Tak for dit besøg på Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller slår kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer). I mellemtiden vil vi for at sikre fortsat understøttelse vise webstedet uden stilarter og JavaScript.
Porøse silicapartikler blev fremstillet ved en sol-gel-metode med nogle modifikationer for at opnå makroporøse partikler. Disse partikler blev derivatiseret ved reversibel additionsfragmenteringskædeoverføringspolymerisation (RAFT) med N-phenylmaleimid-methylvinylisocyanat (PMI) og styren for at fremstille N-phenylmaleimidinterkalering af polystyren (PMP) stationær fase. Smalborede rustfri stålkolonner (100 × 1,8 mm id) blev pakket ved hjælp af opslæmningspakning. Evaluering af PMP-kolonneseparation af en peptidblanding bestående af fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkephalin) kromatografisk ydeevne) og trypsinfordøjelse af humant serumalbumin (HAS). Under optimale elueringsbetingelser er det teoretiske pladetal for peptidblandingen så højt som 280.000 plader/m². Sammenligning af separationsydeevnen for den udviklede kolonne med den kommercielle Ascentis Express. RP-Amid-kolonnen, blev det observeret, at PMP-kolonnens separationsevne var bedre end den kommercielle kolonnes med hensyn til separationseffektivitet og opløsning.
I de senere år er den biofarmaceutiske industri blevet et voksende globalt marked med en betydelig stigning i markedsandele. Med den eksplosive vækst i den biofarmaceutiske industri1,2,3 er analyse af peptider og proteiner meget eftertragtet. Ud over målpeptidet genereres adskillige urenheder under peptidsyntese, hvilket kræver kromatografisk oprensning for at opnå peptider med den ønskede renhed. Analyse og karakterisering af proteiner i kropsvæsker, væv og celler er en ekstremt udfordrende opgave på grund af det store antal potentielt detekterbare arter i en enkelt prøve. Selvom massespektrometri er et effektivt værktøj til peptid- og proteinsekventering, vil separationen ikke være ideel, hvis sådanne prøver injiceres i massespektrometeret i én omgang. Dette problem kan afhjælpes ved at implementere væskekromatografi (LC) separationer før MS-analyse, hvilket vil reducere antallet af analytter, der kommer ind i massespektrometeret på et givet tidspunkt4,5,6. Derudover kan analytter under væskefaseseparation fokuseres i smalle områder, hvorved disse analytter koncentreres og MS-detektionsfølsomheden forbedres. Væskekromatografi (LC) har udviklet sig betydeligt i løbet af det sidste årti og er blevet et populært ... teknik i proteomisk analyse7,8,9,10.
Omvendt fasevæskekromatografi (RP-LC) anvendes i vid udstrækning til oprensning og separation af peptidblandinger ved hjælp af octadecylmodificeret silica (ODS) som stationær fase11,12,13. Imidlertid giver RP-stationære faser ikke tilfredsstillende separation af peptider og proteiner på grund af deres komplekse struktur og amfifile natur14,15. Derfor kræves der specielt designede stationære faser for at analysere peptider og proteiner med polære og ikke-polære dele for at interagere med og tilbageholde disse analytter16. Blandet-mode kromatografi, som giver multimodale interaktioner, kan være et alternativ til RP-LC til separation af peptider, proteiner og andre komplekse blandinger. Flere blandede-mode stationære faser er blevet fremstillet, og søjler pakket med disse faser er blevet brugt til peptid- og proteinseparationer17,18,19,20,21. Blandede-mode stationære faser (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polær interkalering/RPLC) er egnede til peptid- og proteinseparationer på grund af tilstedeværelsen af ​​både polære og ikke-polære. grupper22,23,24,25,26,27,28. Tilsvarende viser polære interkalerende stationære faser med kovalent bundne polære grupper god separationsevne og unik selektivitet for polære og ikke-polære analytter, da separationen afhænger af interaktionen mellem analyt og stationær fase. Multimodale interaktioner29, 30, 31, 32. For nylig fremstillede Zhang et al.30 en dodecyl-termineret polyamin stationær fase og separerede med succes kulbrinter, antidepressiva, flavonoider, nukleosider, østrogener og adskillige andre analytter.Den polære interkalator har både polære og ikke-polære grupper, så den kan bruges til at separere peptider og proteiner, der har både hydrofobe og hydrofile dele.Polarindlejrede søjler (f.eks. amidindlejrede C18-søjler) er kommercielt tilgængelige under handelsnavnet Ascentis Express RP-Amide-søjler, men disse søjler bruges kun til analyse af amin 33.
I den aktuelle undersøgelse blev en polært indlejret stationær fase (N-phenylmaleimid-indlejret polystyren) fremstillet og evalueret for separation af peptider og trypsinfordøjelser af HSA. Den stationære fase blev fremstillet ved hjælp af følgende strategi. Porøse silicapartikler blev fremstillet i henhold til proceduren angivet i vores tidligere publikation med nogle ændringer af fremstillingsprotokollen. Forholdet mellem urinstof, polyethylenglycol (PEG), TMOS, vand og eddikesyre blev justeret for at fremstille silicapartikler med stor porestørrelse. For det andet blev en ny ligand, phenylmaleimid-methylvinylisocyanat, syntetiseret og brugt til at derivatisere silicapartikler for at fremstille en polært indlejret stationær fase. Den resulterende stationære fase blev pakket i en rustfri stålsøjle (100 × 1,8 mm id) ved hjælp af det optimerede pakningsskema. Søjlepakningen assisteres af mekanisk vibration for at sikre, at der dannes et homogent leje i søjlen. Evaluer pakket søjleseparation af peptidblandinger bestående af fem peptider; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkephalin) og trypsinfordøjelse af humant serumalbumin (HAS). Peptidblandingen og trypsinfordøjelsen af ​​HSA blev observeret at separere med god opløsning og effektivitet. Separationsevnen for PMP-kolonnen blev sammenlignet med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen. Både peptider og proteiner blev observeret at være godt adskilt og effektive på PMP-kolonnen, som var mere effektiv end Ascentis Express RP-Amide-kolonnen.
PEG (polyethylenglycol), urinstof, eddikesyre, trimethoxyorthosilicat (TMOS), trimethylchlorosilan (TMCS), trypsin, humant serumalbumin (HSA), ammoniumchlorid, urinstof, hexanmethyldisilazan (HMDS), methacryloylchlorid (MC), styren, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxid (BPO), HPLC-kvalitet acetonitril (ACN), methanol, 2-propanol og acetone. Købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
En blanding af urinstof (8 g), polyethylenglycol (8 g) og 8 ml 0,01 N eddikesyre blev omrørt i 10 minutter, og derefter blev 24 ml TMOS tilsat under iskolde forhold. Reaktionsblandingen blev opvarmet ved 40 °C i 6 timer og derefter ved 120 °C i 8 timer i en autoklav af rustfrit stål. Vandet blev hældt fra, og det resterende materiale blev tørret ved 70 °C i 12 timer. Den tørrede bløde masse blev glatmalet i en ovn og kalcineret ved 550 °C i 12 timer. Tre batcher blev fremstillet og karakteriseret for at undersøge reproducerbarhed i partikelstørrelse, porestørrelse og overfladeareal.
Ved overflademodifikation af silicapartikler med den præsyntetiserede ligand phenylmaleimid-methylvinylisocyanat (PCMP) efterfulgt af radial polymerisering med styren blev en forbindelse indeholdende polære grupper fremstillet. Stationær fase for aggregater og polystyrenkæder. Fremstillingsprocessen er beskrevet nedenfor.
N-phenylmaleimid (200 mg) og methylvinylisocyanat (100 mg) blev opløst i tør toluen, og 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) blev tilsat reaktionskolben for at fremstille phenylmaleimid-methylvinylisocyanat-copolymer (PMCP). Blandingen blev opvarmet ved 60 °C i 3 timer, filtreret og tørret i en ovn ved 40 °C i 3 timer.
Tørrede silicapartikler (2 g) blev dispergeret i tør toluen (100 ml), omrørt og sonikeret i en 500 ml rundbundet kolbe i 10 minutter. PMCP (10 mg) blev opløst i toluen og tilsat dråbevis til reaktionskolben via en tildrypningstragt. Blandingen blev tilbagesvalet ved 100 °C i 8 timer, filtreret og vasket med acetone og tørret ved 60 °C i 3 timer. Derefter blev PMCP-bundne silicapartikler (100 g) opløst i toluen (200 ml), og 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) blev tilsat i nærvær af 100 µL dibutyltindilaurat som katalysator. Blandingen blev omrørt ved 50 °C i 8 timer, filtreret og tørret ved 50 °C i 3 timer.
Styren (1 ml), benzoylperoxid BPO (0,5 ml) og TEMPO-PMCP-bundne silicapartikler (1,5 g) blev dispergeret i toluen og renset med nitrogen. Polymerisationen af ​​styren blev udført ved 100 °C i 12 timer. Det resulterende produkt blev vasket med methanol og tørret ved 60 °C natten over. Det overordnede reaktionsskema er vist i figur 1.
Prøverne blev afgasset ved 393 K i 1 time for at opnå et resttryk på mindre end 10-3 Torr. Mængden af ​​N2 adsorberet ved et relativt tryk på P/P0 = 0,99 blev brugt til at bestemme det samlede porevolumen. Morfologien af ​​bare og ligandbundne silicapartikler blev undersøgt med scanningselektronmikroskopi (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Tørrede prøver (bar silica og ligandbundne silicapartikler) blev placeret på en aluminiumsøjle ved hjælp af klæbende kulstoftape. Guld blev belagt på prøverne ved hjælp af en Q150T sputtercoater, og et 5 nm Au-lag blev afsat på prøverne. Dette forbedrer proceseffektiviteten ved brug af lave spændinger og giver finkornet, kold sputtering. En Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elementaranalysator blev brugt til elementaranalyse. En Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 partikelstørrelsesanalysator blev brugt til at bestemme partikelstørrelsesfordelingen. Bare silicapartikler og ligandbundne silicapartikler (5 mg hver) blev dispergeret i 5 ml isopropanol, sonikeret i 10 minutter, vortexbehandlet i 5 minutter og placeret på Mastersizerens optiske bænk. Termogravimetrisk analyse blev udført med en hastighed på 5 °C pr. minut over et temperaturområde på 30 til 800 °C.
Glasforede smalborede søjler af rustfrit stål med dimensionerne (100 × 1,8 mm indvendig diameter) blev pakket ved hjælp af opslæmningsmetoden med samme procedure som i Ref. 31. En rustfri stålkolonne (glasforet, 100 × 1,8 mm indvendig diameter) med en udløbsfitting indeholdende en 1 µm fritte blev forbundet til en slampakker (Alltech Deerfield, IL, USA). Forbered en stationær faseopslæmning ved at suspendere 150 mg stationær fase i 1,2 ml methanol og sende den til opbevaringskolonnen. Methanol blev brugt som slamopløsningsmiddel såvel som drivmiddel. Fyld kolonnen sekventielt ved at påføre tryk på 100 MP i 10 minutter, 80 MP i 15 minutter og 60 MP i 30 minutter. Under pakningen blev der påført mekanisk vibration med to GC-kolonnerystere (Alltech, Deerfield, IL, USA) for at sikre ensartet pakning af kolonnen. Luk slampakkeren, og slip trykket langsomt for at forhindre skader i kolonnen. Frakobl kolonnen fra slampakkeenheden, og tilslut en anden fitting til indløbet og til LC-systemet for at kontrollere dens ydeevne.
En LC-pumpe (10AD Shimadzu, Japan), injektor (Valco (USA) C14 W.05) med 50nL injektionsloop, membranafgasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillærvindue blev konstrueret. Speciel µLC-detektor (UV-2075) og glasforede mikrokolonner blev anvendt. Der blev brugt meget smalle og korte forbindelsesslanger for at minimere effekten af ​​ekstra kolonnebåndudvidelse. Efter pakning blev kapillærer (50 μm id 365) og reducerende unionskapillærer (50 μm) installeret ved 1/16″ udløbet af den reducerende union. Dataindsamling og kromatografisk behandling blev udført ved hjælp af Multichro 2000-software. Overvågning ved 254 nm. Analytter blev testet for UV-absorbans. Kromatografiske data blev analyseret af OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin fra humant serum, frysetørret pulver, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg blandet med trypsin (1,5 mg), 4,0 M urinstof (1 ml) og 0,2 M ammoniumbicarbonat (1 ml). Opløsningen blev omrørt i 10 minutter og holdt i et vandbad ved 37°C i 6 timer, hvorefter den blev tilsat 1 ml 0,1% TFA. Opløsningen filtreres og opbevares ved temperaturer under 4°C.
Separation af peptidblandinger og HSA-trypsinfordøjelser blev evalueret separat på PMP-kolonner. Kontroller separationen af ​​peptidblandingen og trypsinfordøjelsen af ​​HSA ved hjælp af PMP-kolonnen, og sammenlign resultaterne med Ascentis Express RP-Amid-kolonnen. Det teoretiske pladetal beregnes som følger:
SEM-billeder af bare silicapartikler og ligandbundne silicapartikler er vist i FIG. 2. SEM-billeder af bare silicapartikler (A, B) viser, at disse partikler i modsætning til vores tidligere undersøgelser er sfæriske, hvor partiklerne er aflange eller har uregelmæssig symmetri. Overfladen af ​​de ligandbundne silicapartikler (C, D) er glattere end overfladen af ​​de bare silicapartikler, hvilket kan skyldes belægningen af ​​polystyrenkæder på overfladen af ​​silicapartiklerne.
Scanningselektronmikroskopbilleder af bare silicapartikler (A, B) og ligandbundne silicapartikler (C, D).
Partikelstørrelsesfordelingerne af bare silicapartikler og ligandbundne silicapartikler er vist i figur 3(A). Volumenbaserede partikelstørrelsesfordelingskurver viste, at størrelsen af ​​silicapartiklerne steg efter kemisk modifikation (fig. 3A). Partikelstørrelsesfordelingsdataene for silicapartiklerne fra den aktuelle undersøgelse og den tidligere undersøgelse er sammenlignet i tabel 1(A). Den volumenbaserede partikelstørrelse, d(0,5), af PMP er 3,36 μm sammenlignet med vores tidligere undersøgelse med en ad(0,5)-værdi på 3,05 μm (polystyrenbundne silicapartikler)34. Denne batch havde en smallere partikelstørrelsesfordeling sammenlignet med vores tidligere undersøgelse på grund af de varierende forhold mellem PEG, urinstof, TMOS og eddikesyre i reaktionsblandingen. Partikelstørrelsen af ​​PMP-fasen er lidt større end den af ​​den polystyrenbundne silicapartikelfase, vi tidligere undersøgte. Dette betyder, at overfladefunktionalisering af silicapartikler med styren kun afsatte et polystyrenlag (0,97 µm) på silicaoverfladen, hvorimod lagtykkelsen i PMP-fasen var 1,38 µm.
Partikelstørrelsesfordeling (A) og porestørrelsesfordeling (B) af bare silicapartikler og ligandbundne silicapartikler.
Porestørrelsen, porevolumenet og overfladearealet af silicapartiklerne fra den aktuelle undersøgelse er angivet i tabel 1(B). PSD-profilerne for bare silicapartikler og ligandbundne silicapartikler er vist i figur 3(B). Resultaterne er sammenlignelige med vores tidligere undersøgelse. Porestørrelserne for de bare og ligandbundne silicapartikler er henholdsvis 310 og 241, hvilket indikerer, at porestørrelsen falder med 69 efter kemisk modifikation, som vist i tabel 1(B), og ændringen af ​​kurven er vist i figur 3(B). Tilsvarende faldt porevolumenet af silicapartiklerne fra 0,67 til 0,58 cm3/g efter kemisk modifikation. Det specifikke overfladeareal af de aktuelt undersøgte silicapartikler er 116 m2/g, hvilket er sammenligneligt med vores tidligere undersøgelse (124 m2/g). Som vist i tabel 1(B) faldt overfladearealet (m2/g) af silicapartiklerne også fra 116 m2/g til 105 m2/g efter kemisk modifikation. ændring.
Resultaterne af elementaranalysen af ​​den stationære fase er vist i tabel 2. Kulstofindholdet i den nuværende stationære fase er 6,35 %, hvilket er lavere end kulstofindholdet i vores tidligere undersøgelse (polystyrenbundne silicapartikler, henholdsvis 7,93 %35 og 10,21 %)42. Kulstofindholdet i den nuværende stationære fase er lavt, fordi der i fremstillingen af ​​den nuværende SP, udover styren, blev anvendt nogle polære ligander såsom phenylmaleimid-methylvinylisocyanat (PCMP) og 4-hydroxy-TEMPO. Nitrogenvægtprocenten i den nuværende stationære fase er 2,21 % sammenlignet med henholdsvis 0,1735 og 0,85 vægtprocent nitrogen i tidligere undersøgelser. Dette betyder, at vægtprocenten af ​​nitrogen er højere i den nuværende stationære fase på grund af phenylmaleimid. Tilsvarende var kulstofindholdet i produkterne (4) og (5) henholdsvis 2,7 % og 2,9 %, mens kulstofindholdet i slutproduktet (6) var 6,35%, som vist i tabel 2. Vægttabet blev kontrolleret med PMP stationær fase, og TGA-kurven er vist i figur 4. TGA-kurven viser et vægttab på 8,6%, hvilket er i god overensstemmelse med kulstofindholdet (6,35%), fordi liganderne ikke kun indeholder C, men også N, O og H.
Phenylmaleimid-methylvinylisocyanatliganden blev valgt til overflademodifikation af silicapartikler, fordi den har polære phenylmaleimidgrupper og vinylisocyanatgrupper. Vinylisocyanatgrupper kan yderligere reagere med styren ved levende radikalpolymerisation. Den anden grund er at indsætte en gruppe, der har en moderat interaktion med analytten og ingen stærk elektrostatisk interaktion mellem analytten og den stationære fase, da phenylmaleimiddelen ikke har nogen virtuel ladning ved normal pH. Polariteten af ​​den stationære fase kan styres af den optimale mængde styren og reaktionstiden for fri radikalpolymerisation. Det sidste trin i reaktionen (fri radikalpolymerisation) er kritisk og kan ændre polariteten af ​​den stationære fase. Elementaranalyse blev udført for at kontrollere kulstofbelastningen af ​​disse stationære faser. Det blev observeret, at en forøgelse af mængden af ​​styren og reaktionstiden øgede kulstofbelastningen af ​​den stationære fase og omvendt. SP'er fremstillet med forskellige koncentrationer af styren har forskellige kulstofbelastninger. Igen, fyld disse stationære faser i rustfri stålsøjler og kontroller deres kromatografiske ydeevne (selektivitet, opløsning, N værdi osv.). Baseret på disse eksperimenter blev en optimeret formulering valgt til at fremstille den stationære PMP-fase for at sikre kontrolleret polaritet og god analytretention.
Fem peptidblandinger (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkephalin) blev også evalueret ved hjælp af en PMP-søjle med en mobil fase; 60/40 (v/v) acetonitril/vand (0,1% TFA) ved en flowhastighed på 80 μL/min. Under optimale elueringsbetingelser er det teoretiske pladetal (N) pr. kolonne (100 × 1,8 mm id) 20.000 ± 100 (200.000 plader/m²). Tabel 3 viser N-værdierne for de tre PMP-kolonner, og kromatogrammerne er vist i figur 5A. Hurtig analyse på en PMP-kolonne ved høj flowhastighed (700 μL/min). Fem peptider blev elueret inden for et minut. N-værdierne var meget gode, 13.500 ± 330 pr. kolonne (100 × 1,8 mm id). Svarende til 135.000 plader/m² (figur 5B). Tre identisk store kolonner (100 × 1,8 mm id) blev pakket med tre forskellige partier PMP stationær fase for at kontrollere reproducerbarheden. Analytkoncentrationen for hver kolonne blev registreret ved hjælp af de optimale elueringsbetingelser og antallet af teoretiske plader N og retentionstid for at separere den samme testblanding på hver kolonne. Reproducerbarhedsdataene for PMP-kolonnerne er vist i tabel 4. Reproducerbarheden af ​​PMP-kolonnen korrelerer godt med meget lave %RSD-værdier, som vist i tabel 3.
Separation af peptidblandingen på PMP-søjle (B) og Ascentis Express RP-Amid-søjle (A); mobil fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP-søjledimensioner (100 × 1,8 mm indvendig diameter); analytisk Elueringsrækkefølgen for forbindelserne: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) og 5 (leucin) syre enkephalin)).
En PMP-søjle (100 × 1,8 mm id) blev evalueret til separation af tryptiske fordøjelser af humant serumalbumin i højtydende væskekromatografi. Kromatogrammet i figur 6 viser, at prøven er godt adskilt, og at opløsningen er meget god. HSA-fordøjelser blev analyseret ved hjælp af en flowhastighed på 100 µL/min, mobil fase 70/30 acetonitril/vand og 0,1% TFA. Som vist i kromatogrammet (figur 6) er HSA-fordøjelsen blevet opdelt i 17 toppe svarende til 17 peptider. Separationseffektiviteten af ​​hver top i HSA-fordøjelsen blev beregnet, og værdierne er angivet i tabel 5.
Et tryptisk fordøjelsesprodukt af HSA (100 × 1,8 mm id) blev separeret på en PMP-søjle; flowhastighed (100 µL/min), mobil fase 60/40 acetonitril/vand med 0,1% TFA.
hvor L er kolonnelængden, η er viskositeten af ​​den mobile fase, ΔP er kolonnens modtryk, og u er den lineære hastighed af den mobile fase. PMP-kolonnens permeabilitet var 2,5 × 10-14 m2, strømningshastigheden var 25 μL/min, og der blev anvendt 60/40 v/v ACN/vand. PMP-kolonnens permeabilitet (100 × 1,8 mm id) svarede til den i vores tidligere undersøgelse Ref. 34. Permeabiliteten af ​​kolonnen pakket med overfladisk porøse partikler er: 1,7 × 10-15 for 1,3 μm partikler, 3,1 × 10-15 for 1,7 μm partikler, 5,2 × 10-15 og 2,5 × 10-14 m2 for 2,6 μm partikler. For 5 μm partikler 43. Derfor svarer permeabiliteten af ​​PMP-fasen til den for 5 μm kerne-skal-partikler.
hvor Wx er vægten af ​​den kolonne, der er pakket med chloroform, Wy er vægten af ​​den kolonne, der er pakket med methanol, og ρ er opløsningsmidlets densitet. Densiteterne af methanol (ρ = 0,7866) og chloroform (ρ = 1,484). Den samlede porøsitet af SILICA PARTICLES-C18-kolonner (100 × 1,8 mm id) 34 og C18-Urea-kolonner 31, som vi tidligere har undersøgt, var henholdsvis 0,63 og 0,55. Dette betyder, at tilstedeværelsen af ​​urinstofligander reducerer permeabiliteten af ​​den stationære fase. På den anden side er den samlede porøsitet af PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) 0,60. Permeabiliteten af ​​PMP-kolonner er lavere end for kolonner pakket med C18-bundne silicapartikler, fordi C18-liganderne i stationære faser af C18-typen er bundet til silicapartiklerne som lineære kæder, mens det i stationære faser af polystyren-typen er et relativt tykt polymerlag. dannes omkring den. I et typisk eksperiment beregnes kolonnens porøsitet som:
Figur 7A,B viser PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm indvendig diameter) og Ascentis Express RP-Amid-kolonnen (100 × 1,8 mm indvendig diameter) under anvendelse af de samme elueringsbetingelser (dvs. 60/40 ACN/H2O og 0,1% TFA) som i van Deemter-plottet. Udvalgte peptidblandinger (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkephalin) blev fremstillet i 20 µL/. Den minimale flowhastighed for begge kolonner er 800 µL/min. De minimale HETP-værdier ved den optimale flowhastighed (80 µL/min) for PMP-kolonnen og Ascentis Express RP-Amid-kolonnen var henholdsvis 2,6 µm og 3,9 µm. HETP-værdierne indikerer, at separationseffektiviteten af ​​PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) er meget bedre end den kommercielt tilgængelige Ascentis Express RP-Amid-kolonne (100 × 1,8 mm id). Van Deemter-plottet i figur 7(A) viser, at faldet i N-værdi med stigende flow ikke er signifikant sammenlignet med vores tidligere undersøgelse. Den højere separationseffektivitet af PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) sammenlignet med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen er baseret på forbedringer i partikelform, størrelse og komplekse kolonnepakningsprocedurer, der anvendes i det nuværende arbejde34.
(A) van Deemter-plot (HETP versus mobil fases lineære hastighed) opnået ved hjælp af en PMP-søjle (100 × 1,8 mm id) i 60/40 ACN/H2O med 0,1% TFA. (B) van Deemter-plot (HETP versus mobil fases lineære hastighed) opnået ved hjælp af en Ascentis Express RP-Amide-søjle (100 × 1,8 mm id) i 60/40 ACN/H2O med 0,1% TFA.
En polært indlejret polystyren stationær fase blev fremstillet og evalueret til separation af syntetiske peptidblandinger og trypsinfordøjelser af humant serumalbumin (HAS) i højtydende væskekromatografi. Den kromatografiske ydeevne af PMP-søjler til peptidblandinger er fremragende med hensyn til separationseffektivitet og opløsning. Den forbedrede separationsydelse af PMP-søjler skyldes en række årsager, såsom partikelstørrelse og porestørrelse af silicapartiklerne, kontrolleret syntese af den stationære fase og kompleks søjlepakning. Ud over høj separationseffektivitet er lavt søjlemodtryk ved høje strømningshastigheder en anden fordel ved denne stationære fase. PMP-søjler udviser god reproducerbarhed og kan bruges til analyse af peptidblandinger og trypsinfordøjelse af forskellige proteiner. Vi har til hensigt at bruge denne søjle til separation af naturprodukter, bioaktive forbindelser fra lægeplanter og svampeekstrakter i væskekromatografi. I fremtiden vil PMP-søjler også blive evalueret til separation af proteiner og monoklonale antistoffer.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Forskning i peptidseparationssystemer ved omvendt fasekromatografi del I: Udvikling af en søjlekarakteriseringsprotokol. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Forbedrede aktive peptider designet til behandling af infektionssygdomme. Biotechnology.Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetiske terapeutiske peptider: videnskab og markedet. lægemiddelforskning. 15 (1-2) i dag, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avanceret proteomisk væskekromatografi. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Avanceret væskekromatografi-massespektrometri muliggør inkorporering af bredt målrettede metabolomics og proteomics. anus. Chim. Acta 1069, 89-97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC's rolle i lægemiddeludvikling. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grundlæggende og praktiske aspekter af ultrahøjtryksvæskekromatografi til hurtige separationer. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Anvendelse af ultrahøjtydende væskekromatografi i lægemiddeludvikling. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolitiske makroporøse hydrogeler fremstillet af olie-i-vand-emulsioner med høj intern fase til effektiv oprensning af enterovirusser. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA. Væskekromatografiens rolle i proteomik. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Nye tendenser inden for omvendt fasevæskekromatografiseparationer af terapeutiske peptider og proteiner: teori og anvendelser. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Todimensionel separation af peptider ved hjælp af et RP-RP-HPLC-system med forskellige pH-værdier i den første og anden separationsdimension. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Masseoverføringsegenskaberne og den kinetiske ydeevne af højeffektive kromatografiske kolonner pakket med C18 sub-2 μm fuldt og overfladisk porøse partikler blev undersøgt. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nylige tendenser og analytiske udfordringer inden for isolering, identifikation og validering af plantebaserede bioaktive peptider. anus. biological anus. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Det proteomiske landskab i livets rige. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Downstream-behandling af terapeutiske peptider ved præparativ væskekromatografi. Molecule (Basel, Schweiz) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode kromatografi og dens anvendelse på biopolymerer. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligander til mixed-mode proteinkromatografi: princip, karakterisering og design. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).