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多孔質シリカ粒子は、マクロ多孔質粒子を得るために、ゾルゲル法に若干の変更を加えて調製した。これらの粒子は、N-フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート（PMI）とスチレンを用いた可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合により誘導体化され、ポリスチレンのN-フェニルマレイミドインターカレーション（PMP）固定相が調製された。細径ステンレス鋼カラム（100 × 1.8 mm id）は、スラリー充填により充填された。5種類のペプチド（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン）からなるペプチド混合物のPMPカラム分離（クロマトグラフィー性能）とヒト血清アルブミン（HAS）のトリプシン消化を評価した。最適な溶出条件下では、ペプチド混合物の理論段数は280,000プレート/m²にも達する。市販のAscentis Express RP-Amideカラムと開発したカラムを比較したところ、分離効率と分離能の点で、PMPカラムの分離性能が市販のカラムよりも優れていることが観察された。
近年、バイオ医薬品産業は市場シェアの大幅な増加に伴い、拡大を続けるグローバル市場となっています。バイオ医薬品産業の爆発的な成長1,2,3に伴い、ペプチドおよびタンパク質の分析が強く求められています。ペプチド合成では、目的のペプチドに加えて、いくつかの不純物が生成されるため、目的の純度のペプチドを得るにはクロマトグラフィーによる精製が必要です。体液、組織、細胞中のタンパク質の分析と特性評価は、1つのサンプル中に検出可能な種が多数存在するため、非常に困難な作業です。質量分析法はペプチドおよびタンパク質の配列決定に有効なツールですが、このようなサンプルを一度に質量分析計に注入すると、分離が理想的にはなりません。この問題は、質量分析の前に液体クロマトグラフィー（LC）分離を実施することで軽減できます。これにより、一定時間内に質量分析計に入る分析対象物の数を減らすことができます4,5,6。さらに、液相分離中に分析対象物を狭い領域に集中させることができ、これらの分析対象物を濃縮することができます。液体クロマトグラフィー（LC）は過去10年間で大きく進歩し、プロテオミクス分析で人気の高い技術となっています7,8,9,10。
逆相液体クロマトグラフィー（RP-LC）は、オクタデシル修飾シリカ（ODS）を固定相として用いてペプチド混合物の精製および分離に広く用いられています11,12,13。しかしながら、RP固定相は、ペプチドやタンパク質の複雑な構造と両親媒性のため、満足のいく分離を提供しません14,15。そのため、極性および非極性部分を持つペプチドやタンパク質を分析するには、これらの分析対象物と相互作用して保持する特殊な固定相が必要となります16。マルチモード相互作用を提供する混合モードクロマトグラフィーは、ペプチド、タンパク質、およびその他の複雑な混合物の分離においてRP-LCの代替となり得ます。いくつかの混合モード固定相が調製されており、これらの固定相を充填したカラムがペプチドおよびタンパク質の分離に使用されています17,18,19,20,21。混合モード固定相（WAX/RPLC、HILIC/RPLC、極性）極性インターカレーション/RPLC)は、極性基と非極性基の両方が存在するため、ペプチドおよびタンパク質の分離に適しています22,23,24,25,26,27,28。同様に、共有結合した極性基を持つ極性インターカレーション固定相は、分離が分析物と固定相との相互作用に依存するため、極性および非極性分析物に対して優れた分離力と独自の選択性を示します。マルチモーダル相互作用29, 30, 31, 32。最近、Zhangらは、 30はドデシル末端ポリアミン固定相を調製し、炭化水素、抗うつ剤、フラボノイド、ヌクレオシド、エストロゲン、およびその他のいくつかの分析対象物を分離することに成功した。極性インターカレーターは極性基と非極性基の両方を有するため、疎水性部分と親水性部分の両方を有するペプチドおよびタンパク質の分離に使用できる。極性埋め込みカラム（例えば、アミド埋め込みC18カラム）はAscentis Express RP-Amideカラムという商標名で市販されているが、これらのカラムはアミン33の分析にのみ使用される。
本研究では、極性埋め込み固定相（N-フェニルマレイミド埋め込みポリスチレン）を調製し、HSAのペプチドおよびトリプシン消化物の分離について評価した。固定相は以下の戦略を用いて調製した。多孔質シリカ粒子は、調製プロトコルに若干の変更を加えた上で、以前の論文に記載した手順に従って調製した。尿素、ポリエチレングリコール（PEG）、TMOS、水、酢酸の比率を調整して、大きな細孔径のシリカ粒子を調製した。次に、新しいリガンドであるフェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネートを合成し、シリカ粒子を誘導体化して極性埋め込み固定相を調製した。得られた固定相は、最適化された充填スキームを用いてステンレス鋼カラム（100 × 1.8 mm id）に充填した。カラム充填は、カラム内に均一な充填層が形成されるように機械的振動によって補助した。5つのペプチドからなるペプチド混合物の充填カラム分離を評価した。 (Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン) およびヒト血清アルブミン (HAS) のトリプシン消化物。ペプチド混合物と HSA のトリプシン消化物は、良好な分離度と効率で分離されることが観察された。PMP カラムの分離性能を Ascentis Express RP-Amide カラムと比較した。ペプチドとタンパク質の両方が PMP カラムで良好に分離され、効率的であることが観察され、Ascentis Express RP-Amide カラムよりも効率的であった。
PEG（ポリエチレングリコール）、尿素、酢酸、トリメトキシオルトシリケート（TMOS）、トリメチルクロロシラン（TMCS）、トリプシン、ヒト血清アルブミン（HSA）、塩化アンモニウム、尿素、ヘキサンメチルジシラザン（HMDS）、メタクリロイルクロリド（MC）、スチレン、4-ヒドロキシ-TEMPO、過酸化ベンゾイル（BPO）、HPLCグレードアセトニトリル（ACN）、メタノール、2-プロパノール、アセトンは、Sigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。
尿素（8 g）、ポリエチレングリコール（8 g）、および 0.01 N 酢酸 8 mL の混合物を 10 分間攪拌し、氷冷条件下で TMOS 24 mL を加えた。反応混合物をステンレス鋼オートクレーブで 40 °C で 6 時間、その後 120 °C で 8 時間加熱した。水を注ぎ出し、残留物を 70 °C で 12 時間乾燥させた。乾燥した軟質塊をオーブンで滑らかに粉砕し、550 °C で 12 時間焼成した。粒子サイズ、細孔サイズ、および表面積の再現性を調べるために、3 つのバッチを準備して特性評価を行った。
予め合成した配位子フェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート（PCMP）を用いてシリカ粒子の表面修飾を行い、続いてスチレンとの放射状重合を行うことにより、極性基を含む化合物を調製した。凝集体およびポリスチレン鎖の固定相。調製プロセスは以下に説明する。
N-フェニルマレイミド（200 mg）とメチルビニルイソシアネート（100 mg）を乾燥トルエンに溶解し、2,2′-アゾイソブチロニトリル（AIBN）0.1 mLを反応フラスコに加えて、フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート共重合体（PMCP）を調製した。混合物を60℃で3時間加熱し、濾過後、40℃のオーブンで3時間乾燥させた。
乾燥させたシリカ粒子（2 g）を乾燥トルエン（100 mL）に分散させ、500 mL 丸底フラスコで 10 分間攪拌および超音波処理した。PMCP（10 mg）をトルエンに溶解し、滴下漏斗を用いて反応フラスコに滴下した。混合物を 100 °C で 8 時間還流し、ろ過してアセトンで洗浄し、60 °C で 3 時間乾燥させた。次に、PMCP 結合シリカ粒子（100 g）をトルエン（200 ml）に溶解し、触媒として 100 µL のジブチル錫ジラウレートの存在下で 4-ヒドロキシ-TEMPO（2 mL）を加えた。混合物を 50 °C で 8 時間攪拌し、ろ過して 50 °C で 3 時間乾燥させた。
スチレン（1 mL）、過酸化ベンゾイル（BPO）（0.5 mL）、およびTEMPO-PMCP結合シリカ粒子（1.5 g）をトルエンに分散させ、窒素でパージした。スチレンの重合を100℃で12時間行った。得られた生成物をメタノールで洗浄し、60℃で一晩乾燥させた。全体の反応スキームを図1に示す。
サンプルは、残留圧力が 10⁻³ Torr 未満になるように 393 K で 1 時間脱気した。相対圧力 P/P₀ = 0.99 で吸着された N₂ の量を使用して、全細孔容積を決定した。裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の形態は、走査型電子顕微鏡 (日立ハイテクノロジーズ、東京、日本) で調べた。乾燥させたサンプル (裸のシリカとリガンド結合シリカ粒子) を粘着カーボンテープを使用してアルミニウムカラムに置いた。Q150T スパッタコーターを使用してサンプルに金メッキを行い、5 nm Au 層をサンプル上に堆積した。これにより、低電圧を使用したプロセス効率が向上し、微細粒の低温スパッタリングが実現する。元素分析には、Thermo Electron (Waltham、MA、USA) Flash EA1112 元素分析装置を使用した。粒子サイズ分布を取得するために、Malvern (Worcestershire、UK) Mastersizer 2000 粒子サイズ分析装置を使用した。裸のシリカ粒子と配位子結合シリカ粒子（各5 mg）を5 mLのイソプロパノールに分散させ、10分間超音波処理し、5分間ボルテックスした後、マスターサイザーの光学ベンチに置いた。熱重量分析は、30～800℃の温度範囲で毎分5℃の速度で実施した。
寸法 (100 × 1.8 mm id) のガラスライニングされたステンレス鋼の狭径カラムを、文献に記載されている手順と同じ手順でスラリー充填法を使用して充填した。 31. 出口継手に 1 µm のフリットが付いたステンレス鋼カラム (ガラスライニング、100 × 1.8 mm 内径) をスラリーパッカー (Alltech Deerfield、IL、USA) に接続しました。150 mg の固定相を 1.2 mL のメタノールに懸濁して固定相スラリーを調製し、それを貯蔵カラムに送ります。メタノールはスラリー溶媒および推進溶媒として使用しました。100 MP で 10 分間、80 MP で 15 分間、60 MP で 30 分間の圧力を順次適用してカラムを充填します。充填中は、カラムの均一な充填を確保するために、2 台の GC カラムシェーカー (Alltech、Deerfield、IL、USA) で機械的振動を適用しました。スラリーパッカーを閉じ、カラム内部の損傷を防ぐために圧力をゆっくりと解放します。カラムをスラリー充填ユニットから切り離し、別の継手を入口と LC システムに接続して性能を確認します。
LC ポンプ (10AD 島津製作所、日本)、50 nL 注入ループ付きインジェクター (Valco (USA) C14 W.05)、メンブレン脱気装置 (島津製作所 DGU-14A)、UV-VIS キャピラリー ウィンドウ、特殊な µLC デバイス検出器 (UV-2075)、およびガラスライニング マイクロカラムが構築されました。余分なカラム バンドの広がりの影響を最小限に抑えるため、非常に細くて短い接続チューブを使用しました。パッケージング後、キャピラリー (50 μm 内径 365) とレデューシング ユニオン キャピラリー (50 μm) がレデューシング ユニオンの 1/16 インチ出口に取り付けられました。データ収集とクロマトグラフィー処理は Multichro 2000 ソフトウェアを使用して行いました。254 nm でのモニタリング 分析対象物は UV 吸光度をテストしました。クロマトグラフィー データは OriginPro8 (Northampton, MA) で分析しました。
ヒト血清由来アルブミン、凍結乾燥粉末、96%以上（アガロースゲル電気泳動）3 mgをトリプシン（1.5 mg）、4.0 M尿素（1 mL）、および0.2 M炭酸水素アンモニウム（1 mL）と混合した。溶液を10分間撹拌し、37℃のウォーターバスで6時間保持した後、0.1% TFA 1 mLで反応を停止させた。溶液を濾過し、4℃以下で保存する。
ペプチド混合物とHSAトリプシン消化物の分離は、PMPカラムで別々に評価した。PMPカラムによるペプチド混合物とHSAトリプシン消化物の分離を確認し、その結果をAscentis Express RP-Amideカラムの結果と比較する。理論段数は次のように計算される。
図2に、裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子のSEM画像を示します。裸のシリカ粒子（A、B）のSEM画像を見ると、これまでの研究とは対照的に、これらの粒子は球形であり、粒子は細長く、または不規則な対称性を持っています。リガンド結合シリカ粒子（C、D）の表面は、裸のシリカ粒子の表面よりも滑らかですが、これはシリカ粒子の表面にポリスチレン鎖がコーティングされているためと考えられます。
裸のシリカ粒子（A、B）と配位子結合シリカ粒子（C、D）の走査型電子顕微鏡画像。
裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の粒径分布を図3(A)に示す。体積ベースの粒径分布曲線は、化学修飾後にシリカ粒子のサイズが増加したことを示している（図3A）。本研究と以前の研究におけるシリカ粒子の粒径分布データを表1(A)で比較する。PMPの体積ベースの粒径d(0.5)は3.36μmであり、以前の研究におけるad(0.5)値3.05μm（ポリスチレン結合シリカ粒子）34と比較した。このバッチは、反応混合物中のPEG、尿素、TMOS、および酢酸の比率が変化するため、以前の研究と比較して粒径分布が狭くなっている。PMP相の粒径は、以前に研究したポリスチレン結合シリカ粒子相の粒径よりもわずかに大きい。これは、シリカ粒子の表面をスチレンで官能化すると、シリカ表面にポリスチレン層（0.97μm）のみが堆積するのに対し、PMP相では層の厚さが1.38 µmでした。
裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の粒径分布（A）および細孔径分布（B）。
本研究で用いたシリカ粒子の細孔径、細孔容積、表面積を表1(B)に示す。裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子のPSDプロファイルを図3(B)に示す。結果は、我々の以前の研究とほぼ同等である。裸のシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の細孔径はそれぞれ310と241であり、表1(B)に示すように、化学修飾後に細孔径が69減少することを示している。曲線の変化を図3(B)に示す。同様に、シリカ粒子の細孔容積は、化学修飾後に0.67から0.58 cm3/gに減少した。本研究で用いたシリカ粒子の比表面積は116 m2/gであり、これは我々の以前の研究(124 m2/g)とほぼ同等である。表1(B)に示すように、シリカ粒子の表面積(m2/g)も116 m2/gから105に減少した。化学修飾後のm2/g。
固定相の元素分析結果を表2に示す。現在の固定相の炭素負荷量は6.35%であり、これは我々の以前の研究（ポリスチレン結合シリカ粒子、それぞれ7.93%35および10.21%）42の炭素負荷量よりも低い。現在の固定相の炭素負荷量が低いのは、現在のSPの調製において、スチレンに加えて、フェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート（PCMP）や4-ヒドロキシ-TEMPOなどの極性配位子が使用されたためである。現在の固定相の窒素重量パーセントは2.21%であり、以前の研究における窒素重量パーセント0.1735および0.85%と比較すると、これはフェニルマレイミドのために現在の固定相の窒素重量パーセントが高いことを意味する。同様に、生成物（4）および（5）の炭素負荷量はそれぞれ2.7%および2.9%であったが、表2に示すように、最終生成物（6）は6.35%でした。重量減少はPMP固定相で確認され、TGA曲線は図4に示されています。TGA曲線は8.6%の重量減少を示しており、これは配位子がCだけでなくN、O、Hも含むため、炭素負荷（6.35%）とよく一致しています。
フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート配位子は、極性フェニルマレイミド基とビニルイソシアネート基を有するため、シリカ粒子の表面修飾に選択された。ビニルイソシアネート基は、リビングラジカル重合によりスチレンとさらに反応することができる。2つ目の理由は、フェニルマレイミド部分は通常のpHでは仮想電荷を持たないため、分析対象物との相互作用が中程度で、分析対象物と固定相との間に強い静電相互作用を持たない基を導入するためである。固定相の極性は、スチレンの最適量とフリーラジカル重合の反応時間によって制御できる。反応の最終段階（フリーラジカル重合）は重要であり、固定相の極性を変化させる可能性がある。これらの固定相の炭素負荷量を確認するために元素分析を行った。スチレンの量と反応時間を増やすと固定相の炭素負荷量が増加し、その逆もまた同様であることが観察された。異なる濃度のスチレンで調製した固定相は、異なる炭素負荷量を有する。これらの固定相をステンレス鋼カラムに再度ロードし、確認する。クロマトグラフィー性能（選択性、分離度、N値など）を評価しました。これらの実験に基づいて、極性を制御し、分析対象物の保持を良好にするために、PMP固定相を調製するための最適化された処方を選択しました。
5種類のペプチド混合物（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン）も、移動相を用いたPMPカラムで評価した。 60/40 (v/v) アセトニトリル/水 (0.1% TFA) を流速 80 μL/min で溶出しました。最適な溶出条件下では、カラム (100 × 1.8 mm id) あたりの理論段数 (N) は 20,000 ± 100 (200,000 段/m²) です。表 3 に 3 つの PMP カラムの N 値を示し、クロマトグラムを図 5A に示します。PMP カラムで高速分析を高流速 (700 μL/min) で行ったところ、5 つのペプチドが 1 分以内に溶出され、N 値は非常に良好で、カラム (100 × 1.8 mm id) あたり 13,500 ± 330 であり、135,000 段/m に相当します (図 5B)。3 つの同一サイズのカラム (100 × 1.8 mm id) に、3 つの異なるロットの PMP 固定相を充填しました。再現性を確認するため、各カラムの分析対象物濃度を最適な溶出条件と理論段数Nおよび保持時間を使用して記録し、各カラムで同じ試験混合物を分離しました。PMPカラムの再現性データは表4に示されています。PMPカラムの再現性は、表3に示すように、非常に低い%RSD値とよく相関しています。
PMPカラム（B）およびAscentis Express RP-Amideカラム（A）でのペプチド混合物の分離；移動相60/40 ACN/H2O（TFA 0.1%）、PMPカラム寸法（100 × 1.8 mm id）；分析用化合物の溶出順序：1（Gly-Tyr）、2（Gly-Leu-Tyr）、3（Gly-Gly-Tyr-Arg）、4（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg）および5（ロイシン）酸エンケファリン）。
高性能液体クロマトグラフィーでヒト血清アルブミンのトリプシン消化物の分離を評価するために、PMPカラム（100 × 1.8 mm id）を評価した。図6のクロマトグラムは、サンプルが良好に分離され、分解能が非常に良いことを示している。HSA消化物は、流速100 µL/min、移動相70/30アセトニトリル/水、0.1% TFAを使用して分析した。クロマトグラム（図6）に示すように、HSA消化物は17個のペプチドに対応する17個のピークに分割された。HSA消化物の各ピークの分離効率を計算し、その値を表5に示す。
HSAのトリプシン消化物（100 × 1.8 mm id）をPMPカラムで分離した。流速（100 µL/分）、移動相は0.1% TFAを含むアセトニトリル/水60/40。
ここで、Lはカラム長、ηは移動相の粘度、ΔPはカラム背圧、uは移動相の線速度である。PMPカラムの透過率は2.5 × 10⁻¹⁴ m²、流速は25 μL/min、60/40 v/v ACN/水を使用した。PMPカラム（100 × 1.8 mm id）の透過率は、我々の以前の研究Ref.34と同様であった。表面多孔質粒子を充填したカラムの透過率は、1.3 μm粒子で1.7 × 10⁻¹⁵、1.7 μm粒子で3.1 × 10⁻¹⁵、2.6 μm粒子で5.2 × 10⁻¹⁵および2.5 × 10⁻¹⁴ m²、5 μm粒子で43である。したがって、PMP相の透過率は5 μm粒子の透過率と同様である。マイクロメートルサイズのコアシェル粒子。
ここで、Wxはクロロホルムを充填したカラムの重量、Wyはメタノールを充填したカラムの重量、ρは溶媒の密度である。メタノール（ρ = 0.7866）とクロロホルム（ρ = 1.484）の密度。以前に研究したシリカ粒子-C18カラム（100 × 1.8 mm id）34とC18-尿素カラム31の全多孔度はそれぞれ0.63と0.55であった。これは、尿素リガンドの存在が固定相の透過性を低下させることを意味する。一方、PMPカラム（100 × 1.8 mm id）の全多孔度は0.60である。PMPカラムの透過性は、C18結合シリカ粒子を充填したカラムの透過性よりも低い。これは、C18型固定相ではC18リガンドが線状鎖としてシリカ粒子に結合しているのに対し、ポリスチレン系固定相の場合、その周囲に比較的厚いポリマー層が形成される。典型的な実験では、カラムの多孔度は次のように計算される。
図7A、Bは、同じ溶出条件（すなわち、60/40 ACN/H2Oおよび0.1% TFA）を使用したPMPカラム（100 × 1.8 mm id）とAscentis Express RP-Amideカラム（100 × 1.8 mm id）を示しています。）ファン・デームタープロット。選択されたペプチド混合物（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン）を20 µL/minで調製した。両カラムの最小流量は800 µL/minである。最適流量（80 µL/min）におけるPMPカラムとAscentis Express RP-Amideカラムの最小HETP値は、それぞれ2.6 µmと3.9 µmであった。HETP値は、PMPカラム（100 × 1.8 mm id）の分離効率が市販のAscentis Express RP-Amideカラム（100 × 1.8 mm id）よりもはるかに優れていることを示している。図7（A）のvan Deemterプロットは、流量の増加に伴うN値の減少が、以前の研究と比較して有意ではないことを示している。 PMPカラム（100 × 1.8 mm id）は、Ascentis Express RP-Amideカラムと比較して、現在の研究で使用されている粒子形状、サイズ、および複雑なカラム充填手順の改善に基づいています34。
(A) 0.1% TFA を含む 60/40 ACN/H2O 中で PMP カラム (100 × 1.8 mm id) を使用して得られたファン デームター プロット (HETP 対移動相線速度)。(B) 0.1% TFA を含む 60/40 ACN/H2O 中で Ascentis Express RP-Amide カラム (100 × 1.8 mm id) を使用して得られたファン デームター プロット (HETP 対移動相線速度)。
極性埋め込みポリスチレン固定相を調製し、高性能液体クロマトグラフィーで合成ペプチド混合物およびヒト血清アルブミン（HAS）のトリプシン消化物の分離について評価した。ペプチド混合物に対するPMPカラムのクロマトグラフィー性能は、分離効率と分解能において優れている。PMPカラムの分離性能の向上は、シリカ粒子の粒径と細孔径、固定相の制御された合成、複雑なカラム充填など、さまざまな理由によるものである。高い分離効率に加えて、高流量での低いカラム背圧も、この固定相のもう1つの利点である。PMPカラムは再現性が高く、ペプチド混合物およびさまざまなタンパク質のトリプシン消化物の分析に使用できる。我々は、このカラムを液体クロマトグラフィーで天然物、薬用植物および真菌抽出物の生物活性化合物の分離に使用する予定である。将来的には、PMPカラムをタンパク質およびモノクローナル抗体の分離についても評価する予定である。
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