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다공성 실리카 입자는 일부 변형된 졸-겔법을 이용하여 제조하여 거대다공성 입자를 얻었다. 이 입자들을 N-페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트(PMI)와 스티렌을 이용한 가역적 첨가-분해 연쇄 이동(RAFT) 중합으로 유도체화하여 N-페닐말레이미드 폴리스티렌 삽입체(PMP) 고정상을 제조하였다. 내경 1.8 mm의 좁은 내경을 가진 스테인리스 스틸 컬럼에 슬러리 패킹을 적용하였다. 5가지 펩타이드(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, 류신 엔케팔린)로 구성된 펩타이드 혼합물과 인간 혈청 알부민(HAS)의 트립신 소화에 대한 PMP 컬럼 분리 성능을 평가하였다. 최적 용출 조건에서 펩타이드 혼합물의 이론 단수는 280,000 플레이트/m²에 달하였다. 개발된 컬럼의 분리 성능을 상용 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교한 결과, PMP 컬럼의 분리 효율 및 분해능이 상용 컬럼보다 우수한 것으로 나타났다.
최근 몇 년 동안 바이오의약품 산업은 시장 점유율이 크게 증가하면서 전 세계적으로 성장하는 시장이 되었습니다. 바이오의약품 산업의 폭발적인 성장1,2,3에 따라 펩타이드 및 단백질 분석에 대한 수요가 매우 높아졌습니다. 펩타이드 합성 과정에서 목표 펩타이드 외에도 여러 불순물이 생성되므로 원하는 순도의 펩타이드를 얻기 위해서는 크로마토그래피 정제가 필요합니다. 체액, 조직 및 세포 내 단백질 분석 및 특성화는 단일 시료에 잠재적으로 검출 가능한 물질의 수가 매우 많기 때문에 매우 어려운 과제입니다. 질량 분석법은 펩타이드 및 단백질 서열 분석에 효과적인 도구이지만, 이러한 시료를 한 번에 질량 분석기에 주입하면 분리 효율이 떨어집니다. 이 문제는 질량 분석 전에 액체 크로마토그래피(LC) 분리를 수행함으로써 완화할 수 있으며, 이를 통해 특정 시점에 질량 분석기에 유입되는 분석물질의 수를 줄일 수 있습니다4,5,6. 또한, 액상 분리 과정에서 분석물질을 좁은 영역에 집중시킬 수 있으므로 분석물질의 농도를 높여 질량 분석 검출 효율을 향상시킬 수 있습니다. 감도. 액체 크로마토그래피(LC)는 지난 10년 동안 크게 발전하여 단백질체 분석에서 널리 사용되는 기술이 되었습니다.7,8,9,10
역상 액체 크로마토그래피(RP-LC)는 옥타데실 변형 실리카(ODS)를 고정상으로 사용하여 펩타이드 혼합물의 정제 및 분리에 널리 사용됩니다.11,12,13 그러나 RP 고정상은 복잡한 구조와 양친매성으로 인해 펩타이드와 단백질의 만족스러운 분리를 제공하지 못합니다.14,15 따라서 펩타이드와 단백질을 분석하기 위해서는 극성 및 비극성 작용기를 가지고 이러한 분석물질과 상호작용하고 유지할 수 있도록 특별히 설계된 고정상이 필요합니다.16 다중 모드 상호작용을 제공하는 혼합 모드 크로마토그래피는 펩타이드, 단백질 및 기타 복잡한 혼합물의 분리를 위한 RP-LC의 대안이 될 수 있습니다. 여러 가지 혼합 모드 고정상이 제조되었으며, 이러한 상으로 채워진 컬럼은 펩타이드 및 단백질 분리에 사용되었습니다.17,18,19,20,21 혼합 모드 고정상(WAX/RPLC, HILIC/RPLC, 극성) 삽입/RPLC는 극성 및 비극성 그룹이 모두 존재하기 때문에 펩타이드 및 단백질 분리에 적합합니다.22,23,24,25,26,27,28 마찬가지로, 공유 결합된 극성 그룹을 가진 극성 삽입 고정상은 분석물과 고정상 사이의 상호작용에 따라 분리가 달라지기 때문에 극성 및 비극성 분석물에 대해 우수한 분리력과 고유한 선택성을 나타냅니다. 다중 모드 상호작용29, 30, 31, 32. 최근 Zhang et al. 30은 도데실 말단 폴리아민 고정상을 제조하여 탄화수소, 항우울제, 플라보노이드, 뉴클레오사이드, 에스트로겐 및 기타 여러 분석물을 성공적으로 분리했습니다. 극성 인터칼레이터는 극성 및 비극성 그룹을 모두 가지고 있으므로 소수성 및 친수성 부분을 모두 가진 펩타이드와 단백질을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 극성 삽입 컬럼(예: 아미드 삽입 C18 컬럼)은 Ascentis Express RP-Amide 컬럼이라는 상품명으로 시판되고 있지만, 이러한 컬럼은 아민 33의 분석에만 사용됩니다.
본 연구에서는 극성 고정상(N-페닐말레이미드가 내장된 폴리스티렌)을 제조하고 HSA의 펩타이드 및 트립신 소화물 분리 성능을 평가하였다. 고정상은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 다공성 실리카 입자는 이전 연구에서 제시된 방법을 일부 수정하여 제조하였다. 요소, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), TMOS, 물, 아세트산의 비율을 조절하여 기공 크기가 큰 실리카 입자를 제조하였다. 둘째, 새로운 리간드인 페닐말레이미드-메틸 비닐 이소시아네이트를 합성하여 실리카 입자에 도입함으로써 극성 고정상을 제조하였다. 제조된 고정상을 최적화된 충전 방식을 이용하여 스테인리스 스틸 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)에 충전하였다. 컬럼 충전 시 기계적 진동을 가하여 컬럼 내부에 균일한 충전층을 형성하였다. 본 연구에서는 5가지 펩타이드로 구성된 펩타이드 혼합물의 충전 컬럼 분리 성능을 평가하였다. (글리신-티로신, 글리신-류신-티로신, 글리신-글리신-티로신-아르기닌, 티로신-이소류신-글리신-세린-아르기닌, 류신 엔케팔린) 펩타이드 혼합물과 인간 혈청 알부민(HSA)의 트립신 소화물을 PMP 컬럼으로 분석하였다. 펩타이드 혼합물과 HSA 트립신 소화물은 우수한 분해능과 효율로 분리되었다. PMP 컬럼의 분리 성능을 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교한 결과, 펩타이드와 단백질 모두 PMP 컬럼에서 잘 분리되었고 효율이 Ascentis Express RP-Amide 컬럼보다 우수하였다.
PEG(폴리에틸렌글리콜), 요소, 아세트산, 트리메톡시 오르토실리케이트(TMOS), 트리메틸클로로실란(TMCS), 트립신, 인간혈청알부민(HSA), 염화암모늄, 요소, 헥산메틸디실라잔(HMDS), 메타크릴로일클로라이드(MC), 스티렌, 4-하이드록시-TEMPO, 벤조일퍼옥사이드(BPO), HPLC 등급 아세토니트릴(ACN), 메탄올, 2-프로판올 및 아세톤은 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입했습니다.
요소(8g), 폴리에틸렌 글리콜(8g), 0.01N 아세트산 8mL를 혼합하여 10분간 교반한 후, 얼음처럼 차가운 상태에서 TMOS 24mL를 첨가하였다. 반응 혼합물을 스테인리스강 오토클레이브에서 40°C에서 6시간, 이어서 120°C에서 8시간 동안 가열하였다. 물을 제거하고 잔류물을 70°C에서 12시간 동안 건조시켰다. 건조된 연질 물질을 오븐에서 고르게 분쇄한 후 550°C에서 12시간 동안 소성하였다. 입자 크기, 기공 크기 및 표면적의 재현성을 확인하기 위해 세 배치(batch)를 제조하고 특성을 분석하였다.
합성된 리간드인 페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트(PCMP)로 실리카 입자의 표면을 개질한 후, 스티렌과의 방사형 중합을 통해 극성기를 함유하는 화합물을 제조하였다. 이 화합물은 응집체 및 폴리스티렌 사슬의 고정상으로 사용되었다. 제조 과정은 아래에 설명되어 있다.
N-페닐말레이미드(200mg)와 메틸 비닐 이소시아네이트(100mg)를 건조 톨루엔에 용해시키고, 반응 플라스크에 2,2′-아조이소부티로니트릴(AIBN) 0.1mL를 첨가하여 페닐말레이미드-메틸 비닐 이소시아네이트 공중합체(PMCP)를 제조하였다. 혼합물을 60°C에서 3시간 동안 가열한 후 여과하고 40°C 오븐에서 3시간 동안 건조하였다.
건조된 실리카 입자(2g)를 건조 톨루엔(100mL)에 분산시키고, 500mL 둥근 바닥 플라스크에서 10분 동안 교반 및 초음파 처리하였다. PMCP(10mg)를 톨루엔에 용해시킨 후, 적하 깔때기를 이용하여 반응 플라스크에 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 100°C에서 8시간 동안 환류시키고, 여과한 후 아세톤으로 세척하고 60°C에서 3시간 동안 건조하였다. 그 후, PMCP가 결합된 실리카 입자(100g)를 톨루엔(200mL)에 용해시키고, 촉매로 디부틸틴 디라우레이트 100µL를 첨가한 상태에서 4-하이드록시-TEMPO(2mL)를 첨가하였다. 혼합물을 50°C에서 8시간 동안 교반하고, 여과한 후 50°C에서 3시간 동안 건조하였다.
스티렌(1 mL), 벤조일퍼옥사이드(BPO, 0.5 mL) 및 TEMPO-PMCP가 부착된 실리카 입자(1.5 g)를 톨루엔에 분산시키고 질소로 퍼징하였다. 스티렌의 중합 반응은 100°C에서 12시간 동안 진행하였다. 생성물을 메탄올로 세척하고 60°C에서 밤새 건조시켰다. 전체 반응식은 그림 1에 나타내었다.
시료는 393K에서 1시간 동안 탈기하여 잔류 압력을 10⁻³ Torr 미만으로 낮추었다. 상대 압력 P/P₀ = 0.99에서 흡착된 N₂의 양을 이용하여 총 기공 부피를 측정하였다. 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 형태는 주사전자현미경(Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 건조된 시료(순수 실리카 및 리간드 결합 실리카 입자)는 접착성 탄소 테이프를 이용하여 알루미늄 컬럼에 고정하였다. Q150T 스퍼터 코터를 사용하여 시료에 금을 도금하여 5nm 두께의 Au 층을 형성하였다. 이 방법은 저전압을 사용하여 공정 효율을 향상시키고 미세 입자의 저온 스퍼터링을 가능하게 한다. 원소 분석은 Thermo Electron(Waltham, MA, USA) Flash EA1112 원소 분석기를 사용하였다. 입자 크기는 Malvern(Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 입자 크기 분석기를 사용하여 측정하였다. 분산 방법: 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자(각 5mg)를 이소프로판올 5mL에 분산시키고, 10분간 초음파 처리한 후, 5분간 와류 혼합하고, 마스터사이저 광학 벤치에 올려놓았다. 열중량 분석은 30~800°C 온도 범위에서 분당 5°C의 속도로 수행하였다.
(100 × 1.8 mm 내경) 크기의 유리 코팅 스테인리스강 내경 컬럼을 참고문헌에 사용된 것과 동일한 절차를 적용하여 슬러리 패킹법으로 충전하였다. 31. 1 µm 프릿이 있는 출구 피팅이 장착된 스테인리스 스틸 컬럼(유리 코팅, 100 × 1.8 mm 내경)을 슬러리 패커(Alltech, Deerfield, IL, USA)에 연결했습니다. 고정상 150 mg을 메탄올 1.2 mL에 현탁시켜 고정상 슬러리를 제조하고 저장 컬럼으로 보냈습니다. 메탄올은 슬러리 용매 및 추진 용매로 사용되었습니다. 10분 동안 100 MPa, 15분 동안 80 MPa, 30분 동안 60 MPa의 압력을 순차적으로 가하여 컬럼을 충전했습니다. 충전 중에는 두 개의 GC 컬럼 셰이커(Alltech, Deerfield, IL, USA)를 사용하여 기계적 진동을 가하여 컬럼이 균일하게 충전되도록 했습니다. 슬러리 패커를 닫고 컬럼 내부 손상을 방지하기 위해 압력을 천천히 해제했습니다. 컬럼을 슬러리 패킹 장치에서 분리하고 다른 피팅을 입구와 LC에 연결했습니다. 시스템의 성능을 확인하기 위한 시스템.
LC 펌프(10AD Shimadzu, 일본), 주입기(Valco(미국) C14 W.05) (50nL 주입 루프 포함), 멤브레인 탈기 장치(Shimadzu DGU-14A), UV-VIS 모세관 창, 특수 µLC 장치 검출기(UV-2075) 및 유리 코팅 마이크로 컬럼을 사용하여 시스템을 구축했습니다. 컬럼 외부 밴드 확산 효과를 최소화하기 위해 매우 가늘고 짧은 연결 튜브를 사용했습니다. 패키징 후, 모세관(내경 50μm 365)과 리듀싱 유니온 모세관(50μm)을 리듀싱 유니온의 1/16″ 출구에 설치했습니다. 데이터 수집 및 크로마토그래피 처리는 Multichro 2000 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다. 254nm에서 모니터링했으며, 분석 대상 물질의 UV 흡광도를 측정했습니다. 크로마토그래피 데이터는 OriginPro8(Northampton, MA)을 사용하여 분석했습니다.
동결건조 분말 형태의 인간 혈청 알부민(순도 ≥ 96%, 아가로스 겔 전기영동) 3mg을 트립신(1.5mg), 4.0M 요소(1mL), 0.2M 탄산암모늄(1mL)과 혼합하였다. 이 용액을 10분간 교반한 후 37°C 수조에서 6시간 동안 반응시켰다. 그 후 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 1mL를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 용액을 여과하고 4°C 이하에서 보관하였다.
펩타이드 혼합물과 HSA 트립신 소화물의 분리는 PMP 컬럼에서 각각 평가되었습니다. PMP 컬럼을 이용한 펩타이드 혼합물과 HSA 트립신 소화물의 분리를 확인하고, 그 결과를 Ascentis Express RP-Amide 컬럼의 결과와 비교하십시오. 이론 단수는 다음과 같이 계산됩니다.
그림 2는 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 SEM 이미지를 보여준다. 순수 실리카 입자(A, B)의 SEM 이미지를 보면, 이전 연구와는 달리 이 입자들은 구형이지만 길쭉하거나 불규칙한 대칭을 나타낸다. 리간드 결합 실리카 입자(C, D)의 표면은 순수 실리카 입자보다 매끄러운데, 이는 실리카 입자 표면에 폴리스티렌 사슬이 코팅되었기 때문일 수 있다.
주사전자현미경으로 촬영한 순수 실리카 입자(A, B)와 리간드가 결합된 실리카 입자(C, D)의 이미지.
그림 3(A)는 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 입자 크기 분포를 보여줍니다. 부피 기반 입자 크기 분포 곡선은 화학적 변형 후 실리카 입자의 크기가 증가했음을 나타냅니다(그림 3A). 본 연구와 이전 연구의 실리카 입자 입자 크기 분포 데이터를 표 1(A)에서 비교했습니다. PMP의 부피 기반 입자 크기 d(0.5)는 3.36 μm이며, 이전 연구의 ad(0.5) 값인 3.05 μm(폴리스티렌 결합 실리카 입자)34와 비교됩니다. 이번 배치는 반응 혼합물에서 PEG, 요소, TMOS 및 아세트산의 비율이 달라짐에 따라 이전 연구에 비해 입자 크기 분포가 더 좁았습니다. PMP 상의 입자 크기는 이전에 연구한 폴리스티렌 결합 실리카 입자 상의 입자 크기보다 약간 큽니다. 이는 스티렌을 이용한 실리카 입자의 표면 기능화가 실리카 표면에 폴리스티렌 층(0.97 μm)만 증착시킨 반면, PMP 단계에서 층 두께는 1.38 µm였습니다.
순수 실리카 입자와 리간드가 결합된 실리카 입자의 입자 크기 분포(A) 및 기공 크기 분포(B).
본 연구에서 사용된 실리카 입자의 기공 크기, 기공 부피 및 표면적은 표 1(B)에 제시되어 있다. 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 기공 크기 분포(PSD)는 그림 3(B)에 나타나 있다. 결과는 이전 연구 결과와 유사하다. 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 기공 크기는 각각 310과 241로, 화학적 개질 후 기공 크기가 69 감소했음을 표 1(B)에서 확인할 수 있으며, 그림 3(B)에서 곡선의 변화를 볼 수 있다. 마찬가지로, 실리카 입자의 기공 부피는 화학적 개질 후 0.67 cm³/g에서 0.58 cm³/g으로 감소했다. 본 연구에서 사용된 실리카 입자의 비표면적은 116 m²/g으로, 이전 연구 결과(124 m²/g)와 유사하다. 표 1(B)에서 볼 수 있듯이, 실리카 입자의 표면적(m²/g) 또한 116 m²/g에서 105 m²/g으로 감소했다. 화학적 변형 후 m2/g.
고정상의 원소 분석 결과는 표 2에 나타내었다. 현재 고정상의 탄소 함량은 6.35%로, 이전 연구(폴리스티렌 결합 실리카 입자, 각각 7.93%, 10.21%)의 탄소 함량보다 낮다. 42 현재 고정상의 탄소 함량이 낮은 이유는 현재 고정상 제조 과정에서 스티렌 외에도 페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트(PCMP) 및 4-하이드록시-TEMPO와 같은 극성 리간드를 사용했기 때문이다. 현재 고정상의 질소 함량은 2.21%로, 이전 연구의 0.17% 및 0.85%에 비해 높다. 이는 페닐말레이미드의 사용으로 인해 현재 고정상의 질소 함량이 더 높다는 것을 의미한다. 마찬가지로, 생성물 (4)와 (5)의 탄소 함량은 각각 2.7%와 2.9%였지만, 최종 생성물(6)은 표 2에 나타낸 바와 같이 6.35%였습니다. 중량 감소는 PMP 고정상을 사용하여 확인했으며 TGA 곡선은 그림 4에 나타냈습니다. TGA 곡선은 8.6%의 중량 감소를 보여주는데, 이는 리간드에 C뿐만 아니라 N, O, H도 포함되어 있기 때문에 탄소 함량(6.35%)과 잘 일치합니다.
페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트 리간드는 극성 페닐말레이미드기와 비닐이소시아네이트기를 가지고 있기 때문에 실리카 입자의 표면 개질에 사용하기 위해 선택되었습니다. 비닐이소시아네이트기는 리빙 라디칼 중합을 통해 스티렌과 추가적으로 반응할 수 있습니다. 두 번째 이유는 페닐말레이미드기가 정상 pH에서 가상 전하를 띠지 않으므로 분석물질과 적당한 상호작용을 하면서도 분석물질과 고정상 사이에 강한 정전기적 상호작용이 없는 작용기를 도입하기 위함입니다. 고정상의 극성은 최적의 스티렌 양과 자유 라디칼 중합 반응 시간을 조절함으로써 제어할 수 있습니다. 반응의 마지막 단계(자유 라디칼 중합)는 고정상의 극성을 변화시킬 수 있는 중요한 단계입니다. 원소 분석을 통해 이러한 고정상의 탄소 함량을 확인했습니다. 스티렌 양과 반응 시간이 증가함에 따라 고정상의 탄소 함량이 증가하고, 반대로 감소함에 따라 탄소 함량이 감소하는 것을 관찰했습니다. 스티렌 농도가 다른 조건에서 제조된 고정상은 서로 다른 탄소 함량을 나타냈습니다. 이러한 고정상을 스테인리스강에 담지했습니다. 컬럼을 사용하여 크로마토그래피 성능(선택성, 분해능, N 값 등)을 확인했습니다. 이러한 실험을 바탕으로, 제어된 극성과 우수한 분석물질 유지 시간을 보장하는 최적화된 조성을 선택하여 PMP 고정상을 제조했습니다.
또한 5가지 펩타이드 혼합물(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, 류신 엔케팔린)을 이동상을 사용하는 PMP 컬럼을 이용하여 평가하였다. 60/40(v/v) 아세토니트릴/물(0.1% TFA) 용액을 유속 80 μL/min으로 사용하여 분석을 수행했습니다. 최적 용출 조건에서 컬럼당 이론 단수(N)는 20,000 ± 100(200,000 단/m²)입니다(100 × 1.8 mm 내경). 표 3은 세 개의 PMP 컬럼에 대한 N 값을 나타내며, 크로마토그램은 그림 5A에 나와 있습니다. 높은 유속(700 μL/min)에서 PMP 컬럼을 이용한 고속 분석 결과, 1분 이내에 5개의 펩타이드가 용출되었으며, N 값은 컬럼당 13,500 ± 330으로 매우 우수했습니다(100 × 1.8 mm 내경). 이는 135,000 단/m²에 해당합니다(그림 5B). 동일한 크기의 컬럼 3개(100 × 1.8 mm 내경)에 각각 다른 제조 번호의 PMP 고정상을 충전했습니다. 재현성을 확인하기 위해 각 컬럼에서 동일한 시험 혼합물을 분리하는 데 사용된 최적 용출 조건, 이론 단수 N 및 유지 시간을 이용하여 각 컬럼의 분석물 농도를 기록했습니다. PMP 컬럼의 재현성 데이터는 표 4에 나와 있습니다. 표 3에서 볼 수 있듯이 PMP 컬럼의 재현성은 매우 낮은 %RSD 값과 잘 일치합니다.
PMP 컬럼(B)과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(A)에서 펩타이드 혼합물의 분리; 이동상 60/40 아세토니트릴/물(TFA 0.1%), PMP 컬럼 크기(100 × 1.8 mm 내경); 분석 화합물의 용출 순서: 1(Gly-Tyr), 2(Gly-Leu-Tyr), 3(Gly-Gly-Tyr-Arg), 4(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) 및 5(류신)산 엔케팔린).
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 인간 혈청 알부민(HSA)의 트립신 소화물 분리를 위해 PMP 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)을 평가했습니다. 그림 6의 크로마토그램에서 시료가 잘 분리되었고 분해능이 매우 우수함을 확인할 수 있습니다. HSA 소화물은 유속 100 µL/min, 이동상 70/30 아세토니트릴/물, 0.1% TFA를 사용하여 분석했습니다. 크로마토그램(그림 6)에서 볼 수 있듯이, HSA 소화물은 17개의 펩타이드에 해당하는 17개의 피크로 분리되었습니다. HSA 소화물에서 각 피크의 분리 효율을 계산했으며, 그 값은 표 5에 제시되어 있습니다.
HSA(100 × 1.8 mm 내경)의 트립신 소화물을 PMP 컬럼에서 분리하였다. 유속은 100 µL/min이었고, 이동상은 0.1% TFA를 함유한 60/40 아세토니트릴/물이었다.
여기서 L은 컬럼 길이, η는 이동상의 점도, ΔP는 컬럼 배압, u는 이동상의 선속도입니다. PMP 컬럼의 투과도는 2.5 × 10⁻¹⁴ m²였고, 유속은 25 μL/min이었으며, 60/40 v/v의 아세토니트릴/물 혼합액을 사용했습니다. PMP 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)의 투과도는 이전 연구(참고문헌 34)와 유사했습니다. 표면 다공성 입자로 충전된 컬럼의 투과도는 1.3 μm 입자의 경우 1.7 × 10⁻¹⁵ m², 1.7 μm 입자의 경우 3.1 × 10⁻¹⁵ m², 2.6 μm 입자의 경우 5.2 × 10⁻¹⁵ m² 및 2.5 × 10⁻¹⁴ m²입니다. 따라서 PMP 상의 투과도는 5 μm 입자의 투과도와 유사합니다. μm 코어-쉘 입자.
여기서 Wx는 클로로포름으로 충전된 컬럼의 무게, Wy는 메탄올로 충전된 컬럼의 무게, ρ는 용매의 밀도입니다. 메탄올(ρ = 0.7866)과 클로로포름(ρ = 1.484)의 밀도는 다음과 같습니다. 이전에 연구했던 SILICA PARTICLES-C18 컬럼(100 × 1.8 mm 내경) 34과 C18-Urea 컬럼 31의 총 기공률은 각각 0.63과 0.55였습니다. 이는 우레아 리간드의 존재가 고정상의 투과성을 감소시킨다는 것을 의미합니다. 반면, PMP 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)의 총 기공률은 0.60입니다. PMP 컬럼의 투과성은 C18 결합 실리카 입자로 충전된 컬럼보다 낮은데, 이는 C18형 고정상에서 C18 리간드가 실리카 입자에 선형으로 결합되어 있기 때문입니다. 폴리스티렌 계열 고정상에서는 사슬 형태로 존재하며, 상대적으로 두꺼운 고분자 층이 주변에 형성됩니다. 일반적인 실험에서 컬럼의 다공성은 다음과 같이 계산됩니다.
그림 7A,B는 동일한 용출 조건(즉, 60/40 아세토니트릴/물 및 0.1% 트리플루오로아세트산)을 사용한 PMP 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)의 결과를 보여줍니다. 선택된 펩타이드 혼합물(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin)을 20 µL/min에 준비했습니다. 두 컬럼 모두 최소 유속은 800 µL/min입니다. 최적 유속(80 µL/min)에서 PMP 컬럼과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼의 최소 HETP 값은 각각 2.6 µm와 3.9 µm였습니다. HETP 값은 PMP 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)의 분리 효율이 시판되는 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)보다 훨씬 우수함을 나타냅니다. 그림 7(A)의 van Deemter 플롯은 유속 증가에 따른 N 값의 감소가 이전 연구와 비교했을 때 크지 않음을 보여줍니다. PMP 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)의 더 높은 분리 효율은 이러한 차이를 뒷받침합니다. Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교했을 때 1.8mm id)의 개선은 본 연구에서 사용된 입자 모양, 크기 및 복잡한 컬럼 패킹 절차의 개선을 기반으로 합니다.34
(A) 0.1% TFA를 첨가한 60/40 아세토니트릴/물 용액에서 PMP 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)을 사용하여 얻은 반 데엠터 플롯(HETP 대 이동상 선형 속도). (B) 0.1% TFA를 첨가한 60/40 아세토니트릴/물 용액에서 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)을 사용하여 얻은 반 데엠터 플롯(HETP 대 이동상 선형 속도).
극성 입자가 내장된 폴리스티렌 고정상(PMP)을 제조하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 합성 펩타이드 혼합물과 인간 혈청 알부민(HAS)의 트립신 소화물의 분리 성능을 평가했습니다. PMP 컬럼은 펩타이드 혼합물 분리에 있어 분리 효율과 분해능이 우수합니다. 이러한 분리 성능 향상은 실리카 입자의 크기와 기공 크기, 고정상의 제어된 합성, 그리고 복잡한 컬럼 충전 구조 등 다양한 요인에 기인합니다. 높은 분리 효율 외에도, 높은 유속에서도 낮은 컬럼 배압을 나타내는 것이 이 고정상의 또 다른 장점입니다. PMP 컬럼은 우수한 재현성을 보이며 다양한 단백질의 펩타이드 혼합물 및 트립신 소화물 분석에 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는 이 컬럼을 액체 크로마토그래피를 이용한 천연물, 약용 식물 및 균류 추출물의 생리활성 물질 분리에 활용할 계획입니다. 향후에는 단백질 및 단클론 항체 분리에도 PMP 컬럼의 활용 가능성을 평가할 예정입니다.
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