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다공성 실리카 입자는 졸-겔법에 약간의 변형을 가하여 거대 다공성 입자를 제조하였다. 이 입자는 N-페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트(PMI)와 스티렌을 이용한 가역적 첨가 단편화 사슬 이동(RAFT) 중합으로 유도체화하여 폴리스티렌(PMP) 고정상에 N-페닐말레이미드가 삽입된 용액을 제조하였다. 협구경 스테인리스 스틸 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)을 슬러리 충진법으로 충진하였다. 5가지 펩타이드(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, 류신-엔케팔린)로 구성된 펩타이드 혼합물의 PMP 컬럼 분리능(크로마토그래피 성능)과 인간 혈청 알부민(HAS)의 트립신 분해능을 평가하였다. 최적의 용출 조건에서 펩타이드 혼합물의 이론적인 플레이트 수는 최대 280,000개이다. 개발된 컬럼의 분리 성능을 상용 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교한 결과, 분리 효율과 분리능 측면에서 PMP 컬럼의 분리 성능이 상용 컬럼보다 우수한 것으로 나타났습니다.
최근 몇 년 동안 생물제약 산업은 시장 점유율이 크게 증가하면서 확장되는 글로벌 시장이 되었습니다.생물제약 산업의 폭발적인 성장1,2,3으로 인해 펩타이드와 단백질 분석이 매우 요구됩니다.대상 펩타이드 외에도 펩타이드 합성 중에 여러 불순물이 생성되므로 원하는 순도의 펩타이드를 얻으려면 크로마토그래피 정제가 필요합니다.체액, 조직 및 세포에서 단백질을 분석하고 특성화하는 것은 단일 샘플에서 잠재적으로 검출 가능한 종의 수가 많기 때문에 매우 어려운 작업입니다.질량 분석법은 펩타이드 및 단백질 시퀀싱에 효과적인 도구이지만 이러한 샘플을 한 번에 질량 분석기에 주입하면 분리가 이상적이지 않습니다.이 문제는 MS 분석 전에 액체 크로마토그래피(LC) 분리를 구현하여 주어진 시간에 질량 분석기에 들어가는 분석물 수를 줄임으로써 완화할 수 있습니다4,5,6.또한 액상 분리 중에 분석물을 좁은 영역에 집중시켜 이러한 분석물을 농축할 수 있습니다. MS 검출 감도 향상. 액체 크로마토그래피(LC)는 지난 10년 동안 크게 발전하여 프로테오믹 분석에서 인기 있는 기술이 되었습니다.7,8,9,10
역상 액체 크로마토그래피(RP-LC)는 옥타데실 개질 실리카(ODS)를 고정상으로 사용하여 펩타이드 혼합물의 정제 및 분리에 널리 사용됩니다.11,12,13. 그러나 RP 고정상은 복잡한 구조와 양친매성 때문에 펩타이드와 단백질을 만족스럽게 분리하지 못합니다.14,15. 따라서 이러한 분석물과 상호 작용하고 이를 유지하기 위해 극성 및 비극성 부분을 가진 펩타이드와 단백질을 분석하기 위해 특별히 설계된 고정상이 필요합니다.16. 다중 모드 상호 작용을 제공하는 혼합 모드 크로마토그래피는 펩타이드, 단백질 및 기타 복잡한 혼합물의 분리를 위한 RP-LC의 대안이 될 수 있습니다. 여러 혼합 모드 고정상이 제조되었으며 이러한 상으로 채워진 컬럼은 펩타이드 및 단백질 분리에 사용되었습니다.17,18,19,20,21. 혼합 모드 고정상(WAX/RPLC, HILIC/RPLC, 극성 인터칼레이션/RPLC는 극성기와 비극성기가 모두 존재하기 때문에 펩타이드 및 단백질 분리에 적합합니다.22,23,24,25,26,27,28 . 마찬가지로, 공유 결합된 극성기를 갖는 극성 인터칼레이션 고정상은 분석물과 고정상 간의 상호작용에 따라 분리가 이루어지므로, 극성 및 비극성 분석물에 대해 우수한 분리능과 고유한 선택성을 보입니다. 다중 모드 상호작용 29, 30, 31, 32 . 최근 Zhang et al. 30은 도데실 말단 폴리아민 고정상을 제조하고 탄화수소, 항우울제, 플라보노이드, 뉴클레오사이드, 에스트로겐 및 여러 다른 분석물을 성공적으로 분리했습니다.극성 삽입제는 극성 및 비극성 그룹을 모두 가지고 있으므로 소수성 및 친수성 부분을 모두 가지고 있는 펩타이드와 단백질을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.극성 매입 컬럼(예: 아미드 매입 C18 컬럼)은 Ascentis Express RP-Amide 컬럼이라는 상표명으로 상업적으로 판매되지만 이 컬럼은 아민 33의 분석에만 사용됩니다.
현재 연구에서는 극성 포매 고정상(N-페닐말레이미드 포매 폴리스티렌)을 제조하여 HSA의 펩타이드와 트립신 소화물의 분리를 평가했습니다. 고정상은 다음 전략을 사용하여 제조했습니다. 다공성 실리카 입자는 제조 프로토콜을 약간 수정하여 이전 출판물에 제공된 절차에 따라 제조했습니다. 요소, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), TMOS, 물 아세트산의 비율을 조정하여 기공 크기가 큰 실리카 입자를 제조했습니다. 두 번째로, 새로운 리간드인 페닐말레이미드-메틸 비닐 이소시아네이트를 합성하여 실리카 입자를 유도체화하여 극성 포매 고정상을 제조했습니다. 그 결과 고정상을 최적화된 패킹 방식을 사용하여 스테인리스 스틸 컬럼(100 × 1.8mm id)에 패킹했습니다. 컬럼 패킹은 기계적 진동으로 보조되어 컬럼 내에 균일한 층이 형성되도록 합니다. 5개의 펩타이드로 구성된 펩타이드 혼합물의 패킹 컬럼 분리를 평가합니다. (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 및 인간 혈청 알부민(HAS)의 트립신 분해물. HSA의 펩타이드 혼합물과 트립신 분해물은 우수한 분리능과 효율로 분리되는 것으로 관찰되었습니다. PMP 컬럼의 분리 성능을 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교했습니다. 펩타이드와 단백질 모두 PMP 컬럼에서 잘 분리되고 효율적인 것으로 관찰되었으며, Ascentis Express RP-Amide 컬럼보다 효율적이었습니다.
PEG(폴리에틸렌글리콜), 요소, 아세트산, 트리메톡시 오르토실리케이트(TMOS), 트리메틸클로로실란(TMCS), 트립신, 인간혈청알부민(HSA), 염화암모늄, 요소, 헥산메틸디실라잔(HMDS), 메타크릴로일클로라이드(MC), 스티렌, 4-하이드록시-TEMPO, 벤조일퍼옥사이드(BPO), HPLC 등급 아세토니트릴(ACN), 메탄올, 2-프로판올, 아세톤은 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입했습니다.
요소(8g), 폴리에틸렌글리콜(8g), 0.01N 아세트산 8mL의 혼합물을 10분간 교반한 후, 얼음처럼 차가운 조건에서 TMOS 24mL를 첨가했습니다. 반응 혼합물을 스테인리스 스틸 오토클레이브에서 40°C에서 6시간, 그 다음 120°C에서 8시간 동안 가열했습니다. 물을 붓고 잔여물을 70°C에서 12시간 동안 건조했습니다. 건조된 연질 덩어리를 오븐에서 매끄럽게 분쇄한 후 550°C에서 12시간 동안 소성했습니다. 3개의 배치를 준비하고 특성화하여 입자 크기, 기공 크기 및 표면적의 재현성을 조사했습니다.
미리 합성된 리간드인 페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트(PCMP)로 실리카 입자의 표면을 개질한 후 스티렌과 방사 중합하여 극성기를 포함하는 화합물을 제조하였다. 응집체 및 폴리스티렌 사슬용 고정상. 제조 공정은 아래와 같다.
N-페닐말레이미드(200mg)와 메틸비닐이소시아네이트(100mg)를 건조톨루엔에 녹이고, 반응 플라스크에 2,2'-아조이소부티로니트릴(AIBN) 0.1mL을 첨가하여 페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트 공중합체(PMCP)를 제조하였다. 혼합물을 60°C에서 3시간 동안 가열하고, 여과한 후 40°C 오븐에서 3시간 동안 건조하였다.
건조된 실리카 입자(2g)를 건조 톨루엔(100mL)에 분산시키고, 교반한 후 500mL 둥근 바닥 플라스크에서 10분간 초음파 처리했습니다. PMCP(10mg)를 톨루엔에 녹인 후 적하 깔때기를 통해 반응 플라스크에 적하했습니다. 혼합물을 100°C에서 8시간 동안 환류시키고, 여과한 후 아세톤으로 세척하고 60°C에서 3시간 동안 건조했습니다. 그런 다음 PMCP가 결합된 실리카 입자(100g)를 톨루엔(200ml)에 녹이고, 촉매로 디부틸틴 디라우레이트 100µL가 존재하는 상태에서 4-하이드록시-TEMPO(2mL)를 첨가했습니다. 혼합물을 50°C에서 8시간 동안 교반하고, 여과한 후 50°C에서 3시간 동안 건조했습니다.
스티렌(1 mL), 과산화벤조일 BPO(0.5 mL) 및 TEMPO-PMCP가 부착된 실리카 입자(1.5 g)를 톨루엔에 분산시키고 질소로 정화했습니다. 스티렌의 중합은 100°C에서 12시간 동안 수행되었습니다. 생성된 생성물을 메탄올로 세척하고 60°C에서 하룻밤 동안 건조했습니다. 전체 반응 계획은 그림 1에 나와 있습니다.
샘플은 10-3 Torr 미만의 잔류 압력을 얻기 위해 393 K에서 1시간 동안 탈기되었습니다.상대 압력 P/P0 = 0.99에서 흡착된 N2의 양은 전체 기공 부피를 결정하는 데 사용되었습니다.맨손 및 리간드 결합 실리카 입자의 형태는 주사 전자 현미경(Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan)으로 조사되었습니다.건조된 샘플(맨손 실리카 및 리간드 결합 실리카 입자)은 접착성 탄소 테이프를 사용하여 알루미늄 컬럼에 올려놓았습니다.Q150T 스퍼터 코터를 사용하여 샘플에 금을 도금하고 5 nm Au 층을 샘플에 증착했습니다.이는 낮은 전압을 사용하여 공정 효율을 개선하고 미세 입자의 콜드 스퍼터링을 제공합니다.Thermo Electron(Waltham, MA, USA) Flash EA1112 원소 분석기를 원소 분석에 사용했습니다.Malvern(Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 입자 크기 분석기를 사용하여 입자를 얻었습니다. 크기 분포.나체 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자(각각 5mg)를 5mL의 이소프로판올에 분산시키고, 10분간 초음파 처리한 후, 5분간 진탕하고, Mastersizer의 광학 벤치에 올려놓았습니다.열중량 분석은 30~800°C의 온도 범위에서 분당 5°C의 속도로 수행되었습니다.
치수(100 × 1.8 mm id)의 유리 라이닝 스테인리스 스틸 협구 컬럼은 Ref.에서 사용된 것과 동일한 절차를 적용하여 슬러리 패킹 방법을 사용하여 패킹되었습니다. 31. 1µm 프릿이 포함된 배출 피팅이 있는 스테인리스 스틸 컬럼(유리 라이닝, 100 × 1.8mm id)을 슬러리 패커(Alltech, Deerfield, IL, USA)에 연결했습니다. 1.2mL의 메탄올에 고정상 150mg을 현탁시켜 고정상 슬러리를 제조하고 저장 컬럼으로 보냈습니다. 메탄올은 슬러리 용매이자 추진 용매로 사용되었습니다. 10분 동안 100MP, 15분 동안 80MP, 30분 동안 60MP의 압력을 순차적으로 적용하여 컬럼을 채웠습니다. 패킹하는 동안 두 개의 GC 컬럼 셰이커(Alltech, Deerfield, IL, USA)로 기계적 진동을 가하여 컬럼의 균일한 패킹을 보장했습니다. 슬러리 패커를 닫고 컬럼 내부의 손상을 방지하기 위해 천천히 압력을 해제했습니다. 슬러리 패킹 장치에서 컬럼을 분리하고 다른 피팅을 입구에 연결했습니다. LC 시스템의 성능을 점검합니다.
영어: LC 펌프(10AD Shimadzu, 일본), 50nL 주입 루프, 멤브레인 탈기 장치(Shimadzu DGU-14A), UV-VIS 모세관 창이 있는 주입기(Valco(USA) C14 W.05)를 특수 µLC 장치 검출기(UV-2075) 및 유리 라이닝 마이크로 컬럼으로 구성했습니다. 추가 컬럼 밴드 확장 효과를 최소화하기 위해 매우 좁고 짧은 연결 튜빙을 사용했습니다. 패키징 후 모세관(50μm id 365)과 환원 유니온 모세관(50μm)을 환원 유니온의 1/16″ 출구에 설치했습니다. 데이터 수집 및 크로마토그래피 처리는 Multichro 2000 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다. 254nm에서 모니터링 분석물의 UV 흡광도를 테스트했습니다. 크로마토그래피 데이터는 OriginPro8(Northampton, MA)로 분석했습니다.
인간 혈청의 알부민, 동결건조 분말, ≥ 96% (아가로스 겔 전기영동) 3mg을 트립신(1.5mg), 4.0M 요소(1mL), 0.2M 중탄산암모늄(1mL)과 혼합했습니다. 용액을 10분간 교반한 후 37°C의 수조에서 6시간 동안 방치한 후 0.1% TFA 1mL로 냉각시켰습니다. 용액을 여과한 후 4°C 이하에서 보관합니다.
펩타이드 혼합물과 HSA 트립신 분해물의 분리는 PMP 컬럼에서 별도로 평가되었습니다. PMP 컬럼을 사용하여 HSA의 펩타이드 혼합물과 트립신 분해물의 분리를 확인하고 그 결과를 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교했습니다. 이론적인 단층은 다음과 같이 계산합니다.
맨 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 SEM 이미지가 그림 2에 나와 있습니다. 맨 실리카 입자의 SEM 이미지(A, B)는 이전 연구와 달리 이 입자가 구형이며 입자가 길쭉하거나 불규칙한 대칭을 가지고 있음을 보여줍니다. 리간드 결합 실리카 입자(C, D)의 표면은 맨 실리카 입자보다 매끄럽습니다. 이는 실리카 입자 표면에 폴리스티렌 사슬이 코팅되어 있기 때문일 수 있습니다.
맨 실리카 입자(A, B)와 리간드 결합 실리카 입자(C, D)의 주사 전자 현미경 이미지.
맨 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 입자 크기 분포는 그림 3(A)에 나와 있습니다.부피 기반 입자 크기 분포 곡선은 화학적 변형 후 실리카 입자의 크기가 증가했음을 보여주었습니다(그림 3A).현재 연구와 이전 연구의 실리카 입자의 입자 크기 분포 데이터는 표 1(A)에 비교되어 있습니다.PMP의 부피 기반 입자 크기 d(0.5)는 3.36μm로, 이전 연구의 ad(0.5) 값인 3.05μm(폴리스티렌 결합 실리카 입자)34과 비교됩니다.이 배치는 반응 혼합물에서 PEG, 우레아, TMOS 및 아세트산의 비율이 다양하기 때문에 이전 연구에 비해 입자 크기 분포가 좁았습니다.PMP 상의 입자 크기는 이전에 연구한 폴리스티렌 결합 실리카 입자 상의 입자 크기보다 약간 큽니다.이는 스티렌으로 실리카 입자의 표면 기능화가 실리카 표면에 폴리스티렌 층(0.97μm)만 증착했음을 의미합니다. 반면 PMP 단계에서는 층 두께가 1.38µm였습니다.
맨실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 입자 크기 분포(A) 및 기공 크기 분포(B).
현재 연구의 실리카 입자의 기공 크기, 기공 부피 및 표면적은 표 1(B)에 나와 있습니다.맨손 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 PSD 프로파일은 그림 3(B)에 나와 있습니다.결과는 이전 연구와 비슷합니다.맨손 및 리간드 결합 실리카 입자의 기공 크기는 각각 310과 241로, 화학적 변형 후 기공 크기가 69만큼 감소했음을 나타내며, 표 1(B)에 나와 있고 곡선의 변화는 그림 3(B)에 나와 있습니다.마찬가지로, 화학적 변형 후 실리카 입자의 기공 부피는 0.67에서 0.58 cm3/g로 감소했습니다.현재 연구된 실리카 입자의 비표면적은 116 m2/g로 이전 연구(124 m2/g)와 비슷합니다.표 1(B)에 나와 있듯이 실리카 입자의 표면적(m2/g)도 116 m2/g에서 105로 감소했습니다. 화학적 변형 후 m2/g.
정지상의 원소 분석 결과는 표 2에 나와 있습니다.현재 정지상의 탄소 로딩은 6.35%로 이전 연구의 탄소 로딩(폴리스티렌 결합 실리카 입자, 각각 7.93%35 및 10.21%)42보다 낮습니다.현재 정지상의 탄소 로딩은 낮은데, 이는 현재 SP를 제조할 때 스티렌 외에도 페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트(PCMP) 및 4-하이드록시-TEMPO와 같은 극성 리간드가 사용되었기 때문입니다.현재 정지상의 질소 중량 백분율은 이전 연구에서 각각 질소 중량 기준 0.1735 및 0.85%에 비해 2.21%입니다.이는 페닐말레이미드로 인해 현재 정지상에서 질소의 중량 %가 더 높다는 것을 의미합니다.마찬가지로, 제품 (4) 및 (5)의 탄소 로딩은 각각 2.7% 및 2.9%인 반면 탄소 최종 생성물(6)의 로딩량은 표 2에 나타낸 바와 같이 6.35%였다. 중량 감소는 PMP 고정상으로 확인하였고, TGA 곡선은 그림 4에 나타내었다. TGA 곡선은 8.6%의 중량 감소를 나타내는데, 이는 리간드에 C뿐만 아니라 N, O, H도 포함되어 있기 때문에 탄소 로딩량(6.35%)과 잘 일치한다.
페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트 리간드는 극성 페닐말레이미드기와 비닐이소시아네이트기를 가지고 있기 때문에 실리카 입자의 표면 개질에 선택되었습니다. 비닐이소시아네이트기는 리빙 라디칼 중합을 통해 스티렌과 추가로 반응할 수 있습니다. 두 번째 이유는 페닐말레이미드 부분이 정상 pH에서 가상 전하를 갖지 않기 때문에 분석물과 적당한 상호작용을 하고 분석물과 고정상 사이에 강한 정전기적 상호작용이 없는 기를 삽입하는 것입니다. 고정상의 극성은 스티렌의 최적 양과 자유 라디칼 중합 반응 시간에 의해 제어될 수 있습니다. 반응의 마지막 단계(자유 라디칼 중합)는 매우 중요하며 고정상의 극성을 변화시킬 수 있습니다. 이러한 고정상의 탄소 함량을 확인하기 위해 원소 분석을 수행했습니다. 스티렌의 양과 반응 시간을 증가시키면 고정상의 탄소 함량이 증가하고 그 반대의 경우도 마찬가지였습니다. 스티렌의 농도가 다른 SP는 탄소 함량이 다릅니다. 다시 말해, 이러한 고정상에 탄소를 공급합니다. 스테인리스 스틸 컬럼에 넣고 크로마토그래피 성능(선택성, 분리능, N 값 등)을 확인합니다. 이러한 실험을 바탕으로, 제어된 극성과 양호한 분석물 유지를 보장하기 위해 PMP 고정상을 제조하기 위해 최적화된 제형을 선택했습니다.
5가지 펩타이드 혼합물(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, 류신 엔케팔린)도 이동상을 사용하는 PMP 컬럼을 사용하여 평가했습니다. 60/40(v/v) 아세토니트릴/물(0.1% TFA)을 유속 80 μL/min으로 처리합니다.최적의 용출 조건에서 컬럼당 이론적인 플레이트 수(N)(100 × 1.8 mm id)는 20,000 ± 100(200,000 플레이트/m²)입니다.표 3은 3개의 PMP 컬럼에 대한 N 값을 제공하고 크로마토그램은 그림 5A에 나와 있습니다.고유속(700 μL/min)에서 PMP 컬럼에 대한 빠른 분석에서 5개의 펩타이드가 1분 이내에 용출되었으며 N 값은 매우 양호했습니다.컬럼당 13,500 ± 330(100 × 1.8 mm id), 135,000 플레이트/m에 해당합니다(그림 5B).크기가 동일한 3개의 컬럼(100 × 1.8 mm id)에 3개의 다른 PMP 로트를 채웠습니다. 재현성을 확인하기 위한 고정상. 각 컬럼의 분석물 농도는 최적의 용출 조건과 이론 플레이트 수 N 및 각 컬럼에서 동일한 시험 혼합물을 분리하기 위한 보유 시간을 사용하여 기록했습니다. PMP 컬럼의 재현성 데이터는 표 4에 나와 있습니다. PMP 컬럼의 재현성은 표 3에 나와 있는 것처럼 매우 낮은 %RSD 값과 잘 상관관계가 있습니다.
PMP 컬럼(B)과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(A)에서 펩타이드 혼합물을 분리함; 이동상 60/40 ACN/H2O(TFA 0.1%), PMP 컬럼 크기(100 × 1.8 mm id); 분석 화합물의 용출 순서: 1(Gly-Tyr), 2(Gly-Leu-Tyr), 3(Gly-Gly-Tyr-Arg), 4(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) 및 5(류신) 산 엔케팔린)).
PMP 컬럼(100 × 1.8 mm id)을 고성능 액체 크로마토그래피에서 인간 혈청 알부민의 트립신 분해물을 분리하는 데 평가했습니다.그림 6의 크로마토그램은 샘플이 잘 분리되었고 분해능이 매우 우수함을 보여줍니다.HSA 분해물은 100 µL/분의 유속, 이동상 70/30 아세토니트릴/물 및 0.1% TFA를 사용하여 분석했습니다.크로마토그램(그림 6)에서 볼 수 있듯이 HSA 분해물은 17개 펩타이드에 해당하는 17개 피크로 분리되었습니다.HSA 분해물의 각 피크의 분리 효율을 계산하여 값을 표 5에 나타냈습니다.
HSA의 트립신 분해물(100 × 1.8 mm id)을 PMP 컬럼에서 분리했습니다. 유속(100 µL/분), 이동상은 60/40 아세토니트릴/물, 0.1% TFA입니다.
여기서 L은 컬럼 길이, η는 이동상의 점도, ΔP는 컬럼 역압, u는 이동상의 선속도입니다.PMP 컬럼의 투과율은 2.5 × 10-14 m2이고, 유속은 25 μL/min이며, 60/40 v/v ACN/물이 사용되었습니다.PMP 컬럼(100 × 1.8 mm id)의 투과율은 이전 연구 Ref.34와 유사했습니다.표면 다공성 입자로 채워진 컬럼의 투과율은 다음과 같습니다.1.3 μm 입자의 경우 1.7 × 10-15, 1.7 μm 입자의 경우 3.1 × 10-15, 2.6 μm 입자의 경우 5.2 × 10-15 및 2.5 × 10-14 m2 5 μm 입자의 경우 43.따라서 PMP 상의 투과율은 다음과 유사합니다. 5 μm 코어-쉘 입자.
여기서 Wx는 클로로포름으로 채워진 컬럼의 무게이고, Wy는 메탄올로 채워진 컬럼의 무게이며, ρ는 용매의 밀도입니다.메탄올(ρ = 0.7866)과 클로로포름(ρ = 1.484)의 밀도입니다.이전에 연구한 SILICA PARTICLES-C18 컬럼(100 × 1.8 mm id) 34와 C18-Urea 컬럼 31의 총 다공성은 각각 0.63과 0.55였습니다.이는 요소 리간드의 존재가 고정상의 투과성을 감소시킨다는 것을 의미합니다.반면에 PMP 컬럼(100 × 1.8 mm id)의 총 다공성은 0.60입니다.PMP 컬럼의 투과성은 C18 결합 실리카 입자로 채워진 컬럼보다 낮습니다.C18 유형의 고정상에서 C18 리간드는 실리카 입자에 다음과 같이 부착되어 있기 때문입니다. 선형 사슬인 반면 폴리스티렌 유형의 고정상에서는 A가 비교적 두꺼운 폴리머 층을 주변에 형성합니다. 일반적인 실험에서 컬럼 다공성은 다음과 같이 계산됩니다.
그림 7A,B는 동일한 용출 조건(즉, 60/40 ACN/H2O 및 0.1% TFA)을 사용하는 PMP 컬럼(100 × 1.8 mm id)과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(100 × 1.8 mm id)을 보여줍니다. )의 van Deemter 플롯입니다. 선택된 펩타이드 혼합물(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin)은 20 µL/에서 준비되었습니다. 두 컬럼 모두의 최소 유속은 800 µL/min입니다. PMP 컬럼과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼의 최적 유속(80 µL/min)에서 최소 HETP 값은 각각 2.6 µm와 3.9 µm였습니다. HETP 값은 PMP 컬럼(100 × 1.8 mm id)의 분리 효율이 시중에서 판매되는 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(100 × 1.8 mm id)보다 훨씬 우수함을 나타냅니다. 그림 7(A)의 van Deemter 플롯은 유량이 증가함에 따라 N 값이 감소하는 것이 이전 연구에 비해 크지 않음을 보여줍니다. PMP 컬럼(100 × 1.8 mm id)가 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교되는 것은 현재 작업에서 사용되는 입자 모양, 크기 및 복잡한 컬럼 충진 절차의 개선에 기반합니다.34
(A) 0.1% TFA가 포함된 60/40 ACN/H2O에서 PMP 컬럼(100 × 1.8 mm id)을 사용하여 얻은 van Deemter 플롯(HETP 대 이동상 선속도).(B) 0.1% TFA가 포함된 60/40 ACN/H2O에서 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(100 × 1.8 mm id)을 사용하여 얻은 van Deemter 플롯(HETP 대 이동상 선속도).
극성 포매 폴리스티렌 고정상을 제조하여 고성능 액체 크로마토그래피에서 합성 펩타이드 혼합물과 인간 혈청 알부민(HAS)의 트립신 소화물을 분리하기 위해 평가했습니다.펩타이드 혼합물에 대한 PMP 컬럼의 크로마토그래피 성능은 분리 효율과 분해능 면에서 우수합니다.PMP 컬럼의 분리 성능이 향상된 것은 실리카 입자의 입자 크기와 기공 크기, 고정상의 합성 제어, 복잡한 컬럼 패킹과 같은 다양한 이유 때문입니다.높은 분리 효율 외에도 높은 유속에서 컬럼 역압이 낮은 것도 이 고정상의 또 다른 장점입니다.PMP 컬럼은 재현성이 좋으며 펩타이드 혼합물 분석과 다양한 단백질의 트립신 소화에 사용할 수 있습니다.이 컬럼을 사용하여 액체 크로마토그래피에서 천연물, 약용 식물의 생리활성 화합물, 곰팡이 추출물을 분리할 계획입니다.앞으로 PMP 컬럼을 사용하여 단백질과 단일클론 항체를 분리하는 것도 평가할 것입니다.
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