Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad užtikrintumėte geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodysime be stilių ir „JavaScript“.
Porėtos silicio dioksido dalelės buvo paruoštos zolio-gelio metodu su tam tikrais pakeitimais, siekiant gauti makroporingas daleles. Šios dalelės buvo derivatizuotos grįžtamosios prijungimo fragmentacijos grandinės perdavimo (RAFT) polimerizacijos būdu su N-fenilmaleimido-metilvinilizocianatu (PMI) ir stirenu, siekiant paruošti polistireno (PMP) stacionariosios fazės N-fenilmaleimido interkaliaciją. Siaurojo skersmens nerūdijančio plieno kolonėlės (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) buvo pakuojamos suspensijos būdu. Įvertintas peptidų mišinio, sudaryto iš penkių peptidų (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucino enkefalino), atskyrimas PMP kolonėlėje (chromatografinis efektyvumas) ir žmogaus serumo albumino (HAS) skaidymas tripsinu. Optimaliomis eliucijos sąlygomis teorinis peptidų mišinio plokštelių skaičius siekia net 280 000 plokštelių/m². Lyginant sukurtos kolonėlės atskyrimo efektyvumą su komercine „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėle, buvo pastebėta, kad PMP kolonėlės atskyrimo efektyvumas ir skiriamoji geba buvo pranašesni už komercinę kolonėlę.
Pastaraisiais metais biofarmacijos pramonė tapo besiplečiančia pasauline rinka, kurios rinkos dalis gerokai išaugo. Dėl sprogstamojo biofarmacijos pramonės augimo1,2,3 labai pageidaujama peptidų ir baltymų analizė. Be tikslinio peptido, peptidų sintezės metu susidaro keletas priemaišų, todėl norint gauti norimo grynumo peptidus, reikia chromatografinio valymo. Baltymų analizė ir apibūdinimas kūno skysčiuose, audiniuose ir ląstelėse yra itin sudėtinga užduotis dėl didelio skaičiaus potencialiai aptinkamų rūšių viename mėginyje. Nors masių spektrometrija yra veiksminga peptidų ir baltymų sekoskaitos priemonė, jei tokie mėginiai į masių spektrometrą įšvirkščiami vienu praėjimu, atskyrimas nebus idealus. Šią problemą galima išspręsti prieš MS analizę įdiegiant skysčių chromatografijos (LC) atskyrimą, kuris sumažins analitų, patenkančių į masių spektrometrą tam tikru laiku, skaičių4,5,6. Be to, skystosios fazės atskyrimo metu analites galima sufokusuoti siauruose regionuose, tokiu būdu sukoncentruojant šias analites ir pagerinant MS aptikimo jautrumą. Skysčių chromatografija (LC) per pastarąjį dešimtmetį labai patobulėjo ir tapo populiaria proteomikos technika. analizė7, 8, 9, 10.
Atvirkštinės fazės skysčių chromatografija (RP-LC) plačiai naudojama peptidų mišiniams gryninti ir atskirti, naudojant oktadecilo modifikuotą silicio dioksidą (ODS) kaip stacionariąją fazę11,12,13. Tačiau RP stacionariosios fazės neužtikrina patenkinamo peptidų ir baltymų atskyrimo dėl jų sudėtingos struktūros ir amfifilinio pobūdžio14,15. Todėl peptidams ir baltymams su polinėmis ir nepolinėmis dalimis analizuoti reikalingos specialiai sukurtos stacionariosios fazės, kurios sąveikauja su šiais analitais ir juos sulaiko16. Mišraus režimo chromatografija, užtikrinanti daugiamodalinę sąveiką, gali būti alternatyva RP-LC peptidų, baltymų ir kitų sudėtingų mišinių atskyrimui. Buvo paruoštos kelios mišraus režimo stacionariosios fazės, o šiomis fazėmis užpildytos kolonėlės buvo naudojamos peptidų ir baltymų atskyrimui17,18,19,20,21. Mišraus režimo stacionariosios fazės (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polinė interkaliacija/RPLC) tinka peptidų ir baltymų atskyrimui dėl polinių ir nepolinių junginių buvimo. grupės22,23,24,25,26,27,28. Panašiai, polinės interkaliacijos stacionarios fazės su kovalentiškai sujungtomis polinėmis grupėmis pasižymi gera atskyrimo galia ir unikaliu selektyvumu poliniams ir nepoliniams analitams, nes atskyrimas priklauso nuo analitės ir stacionarios fazės sąveikos. Multimodalinės sąveikos 29, 30, 31, 32. Neseniai Zhang ir kt. 30 paruošė dodecilo grupe užbaigtą poliamino stacionarią fazę ir sėkmingai atskyrė angliavandenilius, antidepresantus, flavonoidus, nukleozidus, estrogenus ir keletą kitų analitų. Poliarinis interkaliatorius turi ir poliarines, ir nepoliarines grupes, todėl jį galima naudoti peptidams ir baltymams, turintiems ir hidrofobinių, ir hidrofilinių dalių, atskirti. Poliarinės kolonėlės (pvz., amidu įterptos C18 kolonėlės) yra komerciškai prieinamos prekiniu pavadinimu „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlės, tačiau šios kolonėlės naudojamos tik amino 33 analizei.
Šiame tyrime buvo paruošta ir įvertintas poliariškai įterptoji stacionari fazė (N-fenilmaleimidu įterptas polistirenas) peptidų ir HSA tripsino skaidinių atskyrimo efektyvumas. Stacionari fazė buvo paruošta naudojant šią strategiją. Akytos silicio dioksido dalelės buvo paruoštos pagal ankstesniame mūsų leidinyje pateiktą procedūrą su tam tikrais paruošimo protokolo pakeitimais. Karbamido, polietilenglikolio (PEG), TMOS, vandens ir acto rūgšties santykis buvo pakoreguotas, kad būtų gautos didelio porų dydžio silicio dioksido dalelės. Antra, buvo susintetintas naujas ligandas – fenilmaleimido metilvinilizocianatas – ir panaudotas silicio dioksido dalelėms derivatizuoti, siekiant paruošti poliariškai įterptąją stacionariąją fazę. Gauta stacionari fazė buvo supakuota į nerūdijančio plieno kolonėlę (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo), naudojant optimizuotą pakavimo schemą. Kolonėlės pakavimas padedamas mechanine vibracija, siekiant užtikrinti, kad kolonėlėje susidarytų homogeninis sluoksnis. Įvertintas penkių peptidų peptidų mišinių atskyrimas supakuotoje kolonėlėje. (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucino enkefalinas) ir tripsinu suskaidyto žmogaus serumo albumino (HAS) peptidų mišinys ir tripsinu suskaidyto HSA peptidai atsiskyrė gerai ir efektyviai. PMP kolonėlės atskyrimo efektyvumas buvo palygintas su „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlės atskyrimo efektyvumu. Tiek peptidai, tiek baltymai PMP kolonėlėje, kuri buvo efektyvesnė nei „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlė, buvo gerai atskirti ir efektyviai atskirti.
PEG (polietilenglikolis), karbamidas, acto rūgštis, trimetoksi-ortosilikatas (TMOS), trimetilchlorosilanas (TMCS), tripsinas, žmogaus serumo albuminas (HSA), amonio chloridas, karbamidas, heksano metildisilazanas (HMDS), metakriloilo chloridas (MC), stirenas, 4-hidroksi-TEMPO, benzoilo peroksidas (BPO), HPLC klasės acetonitrilas (ACN), metanolis, 2-propanolis ir acetonas. Įsigyta iš „Sigma-Aldrich“ (Sent Luisas, Misūris, JAV).
Karbamido (8 g), polietilenglikolio (8 g) ir 8 ml 0,01 N acto rūgšties mišinys buvo maišomas 10 minučių, o tada į jį lediniu būdu įpilta 24 ml TMOS. Reakcijos mišinys buvo kaitinamas 40 °C temperatūroje 6 valandas, o po to 120 °C temperatūroje 8 valandas nerūdijančio plieno autoklave. Vanduo buvo nupiltas, o likusi medžiaga džiovinama 70 °C temperatūroje 12 valandų. Išdžiovinta minkšta masė buvo lygiai sumalta krosnyje ir kalcinuota 550 °C temperatūroje 12 valandų. Buvo paruoštos ir apibūdintos trys partijos, siekiant ištirti dalelių dydžio, porų dydžio ir paviršiaus ploto atkuriamumą.
Modifikuojant silicio dioksido dalelių paviršių iš anksto susintetintu ligandu fenilmaleimido-metilvinilizocianatu (PCMP) ir po to radialine polimerizacija su stirenu, buvo gautas junginys, turintis polinę grupę. Stacionari fazė agregatams ir polistireno grandinėms. Paruošimo procesas aprašytas toliau.
N-fenilmaleimidas (200 mg) ir metilvinilizocianatas (100 mg) buvo ištirpinti sausame toluene, o į reakcijos kolbą įpilta 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitrilo (AIBN), kad būtų paruoštas fenilmaleimido-metilvinilizocianato kopolimeras (PMCP). Mišinys buvo kaitinamas 60 °C temperatūroje 3 valandas, filtruojamas ir džiovinamas orkaitėje 40 °C temperatūroje 3 valandas.
Džiovintos silicio dioksido dalelės (2 g) buvo disperguotos sausame toluene (100 ml), maišytos ir sonikuotos 500 ml talpos apvaliadugnėje kolboje 10 min. PMCP (10 mg) buvo ištirpintas toluene ir lašinamas į reakcijos kolbą per lašinamąjį piltuvą. Mišinys buvo virinamas su grįžtamuoju šaldytuvu 100 °C temperatūroje 8 valandas, filtruojamas, plaunamas acetonu ir džiovinamas 60 °C temperatūroje 3 valandas. Tada PMCP surištos silicio dioksido dalelės (100 g) buvo ištirpintos toluene (200 ml) ir įpilta 4-hidroksi-TEMPO (2 ml), esant 100 µl dibutilalavo dilaurato kaip katalizatoriaus. Mišinys buvo maišomas 50 °C temperatūroje 8 valandas, filtruojamas ir džiovinamas 50 °C temperatūroje 3 valandas.
Stirenas (1 ml), benzoilo peroksidas BPO (0,5 ml) ir prie TEMPO-PMCP prijungtos silicio dioksido dalelės (1,5 g) buvo disperguotos toluene ir prapūstos azotu. Stireno polimerizacija buvo vykdoma 100 °C temperatūroje 12 valandų. Gautas produktas buvo plaunamas metanoliu ir džiovinamas 60 °C temperatūroje per naktį. Bendra reakcijos schema parodyta 1 paveiksle.
Mėginiai buvo degazuojami 393 K temperatūroje 1 valandą, kad būtų gautas mažesnis nei 10⁻³ Torr liekamasis slėgis. Bendram porų tūriui nustatyti buvo naudojamas adsorbuoto N2 kiekis esant santykiniam P/P0 = 0,99 slėgiui. Plikų ir ligandais sujungtų silicio dioksido dalelių morfologija buvo tirta skenuojančia elektronine mikroskopija („Hitachi High Technologies“, Tokijas, Japonija). Džiovinti mėginiai (plikas silicio dioksidas ir ligandais sujungtos silicio dioksido dalelės) buvo dedami ant aliuminio kolonėlės, naudojant lipnią anglies juostą. Mėginiai buvo padengti auksu naudojant Q150T purškimo įrenginį, o ant mėginių buvo nusodintas 5 nm Au sluoksnis. Tai pagerina proceso efektyvumą naudojant žemą įtampą ir užtikrina smulkiagrūdį, šaltą purškimą. Elementinei analizei buvo naudojamas „Thermo Electron“ (Voltamas, Masačusetsas, JAV) „Flash EA1112“ elementų analizatorius. Dalelių dydžio pasiskirstymui gauti buvo naudojamas „Malvern“ (Vusteršyras, JK) „Mastersizer 2000“ dalelių dydžio analizatorius. Plikos silicio dioksido dalelės ir ligandais sujungtos silicio dioksido dalelės. (po 5 mg) buvo disperguoti 5 ml izopropanolio, 10 min. sonikuoti, 5 min. maišyti sūkuriniame maišytuve ir padėti ant „Mastersizer“ optinio stalo. Termogravimetrinė analizė atlikta 5 °C per minutę greičiu, esant 30–800 °C temperatūros intervalui.
Stiklu dengtos nerūdijančio plieno siauro skersmens kolonos, kurių matmenys (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo), buvo supakuotos naudojant srutų supakavimo metodą, taikant tą pačią procedūrą, naudotą nuorodoje. 31. Nerūdijančio plieno kolonėlė (stiklu išklota, 100 × 1,8 mm vidinio skersmens) su išleidimo anga, kurioje yra 1 µm fritas, buvo prijungta prie suspensijos pakavimo įrenginio („Alltech Deerfield“, IL, JAV). Paruoškite stacionarios fazės suspensiją suspenduodami 150 mg stacionarios fazės 1,2 ml metanolio ir nusiųskite ją į saugojimo kolonėlę. Metanolis buvo naudojamas kaip suspensijos tirpiklis ir kaip propelentinis tirpiklis. Kolonėlė pildoma nuosekliai, taikant 100 MP slėgį 10 minučių, 80 MP slėgį 15 minučių ir 60 MP slėgį 30 minučių. Pakavimo metu dviem dujų chromatografijos (GC) kolonėlės kratytuvais („Alltech“, Deerfieldas, IL, JAV) buvo taikoma mechaninė vibracija, siekiant užtikrinti tolygų kolonėlės užpildymą. Uždarykite suspensijos pakavimo įrenginį ir lėtai išleiskite slėgį, kad kolonėlė nebūtų pažeista. Atjunkite kolonėlę nuo suspensijos pakavimo įrenginio ir prijunkite kitą jungtį prie įleidimo angos ir LC sistemos, kad patikrintumėte jos veikimą.
Buvo sukonstruotas LC siurblys („10AD Shimadzu“, Japonija), injektorius („Valco“ (JAV) C14 W.05) su 50 nL įpurškimo kilpa, membraninis degazatorius („Shimadzu DGU-14A“), UV-VIS kapiliarinis langas, specialus µLC prietaisas, detektorius (UV-2075) ir stiklu dengtos mikrokolonėlės. Naudojami labai siauri ir trumpi jungiamieji vamzdžiai, siekiant sumažinti papildomo kolonėlės juostos išplėtimo poveikį. Po supakavimo kapiliarai (50 μm, vidinis skersmuo 365) ir redukcinės jungties kapiliarai (50 μm) buvo sumontuoti prie redukcinės jungties 1/16 colio išleidimo angos. Duomenų rinkimas ir chromatografinis apdorojimas buvo atlikti naudojant „Multichro 2000“ programinę įrangą. Stebėjimas esant 254 nm bangos ilgiui. Analitai buvo testuojami pagal UV absorbciją. Chromatografiniai duomenys buvo analizuojami naudojant „OriginPro8“ (Northamptonas, MA).
Albuminas iš žmogaus serumo, liofilizuoti milteliai, ≥ 96 % (agarozės gelio elektroforezė), 3 mg, sumaišytas su tripsinu (1,5 mg), 4,0 M karbamidu (1 ml) ir 0,2 M amonio bikarbonatu (1 ml). Tirpalas buvo maišomas 10 minučių ir laikomas vandens vonioje 37 °C temperatūroje 6 valandas, po to užgesinamas 1 ml 0,1 % TFA. Tirpalą filtruokite ir laikykite žemesnėje nei 4 °C temperatūroje.
Peptidų mišinių ir HSA tripsino skaidulų atskyrimas buvo įvertintas atskirai PMP kolonėlėse. Patikrinkite peptidų mišinio ir tripsino skaidulų atskyrimą PMP kolonėlėje ir palyginkite rezultatus su „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėle. Teorinis plokštelių skaičius apskaičiuojamas taip:
2 paveiksle parodyti grynų silicio dioksido dalelių ir ligandais sujungtų silicio dioksido dalelių SEM vaizdai. Grynų silicio dioksido dalelių (A, B) SEM vaizdai rodo, kad, priešingai nei ankstesniuose mūsų tyrimuose, šios dalelės yra sferinės, pailgos arba netaisyklingos simetrijos. Ligandais sujungtų silicio dioksido dalelių (C, D) paviršius yra lygesnis nei grynų silicio dioksido dalelių, o tai gali būti dėl polistireno grandinių, esančių ant silicio dioksido dalelių paviršiaus.
Skenuojančio elektroninio mikroskopo vaizdai, kuriuose matyti grynos silicio dioksido dalelės (A, B) ir ligandu sujungtos silicio dioksido dalelės (C, D).
Grynų silicio dioksido dalelių ir ligandu surištų silicio dioksido dalelių dydžio pasiskirstymas parodytas 3(A) paveiksle. Tūrio pagrindu sukurtos dalelių dydžio pasiskirstymo kreivės parodė, kad silicio dioksido dalelių dydis padidėjo po cheminės modifikacijos (3A pav.). Dabartinio ir ankstesnio tyrimų silicio dioksido dalelių dydžio pasiskirstymo duomenys palyginti 1(A) lentelėje. PMP tūrio pagrindu sukurto dalelių dydžio d(0,5) vertė yra 3,36 μm, palyginti su ankstesniu mūsų tyrimu, kurio ad(0,5) vertė buvo 3,05 μm (polistirenu surištos silicio dioksido dalelės)34. Šios partijos dalelių dydžio pasiskirstymas buvo siauresnis, palyginti su ankstesniu mūsų tyrimu, dėl skirtingų PEG, karbamido, TMOS ir acto rūgšties santykių reakcijos mišinyje. PMP fazės dalelių dydis yra šiek tiek didesnis nei anksčiau tirtos polistirenu surištos silicio dioksido dalelių fazės. Tai reiškia, kad silicio dioksido dalelių paviršiaus funkcionalizavimas stirenu nusodino tik polistireno sluoksnį (0,97 µm) ant silicio dioksido paviršiaus, o PMP fazėje sluoksnio storis buvo 1,38 µm.
Plikų silicio dioksido dalelių ir ligandų surištų silicio dioksido dalelių dalelių dydžio pasiskirstymas (A) ir porų dydžio pasiskirstymas (B).
Šio tyrimo silicio dioksido dalelių porų dydis, porų tūris ir paviršiaus plotas pateikti 1(B) lentelėje. Plikų silicio dioksido dalelių ir ligandu surištų silicio dioksido dalelių PSD profiliai parodyti 3(B) paveiksle. Rezultatai palyginami su ankstesniu mūsų tyrimu. Plikų ir ligandu surištų silicio dioksido dalelių porų dydžiai yra atitinkamai 310 ir 241, o tai rodo, kad po cheminės modifikacijos porų dydis sumažėja 69, kaip parodyta 1(B) lentelėje, o kreivės pokytis parodytas 3(B) paveiksle. Panašiai silicio dioksido dalelių porų tūris po cheminės modifikacijos sumažėjo nuo 0,67 iki 0,58 cm3/g. Šiuo metu tirtų silicio dioksido dalelių savitasis paviršiaus plotas yra 116 m2/g, o tai palyginama su mūsų ankstesniu tyrimu (124 m2/g). Kaip parodyta 1(B) lentelėje, silicio dioksido dalelių paviršiaus plotas (m2/g) taip pat sumažėjo nuo 116 m2/g iki 105 m2/g po... cheminis modifikavimas.
Stacionariosios fazės elementinės analizės rezultatai pateikti 2 lentelėje. Dabartinės stacionariosios fazės anglies kiekis yra 6,35 %, tai yra mažiau nei ankstesnio mūsų tyrimo anglies kiekis (polistirenu surištos silicio dioksido dalelės, atitinkamai 7,93 %35 ir 10,21 %)42. Dabartinės stacionariosios fazės anglies kiekis yra mažas, nes ruošiant dabartinį SP, be stireno, buvo naudojami ir kai kurie poliniai ligandai, tokie kaip fenilmaleimido-metilvinilizocianatas (PCMP) ir 4-hidroksi-TEMPO. Dabartinės stacionariosios fazės azoto masės procentas yra 2,21 %, palyginti su atitinkamai 0,1735 ir 0,85 % azoto masės ankstesniuose tyrimuose. Tai reiškia, kad azoto masės procentas dabartinėje stacionariojoje fazėje yra didesnis dėl fenilmaleimido. Panašiai produktų (4) ir (5) anglies kiekis buvo atitinkamai 2,7 % ir 2,9 %, o galutinio produkto (6) anglies kiekis buvo 6,35 %, kaip parodyta 2 lentelėje. Svorio sumažėjimas buvo patikrintas naudojant PMP stacionariąją fazę, o TGA kreivė parodyta 4 paveiksle. TGA kreivė rodo 8,6 % svorio sumažėjimą, kuris gerai atitinka anglies kiekį (6,35 %), nes liganduose yra ne tik C, bet ir N, O bei H.
Fenilmaleimido-metilvinilizocianato ligandas buvo pasirinktas silicio dioksido dalelių paviršiaus modifikavimui, nes jis turi poliarines fenilmaleimido ir vinilizocianato grupes. Vinilo izocianato grupės gali toliau reaguoti su stirenu gyvosios radikalinės polimerizacijos būdu. Antra priežastis – įterpti grupę, kuri vidutiniškai sąveikauja su analitu ir neturi stiprios elektrostatinės sąveikos tarp analito ir stacionariosios fazės, nes fenilmaleimido fragmentas esant normaliam pH neturi virtualaus krūvio. Stacionariosios fazės poliškumą galima kontroliuoti optimaliu stireno kiekiu ir laisvųjų radikalų polimerizacijos reakcijos laiku. Paskutinis reakcijos etapas (laisvųjų radikalų polimerizacija) yra labai svarbus ir gali pakeisti stacionariosios fazės poliškumą. Buvo atlikta elementų analizė, siekiant patikrinti šių stacionariųjų fazių anglies kiekį. Pastebėta, kad didinant stireno kiekį ir reakcijos laiką, padidėjo stacionariosios fazės anglies kiekis ir atvirkščiai. Su skirtingomis stireno koncentracijomis paruošti SP turi skirtingą anglies kiekį. Vėlgi, šias stacionariąsias fazes supilkite į nerūdijančio plieno kolonėles ir patikrinkite jų chromatografinį našumą (selektyvumą, skiriamąją gebą, N vertę ir kt.). Remiantis šiais eksperimentais, buvo atliktas... PMP stacionariosios fazės paruošimui buvo pasirinkta optimizuota formulė, siekiant užtikrinti kontroliuojamą poliškumą ir gerą analitės sulaikymą.
Penki peptidų mišiniai (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucino enkefalinas) taip pat buvo įvertinti naudojant PMP kolonėlę su mobiliąja faze; 60/40 (v/v) acetonitrilas/vanduo (0,1 % TFA), esant 80 μL/min. srauto greičiui. Optimaliomis eliuavimo sąlygomis teorinis plokštelių skaičius (N) vienai kolonėlei (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) yra 20 000 ± 100 (200 000 plokštelių/m²). 3 lentelėje pateiktos trijų PMP kolonėlių N vertės, o chromatogramos parodytos 5A paveiksle. Greita analizė PMP kolonėlėje, esant dideliam srauto greičiui (700 μL/min.), penki peptidai buvo eliuuoti per vieną minutę, N vertės buvo labai geros – 13 500 ± 330 vienai kolonėlei (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo), atitinka 135 000 plokštelių/m (5B paveikslas). Trys vienodo dydžio kolonėlės (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) buvo pripildytos trijų skirtingų PMP stacionariosios fazės partijų, siekiant patikrinti pakartojamumą. Analitė Kiekvienos kolonėlės koncentracija buvo užregistruota naudojant optimalias eliucijos sąlygas ir teorinių lėkščių skaičių N bei sulaikymo laiką, kad būtų galima atskirti tą patį bandymo mišinį kiekvienoje kolonėlėje. PMP kolonėlių atkuriamumo duomenys pateikti 4 lentelėje. PMP kolonėlės atkuriamumas gerai koreliuoja su labai mažomis %RSD vertėmis, kaip parodyta 3 lentelėje.
Peptidų mišinio atskyrimas PMP kolonėlėje (B) ir Ascentis Express RP-Amide kolonėlėje (A); mobilioji fazė 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP kolonėlės matmenys (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo); analizinis. Junginių eliucijos tvarka: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ir 5 (leucinas) (rūgštinis enkefalinas).
PMP kolonėlė (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) buvo įvertinta efektyviosios skysčių chromatografijos pagalba, siekiant atskirti žmogaus serumo albumino tripsino hidrolizatus. 6 paveiksle pateiktoje chromatogramoje matyti, kad mėginys yra gerai atskirtas, o skiriamoji geba yra labai gera. HSA hidrolizatai buvo analizuojami naudojant 100 µL/min srauto greitį, mobiliąją fazę 70/30 acetonitrilo/vandens ir 0,1 % TFA. Kaip parodyta chromatogramoje (6 paveikslas), HSA hidrolizatas buvo padalintas į 17 smailių, atitinkančių 17 peptidų. Buvo apskaičiuotas kiekvienos HSA hidrolizato smailės atskyrimo efektyvumas, o vertės pateiktos 5 lentelėje.
HSA (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) tripsiniu būdu suskaidyta frakcija buvo atskirta PMP kolonėlėje; srauto greitis (100 µL/min.), judanti fazė 60/40 acetonitrilas/vanduo su 0,1 % TFA.
kur L yra kolonėlės ilgis, η yra mobiliosios fazės klampumas, ΔP yra kolonėlės priešslėgis, o u yra mobiliosios fazės linijinis greitis. PMP kolonėlės pralaidumas buvo 2,5 × 10-14 m2, srauto greitis buvo 25 μL/min, o ACN/vandens santykis buvo 60/40 v/v. PMP kolonėlės (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) pralaidumas buvo panašus į ankstesnio mūsų tyrimo (Ref. 34) pralaidumą. Kolonėlės, pripildytos paviršiniu požiūriu porėtomis dalelėmis, pralaidumas yra: 1,7 × 10-15 1,3 μm dalelėms, 3,1 × 10-15 1,7 μm dalelėms, 5,2 × 10-15 ir 2,5 × 10-14 m2 2,6 μm dalelėms. 5 μm dalelėms 43. Todėl PMP fazės pralaidumas yra panašus į 5 μm šerdies-apvalkalo dalelių pralaidumą.
kur Wx yra kolonėlės, pripildytos chloroformu, svoris, Wy yra kolonėlės, pripildytos metanolio, svoris, o ρ yra tirpiklio tankis. Metanolio (ρ = 0,7866) ir chloroformo (ρ = 1,484) tankiai. Anksčiau tirtų SILICA PARTICLES-C18 kolonėlių (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) 34 ir C18-karbamido kolonėlių 31 bendras poringumas buvo atitinkamai 0,63 ir 0,55. Tai reiškia, kad karbamido ligandų buvimas sumažina stacionariosios fazės pralaidumą. Kita vertus, PMP kolonėlės (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) bendras poringumas yra 0,60. PMP kolonėlių pralaidumas yra mažesnis nei kolonėlių, pripildytų C18 surištomis silicio dioksido dalelėmis, nes C18 tipo stacionariosiose fazėse C18 ligandai yra prijungti prie silicio dioksido dalelių kaip linijinės grandinės, o polistireno tipo stacionariosiose fazėse aplink jį susidaro santykinai storas polimero sluoksnis. Tipiniame eksperimente kolonėlės poringumas apskaičiuojamas taip:
7A ir 7B paveiksluose parodyta PMP kolonėlė (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) ir „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlė (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo), naudojant tas pačias eliucijos sąlygas (t. y. 60/40 ACN/H2O ir 0,1 % TFA). Pasirinkti peptidų mišiniai (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucino enkefalinas) buvo paruošti 20 µL/min. Minimalus abiejų kolonėlių srautas yra 800 µL/min. Minimalios HETP vertės esant optimaliam srautui (80 µL/min) PMP kolonėlėje ir „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlėje buvo atitinkamai 2,6 µm ir 3,9 µm. HETP vertės rodo, kad PMP kolonėlės (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) atskyrimo efektyvumas yra daug geresnis nei komerciškai prieinamos „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlės (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo). Van Deemterio grafikas 7(A) paveiksle rodo, kad N vertės sumažėjimas didėjant srautui nėra reikšmingas, palyginti su ankstesniu mūsų tyrimu. Didesnis PMP kolonėlės (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) atskyrimo efektyvumas, palyginti su... „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlės pritaikymas pagrįstas dalelių formos, dydžio ir sudėtingų kolonėlių pakavimo procedūrų, naudojamų šiame darbe, patobulinimais34.
(A) van Deemterio grafikas (HETP ir mobiliosios fazės linijinis greitis), gautas naudojant PMP kolonėlę (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) 60/40 ACN/H2O su 0,1 % TFA. (B) van Deemterio grafikas (HETP ir mobiliosios fazės linijinis greitis), gautas naudojant „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlę (100 × 1,8 mm vidinis skersmuo) 60/40 ACN/H2O su 0,1 % TFA.
Poliariniu būdu įterpta polistireno stacionari fazė buvo paruošta ir įvertinta sintetinių peptidų mišinių ir žmogaus serumo albumino (HAS) tripsino hidrolizatų atskyrimui didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje. PMP kolonėlių chromatografinis našumas peptidų mišiniams yra puikus atskyrimo efektyvumo ir skiriamosios gebos požiūriu. Pagerėjęs PMP kolonėlių atskyrimo našumas pasiekiamas dėl įvairių priežasčių, tokių kaip silicio dioksido dalelių dydis ir porų dydis, kontroliuojama stacionarios fazės sintezė ir sudėtingas kolonėlės užpildymas. Be didelio atskyrimo efektyvumo, mažas kolonėlės priešslėgis esant dideliam srautui yra dar vienas šios stacionarios fazės privalumas. PMP kolonėlės pasižymi geru atkuriamumu ir gali būti naudojamos peptidų mišinių analizei ir įvairių baltymų hidrolizavimui tripsinu. Ketiname naudoti šią kolonėlę natūralių produktų, bioaktyvių junginių iš vaistinių augalų ir grybų ekstraktų atskyrimui skysčių chromatografijoje. Ateityje PMP kolonėlės taip pat bus įvertintos baltymų ir monokloninių antikūnų atskyrimui.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ir Petersson, P. Peptidų atskyrimo sistemų tyrimas atvirkštinės fazės chromatografija. I dalis: kolonėlės apibūdinimo protokolo sukūrimas. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. ir kt. Patobulinti aktyvūs peptidai, skirti infekcinių ligų gydymui. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ir Khrestchatisky, M. Sintetiniai terapiniai peptidai: mokslas ir rinka. Vaistų atradimas. 15 (1-2) šiandien, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ir Shen, Y. Pažangi proteominė skysčių chromatografija. J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ir kt. Pažangi skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos technologija leidžia integruoti plačiai taikomus metabolomikos ir proteomikos metodus. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM ir Salisbury, JJ. UHPLC vaidmuo vaistų kūrime. J. Sep. Sci. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. ir Clausen, AM. Pagrindiniai ir praktiniai itin aukšto slėgio skysčių chromatografijos aspektai greitam atskyrimui. J. Sep. Sci. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA ir Tchelitcheff, P. Itin efektyviosios skysčių chromatografijos taikymas vaistų kūrime. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. ir kt. Monolitiniai makroporiniai hidrogeliai, pagaminti iš aliejaus vandenyje didelės vidinės fazės emulsijų, skirtų efektyviam enterovirusų valymui. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ir Wilkins, JA. Skysčių chromatografijos vaidmuo proteomikoje. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. ir Guillarme, D. Naujos atvirkštinės fazės skysčių chromatografijos tendencijos terapinių peptidų ir baltymų atskyrimui: teorija ir taikymas. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ir Gebler, JC Dvimatis peptidų atskyrimas naudojant RP-RP-HPLC sistemą, kai pirmajame ir antrajame atskyrimo matmenyse yra skirtingos pH vertės. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. ir kt. Buvo tirtos didelio efektyvumo chromatografinių kolonėlių, pripildytų C18 dalelėmis, kurių skersmuo mažesnis nei 2 μm, masės perdavimo charakteristikos ir kinetinis veikimas. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. ir kt. Naujausios tendencijos ir analitiniai iššūkiai išskiriant, identifikuojant ir patvirtinant augalų bioaktyviuosius peptidus. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB ir kt. Gyvybės karalystės proteominis kraštovaizdis. Nature 582(7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. ir kt. Terapinių peptidų apdorojimas preparatyvine skysčių chromatografija. Molecule (Bazelis, Šveicarija) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. ir Geng, X. Mišraus režimo chromatografija ir jos taikymas biopolimerams. J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. ir Sun, Y. Mišraus režimo baltymų chromatografijos ligandai: principas, apibūdinimas ir projektavimas. J. Biotechnology. 144(1), 3–11 (2009).