Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Сітаватыя часціцы крэмнезёму былі падрыхтаваны золь-гель метадам з некаторымі мадыфікацыямі для атрымання макрасітаватых часціц. Гэтыя часціцы былі дэрыватызаваны шляхам палімерызацыі з рэверсіўным даданнем і фрагментацыяй ланцуга (RAFT) з N-фенілмалеімід-метылвінілізацыянатам (PMI) і стыролам для атрымання стацыянарнай фазы інтэркаляцыі N-фенілмалеіміду ў полістырол (PMP). Вузкія калоны з нержавеючай сталі (100 × 1,8 мм унутры) былі набітыя суспензійным спосабам. Ацэнены храматаграфічныя характарыстыкі падзелу на калонцы PMP пептыднай сумесі, якая складаецца з пяці пептыдаў (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцын энкефалін) і трыпсінавы пераварванне сыроватачнага альбуміна чалавека (HAS). Пры аптымальных умовах элюцыі тэарэтычная колькасць пласцін пептыднай сумесі дасягае 280 000 пласцін/м². Параўнанне характарыстык падзелу распрацаванай калоны з камерцыйнай Ascentis Express. На калонцы RP-Amide было заўважана, што прадукцыйнасць падзелу калонкі PMP пераўзыходзіла камерцыйную калонку з пункту гледжання эфектыўнасці падзелу і раздзяляльнай здольнасці.
У апошнія гады біяфармацэўтычная прамысловасць стала глабальным рынкам, які пастаянна расце, са значным павелічэннем долі рынку. З імклівым ростам біяфармацэўтычнай прамысловасці1,2,3 аналіз пептыдаў і бялкоў вельмі запатрабаваны. Акрамя мэтавага пептыда, падчас сінтэзу пептыдаў утвараецца некалькі прымешак, што патрабуе храматаграфічнай ачысткі для атрымання пептыдаў патрэбнай чысціні. Аналіз і характарыстыка бялкоў у біялагічных вадкасцях, тканінах і клетках з'яўляецца надзвычай складанай задачай з-за вялікай колькасці патэнцыйна выяўляемых відаў у адным узоры. Нягледзячы на ​​тое, што мас-спектрометрыя з'яўляецца эфектыўным інструментам для секвенавання пептыдаў і бялкоў, калі такія ўзоры ўводзяцца ў мас-спектрометр за адзін праход, падзел не будзе ідэальным. Гэтую праблему можна вырашыць, ужыўшы вадкасную храматаграфію (ВХ) перад аналізам МС, што зменшыць колькасць аналітаў, якія паступаюць у мас-спектрометр у дадзены момант часу4,5,6. Акрамя таго, падчас вадкафазнага падзелу аналіты могуць быць сфакусаваны ў вузкіх абласцях, тым самым канцэнтруючы гэтыя аналіты і паляпшаючы адчувальнасць выяўлення МС. Вадкасная храматаграфія (ВХ) значна прасунулася за апошняе дзесяцігоддзе і стала папулярнай методыкай у... пратэомны аналіз7,8,9,10.
Абаронча-фазавая вадкасная храматаграфія (АФВХ) шырока выкарыстоўваецца для ачысткі і падзелу пептыдных сумесяў з выкарыстаннем актадэцыл-мадыфікаванага дыяксіду крэмнію (ОДС) у якасці стацыянарнай фазы11,12,13. Аднак стацыянарныя фазы АФВХ не забяспечваюць здавальняючага падзелу пептыдаў і бялкоў з-за іх складанай структуры і амфіфільнай прыроды14,15. Таму для аналізу пептыдаў і бялкоў з палярнымі і непалярнымі фрагментамі патрабуюцца спецыяльна распрацаваныя стацыянарныя фазы, каб узаемадзейнічаць з гэтымі аналітамі і ўтрымліваць іх16. Храматаграфія ў змешаным рэжыме, якая забяспечвае мультымадальныя ўзаемадзеянні, можа быць альтэрнатывай АФВХ для падзелу пептыдаў, бялкоў і іншых складаных сумесяў. Было падрыхтавана некалькі стацыянарных фаз у змешаным рэжыме, і калонкі, запоўненыя гэтымі фазамі, выкарыстоўваліся для падзелу пептыдаў і бялкоў17,18,19,20,21. Стацыянарныя фазы ў змешаным рэжыме (WAX/АФВХ, HILIC/АФВХ, палярная інтэркаляцыя/АФВХ) падыходзяць для падзелу пептыдаў і бялкоў з-за наяўнасці як палярных, так і непалярных кампанентаў. групы22,23,24,25,26,27,28. Падобным чынам, палярныя інтэркаляцыйныя стацыянарныя фазы з кавалентна звязанымі палярнымі групамі дэманструюць добрую раздзяляльную здольнасць і ўнікальную селектыўнасць для палярных і непалярных аналітаў, паколькі падзел залежыць ад узаемадзеяння паміж аналітам і стацыянарнай фазай. Мультымадальныя ўзаемадзеянні 29, 30, 31, 32. Нядаўна Чжан і інш.30 падрыхтавалі стацыянарную фазу поліаміну з дадэцыльнымі канцавымі групамі і паспяхова аддзялілі вуглевадароды, антыдэпрэсанты, флаваноіды, нуклеазіды, эстрагены і некалькі іншых аналітаў. Палярны інтэркалятар мае як палярныя, так і непалярныя групы, таму яго можна выкарыстоўваць для падзелу пептыдаў і бялкоў, якія маюць як гідрафобныя, так і гідрафільныя фрагменты. Палярна-ўбудаваныя калонкі (напрыклад, амід-ўбудаваныя калонкі C18) камерцыйна даступныя пад гандлёвай назвай калонкі Ascentis Express RP-Amide, але гэтыя калонкі выкарыстоўваюцца толькі для аналізу аміна 33.
У дадзеным даследаванні была падрыхтавана і ацэнена палярна-ўбудаваная стацыянарная фаза (полістырол, убудаваны ў N-фенілмалеімід) для падзелу пептыдаў і трыпсінавых перавараў HSA. Стацыянарная фаза была падрыхтавана з выкарыстаннем наступнай стратэгіі. Порыстыя часціцы крэмнезёму былі падрыхтаваны ў адпаведнасці з працэдурай, апісанай у нашай папярэдняй публікацыі, з некаторымі мадыфікацыямі ў пратаколе падрыхтоўкі. Суадносіны мачавіны, поліэтыленгліколю (PEG), TMOS, вады і воцатнай кіслаты было адрэгулявана для атрымання часціц крэмнезёму з вялікім памерам пор. Па-другое, быў сінтэзаваны новы ліганд, фенілмалеімід-метылвінілізацыянат, і выкарыстаны для дэрыватызацыі часціц крэмнезёму для атрымання палярна-ўбудаванай стацыянарнай фазы. Атрыманая стацыянарная фаза была загружана ў калону з нержавеючай сталі (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) з выкарыстаннем аптымізаванай схемы ўпакоўкі. Упакоўка калоны ажыццяўлялася з дапамогай механічнай вібрацыі, каб забяспечыць утварэнне аднастайнага пласта ўнутры калоны. Ацаніце падзел пептыдных сумесяў, якія складаюцца з пяці пептыдаў, на ўпакаванай калоне; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцын-энкефалін) і трыпсінавы перавар сыроватачнага альбуміна чалавека (HAS). Назіралася, што сумесь пептыдаў і трыпсінавы перавар HSA падзяляюцца з добрым раздзяленнем і эфектыўнасцю. Эфектыўнасць падзелу калонкі PMP параўноўвалася з эфектыўнасцю падзелу калонкі Ascentis Express RP-Amide. Назіралася, што як пептыды, так і бялкі добра і эфектыўна раздзяляюцца на калонцы PMP, якая была больш эфектыўнай, чым калонка Ascentis Express RP-Amide.
ПЭГ (поліэтыленгліколь), мачавіна, воцатная кіслата, трыметоксіартасілікат (TMOS), трыметылхлорсілан (TMCS), трыпсін, сыроватачны альбумін чалавека (HSA), хларыд амонію, мачавіна, гексан метылдысілазан (HMDS), метакрылілхларыд (MC), стырол, 4-гідраксі-TEMPO, пераксід бензаілу (BPO), ацэтонітрыл (ACN) класа ВЭЖХ, метанол, 2-прапанол і ацэтон, набытыя ў Sigma-Aldrich (Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША).
Сумесь мачавіны (8 г), поліэтыленгліколю (8 г) і 8 мл 0,01 N воцатнай кіслаты перамешвалі на працягу 10 хвілін, а затым дадалі 24 мл TMOS у ледзяным астуджэнні. Рэакцыйную сумесь награвалі пры тэмпературы 40°C на працягу 6 гадзін, а затым пры тэмпературы 120°C на працягу 8 гадзін у аўтаклаве з нержавеючай сталі. Ваду злілі, а рэшткавы матэрыял сушылі пры тэмпературы 70°C на працягу 12 гадзін. Высушаную мяккую масу гладка здрабнілі ў печы і пракалініравалі пры тэмпературы 550°C на працягу 12 гадзін. Былі падрыхтаваны і ахарактарызаваны тры партыі для праверкі ўзнаўляльнасці памеру часціц, памеру пор і плошчы паверхні.
Шляхам павярхоўнай мадыфікацыі часціц крэмнезёму папярэдне сінтэзаваным лігандам фенілмалеімід-метылвінілізацыянатам (PCMP) з наступнай радыяльнай палімерызацыяй са стыролам было атрымана злучэнне, якое змяшчае палярныя групы. Стацыянарная фаза для агрэгатаў і ланцугоў полістыролу. Працэс атрымання апісаны ніжэй.
N-фенілмалеімід (200 мг) і метылвінілізацыянат (100 мг) растваралі ў сухім талуоле, і ў рэакцыйную колбу дадавалі 0,1 мл 2,2'-азаізабутыранітрылу (AIBN) для атрымання сапалімера фенілмалеіміду і метылвінілізацыянату (PMCP). Сумесь награвалі пры тэмпературы 60°C на працягу 3 гадзін, фільтравалі і сушылі ў духоўцы пры тэмпературы 40°C на працягу 3 гадзін.
Высушаныя часціцы дыяксіду крэмнію (2 г) дыспергавалі ў сухім талуоле (100 мл), перамешвалі і апрацоўвалі ультрагукам у кругладоннай колбе аб'ёмам 500 мл на працягу 10 хвілін. PMCP (10 мг) растваралі ў талуоле і дадавалі па кроплях у рэакцыйную колбу праз кропельную варонку. Сумесь кіпяцілі з зваротным халадзільнікам пры тэмпературы 100°C на працягу 8 гадзін, фільтравалі, прамывалі ацэтонам і сушылі пры тэмпературы 60°C на працягу 3 гадзін. Затым звязаныя з PMCP часціцы дыяксіду крэмнію (100 г) растваралі ў талуоле (200 мл) і дадавалі 4-гідраксі-TEMPO (2 мл) у прысутнасці 100 мкл дыбутылдылаўрата алавянага рэчыва ў якасці каталізатара. Сумесь перамешвалі пры тэмпературы 50°C на працягу 8 гадзін, фільтравалі і сушылі пры 50°C на працягу 3 гадзін.
Стырол (1 мл), бензоілпероксид BPO (0,5 мл) і часціцы дыяксіду крэмнію, звязаныя з TEMPO-PMCP (1,5 г), дыспергавалі ў талуоле і прамывалі азотам. Палімерызацыю стыролу праводзілі пры тэмпературы 100°C на працягу 12 гадзін. Атрыманы прадукт прамывалі метанолам і сушылі пры тэмпературы 60°C на працягу ночы. Агульная схема рэакцыі паказана на малюнку 1.
Узоры дэгазавалі пры тэмпературы 393 K на працягу 1 гадзіны, каб атрымаць рэшткавы ціск менш за 10⁻³ Торр. Колькасць N2, адсарбаванага пры адносным ціску P/P0 = 0,99, выкарыстоўвалася для вызначэння агульнага аб'ёму пор. Марфалогія голых і ліганд-звязаных часціц крэмнезёму даследавалася з дапамогай сканіруючай электроннай мікраскапіі (Hitachi High Technologies, Токіо, Японія). Высушаныя ўзоры (голы крэмнезём і ліганд-звязаныя часціцы крэмнезёму) змяшчалі на алюмініевую калонку з дапамогай клейкай вугляроднай стужкі. Золата наносілі на ўзоры з дапамогай распыляльнай устаноўкі Q150T, і на ўзоры наносілі пласт золата таўшчынёй 5 нм. Гэта павышае эфектыўнасць працэсу пры выкарыстанні нізкіх напружанняў і забяспечвае дробназярністае халоднае распыленне. Для элементнага аналізу выкарыстоўваўся элементны аналізатар Thermo Electron (Уолтэм, Масачусэтс, ЗША) Flash EA1112. Для атрымання размеркавання памераў часціц выкарыстоўваўся аналізатар памераў Malvern (Вустэршыр, Вялікабрытанія) Mastersizer 2000. Голыя часціцы крэмнезёму і часціцы крэмнезёму, звязаныя з лігандам (5 мг (кожны) дыспергавалі ў 5 мл ізапрапанолу, апрацоўвалі ультрагукам на працягу 10 хвілін, перамешвалі на віхравым станку на працягу 5 хвілін і змяшчалі на аптычны стол Mastersizer. Тэрмагравіметрычны аналіз праводзілі са хуткасцю 5 °C у хвіліну ў дыяпазоне тэмператур ад 30 да 800 °C.
Вузкапраходныя калоны з нержавеючай сталі з эмаляваным шклом памерамі (100 × 1,8 мм унутры дыяметра) былі загружаныя метадам суспензійнай запаўняльнасці, выкарыстоўваючы тую ж працэдуру, што і ў спасылцы. 31. Калонка з нержавеючай сталі (з эмаляваным шклом, 100 × 1,8 мм унутраным дыяметрам) з выхадным фітынгам, які змяшчае фрыту памерам 1 мкм, была падключана да пакера суспензіі (Alltech Deerfield, IL, ЗША). Падрыхтуйце суспензію нерухомай фазы, суспендаваўшы 150 мг нерухомай фазы ў 1,2 мл метанолу і адпраўце яе ў калону для захоўвання. Метанол выкарыстоўваўся ў якасці растваральніка суспензіі, а таксама ў якасці прапыльнага растваральніка. Паслядоўна запаўняйце калону, прыкладаючы ціск 100 МПа на працягу 10 хвілін, 80 МПа на працягу 15 хвілін і 60 МПа на працягу 30 хвілін. Падчас упакоўкі механічная вібрацыя ўжывалася з дапамогай двух вібратараў для ГХ (Alltech, Deerfield, IL, ЗША), каб забяспечыць раўнамерную ўпакоўку калоны. Зачыніце пакер суспензіі і павольна скіньце ціск, каб прадухіліць пашкоджанне ўнутры калоны. Адлучыце калону ад блока ўпакоўкі суспензіі і падключыце іншы фітынг да ўваходу і да сістэмы ВХ, каб праверыць яе працаздольнасць.
Былі пабудаваны помпа вадкаснага вадкага шланга (10AD Shimadzu, Японія), інжэктар (Valco (ЗША) C14 W.05) з інжэктарнай пятлёй 50 нл, мембранны дэгазатар (Shimadzu DGU-14A), капілярнае акно УФ-ВІС, спецыяльны дэтэктар для µLC (UV-2075) і мікракалоны са шкляной падкладкай. Выкарыстоўваліся вельмі вузкія і кароткія злучальныя трубкі, каб мінімізаваць эфект дадатковага пашырэння паласы калонкі. Пасля ўпакоўкі капіляры (50 мкм унутраным дыяметрам 365 мм) і капіляры аднаўленчага злучэння (50 мкм) былі ўсталяваны на выхадзе 1/16 цалі аднаўленчага злучэння. Збор дадзеных і храматаграфічная апрацоўка праводзіліся з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння Multichro 2000. Маніторынг пры 254 нм. Аналіты тэставаліся на УФ-паглынанне. Храматаграфічныя дадзеныя аналізаваліся з дапамогай OriginPro8 (Нортгэмптан, Масачусэтс).
Альбумін з сыроваткі крыві чалавека, ліяфілізаваны парашок, ≥ 96% (электрафарэз у агарозным гелі) 3 мг, змяшаны з трыпсінам (1,5 мг), 4,0 М мачавінай (1 мл) і 0,2 М бікарбанатам амонія (1 мл). Раствор перамешвалі на працягу 10 хвілін і вытрымлівалі на вадзяной лазні пры тэмпературы 37°C на працягу 6 гадзін, затым гасілі 1 мл 0,1% TFA. Адфільтравалі раствор і захоўвалі пры тэмпературы ніжэй за 4°C.
Падзел сумесяў пептыдаў і трыпсінавых перавараў HSA ацэньвалі асобна на калонках PMP. Праверце падзел сумесі пептыдаў і трыпсінавых перавараў HSA на калонцы PMP і параўнайце вынікі з калонкай Ascentis Express RP-Amide. Тэарэтычны нумар пласціны разлічваецца наступным чынам:
На мал. 2 паказаны SEM-выявы голых часціц крэмнезёму і часціц крэмнезёму, звязаных з лігандамі. SEM-выявы голых часціц крэмнезёму (A, B) паказваюць, што, у адрозненне ад нашых папярэдніх даследаванняў, гэтыя часціцы маюць сферычную форму, выцягнутую або няправільную сіметрыю. Паверхня часціц крэмнезёму, звязаных з лігандамі (C, D), больш гладкая, чым паверхня голых часціц крэмнезёму, што можа быць звязана з пакрыццём паверхні часціц крэмнезёму ланцужкамі полістыролу.
Здымкі сканіруючага электроннага мікраскопа голых часціц крэмнезёму (A, B) і часціц крэмнезёму, звязаных з лігандамі (C, D).
Размеркаванне памераў часціц неапрацаванага дыяксіду крэмнію і часціц дыяксіду крэмнію, звязаных з лігандамі, паказана на малюнку 3(A). Крывыя размеркавання памераў часціц па аб'ёме паказалі, што памер часціц крэмнію павялічыўся пасля хімічнай мадыфікацыі (мал. 3A). Дадзеныя размеркавання памераў часціц крэмнію з бягучага і папярэдняга даследавання параўноўваюцца ў табліцы 1(A). Памер часціц PMP па аб'ёме, d(0,5), складае 3,36 мкм у параўнанні з нашым папярэднім даследаваннем са значэннем ad(0,5) 3,05 мкм (часціцы крэмнію, звязаныя з полістыролам)34. Гэтая партыя мела больш вузкае размеркаванне памераў часціц у параўнанні з нашым папярэднім даследаваннем з-за розных суадносін PEG, мачавіны, TMOS і воцатнай кіслаты ў рэакцыйнай сумесі. Памер часціц фазы PMP крыху большы, чым у фазы часціц крэмнію, звязанай з полістыролам, якую мы раней вывучалі. Гэта азначае, што павярхоўная функцыяналізацыя часціц крэмнію стыролам прывяла толькі да нанясення пласта полістыролу (0,97 мкм) на паверхню крэмнію, тады як у фазе PMP таўшчыня пласта складала... 1,38 мкм.
Размеркаванне памераў часціц (А) і размеркаванне памераў пор (В) чыстых часціц крэмнезёму і часціц крэмнезёму, звязаных з лігандамі.
Памер пор, аб'ём пор і плошча паверхні часціц крэмнезёму ў дадзеным даследаванні прыведзены ў Табліцы 1(B). Профілі PSD часціц крэмнезёму без утрымання лігандаў і часціц крэмнезёму, звязаных з лігандамі, паказаны на Малюнку 3(B). Вынікі параўнальныя з нашым папярэднім даследаваннем. Памеры пор часціц крэмнезёму без утрымання лігандаў і 241 складаюць адпаведна, што паказвае на памяншэнне памеру пор на 69 пасля хімічнай мадыфікацыі, як паказана ў Табліцы 1(B), а змена крывой паказана на Малюнку 3(B). Аналагічна, аб'ём пор часціц крэмнезёму паменшыўся з 0,67 да 0,58 см3/г пасля хімічнай мадыфікацыі. Удзельная плошча паверхні часціц крэмнезёму, якія даследуюцца ў цяперашні час, складае 116 м2/г, што параўнальна з нашым папярэднім даследаваннем (124 м2/г). Як паказана ў Табліцы 1(B), плошча паверхні (м2/г) часціц крэмнезёму таксама паменшылася са 116 м2/г да 105 м2/г пасля хімічнай апрацоўкі. мадыфікацыя.
Вынікі элементнага аналізу стацыянарнай фазы паказаны ў Табліцы 2. Утрыманне вугляроду ў бягучай стацыянарнай фазе складае 6,35%, што ніжэй за ўтрыманне вугляроду ў нашым папярэднім даследаванні (часціцы дыяксіду крэмнію, звязаныя з полістыролам, 7,93%35 і 10,21% адпаведна)42. Утрыманне вугляроду ў бягучай стацыянарнай фазе нізкае, паколькі пры падрыхтоўцы бягучага SP, акрамя стыролу, выкарыстоўваліся некаторыя палярныя ліганды, такія як фенілмалеімід-метылвінілізацыянат (PCMP) і 4-гідраксі-TEMPO. Масавы працэнт азоту ў бягучай стацыянарнай фазе складае 2,21% у параўнанні з 0,1735 і 0,85% па вазе азоту ў папярэдніх даследаваннях адпаведна. Гэта азначае, што масавы працэнт азоту ў бягучай стацыянарнай фазе вышэйшы з-за фенілмалеіміду. Аналагічна, утрыманне вугляроду ў прадуктах (4) і (5) складала 2,7% і 2,9% адпаведна, у той час як утрыманне вугляроду ў канчатковым прадукце (6) было 6,35%, як паказана ў Табліцы 2. Страта вагі была праверана з дапамогай стацыянарнай фазы PMP, і крывая TGA паказана на Малюнку 4. Крывая TGA паказвае страту вагі на 8,6%, што добра адпавядае нагрузцы вугляроду (6,35%), паколькі ліганды ўтрымліваюць не толькі C, але і N, O і H.
Для мадыфікацыі паверхні часціц крэмнезёму быў абраны ліганд фенілмалеімід-метылвінілізацыянат, паколькі ён мае палярныя фенілмалеімідныя групы і вінілізацыянатныя групы. Вінілізацыянатныя групы могуць далей рэагаваць са стыролам шляхам жывой радыкальнай палімерызацыі. Другая прычына - устаўка групы, якая мае ўмеранае ўзаемадзеянне з аналітам і не мае моцнага электрастатычнага ўзаемадзеяння паміж аналітам і нерухомай фазай, паколькі фенілмалеімідны фрагмент не мае віртуальнага зарада пры нармальным pH. Палярнасць нерухомай фазы можна кантраляваць аптымальнай колькасцю стыролу і часам рэакцыі свабоднарадыкальнай палімерызацыі. Апошні этап рэакцыі (свабоднарадыкальная палімерызацыя) мае вырашальнае значэнне і можа змяніць палярнасць нерухомай фазы. Быў праведзены элементны аналіз для праверкі вугляроднай загрузкі гэтых нерухомых фаз. Было заўважана, што павелічэнне колькасці стыролу і часу рэакцыі павялічвае вугляродную загрузку нерухомай фазы і наадварот. SP, падрыхтаваныя з рознымі канцэнтрацыямі стыролу, маюць розную вугляродную загрузку. Зноў жа, загрузіце гэтыя нерухомыя фазы ў калоны з нержавеючай сталі і праверце іх храматаграфічныя характарыстыкі (селектыўнасць, раздзяляльнасць, значэнне N, і г.д.). На падставе гэтых эксперыментаў была абрана аптымізаваная формула для падрыхтоўкі стацыянарнай фазы PMP, каб забяспечыць кантраляваную палярнасць і добрае ўтрыманне аналіту.
Пяць пептыдных сумесяў (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцын энкефалін) таксама былі ацэнены з выкарыстаннем калонкі PMP з выкарыстаннем рухомай фазы; 60/40 (аб./аб.) ацэтанітрыл/вада (0,1% TFA) пры хуткасці патоку 80 мкл/мін. Пры аптымальных умовах элюцыі тэарэтычная колькасць пласцін (N) на калонку (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) складае 20 000 ± 100 (200 000 пласцін/м²). У табліцы 3 прыведзены значэнні N для трох калонак PMP, а храматаграмы паказаны на малюнку 5A. Хуткі аналіз на калонцы PMP пры высокай хуткасці патоку (700 мкл/мін) прывёў да элюцыі пяці пептыдаў на працягу адной хвіліны, значэнні N былі вельмі добрымі, 13 500 ± 330 на калонку (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр), што адпавядае 135 000 пласцін/м² (малюнак 5B). Тры калонкі аднолькавага памеру (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) былі запоўнены трыма рознымі партыямі стацыянарнай фазы PMP для праверкі ўзнаўляльнасці. Канцэнтрацыя аналіту для кожнай калонкі была зарэгістравана з выкарыстаннем аптымальных умоў элюцыі і колькасці тэарэтычных талерак N і часу ўтрымання для падзелу адной і той жа тэставай сумесі на кожнай калонцы. Дадзеныя па ўзнаўляльнасці для калонак PMP паказаны ў табліцы 4. Узнаўляльнасць калонкі PMP добра карэлюе з вельмі нізкімі значэннямі %RSD, як паказана ў табліцы 3.
Падзел пептыднай сумесі на калонцы PMP (B) і калонцы Ascentis Express RP-Amide (A); рухомая фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), памеры калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр); аналітычны. Парадак элюіравання злучэнняў: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) і 5 (лейцынавая кіслата-энкефалін).
Калонка PMP (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) была ацэненая для падзелу трыпсічных пераварванняў сыроватачнага альбуміна чалавека ў высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі. Храматаграма на малюнку 6 паказвае, што ўзор добра падзелены, і раздзяляльная здольнасць вельмі добрая. Пераварванні HSA былі прааналізаваны з выкарыстаннем хуткасці патоку 100 мкл/мін, рухомай фазы 70/30 ацэтанітрыл/вада і 0,1% TFA. Як паказана на храматаграме (малюнак 6), пераварванне HSA было падзелена на 17 пікаў, якія адпавядаюць 17 пептыдам. Была разлічана эфектыўнасць падзелу кожнага піка ў пераварванні HSA, і значэнні прыведзены ў табліцы 5.
Трыптычны перавар HSA (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) быў аддзелены на калонцы PMP; хуткасць патоку (100 мкл/мін), рухомая фаза 60/40 ацэтанітрыл/вада з 0,1% TFA.
дзе L — даўжыня калоны, η — глейкасць рухомай фазы, ΔP — супрацьціск калоны, а u — лінейная хуткасць рухомай фазы. Пранікальнасць калоны PMP складала 2,5 × 10⁻¹⁴ м², хуткасць патоку — 25 мкл/мін, выкарыстоўвалася сумесь ACN/вада ў суадносінах 60/40 (аб'ём/аб'ём). Пранікальнасць калоны PMP (унутраны дыяметр 100 × 1,8 мм) была падобнай да пранікальнасці нашага папярэдняга даследавання (спасылка 34). Пранікальнасць калоны, запоўненай павярхоўна-сітаватымі часціцамі, складала: 1,7 × 10⁻¹⁴ для часціц памерам 1,3 мкм, 3,1 × 10⁻¹⁴ для часціц памерам 1,7 мкм, 5,2 × 10⁻¹⁴ і 2,5 × 10⁻¹⁴ м² для часціц памерам 2,6 мкм. Для часціц памерам 5 мкм (спасылка 43) пранікальнасць фазы PMP падобная да пранікальнасці часціц памерам 5 мкм.
дзе Wx — вага калоны, запоўненай хлараформам, Wy — вага калоны, запоўненай метанолам, а ρ — шчыльнасць растваральніка. Шчыльнасці метанолу (ρ = 0,7866) і хлараформу (ρ = 1,484). Агульная парыстасць калонак SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) 34 і калонак C18-Urea 31, якія мы раней вывучалі, складала 0,63 і 0,55 адпаведна. Гэта азначае, што прысутнасць лігандаў мачавіны зніжае пранікальнасць стацыянарнай фазы. З іншага боку, агульная парыстасць калоны PMP (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) складае 0,60. Пранікальнасць калонак PMP ніжэйшая, чым у калонак, запоўненых часціцамі крэмнезёму, звязанымі C18, таму што ў стацыянарных фазах тыпу C18 ліганды C18 прымацаваны да часціц крэмнезёму ў выглядзе лінейных ланцугоў, у той час як у стацыянарных фазах тыпу полістыролу вакол яго ўтвараецца адносна тоўсты палімерны пласт. У У тыповым эксперыменце парознасць калоны разлічваецца як:
На малюнках 7A,B паказаны калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) і Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) з выкарыстаннем аднолькавых умоў элюцыі (г.зн., 60/40 ACN/H2O і 0,1% TFA) графіка Ван-Дэемтэра. Абраныя сумесі пептыдаў (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцын-энкефалін) былі падрыхтаваны ў 20 мкл/мін. Мінімальная хуткасць патоку для абедзвюх калонак складала 800 мкл/мін. Мінімальныя значэнні HETP пры аптымальнай хуткасці патоку (80 мкл/мін) для калоны PMP і калоны Ascentis Express RP-Amide складалі 2,6 мкм і 3,9 мкм адпаведна. Значэнні HETP паказваюць, што эфектыўнасць падзелу калоны PMP (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр) значна лепшая, чым у камерцыйна даступнай калоны Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр). Графік Ван-Дэемтэра на мал. 7(A) паказвае, што зніжэнне значэння N з павелічэннем патоку не з'яўляецца значным у параўнанні з нашым папярэднім даследаваннем. Больш высокая эфектыўнасць падзелу калоны PMP (100 × 1,8 мм). ід) у параўнанні з калонкай Ascentis Express RP-Amide заснавана на паляпшэннях формы, памеру часціц і складаных працэдур упакоўкі калонкі, якія выкарыстоўваюцца ў бягучай працы34.
(A) Графік Ван-Дээмтэра (HETP у залежнасці ад лінейнай хуткасці рухомай фазы), атрыманы з выкарыстаннем калонкі PMP (100 × 1,8 мм унутры дыяметра) у 60/40 ACN/H2O з 0,1% TFA. (B) Графік Ван-Дээмтэра (HETP у залежнасці ад лінейнай хуткасці рухомай фазы), атрыманы з выкарыстаннем калонкі Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм унутры дыяметра) у 60/40 ACN/H2O з 0,1% TFA.
Палярна ўбудаваная стацыянарная фаза з полістыролу была падрыхтавана і ацэнена для падзелу сінтэтычных пептыдных сумесяў і трыпсінавых пераварванняў сыроватачнага альбуміна чалавека (HAS) у высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі. Храматаграфічныя характарыстыкі калонак PMP для пептыдных сумесяў выдатныя па эфектыўнасці падзелу і раздзяляльнай здольнасці. Палепшаная эфектыўнасць падзелу калонак PMP абумоўлена рознымі прычынамі, такімі як памер часціц і памер пор часціц крэмнезёму, кантраляваны сінтэз стацыянарнай фазы і складаная ўпакоўка калоны. Акрамя высокай эфектыўнасці падзелу, нізкі супрацьціск у калоне пры высокіх хуткасцях патоку з'яўляецца яшчэ адной перавагай гэтай стацыянарнай фазы. Калоны PMP дэманструюць добрую ўзнаўляльнасць і могуць быць выкарыстаны для аналізу пептыдных сумесяў і трыпсінавай пераваркі розных бялкоў. Мы маем намер выкарыстоўваць гэтую калону для падзелу натуральных прадуктаў, біялагічна актыўных злучэнняў з лекавых раслін і грыбных экстрактаў у вадкаснай храматаграфіі. У будучыні калоны PMP таксама будуць ацэнены для падзелу бялкоў і моноклональных антыцелаў.
Філд, Дж. К., Эўэрбі, М. Р., Лау, Дж., Тэгерсен, Х. і Петэрсан, П. Даследаванне сістэм падзелу пептыдаў метадам храматаграфіі з адваротнай фазай. Частка I: Распрацоўка пратаколу характарыстыкі калонкі. J. ​​Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. і інш. Палепшаныя актыўныя пептыды, прызначаныя для лячэння інфекцыйных захворванняў. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Вліге, П., Лісоўскі, В., Марцінес, Дж. і Хрэсчаціцкі, М. Сінтэтычныя тэрапеўтычныя пептыды: навука і рынак. Адкрыццё лекаў. 15 (1-2) сёння, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Се, Ф., Сміт, Р. Д. і Шэн, Ю. Пашыраная пратэомная вадкасная храматаграфія. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Пашыраная вадкасная храматаграфія-мас-спектрометрыя дазваляе ўключаць шырока накіраваныя метабаломічныя і пратэомічныя даследаванні. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чэснат, С.М. і Солсберы, Дж.Дж. Роля звышвысокапрадукцыйнай вадкаснай хроматографіі (UHPLC) у распрацоўцы лекаў. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. і Клаўзен, А. М. Фундаментальныя і практычныя аспекты вадкаснай храматаграфіі звышвысокага ціску для хуткага падзелу. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рэн, С.А. і Чэлічэф, П. Ужыванне звышвысокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі ў распрацоўцы лекаў. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. і інш. Маналітныя макрапорыстыя гідрагелі, падрыхтаваныя з эмульсій з высокім утрыманнем унутранай фазы тыпу «алей у вадзе» для эфектыўнай ачысткі энтэравірусаў. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Шы, Ю., Сян, Р., Хорват, К. і Уілкінс, Дж. А. Роля вадкаснай храматаграфіі ў пратэоміцы. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекетэ, С., Вёйтэй, Ж.-Л. і Гіларм, Д. Новыя тэндэнцыі ў падзеле тэрапеўтычных пептыдаў і бялкоў з дапамогай вадкаснай храматаграфіі з адваротнай фазай: тэорыя і прымяненне. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Гілар, М., Олівава, П., Дэйлі, А.Е. і Геблер, Дж.К. Двухмернае падзел пептыдаў з выкарыстаннем сістэмы RP-RP-HPLC з выкарыстаннем розных значэнняў pH у першым і другім вымярэннях падзелу. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетці, С. і інш. Былі даследаваны характарыстыкі масапераносу і кінетычныя характарыстыкі высокаэфектыўных храматаграфічных калонак, запоўненых цалкам і павярхоўна порыстымі часціцамі C18 памерам менш за 2 мкм. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Піовесана, С. і інш. Апошнія тэндэнцыі і аналітычныя праблемы ў выдзяленні, ідэнтыфікацыі і валідацыі раслінных біялагічна актыўных пептыдаў. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюлер, Дж. Б. і інш. Пратэомны ландшафт царства жыцця. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДэЛука, К. і інш. Далейшая апрацоўка тэрапеўтычных пептыдаў метадам прэпаратыўнай вадкаснай храматаграфіі. Molecule (Базель, Швейцарыя) 26(15), 4688(2021).
Ян, Ю. і Гэн, Х. Змяшаная храматаграфія і яе прымяненне да біяпалімераў. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. і Sun, Y. Ліганды для змешанай храматаграфіі бялкоў: прынцып, характарыстыка і распрацоўка. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).