Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Grimcat poroze të silicës u përgatitën me anë të një metode sol-xhel me disa modifikime për të përftuar grimca makroporoze. Këto grimca u derivatizuan me anë të polimerizimit të transferimit të zinxhirit të fragmentimit të shtimit të kthyeshëm (RAFT) me N-fenilmaleimid-metilvinilizocianat (PMI) dhe stiren për të përgatitur fazën stacionare të polistirenit (PMP) me interkalim N-fenilmaleimid. Kolonat prej çeliku inox me diametër të ngushtë (100 × 1.8 mm id) u paketuan me anë të paketimit të slurryt. Vlerësoi ndarjen në kolonën PMP të një përzierjeje peptidesh të përbërë nga pesë peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucinë enkefalinë) performancën kromatografike) dhe tretjen me tripsinë të albuminës së serumit njerëzor (HAS). Nën kushte optimale të elucionit, numri teorik i pllakave të përzierjes së peptideve është deri në 280,000 pllaka/m². Duke krahasuar performancën e ndarjes së kolonës së zhvilluar me Ascentis komercial. Në kolonën Express RP-Amid, u vu re se performanca e ndarjes së kolonës PMP ishte superiore ndaj kolonës komerciale për sa i përket efikasitetit dhe rezolucionit të ndarjes.
Në vitet e fundit, industria biofarmaceutike është bërë një treg global në zgjerim me një rritje të konsiderueshme të pjesës së tregut. Me rritjen shpërthyese të industrisë biofarmaceutike1,2,3, analiza e peptideve dhe proteinave është shumë e dëshiruar. Përveç peptidit të synuar, gjatë sintezës së peptideve gjenerohen disa papastërti, duke kërkuar kështu pastrim kromatografik për të marrë peptide me pastërtinë e dëshiruar. Analiza dhe karakterizimi i proteinave në lëngjet, indet dhe qelizat e trupit është një detyrë jashtëzakonisht sfiduese për shkak të numrit të madh të specieve potencialisht të zbulueshme në një mostër të vetme. Megjithëse spektrometria masive është një mjet efektiv për sekuencimin e peptideve dhe proteinave, nëse mostra të tilla injektohen në spektrometrin e masës në një kalim, ndarja nuk do të jetë ideale. Ky problem mund të zbutet duke zbatuar ndarjet e kromatografisë së lëngshme (LC) para analizës MS, e cila do të zvogëlojë numrin e analitëve që hyjnë në spektrometrin e masës në një kohë të caktuar4,5,6. Përveç kësaj, gjatë ndarjes së fazës së lëngshme, analitët mund të përqendrohen në rajone të ngushta, duke përqendruar kështu këta analit dhe duke përmirësuar ndjeshmërinë e zbulimit MS. Kromatografia e lëngshme (LC) ka përparuar ndjeshëm. gjatë dekadës së fundit dhe është bërë një teknikë popullore në analizën proteomike7,8,9,10.
Kromatografia e lëngshme me fazë të përmbysur (RP-LC) përdoret gjerësisht për pastrimin dhe ndarjen e përzierjeve të peptideve duke përdorur silicë të modifikuar me oktadecil (ODS) si fazë stacionare11,12,13. Megjithatë, fazat stacionare RP nuk ofrojnë ndarje të kënaqshme të peptideve dhe proteinave për shkak të strukturës së tyre komplekse dhe natyrës amfifile14,15. Prandaj, kërkohen faza stacionare të projektuara posaçërisht për të analizuar peptidet dhe proteinat me pjesë polare dhe jo polare për të bashkëvepruar me dhe për të ruajtur këto analite16. Kromatografia me modalitet të përzier, e cila siguron ndërveprime multimodale, mund të jetë një alternativë ndaj RP-LC për ndarjen e peptideve, proteinave dhe përzierjeve të tjera komplekse. Janë përgatitur disa faza stacionare me modalitet të përzier dhe kolonat e mbushura me këto faza janë përdorur për ndarjen e peptideve dhe proteinave17,18,19,20,21. Fazat stacionare me modalitet të përzier (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, ndërthurje polare/RPLC) janë të përshtatshme për ndarjen e peptideve dhe proteinave për shkak të pranisë si të polareve ashtu edhe të jo polareve. grupet22,23,24,25,26,27,28. Në mënyrë të ngjashme, fazat stacionare polare të ndërfutura me grupe polare të lidhura kovalente tregojnë fuqi të mirë ndarëse dhe selektivitet unik për analitët polare dhe jo-polarë, pasi ndarja varet nga bashkëveprimi midis analitit dhe fazës stacionare. Ndërveprimet multimodale 29, 30, 31, 32. Kohët e fundit, Zhang et al. 30 përgatitën një fazë stacionare poliamine të terminuar me dodecil dhe ndanë me sukses hidrokarburet, antidepresivët, flavonoidet, nukleozidet, estrogjenet dhe disa analitët e tjerë. Ndërfutësi polar ka grupe si polare ashtu edhe jo-polare, kështu që mund të përdoret për të ndarë peptidet dhe proteinat që kanë pjesë hidrofobike dhe hidrofile. Kolonat e ngulitura polare (p.sh., kolonat C18 të ngulitura në amid) janë të disponueshme komercialisht nën emrin tregtar kolonat Ascentis Express RP-Amid, por këto kolona përdoren vetëm për analizën e aminës 33.
Në studimin aktual, një fazë stacionare e ngulitur në polar (polistireni i ngulitur në N-fenilmaleimid) u përgatit dhe u vlerësua për ndarjen e peptideve dhe tretjeve të tripsinës së HSA-së. Faza stacionare u përgatit duke përdorur strategjinë e mëposhtme. Grimcat poroze të silicës u përgatitën sipas procedurës së dhënë në botimin tonë të mëparshëm me disa modifikime në protokollin e përgatitjes. Raporti i uresë, polietilen glikolit (PEG), TMOS, acidit acetik të ujit u rregullua për të përgatitur grimca silice me madhësi të madhe poresh. Së dyti, një ligand i ri, fenilmaleimid-metil vinil izocianat, u sintetizua dhe u përdor për të derivatizuar grimcat e silicës për të përgatitur një fazë stacionare të ngulitur polare. Faza stacionare që rezultoi u paketua në një kolonë çeliku inox (100 × 1.8 mm id) duke përdorur skemën e paketimit të optimizuar. Paketimi i kolonës ndihmohet me dridhje mekanike për të siguruar që një shtrat homogjen të formohet brenda kolonës. Vlerësoni ndarjen e kolonës së paketuar të përzierjeve të peptideve që përbëhen nga pesë peptide; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucinë Enkefalin) dhe tretja e tripsinës së albuminës së serumit njerëzor (HAS). Përzierja e peptideve dhe tretja e tripsinës së HSA u vu re se ndahen me rezolucion dhe efikasitet të mirë. Performanca e ndarjes së kolonës PMP u krahasua me atë të kolonës Ascentis Express RP-Amid. Si peptidet ashtu edhe proteinat u vunë re se treteshin mirë dhe ishin efikase në kolonën PMP, e cila ishte më efikase se kolona Ascentis Express RP-Amid.
PEG (Polietilen Glikol), Ure, Acid Acetik, Trimetoksilikat Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilan (TMCS), Tripsinë, Albuminë Serumi Njerëzor (HSA), Klorur Amoniumi, Ure, Heksan Metildisilazan (HMDS), Klorur Metakriloil (MC), Stiren, 4-Hidroksi-TEMPO, Peroksid Benzoili (BPO), Acetonitril i Gradës HPLC (ACN), Metanol, 2-Propanol dhe Aceton të blerë nga Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SHBA).
Një përzierje ureje (8 g), polietilen glikol (8 g) dhe 8 mL acid acetik 0.01 N u trazua për 10 minuta, dhe më pas iu shtuan 24 mL TMOS në kushte akulli. Përzierja e reagimit u ngroh në 40°C për 6 orë dhe më pas në 120°C për 8 orë në një autoklavë çeliku inox. Uji u derdh dhe materiali i mbetur u tha në 70°C për 12 orë. Masa e butë e tharë u blua butësisht në një furrë dhe u kalcinua në 550°C për 12 orë. U përgatitën dhe u karakterizuan tre grupe për të shqyrtuar riprodhueshmërinë në madhësinë e grimcave, madhësinë e poreve dhe sipërfaqen.
Me anë të modifikimit sipërfaqësor të grimcave të silicës me ligand të parasintetizuar fenilmaleimid-metilvinilizocianat (PCMP) të ndjekur nga polimerizimi radial me stiren, u përgatit një përbërje që përmbante grup polar. Faza stacionare për agregatet dhe zinxhirët e polistirenit. Procesi i përgatitjes përshkruhet më poshtë.
N-fenilmaleimidi (200 mg) dhe metil vinil izocianati (100 mg) u tretën në toluen të thatë, dhe 0.1 mL 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) u shtua në balonën e reagimit për të përgatitur kopolimerin fenilmaleimid-metil vinil izocianat (PMCP). Përzierja u ngroh në 60°C për 3 orë, u filtrua dhe u tha në furrë në 40°C për 3 orë.
Grimcat e silicës së tharë (2 g) u shpërndanë në toluen të thatë (100 mL), u përzien dhe u nënshtruan ultratingujve në një balonë me fund të rrumbullakët prej 500 mL për 10 minuta. PMCP (10 mg) u tret në toluen dhe u shtua me pika në balonën e reagimit nëpërmjet një hinke pikatore. Përzierja u ngroh në refluks në 100 °C për 8 orë, u filtrua dhe u la me aceton dhe u tha në 60 °C për 3 orë. Pastaj, grimcat e silicës së lidhur me PMCP (100 g) u tretën në toluen (200 ml) dhe u shtua 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) në prani të 100 µL dibutiltin dilaurat si katalizator. Përzierja u përzie në 50 °C për 8 orë, u filtrua dhe u tha në 50 °C për 3 orë.
Stireni (1 mL), peroksidi i benzoilit BPO (0.5 mL) dhe grimcat e silicës të bashkangjitura në TEMPO-PMCP (1.5 g) u shpërndanë në toluen dhe u pastruan me azot. Polimerizimi i stirenit u krye në 100°C për 12 orë. Produkti që rezultoi u la me metanol dhe u tha në 60°C gjatë natës. Skema e përgjithshme e reagimit është treguar në Figurën 1.
Mostrat u degazuan në 393 K për 1 orë për të marrë një presion të mbetur më pak se 10-3 Torr. Sasia e N2 e adsorbuar në një presion relativ prej P/P0 = 0.99 u përdor për të përcaktuar vëllimin total të poreve. Morfologjia e grimcave të silicës së zhveshur dhe të lidhura me ligand u ekzaminua me mikroskopi elektronike skanuese (Hitachi High Technologies, Tokio, Japoni). Mostrat e thara (silicë e zhveshur dhe grimca të silicës së lidhur me ligand) u vendosën në një kolonë alumini duke përdorur shirit karboni ngjitës. Mostrat u veshën me ar duke përdorur një shtresë spërkatëse Q150T, dhe një shtresë Au 5 nm u depozitua në mostra. Kjo përmirëson efikasitetin e procesit duke përdorur tensione të ulëta dhe siguron spërkatje të ftohtë me kokërr të imët. Një analizues elementar Thermo Electron (Waltham, MA, SHBA) Flash EA1112 u përdor për analizën elementare. Një analizues i madhësisë së grimcave Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 u përdor për të marrë shpërndarjen e madhësisë së grimcave. Grimca të silicës së zhveshur dhe silicë e lidhur me ligand Grimcat (5 mg secila) u shpërndanë në 5 mL izopropanol, u nënshtruan sonifikimit për 10 minuta, u përzien në vorteks për 5 minuta dhe u vendosën në bankën optike të Mastersizer. Analiza termogravimetrike u krye me një shpejtësi prej 5 °C për minutë në një diapazon temperature prej 30 deri në 800 °C.
Kolonat prej çeliku inox me diametër të ngushtë të veshura me xham me dimensione (100 × 1.8 mm id) u paketuan duke përdorur metodën e paketimit me slurry, duke zbatuar të njëjtën procedurë të përdorur në Ref. 31. Një kolonë çeliku inox (e veshur me xham, 100 × 1.8 mm id) me një aksesor dalës që përmban një fritë 1 µm u lidh me një paketues slurri (Alltech Deerfield, IL, SHBA). Përgatitni një slurr të fazës stacionare duke pezulluar 150 mg fazë stacionare në 1.2 mL metanol dhe dërgojeni atë në kolonën e ruajtjes. Metanoli u përdor si tretës slurri, si dhe si tretës shtytës. Mbushni kolonën në mënyrë sekuenciale duke aplikuar presione prej 100 MP për 10 minuta, 80 MP për 15 minuta dhe 60 MP për 30 minuta. Gjatë paketimit, u aplikua vibrim mekanik me dy tundës kolonash GC (Alltech, Deerfield, IL, SHBA) për të siguruar paketim uniform të kolonës. Mbyllni paketuesin e slurit dhe lironi presionin ngadalë për të parandaluar çdo dëmtim brenda kolonës. Shkëputeni kolonën nga njësia e paketimit të slurit dhe lidhni një aksesor tjetër në hyrje dhe në sistemin LC për të kontrolluar performancën e tij.
U ndërtua një pompë LC (10AD Shimadzu, Japoni), injektor (Valco (USA) C14 W.05) me lak injeksioni 50nL, degazues membrane (Shimadzu DGU-14A), dritare kapilare UV-VIS. U ndërtua një pajisje speciale detektorësh µLC (UV-2075) dhe mikrokolona të veshura me xham. U përdorën tuba lidhës shumë të ngushtë dhe të shkurtër për të minimizuar efektin e zgjerimit shtesë të brezit të kolonës. Pas paketimit, kapilarët (50 μm id 365 dhe kapilarët e bashkimit reduktues (50 μm) u instaluan në daljen 1/16″ të bashkimit reduktues. Mbledhja e të dhënave dhe përpunimi kromatografik u kryen duke përdorur softuerin Multichro 2000. Monitorimi në 254 nm. Analitët u testuan për thithjen UV. Të dhënat kromatografike u analizuan nga OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina nga serumi njerëzor, pluhur i liofilizuar, ≥ 96% (elektroforezë në xhel agaroze) 3 mg e përzier me tripsinë (1.5 mg), 4.0 M ure (1 mL) dhe 0.2 M bikarbonat amoni (1 mL). Tretësira u trazua për 10 minuta dhe u mbajt në një banjë uji në 37°C për 6 orë, pastaj u shua me 1 mL 0.1% TFA. Filtro tretësirën dhe ruaje nën 4°C.
Ndarja e përzierjeve të peptideve dhe tretjeve të tripsinës HSA u vlerësua veçmas në kolonat PMP. Kontrolloni ndarjen e përzierjes së peptideve dhe tretjes së tripsinës së HSA nga kolona PMP dhe krahasoni rezultatet me kolonën Ascentis Express RP-Amid. Numri teorik i pllakës llogaritet si më poshtë:
Imazhet SEM të grimcave të silicës së zhveshur dhe grimcave të silicës së lidhur me ligand janë paraqitur në FIG. 2. Imazhet SEM të grimcave të silicës së zhveshur (A, B) tregojnë se, në ndryshim nga studimet tona të mëparshme, këto grimca janë sferike në të cilat grimcat janë të zgjatura ose kanë simetri të parregullt. Sipërfaqja e grimcave të silicës së lidhur me ligand (C, D) është më e lëmuar se ajo e grimcave të silicës së zhveshur, gjë që mund të jetë për shkak të veshjes së zinxhirëve të polistirenit në sipërfaqen e grimcave të silicës.
Imazhe të mikroskopit elektronik skanues të grimcave të zhveshura të silicës (A, B) dhe grimcave të silicës të lidhura me ligand (C, D).
Shpërndarjet e madhësisë së grimcave të grimcave të silicës së zhveshur dhe grimcave të silicës së lidhur me ligand tregohen në Figurën 3(A). Kurbat e shpërndarjes së madhësisë së grimcave bazuar në vëllim treguan se madhësia e grimcave të silicës u rrit pas modifikimit kimik (Fig. 3A). Të dhënat e shpërndarjes së madhësisë së grimcave të grimcave të silicës nga studimi aktual dhe studimi i mëparshëm krahasohen në Tabelën 1(A). Madhësia e grimcave bazuar në vëllim, d(0.5), e PMP është 3.36 μm, krahasuar me studimin tonë të mëparshëm me vlerën ad(0.5) prej 3.05 μm (grimca silice të lidhura me polistiren)34. Kjo seri kishte një shpërndarje më të ngushtë të madhësisë së grimcave krahasuar me studimin tonë të mëparshëm për shkak të raporteve të ndryshueshme të PEG, uresë, TMOS dhe acidit acetik në përzierjen e reagimit. Madhësia e grimcave të fazës PMP është pak më e madhe se ajo e fazës së grimcave të silicës të lidhur me polistiren që studiuam më parë. Kjo do të thotë që funksionalizimi sipërfaqësor i grimcave të silicës me stiren depozitoi vetëm një shtresë polistireni (0.97 µm) në sipërfaqen e silicës, ndërsa në fazën PMP trashësia e shtresës ishte 1.38 µm.
Shpërndarja e madhësisë së grimcave (A) dhe shpërndarja e madhësisë së poreve (B) e grimcave të zhveshura të silicës dhe grimcave të silicës të lidhura me ligand.
Madhësia e poreve, vëllimi i poreve dhe sipërfaqja e grimcave të silicës të studimit aktual janë dhënë në Tabelën 1(B). Profilet PSD të grimcave të silicës së zhveshur dhe grimcave të silicës të lidhura me ligand janë treguar në Figurën 3(B). Rezultatet janë të krahasueshme me studimin tonë të mëparshëm. Madhësitë e poreve të grimcave të silicës së zhveshur dhe të lidhura me ligand janë përkatësisht 310 dhe 241, gjë që tregon se madhësia e poreve zvogëlohet me 69 pas modifikimit kimik, siç tregohet në Tabelën 1(B), dhe ndryshimi i kurbës është treguar në Fig. 3(B). Në mënyrë të ngjashme, vëllimi i poreve të grimcave të silicës u ul nga 0.67 në 0.58 cm3/g pas modifikimit kimik. Sipërfaqja specifike e grimcave të silicës të studiuara aktualisht është 116 m2/g, e cila është e krahasueshme me studimin tonë të mëparshëm (124 m2/g). Siç tregohet në Tabelën 1(B), sipërfaqja (m2/g) e grimcave të silicës gjithashtu u ul nga 116 m2/g në 105 m2/g pas modifikim kimik.
Rezultatet e analizës elementare të fazës stacionare janë paraqitur në Tabelën 2. Ngarkesa e karbonit e fazës stacionare aktuale është 6.35%, që është më e ulët se ngarkesa e karbonit e studimit tonë të mëparshëm (grimca silici të lidhura me polistiren, përkatësisht 7.93%35 dhe 10.21%)42. Ngarkesa e karbonit e fazës stacionare aktuale është e ulët, sepse në përgatitjen e SP-së aktuale, përveç stirenit, u përdorën disa ligandë polarë si fenilmaleimid-metilvinilizocianat (PCMP) dhe 4-hidroksi-TEMPO. Përqindja e peshës së azotit të fazës stacionare aktuale është 2.21%, krahasuar me 0.1735 dhe 0.85% të peshës së azotit në studimet e mëparshme, përkatësisht. Kjo do të thotë që % e peshës së azotit është më e lartë në fazën stacionare aktuale për shkak të fenilmaleimidit. Në mënyrë të ngjashme, ngarkesat e karbonit të produkteve (4) dhe (5) ishin përkatësisht 2.7% dhe 2.9%, ndërsa ngarkesa e karbonit e produktit përfundimtar (6) ishte 6.35%, siç tregohet në Tabelën 2. Humbja e peshës u kontrollua me fazën stacionare PMP, dhe kurba TGA tregohet në Figurën 4. Kurba TGA tregon një humbje peshe prej 8.6%, e cila është në përputhje të mirë me ngarkesën e karbonit (6.35%) sepse ligandët përmbajnë jo vetëm C, por edhe N, O dhe H.
Ligandi fenilmaleimid-metilvinilizocianat u zgjodh për modifikimin sipërfaqësor të grimcave të silicës sepse ka grupe polare fenilmaleimide dhe grupe vinilizocianat. Grupet vinil izocianat mund të reagojnë më tej me stirenin duke polimerizuar radikalin e gjallë. Arsyeja e dytë është të futet një grup që ka një bashkëveprim të moderuar me analitin dhe asnjë bashkëveprim të fortë elektrostatik midis analitit dhe fazës stacionare, pasi pjesa e fenilmaleimidit nuk ka ngarkesë virtuale në pH normal. Polarizimi i fazës stacionare mund të kontrollohet nga sasia optimale e stirenit dhe koha e reagimit të polimerizimit me radikal të lirë. Hapi i fundit i reagimit (polimerizimi me radikal të lirë) është kritik dhe mund të ndryshojë polaritetin e fazës stacionare. Analiza elementare u krye për të kontrolluar ngarkesën e karbonit të këtyre fazave stacionare. U vu re se rritja e sasisë së stirenit dhe kohës së reagimit rriti ngarkesën e karbonit të fazës stacionare dhe anasjelltas. SP-të e përgatitura me përqendrime të ndryshme të stirenit kanë ngarkesa të ndryshme karboni. Përsëri, ngarkoni këto faza stacionare në kolona çeliku inox dhe kontrolloni kromatografinë e tyre. performanca (selektiviteti, rezolucioni, vlera e N, etj.). Bazuar në këto eksperimente, u zgjodh një formulë e optimizuar për të përgatitur fazën stacionare PMP për të siguruar polaritet të kontrolluar dhe mbajtje të mirë të analitit.
Pesë përzierje peptidesh (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucinë enkefalinë) u vlerësuan gjithashtu duke përdorur një kolonë PMP që përdor një fazë mobile; 60/40 (v/v) acetonitril/ujë (0.1% TFA) me një shpejtësi rrjedhjeje prej 80 μL/min. Në kushte optimale të elucionit, numri teorik i pllakave (N) për kolonë (100 × 1.8 mm id) është 20,000 ± 100 (200,000 pllaka/m²). Tabela 3 jep vlerat N për tre kolonat PMP dhe kromatogramet tregohen në Figurën 5A. Analizë e shpejtë në një kolonë PMP me shpejtësi të lartë rrjedhjeje (700 μL/min), pesë peptide u eluuan brenda një minute, vlerat N ishin shumë të mira, 13,500 ± 330 për kolonë (100 × 1.8 mm id), që korrespondon me 135,000 pllaka/m² (Figura 5B). Tre kolona me madhësi identike (100 × 1.8 mm id) u mbushën me tre lote të ndryshme të fazës stacionare PMP për të kontrolluar riprodhueshmërinë. Përqendrimi i analitit për secilën kolonë u regjistrua duke përdorur kushtet optimale të elucionit dhe numrin e pllakave teorike N dhe kohën e mbajtjes për të ndarë të njëjtën përzierje testimi në secilën kolonë. Të dhënat e riprodhueshmërisë për kolonat PMP tregohen në Tabelën 4. Riprodhueshmëria e kolonës PMP korrelon mirë me vlera shumë të ulëta %RSD, siç tregohet në Tabelën 3.
Ndarja e përzierjes së peptideve në kolonën PMP (B) dhe kolonën Ascentis Express RP-Amid (A); faza mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensionet e kolonës PMP (100 × 1.8 mm id); analitike Rendi i elucionit të komponimeve: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dhe 5 (leucinë) acid enkefalinë)).
Një kolonë PMP (100 × 1.8 mm id) u vlerësua për ndarjen e tretësve triptikë të albuminës së serumit njerëzor në kromatografi të lëngshme me performancë të lartë. Kromatogrami në Figurën 6 tregon se mostra është e ndarë mirë dhe rezolucioni është shumë i mirë. Tretjet HSA u analizuan duke përdorur një shpejtësi rrjedhjeje prej 100 µL/min, fazë mobile 70/30 acetonitril/ujë dhe 0.1% TFA. Siç tregohet në kromatogram (Figura 6), tretja HSA është ndarë në 17 maja që korrespondojnë me 17 peptide. Efikasiteti i ndarjes së secilës majë në tretësin HSA u llogarit dhe vlerat jepen në Tabelën 5.
Një tretës triptik i HSA-së (100 × 1.8 mm id) u nda në një kolonë PMP; shpejtësia e rrjedhjes (100 µL/min), faza mobile 60/40 acetonitril/ujë me 0.1% TFA.
ku L është gjatësia e kolonës, η është viskoziteti i fazës mobile, ΔP është presioni i kundërt i kolonës dhe u është shpejtësia lineare e fazës mobile. Përshkueshmëria e kolonës PMP ishte 2.5 × 10-14 m2, shkalla e rrjedhjes ishte 25 μL/min, dhe u përdor 60/40 v/v ACN/ujë. Përshkueshmëria e kolonës PMP (100 × 1.8 mm id) ishte e ngjashme me atë të studimit tonë të mëparshëm Ref.34. Përshkueshmëria e kolonës së mbushur me grimca poroze sipërfaqësore është: 1.7 × 10-15 për grimca 1.3 μm, 3.1 × 10-15 për grimca 1.7 μm, 5.2 × 10-15 dhe 2.5 × 10-14 m2 për grimca 2.6 μm Për grimca 5 μm 43. Prandaj, përshkueshmëria e fazës PMP është e ngjashme me atë të grimcave bërthamë-guaskë 5 μm.
ku Wx është pesha e kolonës së mbushur me kloroform, Wy është pesha e kolonës së mbushur me metanol dhe ρ është dendësia e tretësit. Dendësitë e metanolit (ρ = 0.7866) dhe kloroformit (ρ = 1.484). Poroziteti total i kolonave SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 dhe kolonave C18-Ure 31 që studiuam më parë ishin përkatësisht 0.63 dhe 0.55. Kjo do të thotë që prania e ligandëve të uresë zvogëlon përshkueshmërinë e fazës stacionare. Nga ana tjetër, poroziteti total i kolonës PMP (100 × 1.8 mm id) është 0.60. Përshkueshmëria e kolonave PMP është më e ulët se ajo e kolonave të mbushura me grimca silici të lidhura me C18 sepse në fazat stacionare të tipit C18 ligandët C18 janë të bashkangjitur në grimcat e silicës si zinxhirë linearë, ndërsa në fazat stacionare të tipit polistiren, formohet një shtresë polimeri relativisht e trashë. rreth tij. Në një eksperiment tipik, poroziteti i kolonës llogaritet si:
Figura 7A, B tregon kolonën PMP (100 × 1.8 mm id) dhe kolonën Ascentis Express RP-Amid (100 × 1.8 mm id) duke përdorur të njëjtat kushte elucioni (domethënë, 60/40 ACN/H2O dhe 0.1% TFA). ) të grafikut van Deemter. Përzierjet e zgjedhura të peptideve (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) u përgatitën në 20 µL. Shkalla minimale e rrjedhjes për të dy kolonat është 800 µL/min. Vlerat minimale të HETP në shkallën optimale të rrjedhjes (80 µL/min) për kolonën PMP dhe kolonën Ascentis Express RP-Amid ishin përkatësisht 2.6 µm dhe 3.9 µm. Vlerat e HETP tregojnë se efikasiteti i ndarjes së kolonës PMP (100 × 1.8 mm id) është shumë më i mirë se kolona Ascentis Express RP-Amid e disponueshme komercialisht (100 × 1.8 mm id). Grafiku van Deemter në Fig. 7(A) tregon se ulja e vlerës së N me rritjen e rrjedhjes nuk është e rëndësishme krahasuar me studimin tonë të mëparshëm. Efikasiteti më i lartë i ndarjes së kolonës PMP (100 × 1.8 mm id) krahasuar me kolonën Ascentis Express RP-Amid bazohet në përmirësimet në formën, madhësinë e grimcave dhe procedurat komplekse të paketimit të kolonës të përdorura në punën aktuale34.
(A) grafiku van Deemter (HETP kundrejt shpejtësisë lineare të fazës mobile) i marrë duke përdorur një kolonë PMP (100 × 1.8 mm id) në 60/40 ACN/H2O me 0.1% TFA. (B) grafiku van Deemter (HETP kundrejt shpejtësisë lineare të fazës mobile) i marrë duke përdorur një kolonë Ascentis Express RP-Amid (100 × 1.8 mm id) në 60/40 ACN/H2O me 0.1% TFA.
Një fazë stacionare polistireni e ngulitur në polar u përgatit dhe u vlerësua për ndarjen e përzierjeve të peptideve sintetike dhe tretjeve të tripsinës së albuminës së serumit njerëzor (HAS) në kromatografinë e lëngshme me performancë të lartë. Performanca kromatografike e kolonave PMP për përzierjet e peptideve është e shkëlqyer në efikasitetin dhe rezolucionin e ndarjes. Performanca e përmirësuar e ndarjes së kolonave PMP është për shkak të një sërë arsyesh, të tilla si madhësia e grimcave dhe madhësia e poreve të grimcave të silicës, sinteza e kontrolluar e fazës stacionare dhe paketimi kompleks i kolonës. Përveç efikasitetit të lartë të ndarjes, presioni i ulët i kundërt i kolonës në shpejtësi të larta rrjedhjeje është një tjetër avantazh i kësaj faze stacionare. Kolonat PMP shfaqin riprodhueshmëri të mirë dhe mund të përdoren për analizën e përzierjeve të peptideve dhe tretjen e tripsinës së proteinave të ndryshme. Ne synojmë ta përdorim këtë kolonë për ndarjen e produkteve natyrore, komponimeve bioaktive nga bimët medicinale dhe ekstraktet e kërpudhave në kromatografinë e lëngshme. Në të ardhmen, kolonat PMP do të vlerësohen gjithashtu për ndarjen e proteinave dhe antitrupave monoklonalë.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Hulumtime mbi Sistemet e Ndarjes së Peptideve me anë të Kromatografisë me Fazë të Përmbysur Pjesa I: Zhvillimi i një Protokolli të Karakterizimit të Kolonës. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptide aktive të përmirësuara të projektuara për trajtimin e sëmundjeve infektive. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidet terapeutike sintetike: shkenca dhe tregu. zbulimi i barnave. 15 (1-2) sot, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografia e Lëngshme Proteomike e Avancuar. J. Kromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografia e lëngshme e avancuar - spektrometria masive mundëson përfshirjen e metabolomikës dhe proteomikës me objektiv të gjerë. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Roli i UHPLC në zhvillimin e barnave. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspekte themelore dhe praktike të kromatografisë së lëngshme me presion ultra të lartë për ndarje të shpejta. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Zbatimi i kromatografisë së lëngshme me performancë ultra të lartë në zhvillimin e barnave. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogele monolitike makroporoze të përgatitura nga emulsione me fazë të brendshme të lartë vaj-në-ujë për pastrim efikas të enteroviruseve. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Roli i kromatografisë së lëngshme në proteomikë. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Trendet në zhvillim e sipër në ndarjet me kromatografi të lëngshme me fazë të kundërt të peptideve dhe proteinave terapeutike: teoria dhe zbatimet. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Ndarja dy-dimensionale e peptideve duke përdorur një sistem RP-RP-HPLC duke përdorur vlera të ndryshme të pH-it në dimensionin e parë dhe të dytë të ndarjes. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. U hetuan karakteristikat e transferimit të masës dhe performanca kinetike e kolonave kromatografike me efikasitet të lartë të mbushura me grimca C18 nën-2 μm plotësisht dhe sipërfaqësisht poroze. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Trendet e fundit dhe sfidat analitike në izolimin, identifikimin dhe validimin e peptideve bioaktive të bimëve. anus. biological anus. Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Peizazhi proteomik i mbretërisë së jetës. Natyra 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Përpunimi pasues i peptideve terapeutike me anë të kromatografisë së lëngshme përgatitore. Molecule (Bazel, Zvicër) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia me modalitet të përzier dhe zbatimi i saj në biopolimerë. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligandët për kromatografinë e proteinave me modalitet të përzier: parimi, karakterizimi dhe dizajni. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).