Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка за CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да изключите режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще показваме сайта без стилове и JavaScript.
Порести силициеви частици бяха получени чрез зол-гел метод с някои модификации за получаване на макропорести частици. Тези частици бяха дериватизирани чрез обратима адиционно-фрагментационна верижна трансферна (RAFT) полимеризация с N-фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PMI) и стирен за получаване на стационарна фаза с N-фенилмалеимидна интеркалация на полистирен (PMP). Колони от неръждаема стомана с тесен отвор (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) бяха пълни чрез суспензионно пълнене. Оценено е разделянето на PMP колона на пептидна смес, състояща се от пет пептида (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, левцин енкефалин), хроматографска производителност и трипсиново разграждане на човешки серумен албумин (HAS). При оптимални условия на елуиране, теоретичният брой на плаките на пептидната смес е до 280 000 плаки/m². Сравняване на производителността на разделяне на разработената колона с търговската Ascentis Express. RP-амидна колона, беше наблюдавано, че разделителната ефективност на PMP колоната е по-добра от търговската колона по отношение на ефективност на разделяне и разделителна способност.
През последните години биофармацевтичната индустрия се превърна в разрастващ се глобален пазар със значително увеличение на пазарния дял. С експлозивния растеж на биофармацевтичната индустрия1,2,3, анализът на пептиди и протеини е силно желан. В допълнение към целевия пептид, по време на синтеза на пептиди се генерират няколко примеса, което изисква хроматографско пречистване, за да се получат пептиди с желаната чистота. Анализът и характеризирането на протеини в телесни течности, тъкани и клетки е изключително трудна задача поради големия брой потенциално откриваеми видове в една проба. Въпреки че масспектрометрията е ефективен инструмент за секвениране на пептиди и протеини, ако такива проби се инжектират в масспектрометъра наведнъж, разделянето няма да бъде идеално. Този проблем може да бъде смекчен чрез прилагане на течно-хроматографско (LC) разделяне преди MS анализа, което ще намали броя на аналитите, влизащи в масспектрометъра в даден момент4,5,6. Освен това, по време на течнофазово разделяне, аналитите могат да бъдат фокусирани в тесни области, като по този начин се концентрират тези аналити и се подобрява чувствителността на MS откриване. Течната хроматография (LC) се е развила значително през последното десетилетие и се е превърнала в популярна техника в... протеомен анализ7,8,9,10.
Течната хроматография с обратна фаза (RP-LC) се използва широко за пречистване и разделяне на пептидни смеси, като се използва октадецил-модифициран силициев диоксид (ODS) като стационарна фаза11,12,13. RP стационарните фази обаче не осигуряват задоволително разделяне на пептиди и протеини поради тяхната сложна структура и амфифилна природа14,15. Следователно, са необходими специално проектирани стационарни фази за анализ на пептиди и протеини с полярни и неполярни групи, които да взаимодействат с тези аналити и да ги задържат16. Смесената хроматография, която осигурява мултимодални взаимодействия, може да бъде алтернатива на RP-LC за разделяне на пептиди, протеини и други сложни смеси. Приготвени са няколко стационарни фази със смесен режим и колони, пълни с тези фази, са използвани за разделяне на пептиди и протеини17,18,19,20,21. Смесените стационарни фази (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярна интеркалация/RPLC) са подходящи за разделяне на пептиди и протеини поради наличието както на полярни, така и на неполярни... групи22,23,24,25,26,27,28. По подобен начин, полярните интеркалиращи стационарни фази с ковалентно свързани полярни групи показват добра разделителна способност и уникална селективност за полярни и неполярни аналити, тъй като разделянето зависи от взаимодействието между аналита и стационарната фаза. Мултимодални взаимодействия 29, 30, 31, 32. Наскоро Zhang et al. 30 приготвиха додецил-терминирана полиаминова стационарна фаза и успешно разделиха въглеводороди, антидепресанти, флавоноиди, нуклеозиди, естрогени и няколко други аналита. Полярният интеркалатор има както полярни, така и неполярни групи, така че може да се използва за разделяне на пептиди и протеини, които имат както хидрофобни, така и хидрофилни части. Полярно вградени колони (напр. амидно вградени C18 колони) се предлагат в търговската мрежа под търговското наименование Ascentis Express RP-Amide колони, но тези колони се използват само за анализ на амин 33.
В настоящото проучване е приготвена и оценена полярно вградена стационарна фаза (полистирен, вграден в N-фенилмалеимид) за разделяне на пептиди и трипсинови разгради на HSA. Стационарната фаза е приготвена, използвайки следната стратегия. Порести силициеви частици са приготвени съгласно процедурата, дадена в предишната ни публикация, с някои модификации в протокола за приготвяне. Съотношението на урея, полиетиленгликол (PEG), TMOS, вода и оцетна киселина е коригирано, за да се получат силициеви частици с голям размер на порите. Второ, нов лиганд, фенилмалеимид-метил винил изоцианат, е синтезиран и използван за дериватизиране на силициеви частици за приготвяне на полярно вградена стационарна фаза. Получената стационарна фаза е запълнена в колона от неръждаема стомана (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър), използвайки оптимизирана схема за запълване. Запълването на колоната е подпомогнато с механични вибрации, за да се осигури образуването на хомогенен слой в колоната. Оценка на разделянето на пептидни смеси, състоящи се от пет пептида, в запълнена колона; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Левцин енкефалин) и трипсинов дайджест на човешки серумен албумин (HAS). Наблюдава се, че пептидната смес и трипсиновият дайджест на HSA се разделят с добра разделителна способност и ефективност. Разделянето на PMP колоната е сравнено с това на Ascentis Express RP-Amide колоната. Наблюдава се, че както пептидите, така и протеините са добре разделени и ефективни в PMP колоната, която е по-ефективна от Ascentis Express RP-Amide колоната.
PEG (полиетиленгликол), урея, оцетна киселина, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлоросилан (TMCS), трипсин, човешки серумен албумин (HSA), амониев хлорид, урея, хексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоил хлорид (MC), стирен, 4-хидрокси-TEMPO, бензоил пероксид (BPO), ацетонитрил (ACN) с HPLC клас, метанол, 2-пропанол и ацетон, закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).
Смес от урея (8 g), полиетиленгликол (8 g) и 8 mL 0.01 N оцетна киселина се разбърква в продължение на 10 минути, след което към нея се добавят 24 mL TMOS при леденостудени условия. Реакционната смес се нагрява при 40°C в продължение на 6 часа и след това при 120°C в продължение на 8 часа в автоклав от неръждаема стомана. Водата се излива и остатъчният материал се суши при 70°C в продължение на 12 часа. Изсушената мека маса се смила гладко в пещ и се калцинира при 550°C в продължение на 12 часа. Приготвят се и се характеризират три партиди, за да се изследва възпроизводимостта на размера на частиците, размера на порите и повърхностната площ.
Чрез повърхностна модификация на силициеви частици с предварително синтезиран лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP), последвана от радиална полимеризация със стирен, беше получено съединение, съдържащо полярна група. Стационарна фаза за агрегати и полистиролови вериги. Процесът на получаване е описан по-долу.
N-фенилмалеимид (200 mg) и метил винил изоцианат (100 mg) бяха разтворени в сух толуен и 0,1 mL 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) беше добавен към реакционната колба за получаване на фенилмалеимид-метил винил изоцианат съполимер (PMCP). Сместа беше нагрята при 60°C в продължение на 3 часа, филтрирана и изсушена в сушилня при 40°C в продължение на 3 часа.
Изсушени силициеви частици (2 g) се диспергират в сух толуен (100 mL), разбъркват се и се обработват с ултразвук в 500 mL колба с кръгло дъно в продължение на 10 минути. PMCP (10 mg) се разтваря в толуен и се добавя на капки към реакционната колба през фуния за капки. Сместа се нагрява под обратен хладник при 100°C в продължение на 8 часа, филтрира се, промива се с ацетон и се суши при 60°C в продължение на 3 часа. След това, PMCP-свързани силициеви частици (100 g) се разтварят в толуен (200 ml) и се добавя 4-хидрокси-TEMPO (2 mL) в присъствието на 100 µL дибутилкалаен дилаурат като катализатор. Сместа се разбърква при 50°C в продължение на 8 часа, филтрира се и се суши при 50°C в продължение на 3 часа.
Стирен (1 mL), бензоил пероксид BPO (0.5 mL) и TEMPO-PMCP-прикрепени силициеви частици (1.5 g) бяха диспергирани в толуен и продухани с азот. Полимеризацията на стирена беше проведена при 100°C в продължение на 12 часа. Полученият продукт беше промит с метанол и изсушен при 60°C в продължение на една нощ. Цялостната реакционна схема е показана на Фигура 1.
Пробите бяха дегазирани при 393 K за 1 час, за да се получи остатъчно налягане по-малко от 10-3 Torr. Количеството N2, адсорбирано при относително налягане P/P0 = 0.99, беше използвано за определяне на общия обем на порите. Морфологията на голите и лиганд-свързаните силициеви частици беше изследвана със сканираща електронна микроскопия (Hitachi High Technologies, Токио, Япония). Изсушените проби (голи силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици) бяха поставени върху алуминиева колона с помощта на самозалепваща се въглеродна лента. Злато беше нанесено върху пробите с помощта на разпрашително покритие Q150T и върху тях беше отложен 5 nm слой Au. Това подобрява ефективността на процеса при използване на ниски напрежения и осигурява финозърнесто студено разпрашване. За елементен анализ беше използван елементен анализатор Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. За получаване на разпределението на размера на частиците беше използван анализатор на размера на частиците Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Голи силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици (5 mg (всеки) бяха диспергирани в 5 mL изопропанол, обработени с ултразвук в продължение на 10 минути, разбъркани на вортекс в продължение на 5 минути и поставени върху оптичната пейка на Mastersizer. Термогравиметричният анализ беше извършен със скорост 5 °C в минута в температурен диапазон от 30 до 800 °C.
Колони от неръждаема стомана с тесен отвор и стъклена облицовка с размери (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) бяха запълнени с помощта на метода на суспензионно запълване, прилагайки същата процедура, използвана в Ref. 31. Колона от неръждаема стомана (с стъклена облицовка, 100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) с изходен фитинг, съдържащ фрита с размер 1 µm, беше свързана към суспензионен пакер (Alltech Deerfield, IL, USA). Пригответе суспензия от стационарна фаза, като суспендирате 150 mg стационарна фаза в 1,2 mL метанол и я изпратите в колоната за съхранение. Метанолът беше използван като разтворител за суспензията, както и като пропелент. Напълнете колоната последователно, като прилагате налягане от 100 MP за 10 минути, 80 MP за 15 минути и 60 MP за 30 минути. По време на пълненето бяха приложени механични вибрации с две GC клатачки за колони (Alltech, Deerfield, IL, USA), за да се осигури равномерно пълнене на колоната. Затворете суспензионния пакер и бавно освободете налягането, за да предотвратите повреди в колоната. Разкачете колоната от устройството за пълнене на суспензия и свържете друг фитинг към входа и към LC системата, за да проверите нейната работа.
Конструирани са LC помпа (10AD Shimadzu, Япония), инжектор (Valco (САЩ) C14 W.05) с 50nL инжекционен контур, мембранен дегазатор (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капилярен прозорец. Използвани са специално µLC устройство за детектор (UV-2075) и микроколони със стъклена облицовка. Използвани са много тесни и къси свързващи тръби, за да се сведе до минимум ефектът от допълнителното разширяване на лентата на колоната. След опаковане, на изхода 1/16″ на редукционния съединител са инсталирани капиляри (50 μm вътре в диаметър 365) и капиляри на редукционния съединител (50 μm). Събирането на данни и хроматографската обработка са извършени с помощта на софтуера Multichro 2000. Мониторинг при 254 nm. Анализираните вещества са тествани за UV абсорбция. Хроматографските данни са анализирани с OriginPro8 (Нортхамптън, Масачузетс).
Албумин от човешки серум, лиофилизиран прах, ≥ 96% (електрофореза в агарозен гел) 3 mg, смесен с трипсин (1,5 mg), 4,0 M урея (1 mL) и 0,2 M амониев бикарбонат (1 mL). Разтворът се разбърква в продължение на 10 минути и се държи във водна баня при 37°C в продължение на 6 часа, след което се гаси с 1 mL 0,1% TFA. Разтворът се филтрира и се съхранява под 4°C.
Разделянето на пептидни смеси и трипсинови разгради на HSA беше оценено отделно на PMP колони. Проверете разделянето на пептидната смес и трипсиновия разгради на HSA от PMP колоната и сравнете резултатите с колоната Ascentis Express RP-Amide. Теоретичният брой на плаките се изчислява, както следва:
SEM изображения на голи силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици са показани на Фиг. 2. SEM изображения на голи силициеви частици (A, B) показват, че за разлика от предишните ни изследвания, тези частици са сферични, като частиците са удължени или имат неправилна симетрия. Повърхността на лиганд-свързаните силициеви частици (C, D) е по-гладка от тази на голите силициеви частици, което може да се дължи на покритието от полистиролови вериги върху повърхността на силициевите частици.
Изображения от сканиращ електронен микроскоп на голи силициеви частици (A, B) и лиганд-свързани силициеви частици (C, D).
Разпределението на размера на частиците на голите силициеви частици и лиганд-свързаните силициеви частици е показано на Фигура 3(A). Кривите на разпределението на размера на частиците, базирани на обем, показват, че размерът на силициевите частици се е увеличил след химическа модификация (Фиг. 3A). Данните за разпределението на размера на частиците на силициевите частици от настоящото изследване и предишното изследване са сравнени в Таблица 1(A). Размерът на частиците, базиран на обем, d(0.5), на PMP е 3.36 μm, в сравнение с предишното ни изследване със стойност на ad(0.5) от 3.05 μm (полистирен-свързани силициеви частици)34. Тази партида има по-тясно разпределение на размера на частиците в сравнение с предишното ни изследване поради различните съотношения на PEG, урея, TMOS и оцетна киселина в реакционната смес. Размерът на частиците на PMP фазата е малко по-голям от този на полистирен-свързаната силициева фаза, която изследвахме преди това. Това означава, че повърхностната функционализация на силициеви частици със стирен е отложила само полистиренов слой (0.97 µm) върху повърхността на силициевия диоксид, докато във фазата PMP дебелината на слоя е била... 1,38 µm.
Разпределение на размера на частиците (A) и разпределение на размера на порите (B) на голи силициеви частици и лиганд-свързани силициеви частици.
Размерът на порите, обемът на порите и повърхностната площ на силициевите частици от настоящото изследване са дадени в Таблица 1(B). PSD профилите на голите силициеви частици и лиганд-свързаните силициеви частици са показани на Фигура 3(B). Резултатите са сравними с предишното ни изследване. Размерите на порите на голите и лиганд-свързаните силициеви частици са съответно 310 и 241, което показва, че размерът на порите намалява с 69 след химическа модификация, както е показано в Таблица 1(B), а промяната на кривата е показана на Фиг. 3(B). По подобен начин обемът на порите на силициевите частици намалява от 0,67 на 0,58 cm3/g след химическа модификация. Специфичната повърхност на изследваните в момента силициеви частици е 116 m2/g, което е сравнимо с предишното ни изследване (124 m2/g). Както е показано в Таблица 1(B), повърхностната площ (m2/g) на силициевите частици също намалява от 116 m2/g на 105 m2/g след химическа модификация. модификация.
Резултатите от елементния анализ на стационарната фаза са показани в Таблица 2. Въглеродното съдържание на настоящата стационарна фаза е 6,35%, което е по-ниско от въглеродното съдържание на предишното ни проучване (полистирен-свързани силициеви частици, съответно 7,93%35 и 10,21%)42. Въглеродното съдържание на настоящата стационарна фаза е ниско, тъй като при приготвянето на настоящия SP, освен стирен, са използвани някои полярни лиганди като фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) и 4-хидрокси-TEMPO. Тегловният процент азот в настоящата стационарна фаза е 2,21%, в сравнение с 0,1735 и 0,85 тегловни% азот в предишни проучвания, съответно. Това означава, че тегловният процент азот е по-висок в настоящата стационарна фаза поради фенилмалеимида. По подобен начин въглеродните натоварвания на продукти (4) и (5) са съответно 2,7% и 2,9%, докато въглеродното съдържание на крайния продукт (6) е... 6,35%, както е показано в Таблица 2. Загубата на тегло е проверена със стационарна фаза PMP, а TGA кривата е показана на Фигура 4. TGA кривата показва загуба на тегло от 8,6%, което е в добро съответствие с въглеродното натоварване (6,35%), тъй като лигандите съдържат не само C, но и N, O и H.
Фенилмалеимид-метилвинилизоцианатният лиганд е избран за повърхностна модификация на силициеви частици, защото има полярни фенилмалеимидни групи и винилизоцианатни групи. Винил изоцианатните групи могат допълнително да реагират със стирен чрез жива радикалова полимеризация. Втората причина е да се вмъкне група, която има умерено взаимодействие с аналита и няма силно електростатично взаимодействие между аналита и стационарната фаза, тъй като фенилмалеимидната част няма виртуален заряд при нормално pH. Полярността на стационарната фаза може да се контролира чрез оптималното количество стирен и времето за реакция на свободната радикалова полимеризация. Последната стъпка от реакцията (свободна радикалова полимеризация) е критична и може да промени полярността на стационарната фаза. Извършен е елементарен анализ, за ​​да се провери въглеродното натоварване на тези стационарни фази. Наблюдавано е, че увеличаването на количеството стирен и времето за реакция увеличава въглеродното натоварване на стационарната фаза и обратно. SP, приготвени с различни концентрации на стирен, имат различно въглеродно натоварване. Отново, заредете тези стационарни фази в колони от неръждаема стомана и проверете техните хроматографски характеристики (селективност, разделителна способност, N2 стойност, и др.). Въз основа на тези експерименти беше избрана оптимизирана формула за приготвяне на стационарната фаза на PMP, за да се осигури контролирана полярност и добро задържане на аналита.
Пет пептидни смеси (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, левцин енкефалин) също бяха оценени с помощта на PMP колона с мобилна фаза; 60/40 (v/v) ацетонитрил/вода (0,1% TFA) при скорост на потока 80 μL/min. При оптимални условия на елуиране, теоретичният брой плаки (N) на колона (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) е 20 000 ± 100 (200 000 плаки/m²). Таблица 3 дава стойностите на N за трите PMP колони, а хроматограмите са показани на Фигура 5A. Бърз анализ на PMP колона при висока скорост на потока (700 μL/min), пет пептида са елуирани в рамките на една минута, стойностите на N са много добри, 13 500 ± 330 на колона (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър), което съответства на 135 000 плаки/m² (Фигура 5B). Три колони с еднакъв размер (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) са запълнени с три различни партиди стационарна фаза на PMP, за да се провери възпроизводимостта. Концентрацията на аналита за всяка колона беше записана, като се използваха оптималните условия на елуиране и броят на теоретичните плаки N и времето на задържане за разделяне на същата тестова смес във всяка колона. Данните за възпроизводимост за PMP колоните са показани в Таблица 4. Възпроизводимостта на PMP колоната корелира добре с много ниски стойности на %RSD, както е показано в Таблица 3.
Разделяне на пептидната смес на PMP колона (B) и Ascentis Express RP-Amide колона (A); мобилна фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), размери на PMP колоната (100 × 1.8 mm вътрешен диаметър); аналитичен. Редът на елуиране на съединенията: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(левцин) киселинен енкефалин).
PMP колона (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) беше оценена за разделяне на триптични разграждания на човешки серумен албумин във високоефективна течна хроматография. Хроматограмата на Фигура 6 показва, че пробата е добре разделена и разделителната способност е много добра. Разгражданията на HSA бяха анализирани с помощта на скорост на потока от 100 µL/min, мобилна фаза 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% TFA. Както е показано на хроматограмата (Фигура 6), разграждането на HSA е разделено на 17 пика, съответстващи на 17 пептида. Ефективността на разделяне на всеки пик в разграждането на HSA беше изчислена и стойностите са дадени в Таблица 5.
Триптичен дайджест на HSA (100 × 1.8 mm вътрешен диаметър) беше разделен на PMP колона; скорост на потока (100 µL/min), мобилна фаза 60/40 ацетонитрил/вода с 0.1% TFA.
където L е дължината на колоната, η е вискозитетът на подвижната фаза, ΔP е обратното налягане на колоната и u е линейната скорост на подвижната фаза. Пропускливостта на PMP колоната е 2,5 × 10-14 m2, дебитът е 25 μL/min и е използвана смес ACN/вода в съотношение 60/40 v/v. Пропускливостта на PMP колоната (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) е подобна на тази от предишното ни проучване, Ref.34. Пропускливостта на колоната, запълнена с повърхностно порести частици, е: 1,7 × 10-15 за частици с размер 1,3 μm, 3,1 × 10-15 за частици с размер 1,7 μm, 5,2 × 10-15 и 2,5 × 10-14 m2 за частици с размер 2,6 μm. За частици с размер 5 μm 43. Следователно, пропускливостта на PMP фазата е подобна на тази на частиците с размер ядро-обвивка от 5 μm.
където Wx е теглото на колоната, запълнена с хлороформ, Wy е теглото на колоната, запълнена с метанол, а ρ е плътността на разтворителя. Плътностите на метанола (ρ = 0,7866) и хлороформа (ρ = 1,484). Общата порьозност на колоните SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) 34 и колоните C18-Urea 31, които изследвахме преди това, е съответно 0,63 и 0,55. Това означава, че наличието на урея лиганди намалява пропускливостта на стационарната фаза. От друга страна, общата порьозност на PMP колоната (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) е 0,60. Пропускливостта на PMP колоните е по-ниска от тази на колоните, запълнени със силициеви частици, свързани с C18, тъй като в стационарните фази от тип C18 лигандите са прикрепени към силициевите частици като линейни вериги, докато в стационарните фази от тип полистирол около него се образува относително дебел полимерен слой. В В типичен експеримент порьозността на колоната се изчислява като:
Фигура 7A,B показват PMP колоната (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) и Ascentis Express RP-Amide колоната (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър), използвайки същите условия на елуиране (т.е. 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA). ) от графиката на ван Деемтер. Избрани пептидни смеси (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) бяха приготвени в 20 µL/мин. Минималният дебит и за двете колони е 800 µL/мин. Минималните стойности на HETP при оптимален дебит (80 µL/мин) за PMP колоната и Ascentis Express RP-Amide колоната бяха съответно 2,6 µm и 3,9 µm. Стойностите на HETP показват, че ефективността на разделяне на PMP колоната (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) е много по-добра от тази на наличната в търговската мрежа Ascentis Express RP-Amide колона (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър). Диаграмата на ван Деемтер на Фиг. 7(A) показва, че намаляването на стойността на N с увеличаване на потока не е значително в сравнение с предишното ни проучване. По-високата ефективност на разделяне на PMP колоната (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър)... id) в сравнение с колоната Ascentis Express RP-Amide се основава на подобрения във формата, размера на частиците и сложните процедури за пълнене на колоната, използвани в настоящата работа34.
(A) Диаграма на ван Дьомтер (HETP спрямо линейната скорост на подвижната фаза), получена с помощта на PMP колона (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) в 60/40 ACN/H2O с 0,1% TFA. (B) Диаграма на ван Дьомтер (HETP спрямо линейната скорост на подвижната фаза), получена с помощта на Ascentis Express RP-Amide колона (100 × 1,8 mm вътрешен диаметър) в 60/40 ACN/H2O с 0,1% TFA.
Полярно вградена стационарна фаза от полистирен беше приготвена и оценена за разделяне на синтетични пептидни смеси и трипсинови разграждания на човешки серумен албумин (HAS) във високоефективна течна хроматография. Хроматографските характеристики на PMP колоните за пептидни смеси са отлични по отношение на ефективност на разделяне и разделителна способност. Подобрената ефективност на разделяне на PMP колоните се дължи на различни причини, като например размера на частиците и размера на порите на силициевите частици, контролирания синтез на стационарната фаза и сложното пълнене на колоната. В допълнение към високата ефективност на разделяне, ниското обратно налягане в колоната при високи скорости на потока е друго предимство на тази стационарна фаза. PMP колоните показват добра възпроизводимост и могат да се използват за анализ на пептидни смеси и трипсиново разграждане на различни протеини. Възнамеряваме да използваме тази колона за разделяне на природни продукти, биоактивни съединения от лечебни растения и гъбични екстракти в течна хроматография. В бъдеще PMP колоните ще бъдат оценявани и за разделяне на протеини и моноклонални антитела.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Изследване на системи за разделяне на пептиди чрез хроматография с обратна фаза, част I: Разработване на протокол за характеризиране на колона. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Подобрени активни пептиди, предназначени за лечение на инфекциозни заболявания. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиге, П., Лисовски, В., Мартинес, Й. и Хрестчатиски, М. Синтетични терапевтични пептиди: наука и пазар. Откриване на лекарства. 15 (1-2) днес, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Усъвършенствана протеомна течна хроматография. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Усъвършенстваната течна хроматография-масспектрометрия позволява включването на широко насочени метаболомични и протеомични методи. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснут, С. М. и Солсбъри, Дж. Дж. Ролята на UHPLC в разработването на лекарства. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Фундаментални и практически аспекти на течната хроматография при свръхвисоко налягане за бързо разделяне. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Приложение на ултрависокоефективна течна хроматография в разработването на лекарства. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Монолитни макропорести хидрогелове, приготвени от емулсии масло-във-вода с висока вътрешна фаза за ефективно пречистване на ентеровируси. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ролята на течната хроматография в протеомиката. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Възникващи тенденции в разделянето на терапевтични пептиди и протеини чрез течна хроматография с обратна фаза: теория и приложения. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, А.Е. и Геблер, Дж.К. Двуизмерно разделяне на пептиди с помощта на RP-RP-HPLC система, използваща различни стойности на pH в първото и второто измерение на разделяне. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Изследвани са характеристиките на масопреноса и кинетичните характеристики на високоефективни хроматографски колони, запълнени с напълно и повърхностно порести частици C18 под 2 μm. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Последни тенденции и аналитични предизвикателства при изолирането, идентифицирането и валидирането на растителни биоактивни пептиди. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюлер, Дж. Б. и др. Протеомният пейзаж на царството на живота. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Обработка на терапевтични пептиди чрез препаративна течна хроматография. Molecule (Базел, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Смесена хроматография и нейното приложение към биополимери. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Лиганди за смесена протеинова хроматография: принцип, характеризиране и дизайн. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).