Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta para sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ipakita ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Ang mga porous silica particle giandam pinaagi sa sol-gel method nga adunay pipila ka mga pagbag-o aron makakuha og macroporous particles. Kini nga mga particle gi-derivatize pinaagi sa reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization uban sa N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) ug styrene aron maandam ang N-phenylmaleimide intercalation sa polystyrene (PMP) stationary phase. Ang mga narrow-bore stainless steel columns (100 × 1.8 mm id) gi-pack pinaagi sa slurry packing. Gisusi ang PMP column separation sa usa ka peptide mixture nga gilangkoban sa lima ka peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) chromatographic performance) ug trypsin digestion sa human serum albumin (HAS). Ubos sa optimal elution conditions, ang theoretical plate count sa peptide mixture moabot sa 280,000 plates/m². Gitandi ang separation performance sa naugmad nga column sa komersyal nga Ascentis. Sa Express RP-Amide column, naobserbahan nga ang separation performance sa PMP column mas maayo kay sa commercial column sa termino sa separation efficiency ug resolution.
Sa bag-ohay nga mga tuig, ang industriya sa biopharmaceutical nahimong usa ka nagkalapad nga merkado sa kalibutan nga adunay dakong pagtaas sa bahin sa merkado. Uban sa kusog nga pagtubo sa industriya sa biopharmaceutical1,2,3, ang pag-analisar sa mga peptide ug protina gitinguha pag-ayo. Gawas pa sa target nga peptide, daghang mga hugaw ang namugna atol sa peptide synthesis, busa nanginahanglan og chromatographic purification aron makuha ang mga peptide sa gitinguha nga kaputli. Ang pag-analisar ug pag-ila sa mga protina sa mga pluwido sa lawas, mga tisyu ug mga selula usa ka mahagiton nga buluhaton tungod sa daghang gidaghanon sa mga posibleng makit-an nga mga espisye sa usa ka sample. Bisan kung ang mass spectrometry usa ka epektibo nga himan alang sa peptide ug protein sequencing, kung ang ingon nga mga sample gi-inject sa mass spectrometer sa usa ka pass, ang pagbulag dili maayo. Kini nga problema mahimong maminusan pinaagi sa pagpatuman sa liquid chromatography (LC) separations sa wala pa ang MS analysis, nga makapakunhod sa gidaghanon sa mga analyte nga mosulod sa mass spectrometer sa usa ka gihatag nga oras4,5,6. Dugang pa, atol sa liquid phase separation, ang mga analyte mahimong ma-focus sa pig-ot nga mga rehiyon, sa ingon nag-concentrate kini nga mga analyte ug nagpauswag sa MS detection sensitivity. Ang Liquid chromatography (LC) adunay miuswag pag-ayo sa miaging dekada ug nahimong usa ka sikat nga teknik sa proteomic analysis7,8,9,10.
Ang Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) kay kaylap nga gigamit para sa pagputli ug pagbulag sa mga sagol nga peptide gamit ang octadecyl-modified silica (ODS) isip stationary phase11,12,13. Apan, ang RP stationary phases dili makahatag og makatagbaw nga pagbulag sa mga peptide ug protina tungod sa ilang komplikado nga istruktura ug amphiphilic nga kinaiya14,15. Busa, gikinahanglan ang espesyal nga gidisenyo nga stationary phases aron ma-analisa ang mga peptide ug protina nga adunay polar ug non-polar moieties aron makig-uban ug magpabilin kini nga mga analyte16. Ang Mixed-mode chromatography, nga naghatag og multimodal interactions, mahimong alternatibo sa RP-LC para sa pagbulag sa mga peptide, protina, ug uban pang komplikado nga mga sagol. Daghang mixed-mode stationary phases ang giandam, ug ang mga column nga giputos niini nga mga phases gigamit para sa peptide ug protein separations17,18,19,20,21. Ang Mixed-mode stationary phases (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) angay para sa peptide ug protein separations tungod sa presensya sa polar ug mga non-polar nga grupo22,23,24,25,26,27,28. Sa susama, ang polar intercalating stationary phases nga adunay covalently bonded polar groups nagpakita og maayong separation power ug talagsaon nga selectivity para sa polar ug non-polar analytes, tungod kay ang separation nagdepende sa interaksyon tali sa analyte ug stationary phase. Multimodal interactions 29, 30, 31, 32. Bag-ohay lang, si Zhang et al. 30 nag-andam og dodecyl-terminated polyamine stationary phase ug malampusong nakabulag sa mga hydrocarbon, antidepressants, flavonoids, nucleosides, estrogens, ug uban pang mga analytes. Ang polar intercalator adunay polar ug non-polar nga mga grupo, busa magamit kini sa pagbulag sa mga peptide ug protina nga adunay hydrophobic ug hydrophilic moieties. Ang mga polar-embedded columns (pananglitan, amide-embedded C18 columns) anaa sa merkado ubos sa trade name nga Ascentis Express RP-Amide columns, apan kini nga mga columns gigamit lamang alang sa pag-analisa sa amine 33.
Sa kasamtangang pagtuon, usa ka polar-embedded stationary phase (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) ang giandam ug gisusi alang sa pagbulag sa mga peptide ug trypsin digest sa HSA. Ang stationary phase giandam gamit ang mosunod nga estratehiya. Ang mga porous silica particle giandam sumala sa pamaagi nga gihatag sa among miaging publikasyon nga adunay pipila ka mga pagbag-o sa protocol sa pagpangandam. Ang ratio sa urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS, water acetic acid gi-adjust aron maandam ang mga silica particle nga adunay dako nga pore size. Ikaduha, usa ka bag-ong ligand, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, ang gi-synthesize ug gigamit sa pag-derivatize sa mga silica particle aron maandam ang usa ka polar embedded stationary phase. Ang resulta nga stationary phase giputos sa usa ka stainless steel column (100 × 1.8 mm id) gamit ang optimized packing scheme. Ang column packing gitabangan sa mechanical vibration aron masiguro nga ang usa ka homogenous bed maporma sulod sa column. Ebalwasyon ang packed column separation sa mga peptide mixture nga gilangkoban sa lima ka peptide; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ug Trypsin digest sa human serum albumin (HAS). Ang peptide mixture ug trypsin digest sa HSA naobserbahan nga nagkabulag nga adunay maayong resolusyon ug kahusayan. Ang performance sa pagbulag sa PMP column gitandi sa Ascentis Express RP-Amide column. Ang mga peptide ug protina parehong naobserbahan nga maayo ang pagkasulbad ug episyente sa PMP column, nga mas episyente kaysa sa Ascentis Express RP-Amide column.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, Acetic Acid, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Human Serum Albumin (HSA), Ammonium Chloride, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Methanol, 2-Propanol, ug Acetone Gipalit gikan sa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Usa ka sagol nga urea (8 g), polyethylene glycol (8 g), ug 8 mL nga 0.01 N acetic acid ang gikutaw sulod sa 10 ka minuto, ug dayon 24 mL nga TMOS ang gidugang niini ubos sa bugnaw nga mga kondisyon. Ang sagol nga reaksyon gipainit sa 40°C sulod sa 6 ka oras ug dayon sa 120°C sulod sa 8 ka oras sa usa ka stainless steel autoclave. Ang tubig gibubo ug ang nahabilin nga materyal gipauga sa 70°C sulod sa 12 ka oras. Ang uga nga humok nga masa gigaling nga hamis sa usa ka oven ug gi-calcine sa 550°C sulod sa 12 ka oras. Tulo ka batch ang giandam ug gihulagway aron masusi ang reproducibility sa gidak-on sa partikulo, gidak-on sa pore ug gilapdon sa nawong.
Pinaagi sa pag-usab sa nawong sa mga partikulo sa silica gamit ang pre-synthesized ligand nga phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) gisundan sa radial polymerization gamit ang styrene, usa ka polar group-containing compound ang giandam. Stationary phase para sa mga aggregate ug polystyrene chains. Ang proseso sa pag-andam gihulagway sa ubos.
Ang N-phenylmaleimide (200 mg) ug methyl vinyl isocyanate (100 mg) gitunaw sa uga nga toluene, ug 0.1 mL nga 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) gidugang sa reaction flask aron maandam ang phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate copolymer (PMCP). Ang sagol gipainit sa 60°C sulod sa 3 ka oras, gisala ug gipauga sa oven sa 40°C sulod sa 3 ka oras.
Ang mga uga nga partikulo sa silica (2 g) gisabwag sa uga nga toluene (100 mL), gikutaw ug gi-sonicate sa usa ka 500 mL nga round bottom flask sulod sa 10 min. Ang PMCP (10 mg) gitunaw sa toluene ug gidugang nga tinulo sa reaction flask pinaagi sa dropping funnel. Ang sagol gi-reflux sa 100°C sulod sa 8 ka oras, gisala ug gihugasan gamit ang acetone ug gipauga sa 60°C sulod sa 3 ka oras. Dayon, ang mga partikulo sa silica nga gi-bond sa PMCP (100 g) gitunaw sa toluene (200 ml) ug ang 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) gidugang uban sa presensya sa 100 µL nga dibutyltin dilaurate isip catalyst. Ang sagol gikutaw sa 50°C sulod sa 8 ka oras, gisala ug gipauga sa 50°C sulod sa 3 ka oras.
Ang Styrene (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0.5 mL), ug TEMPO-PMCP-attached silica particles (1.5 g) gisabwag sa toluene ug gilimpyohan gamit ang nitroheno. Ang polymerization sa styrene gihimo sa 100°C sulod sa 12 ka oras. Ang resulta nga produkto gihugasan gamit ang methanol ug gipauga sa 60°C sa tibuok gabii. Ang kinatibuk-ang eskema sa reaksyon gipakita sa Figure 1.
Ang mga sample gi-degassed sa 393 K sulod sa 1 ka oras aron makakuha og residual pressure nga ubos sa 10-3 Torr. Ang gidaghanon sa N2 nga na-adsorb sa relative pressure nga P/P0 = 0.99 gigamit aron mahibal-an ang total pore volume. Ang morphology sa bare ug ligand-bonded silica particles gisusi gamit ang scanning electron microscopy (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Ang mga uga nga sample (bare silica ug ligand-bonded silica particles) gibutang sa usa ka aluminum column gamit ang adhesive carbon tape. Ang bulawan gi-plate sa mga sample gamit ang Q150T sputter coater, ug usa ka 5 nm Au layer ang gideposito sa mga sample. Kini nagpauswag sa efficiency sa proseso gamit ang low voltages ug naghatag og fine grain, cold sputtering. Usa ka Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elemental analyzer ang gigamit para sa elemental analysis. Usa ka Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 particle size analyzer ang gigamit aron makuha ang particle size distribution. Ang naked silica particles ug ligand-bonded silica Ang mga partikulo (5 mg matag usa) gisabwag sa 5 mL nga isopropanol, gi-sonicate sulod sa 10 min, gi-vortex sulod sa 5 min, ug gibutang sa optical bench sa Mastersizer. Ang Thermogravimetric analysis gihimo sa rate nga 5 °C kada minuto sa temperatura nga 30 hangtod 800 °C.
Ang mga haligi nga stainless steel nga hinimo sa bildo nga may linya nga nipis nga mga lungag nga may dimensyon (100 × 1.8 mm id) giputos gamit ang slurry packing method, nga naggamit sa samang pamaagi nga gigamit sa Ref. 31. Usa ka stainless steel nga kolum (giputos sa bildo, 100 × 1.8 mm id) nga adunay outlet fitting nga adunay 1 µm frit ang konektado sa usa ka slurry packer (Alltech Deerfield, IL, USA). Pag-andam og stationary phase slurry pinaagi sa pagsuspinde sa 150 mg nga stationary phase sa 1.2 mL nga methanol ug ipadala kini sa storage column. Ang methanol gigamit isip slurry solvent ingon man ang propelling solvent. Pun-a ang kolum sa sunod-sunod nga paagi pinaagi sa pag-apply og pressure nga 100 MP sulod sa 10 minutos, 80 MP sulod sa 15 minutos, ug 60 MP sulod sa 30 minutos. Atol sa pag-pack, ang mechanical vibration gigamit gamit ang duha ka GC column shakers (Alltech, Deerfield, IL, USA) aron masiguro ang parehas nga pag-pack sa kolum. Sirad-i ang slurry packer ug hinayhinay nga buhian ang pressure aron malikayan ang bisan unsang kadaot sulod sa kolum. Idiskonekta ang kolum gikan sa slurry packing unit ug ikonektar ang laing fitting sa inlet ug sa LC system aron masusi ang performance niini.
Usa ka LC pump (10AD Shimadzu, Japan), injector (Valco (USA) C14 W.05) nga adunay 50nL injection loop, membrane degasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS capillary window ang gihimo. Espesyal nga µLC device detector (UV-2075) ug mga microcolumn nga adunay glass lined. Gamita ang pig-ot ug mubo nga connecting tubing aron maminusan ang epekto sa dugang nga pagpalapad sa column band. Human sa pagputos, ang mga capillary (50 μm id 365 ug reducing union capillaries (50 μm) gi-install sa 1/16″ outlet sa reducing union. Ang pagkolekta sa datos ug pagproseso sa chromatographic gihimo gamit ang Multichro 2000 software. Ang pagmonitor sa 254 nm Analytes gisulayan alang sa UV absorbance. Ang datos sa chromatographic gisusi sa OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin gikan sa serum sa tawo, lyophilized powder, ≥ 96% (agarose gel electrophoresis) 3 mg nga gisagol sa trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), ug 0.2 M ammonium bicarbonate (1 mL). Ang solusyon gikutaw sulod sa 10 ka minuto ug gibutang sa usa ka water bath sa 37°C sulod sa 6 ka oras, dayon gipalong gamit ang 1 mL nga 0.1% TFA. Salaa ang solusyon ug tipigi ubos sa 4 °C.
Ang pagbulag sa mga sagol nga peptide ug mga digest sa HSA trypsin gisusi nga gilain sa mga kolum sa PMP. Susiha ang pagbulag sa sagol nga peptide ug digest sa HSA pinaagi sa kolum sa PMP ug itandi ang mga resulta sa kolum sa Ascentis Express RP-Amide. Ang theoretical plate number gikalkulo sama sa mosunod:
Ang mga hulagway sa SEM sa mga bare silica particle ug ligand-bonded silica particle gipakita sa FIG. 2. Ang mga hulagway sa SEM sa mga bare silica particle (A, B) nagpakita nga, sukwahi sa among nangaging mga pagtuon, kini nga mga particle kay spherical diin ang mga particle kay elongated o adunay irregular symmetry. Ang nawong sa ligand-bonded silica particles (C, D) mas hamis kay sa bare silica particles, nga mahimong tungod sa coating sa polystyrene chains sa nawong sa mga silica particle.
Mga hulagway sa scanning electron microscope sa mga hubo nga partikulo sa silica (A, B) ug mga partikulo sa silica nga adunay ligand bonded (C, D).
Ang mga distribusyon sa gidak-on sa partikulo sa mga bare silica particle ug ligand-bonded silica particle gipakita sa Figure 3(A). Ang volume-based particle size distribution curves nagpakita nga ang gidak-on sa mga silica particle misaka human sa chemical modification (Fig. 3A). Ang datos sa distribusyon sa gidak-on sa partikulo sa mga silica particle gikan sa kasamtangang pagtuon ug sa miaging pagtuon gitandi sa Table 1(A). Ang volume-based particle size, d(0.5), sa PMP kay 3.36 μm, kon itandi sa among miaging pagtuon nga adunay ad(0.5) nga kantidad nga 3.05 μm (polystyrene-bound silica particles)34. Kini nga batch adunay mas pig-ot nga distribusyon sa gidak-on sa partikulo kon itandi sa among miaging pagtuon tungod sa lain-laing ratios sa PEG, urea, TMOS, ug acetic acid sa reaction mixture. Ang gidak-on sa partikulo sa PMP phase gamay nga mas dako kay sa polystyrene-bound silica particle phase nga among gitun-an kaniadto. Kini nagpasabot nga ang surface functionalization sa mga silica particle nga adunay styrene nagdeposito lamang og polystyrene layer (0.97 µm) sa silica surface, samtang sa PMP phase ang gibag-on sa layer kay 1.38 µm.
Distribusyon sa gidak-on sa partikulo (A) ug distribusyon sa gidak-on sa pore (B) sa mga partikulo nga walay sulod nga silica ug mga partikulo nga silica nga nakagapos sa ligand.
Ang gidak-on sa pore, gidaghanon sa pore, ug gilapdon sa nawong sa mga partikulo sa silica sa kasamtangang pagtuon gihatag sa Talaan 1(B). Ang mga PSD profile sa mga bare silica particle ug ligand-bonded silica particle gipakita sa Hulagway 3(B). Ang mga resulta ikatandi sa among miaging pagtuon. Ang gidak-on sa pore sa mga bare ug ligand-bound silica particle kay 310 ug 241, matag usa, nga nagpakita nga ang gidak-on sa pore mikunhod og 69 human sa kemikal nga pagbag-o, sama sa gipakita sa Talaan 1(B), ug ang pagbag-o sa kurba gipakita sa Hulagway 3(B). Sa susama, ang gidaghanon sa pore sa mga partikulo sa silica mikunhod gikan sa 0.67 ngadto sa 0.58 cm3/g human sa kemikal nga pagbag-o. Ang piho nga gilapdon sa nawong sa kasamtangang gitun-an nga mga partikulo sa silica kay 116 m2/g, nga ikatandi sa among miaging pagtuon (124 m2/g). Sama sa gipakita sa Talaan 1(B), ang gilapdon sa nawong (m2/g) sa mga partikulo sa silica mikunhod usab gikan sa 116 m2/g ngadto sa 105 m2/g human sa kemikal nga pagbag-o. pagbag-o.
Ang mga resulta sa elemental analysis sa stationary phase gipakita sa Table 2. Ang carbon loading sa kasamtangang stationary phase kay 6.35%, nga mas ubos kay sa carbon loading sa among miaging pagtuon (polystyrene bonded silica particles, 7.93%35 ug 10.21%, matag usa) 42. Ang carbon loading sa kasamtangang stationary phase ubos, Tungod kay sa pag-andam sa kasamtangang SP, dugang sa styrene, gigamit ang pipila ka polar ligands sama sa phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) ug 4-hydroxy-TEMPO. Ang nitrogen weight percent sa kasamtangang stationary phase kay 2.21%, kon itandi sa 0.1735 ug 0.85% sa gibug-aton sa nitrogen sa miaging mga pagtuon, matag usa. Kini nagpasabot nga ang wt % sa nitrogen mas taas sa kasamtangang stationary phase tungod sa phenylmaleimide. Sa susama, ang carbon loadings sa mga produkto (4) ug (5) kay 2.7% ug 2.9%, matag usa, samtang ang carbon loading sa final Ang produkto (6) kay 6.35%, sama sa gipakita sa Table 2. Ang pagkawala sa timbang gisusi gamit ang PMP stationary phase, ug ang TGA curve gipakita sa Figure 4. Ang TGA curve nagpakita og pagkawala sa timbang nga 8.6%, nga nahiuyon sa carbon loading (6.35%) tungod kay ang mga ligand dili lang adunay C apan lakip usab ang N, O, ug H.
Ang phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ligand gipili alang sa pag-usab sa nawong sa mga partikulo sa silica tungod kay kini adunay polar phenylmaleimide groups ug vinylisocyanate groups. Ang vinyl isocyanate groups mahimong dugang nga mo-react sa styrene pinaagi sa living radical polymerization. Ang ikaduha nga rason mao ang pagsal-ot og grupo nga adunay kasarangan nga interaksyon sa analyte ug walay kusog nga electrostatic interaction tali sa analyte ug sa stationary phase, tungod kay ang phenylmaleimide moiety walay virtual charge sa normal nga pH. Ang polarity sa stationary phase mahimong makontrol sa optimal nga kantidad sa styrene ug sa reaction time sa free radical polymerization. Ang katapusang lakang sa reaksyon (free-radical polymerization) kritikal ug mahimong makausab sa polarity sa stationary phase. Gihimo ang elemental analysis aron masusi ang carbon loading niining mga stationary phases. Naobserbahan nga ang pagdugang sa kantidad sa styrene ug ang reaction time nagdugang sa carbon loading sa stationary phase ug vice versa. Ang mga SP nga giandam nga adunay lain-laing konsentrasyon sa styrene adunay lain-laing carbon loadings. Pag-usab, i-load kini nga mga stationary phases ngadto sa stainless steel columns ug susiha ang ilang chromatographic performance. (selectivity, resolution, N value, ug uban pa). Base sa kini nga mga eksperimento, usa ka gi-optimize nga pormulasyon ang gipili aron maandam ang PMP stationary phase aron masiguro ang kontrolado nga polarity ug maayong analyte retention.
Lima ka peptide mixtures (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ang gisusi usab gamit ang PMP column gamit ang mobile phase; 60/40 (v/v) acetonitrile/tubig (0.1% TFA) sa flow rate nga 80 μL/min. Ubos sa optimal elution conditions, ang theoretical plate number (N) kada column (100 × 1.8 mm id) kay 20,000 ± 100 (200,000 plates/m²). Ang Table 3 naghatag sa N values ​​para sa tulo ka PMP columns ug ang chromatograms gipakita sa Figure 5A. Paspas nga pag-analisa sa PMP column sa taas nga flow rate (700 μL/min), lima ka peptides ang na-elute sulod sa usa ka minuto, maayo kaayo ang N values, 13,500 ± 330 kada column (100 × 1.8 mm id), Katumbas sa 135,000 plates/m (Figure 5B). Tulo ka columns nga parehas og gidak-on (100 × 1.8 mm id) ang giputos og tulo ka lain-laing lots sa PMP stationary phase aron masusi ang reproducibility. Ang Ang konsentrasyon sa analyte para sa matag kolum girekord gamit ang optimal elution conditions ug ang gidaghanon sa theoretical plates N ug retention time aron ibulag ang parehas nga test mixture sa matag kolum. Ang reproducibility data para sa mga kolum sa PMP gipakita sa Table 4. Ang reproducibility sa PMP column maayo nga nakig-uban sa ubos kaayo nga %RSD values, sama sa gipakita sa Table 3.
Pagbulag sa sagol nga peptide sa PMP column (B) ug Ascentis Express RP-Amide column (A); mobile phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), mga dimensyon sa PMP column (100 × 1.8 mm id); analitikal Ang elution order sa mga compound: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ug 5 (leucine) acid enkephalin)).
Usa ka PMP column (100 × 1.8 mm id) ang gisusi alang sa pagbulag sa tryptic digests sa human serum albumin sa high performance liquid chromatography. Ang chromatogram sa Figure 6 nagpakita nga ang sample maayo ang pagkabulag ug ang resolusyon maayo kaayo. Ang mga HSA digest gisusi gamit ang flow rate nga 100 µL/min, mobile phase 70/30 acetonitrile/tubig ug 0.1% TFA. Sama sa gipakita sa chromatogram (Figure 6), ang HSA digestion gibahin sa 17 ka peaks nga katumbas sa 17 ka peptides. Ang separation efficiency sa matag peak sa HSA digest gikalkulo ug ang mga kantidad gihatag sa Table 5.
Usa ka tryptic digest sa HSA (100 × 1.8 mm id) ang gibulag sa usa ka PMP column; flow rate (100 µL/min), mobile phase 60/40 acetonitrile/tubig nga adunay 0.1% TFA.
diin ang L mao ang gitas-on sa kolum, ang η mao ang viscosity sa mobile phase, ang ΔP mao ang column back pressure, ug ang u mao ang linear velocity sa mobile phase. Ang permeability sa PMP column kay 2.5 × 10-14 m2, ang flow rate kay 25 μL/min, ug 60/40 v/v ACN/tubig ang gigamit. Ang permeability sa PMP column (100 × 1.8 mm id) susama sa among miaging pagtuon Ref.34. Ang permeability sa column nga puno sa superficially porous particles kay: 1.7 × 10-15 para sa 1.3 μm particles, 3.1 × 10-15 para sa 1.7 μm particles, 5.2 × 10-15 ug 2.5 × 10-14 m2 para sa 2.6 μm particles Para sa 5 μm particles 43. Busa, ang permeability sa PMP phase susama sa 5 μm core-shell particles.
diin ang Wx mao ang gibug-aton sa kolum nga giputos sa chloroform, ang Wy mao ang gibug-aton sa kolum nga giputos sa methanol, ug ang ρ mao ang densidad sa solvent. Ang densidad sa methanol (ρ = 0.7866) ug chloroform (ρ = 1.484). Ang kinatibuk-ang porosity sa mga kolum sa SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 ug mga kolum sa C18-Urea 31 nga among gitun-an kaniadto kay 0.63 ug 0.55, matag usa. Kini nagpasabot nga ang presensya sa mga urea ligand makapakunhod sa permeability sa stationary phase. Sa laing bahin, ang kinatibuk-ang porosity sa kolum sa PMP (100 × 1.8 mm id) kay 0.60. Ang permeability sa mga kolum sa PMP mas ubos kay sa mga kolum nga giputos sa mga partikulo sa silica nga C18-bonded tungod kay sa mga stationary phase nga C18-type ang mga ligand sa C18 gilakip sa mga partikulo sa silica isip linear chains, samtang sa mga stationary phase nga polystyrene-type, ang usa ka medyo baga nga polymer layer naporma sa palibot sa Sa usa ka tipikal nga eksperimento, ang porosity sa kolum gikalkulo sama sa mosunod:
Ang Figure 7A, B nagpakita sa PMP column (100 × 1.8 mm id) ug Ascentis Express RP-Amide column (100 × 1.8 mm id) gamit ang parehas nga elution conditions (ie, 60/40 ACN/H2O ug 0.1% TFA). ) sa van Deemter plot. Ang piniling mga sagol nga peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) giandam sa 20 µL/. Ang minimum nga flow rate para sa duha ka column kay 800 µL/min. Ang minimum nga HETP values ​​sa optimum flow rate (80 µL/min) para sa PMP column ug sa Ascentis Express RP-Amide column kay 2.6 µm ug 3.9 µm, matag usa. Ang HETP values ​​nagpakita nga ang separation efficiency sa PMP column (100 × 1.8 mm id) mas maayo kay sa mabaligya nga Ascentis Express RP-Amide column (100 × 1.8 mm id). Ang van Deemter plot sa Fig. 7(A) nagpakita nga ang pagkunhod sa N value uban sa pagtaas sa flow dili significant kon itandi sa among miaging pagtuon. Ang mas taas nga separation efficiency sa PMP column (100 × 1.8 mm id) kon itandi sa Ascentis Express RP-Amide column gibase sa mga kalamboan sa porma sa partikulo, gidak-on, ug komplikado nga mga pamaagi sa pagputos sa column nga gigamit sa kasamtangang trabaho34.
(A) van Deemter plot (HETP batok sa mobile phase linear velocity) nga nakuha gamit ang PMP column (100 × 1.8 mm id) sa 60/40 ACN/H2O nga adunay 0.1% TFA.(B) van Deemter plot (HETP batok sa mobile phase linear velocity) nga nakuha gamit ang Ascentis Express RP-Amide column (100 × 1.8 mm id) sa 60/40 ACN/H2O nga adunay 0.1% TFA.
Usa ka polar-embedded polystyrene stationary phase ang giandam ug gisusi alang sa pagbulag sa synthetic peptide mixtures ug trypsin digests sa human serum albumin (HAS) sa high performance liquid chromatography. Ang chromatographic performance sa PMP columns para sa peptide mixtures maayo kaayo sa separation efficiency ug resolution. Ang gipauswag nga separation performance sa PMP columns tungod sa lain-laing mga rason, sama sa particle size ug pore size sa silica particles, controlled synthesis sa stationary phase, ug complex column packing. Gawas pa sa taas nga separation efficiency, ang ubos nga column back pressure sa taas nga flow rates usa pa ka bentaha niining stationary phase. Ang PMP columns nagpakita og maayong reproducibility ug magamit alang sa pag-analisa sa peptide mixtures ug trypsin digestion sa lain-laing mga protina. Among gituyo nga gamiton kini nga column alang sa pagbulag sa natural nga mga produkto, bioactive compounds gikan sa mga tanom nga medisina ug fungal extracts sa liquid chromatography. Sa umaabot, ang PMP columns susihon usab alang sa pagbulag sa mga protina ug monoclonal antibodies.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Panukiduki sa mga Sistema sa Pagbulag sa Peptide pinaagi sa Reversed Phase Chromatography Bahin I: Pagpalambo sa usa ka Column Characterization Protocol.J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Gipauswag nga aktibong peptide nga gidisenyo alang sa pagtambal sa mga sakit nga makatakod. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Mga sintetikong therapeutic peptide: siyensya ug ang merkado. drug discovery.15 (1-2) karon, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Abansado nga Proteomic Liquid Chromatography.J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Ang abanteng liquid chromatography-mass spectrometry nagtugot sa paglakip sa lapad nga gipuntirya nga metabolomics ug proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ang papel sa UHPLC sa pagpalambo sa droga.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Pundamental ug praktikal nga mga aspeto sa ultrahigh pressure liquid chromatography para sa paspas nga pagbulag. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Paggamit sa ultra-high performance liquid chromatography sa pagpalambo sa tambal. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Mga monolithic macroporous hydrogel nga giandam gikan sa oil-in-water high internal phase emulsions para sa episyente nga pagputli sa mga enterovirus.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ang papel sa liquid chromatography sa proteomics.J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Mga nag-uswag nga uso sa reversed-phase liquid chromatography separations sa therapeutic peptides ug proteins: teorya ug aplikasyon. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Duha ka dimensyon nga pagbulag sa mga peptide gamit ang sistemang RP-RP-HPLC gamit ang lainlaing mga kantidad sa pH sa una ug ikaduha nga mga dimensyon sa pagbulag. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Gisusi ang mga kinaiya sa pagbalhin sa masa ug ang kinetic performance sa mga high-efficiency chromatographic column nga giputos sa C18 sub-2 μm nga hingpit ug superficially porous nga mga partikulo. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Mga bag-ong uso ug mga hagit sa pag-analisar sa pag-inusara, pag-ila ug pag-validate sa mga bioactive peptide sa tanom.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Ang proteomic nga talan-awon sa gingharian sa kinabuhi. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Pagproseso sa mga therapeutic peptide pinaagi sa preparative liquid chromatography. Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography ug ang aplikasyon niini sa mga biopolymer.J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Mga Ligand para sa mixed-mode protein chromatography: prinsipyo, karakterisasyon, ug disenyo. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).