjies.
Skandeerelektronmikroskoopbeelde van kaal silikadeeltjies (A, B) en ligandgebonde silikadeeltjies (C, D).
Die deeltjiegrootteverspreidings van kaal silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies word in Figuur 3(A) getoon. Volume-gebaseerde deeltjiegrootteverspreidingskrommes het getoon dat die grootte van die silikadeeltjies toegeneem het na chemiese modifikasie (Fig. 3A). Die deeltjiegrootteverspreidingsdata van die silikadeeltjies van die huidige studie en die vorige studie word in Tabel 1(A) vergelyk. Die volume-gebaseerde deeltjiegrootte, d(0.5), van PMP is 3.36 μm, in vergelyking met ons vorige studie met 'n ad(0.5)-waarde van 3.05 μm (polistireengebonde silikadeeltjies)34. Hierdie bondel het 'n nouer deeltjiegrootteverspreiding gehad in vergelyking met ons vorige studie as gevolg van die wisselende verhoudings van PEG, ureum, TMOS en asynsuur in die reaksiemengsel. Die deeltjiegrootte van die PMP-fase is effens groter as dié van die polistireengebonde silikadeeltjiefase wat ons voorheen bestudeer het. Dit beteken dat oppervlakfunksionalisering van silikadeeltjies met stireen slegs 'n polistireenlaag (0.97 µm) op die silika-oppervlak neergelê het, terwyl die laagdikte in die PMP-fase... 1.38 µm.
Deeltjiegrootteverspreiding (A) en poriegrootteverspreiding (B) van kaal silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies.
Die poriegrootte, porievolume en oppervlakarea van die silikadeeltjies van die huidige studie word in Tabel 1(B) gegee. Die PSD-profiele van kaal silikadeeltjies en ligandgebonde silikadeeltjies word in Figuur 3(B) getoon. Die resultate is vergelykbaar met ons vorige studie. Die poriegroottes van die kaal en ligandgebonde silikadeeltjies is onderskeidelik 310 en 241, wat aandui dat die poriegrootte met 69 afneem na chemiese modifikasie, soos in Tabel 1(B) getoon, en die verandering van die kurwe word in Fig. 3(B) getoon. Net so het die porievolume van die silikadeeltjies afgeneem van 0.67 tot 0.58 cm3/g na chemiese modifikasie. Die spesifieke oppervlakarea van die tans bestudeerde silikadeeltjies is 116 m2/g, wat vergelykbaar is met ons vorige studie (124 m2/g). Soos in Tabel 1(B) getoon, het die oppervlakarea (m2/g) van die silikadeeltjies ook afgeneem van 116 m2/g tot 105 m2/g na chemiese modifikasie. wysiging.
Die resultate van elementanalise van die stasionêre fase word in Tabel 2 getoon. Die koolstoflading van die huidige stasionêre fase is 6.35%, wat laer is as die koolstoflading van ons vorige studie (polistireen-gebonde silika-deeltjies, onderskeidelik 7.93%35 en 10.21%)42. Die koolstoflading van die huidige stasionêre fase is laag, want in die voorbereiding van die huidige SP is, benewens stireen, ook sommige polêre ligande soos fenielmaleïmied-metielvinielisosianaat (PCMP) en 4-hidroksi-TEMPO gebruik. Die stikstofgewigpersentasie van die huidige stasionêre fase is 2.21%, in vergelyking met onderskeidelik 0.1735 en 0.85 gewig% stikstof in vorige studies. Dit beteken dat die gewig% stikstof hoër is in die huidige stasionêre fase as gevolg van fenielmaleïmied. Net so was die koolstofladings van produkte (4) en (5) onderskeidelik 2.7% en 2.9%, terwyl die koolstoflading van die finale produk (6) was 6.35%, soos getoon in Tabel 2. Die gewigsverlies is gekontroleer met PMP stasionêre fase, en die TGA-kromme word in Figuur 4 getoon. Die TGA-kromme toon 'n gewigsverlies van 8.6%, wat in goeie ooreenstemming is met die koolstoflading (6.35%) omdat die ligande nie net C bevat nie, maar ook N, O en H.
Die fenielmaleïmied-metielvinielisosianaatligand is gekies vir oppervlakmodifikasie van silikadeeltjies omdat dit polêre fenielmaleïmiedgroepe en vinielisosianaatgroepe het. Vinielisosianaatgroepe kan verder met stireen reageer deur lewende radikaalpolimerisasie. Die tweede rede is om 'n groep in te voeg wat 'n matige interaksie met die analiet het en geen sterk elektrostatiese interaksie tussen die analiet en die stasionêre fase nie, aangesien die fenielmaleïmieddeel geen virtuele lading by normale pH het nie. Die polariteit van die stasionêre fase kan beheer word deur die optimale hoeveelheid stireen en die reaksietyd van vrye radikaalpolimerisasie. Die laaste stap van die reaksie (vrye radikaalpolimerisasie) is krities en kan die polariteit van die stasionêre fase verander. Elementanalise is uitgevoer om die koolstoflading van hierdie stasionêre fases na te gaan. Daar is waargeneem dat die verhoging van die hoeveelheid stireen en die reaksietyd die koolstoflading van die stasionêre fase verhoog het en andersom. SP's wat met verskillende konsentrasies stireen voorberei is, het verskillende koolstofladings. Laai hierdie stasionêre fases weer in vlekvrye staalkolomme en kontroleer hul chromatografiese werkverrigting (selektiwiteit, resolusie, N2). waarde, ens.). Gebaseer op hierdie eksperimente, is 'n geoptimaliseerde formulering gekies om die PMP stasionêre fase voor te berei om beheerde polariteit en goeie analietretensie te verseker.
Vyf peptiedmengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusien-enkefalien) is ook geëvalueer met behulp van 'n PMP-kolom wat 'n mobiele fase gebruik; 60/40 (v/v) asetonitriel/water (0.1% TFA) teen 'n vloeitempo van 80 μL/min. Onder optimale elueringstoestande is die teoretiese plaatgetal (N) per kolom (100 × 1.8 mm id) 20 000 ± 100 (200 000 plate/m²). Tabel 3 gee die N-waardes vir die drie PMP-kolomme en die chromatogramme word in Figuur 5A getoon. Vinnige analise op 'n PMP-kolom teen hoë vloeitempo (700 μL/min), vyf peptiede is binne een minuut geëlueer, N-waardes was baie goed, 13 500 ± 330 per kolom (100 × 1.8 mm id), stem ooreen met 135 000 plate/m² (Figuur 5B). Drie identies groot kolomme (100 × 1.8 mm id) is gepak met drie verskillende lotte PMP stasionêre fase om reproduceerbaarheid te kontroleer. Die Die analietkonsentrasie vir elke kolom is aangeteken met behulp van die optimale elueringskondisies en die aantal teoretiese plate N en retensietyd om dieselfde toetsmengsel op elke kolom te skei. Die reproduceerbaarheidsdata vir die PMP-kolomme word in Tabel 4 getoon. Die reproduceerbaarheid van die PMP-kolom korreleer goed met baie lae %RSD-waardes, soos getoon in Tabel 3.
Skeiding van peptiedmengsel op PMP-kolom (B) en Ascentis Express RP-Amied-kolom (A); mobiele fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP-kolomdimensies (100 × 1.8 mm id); analities Die elueringsvolgorde van die verbindings: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 (leusien) suur enkefalien)).
'n PMP-kolom (100 × 1.8 mm id) is geëvalueer vir die skeiding van triptiese verterings van menslike serumalbumien in hoëprestasievloeistofchromatografie. Die chromatogram in Figuur 6 toon dat die monster goed geskei is en die resolusie baie goed is. HSA-verterings is geanaliseer met behulp van 'n vloeitempo van 100 µL/min, mobiele fase 70/30 asetonitriel/water en 0.1% TFA. Soos getoon in die chromatogram (Figuur 6), is die HSA-vertering verdeel in 17 pieke wat ooreenstem met 17 peptiede. Die skeidingsdoeltreffendheid van elke piek in die HSA-vertering is bereken en die waardes word in Tabel 5 gegee.
'n Triptiese vertering van HSA (100 × 1.8 mm id) is op 'n PMP-kolom geskei; vloeitempo (100 µL/min), mobiele fase 60/40 asetonitriel/water met 0.1% TFA.
waar L die kolomlengte is, η die viskositeit van die mobiele fase is, ΔP die kolomteendruk is, en u die lineêre snelheid van die mobiele fase is. Die deurlaatbaarheid van die PMP-kolom was 2.5 × 10-14 m2, die vloeitempo was 25 μL/min, en 60/40 v/v ACN/water is gebruik. Die deurlaatbaarheid van die PMP-kolom (100 × 1.8 mm id) was soortgelyk aan dié van ons vorige studie Ref.34. Die deurlaatbaarheid van die kolom gepak met oppervlakkig poreuse deeltjies is: 1.7 × 10-15 vir 1.3 μm deeltjies, 3.1 × 10-15 vir 1.7 μm deeltjies, 5.2 × 10-15 en 2.5 × 10-14 m2 vir 2.6 μm deeltjies. Vir 5 μm deeltjies 43. Daarom is die deurlaatbaarheid van die PMP-fase soortgelyk aan dié van 5 μm kern-dop deeltjies.
waar Wx die gewig van die kolom is wat met chloroform gepak is, Wy die gewig van die kolom is wat met metanol gepak is, en ρ die digtheid van die oplosmiddel is. Digthede van metanol (ρ = 0.7866) en chloroform (ρ = 1.484). Die totale porositeit van SILIKA-DELTJIES-C18 kolomme (100 × 1.8 mm id) 34 en C18-Ureum kolomme 31 wat ons voorheen bestudeer het, was onderskeidelik 0.63 en 0.55. Dit beteken dat die teenwoordigheid van ureumligande die deurlaatbaarheid van die stasionêre fase verminder. Aan die ander kant is die totale porositeit van die PMP-kolom (100 × 1.8 mm id) 0.60. Die deurlaatbaarheid van PMP-kolomme is laer as dié van kolomme wat met C18-gebonde silika-deeltjies gepak is, want in C18-tipe stasionêre fases is die C18-ligande as lineêre kettings aan die silika-deeltjies geheg, terwyl in polistireen-tipe stasionêre fases die relatief dik polimeerlaag... word daaromheen gevorm. In 'n tipiese eksperiment word die kolomporositeit bereken as:
Figuur 7A,B toon die PMP-kolom (100 × 1.8 mm id) en Ascentis Express RP-Amied-kolom (100 × 1.8 mm id) met dieselfde elueringskondisies (d.w.s. 60/40 ACN/H2O en 0.1% TFA) van die van Deemter-grafiek. Geselekteerde peptiedmengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leusien Enkefalien) is voorberei in 20 µL/. Die minimum vloeitempo vir beide kolomme is 800 µL/min. Die minimum HETP-waardes teen die optimale vloeitempo (80 µL/min) vir die PMP-kolom en die Ascentis Express RP-Amied-kolom was onderskeidelik 2.6 µm en 3.9 µm. Die HETP-waardes dui daarop dat die skeidingsdoeltreffendheid van die PMP-kolom (100 × 1.8 mm id) baie beter is as die kommersieel beskikbare Ascentis Express RP-Amied-kolom (100 × 1.8 mm id). Die van Deemter-grafiek in Fig. 7(A) toon dat die afname in N-waarde met toenemende vloei nie beduidend is in vergelyking met ons vorige studie nie. Die hoër skeidingsdoeltreffendheid van die PMP-kolom (100 × 1.8 mm id) in vergelyking met die Ascentis Express RP-Amide-kolom is gebaseer op verbeterings in deeltjievorm, grootte en komplekse kolompakkingsprosedures wat in die huidige werk gebruik word34.
(A) van Deemter-grafiek (HETP teenoor mobiele fase lineêre snelheid) verkry met behulp van 'n PMP-kolom (100 × 1.8 mm binnediameter) in 60/40 ACN/H2O met 0.1% TFA. (B) van Deemter-grafiek (HETP teenoor mobiele fase lineêre snelheid) verkry met behulp van 'n Ascentis Express RP-Amied-kolom (100 × 1.8 mm binnediameter) in 60/40 ACN/H2O met 0.1% TFA.
'n Polêr-ingebedde polistireen stasionêre fase is voorberei en geëvalueer vir die skeiding van sintetiese peptiedmengsels en tripsin-verterings van menslike serumalbumien (HAS) in hoëprestasievloeistofchromatografie. Die chromatografiese werkverrigting van PMP-kolomme vir peptiedmengsels is uitstekend in skeidingsdoeltreffendheid en resolusie. Die verbeterde skeidingswerkverrigting van PMP-kolomme is te wyte aan 'n verskeidenheid redes, soos die deeltjiegrootte en poriegrootte van die silika-deeltjies, beheerde sintese van die stasionêre fase, en komplekse kolompakking. Benewens hoë skeidingsdoeltreffendheid, is lae kolom-teendruk teen hoë vloeitempo's nog 'n voordeel van hierdie stasionêre fase. PMP-kolomme vertoon goeie reproduceerbaarheid en kan gebruik word vir die analise van peptiedmengsels en tripsin-vertering van verskeie proteïene. Ons beoog om hierdie kolom te gebruik vir die skeiding van natuurlike produkte, bioaktiewe verbindings van medisinale plante en swam-ekstrakte in vloeistofchromatografie. In die toekoms sal PMP-kolomme ook geëvalueer word vir die skeiding van proteïene en monoklonale teenliggaampies.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Navorsing oor peptiedskeidingstelsels deur omgekeerde fasechromatografie Deel I: Ontwikkeling van 'n kolomkarakteriseringsprotokol. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Verbeterde aktiewe peptiede ontwerp vir die behandeling van aansteeklike siektes. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetiese terapeutiese peptiede: wetenskap en die mark.dwelmondtdekking.15 (1-2) vandag, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gevorderde Proteomiese Vloeistofchromatografie. J. Chromatografie. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Gevorderde vloeistofchromatografie-massaspektrometrie maak die inkorporering van breed geteikende metabolomika en proteomika moontlik. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Die rol van UHPLC in geneesmiddelontwikkeling. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktiese aspekte van ultrahoëdrukvloeistofchromatografie vir vinnige skeidings. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Toepassing van ultrahoëprestasievloeistofchromatografie in geneesmiddelontwikkeling. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolitiese makroporeuse hidrogels voorberei uit olie-in-water hoë interne fase emulsies vir doeltreffende suiwering van enterovirusse. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Die rol van vloeistofchromatografie in proteomika. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Opkomende tendense in omgekeerde-fase vloeistofchromatografie-skeidings van terapeutiese peptiede en proteïene: teorie en toepassings. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionele skeiding van peptiede met behulp van 'n RP-RP-HPLC-stelsel met verskillende pH-waardes in die eerste en tweede skeidingsdimensies. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Die massa-oordragseienskappe en kinetiese werkverrigting van hoë-doeltreffendheid chromatografiese kolomme gepak met C18 sub-2 μm volledig en oppervlakkig poreuse deeltjies is ondersoek. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Onlangse tendense en analitiese uitdagings in die isolasie, identifisering en validering van plant bioaktiewe peptiede. anus. biologiese anus. Chemiese. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Die proteomiese landskap van die koninkryk van die lewe. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Afwaartse verwerking van terapeutiese peptiede deur preparatiewe vloeistofchromatografie. Molecule (Basel, Switserland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-modus chromatografie en die toepassing daarvan op biopolimere. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligande vir gemengde-modus proteïenchromatografie: beginsel, karakterisering en ontwerp. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).