از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
ذرات سیلیس متخلخل با روش سل-ژل و با اعمال برخی اصلاحات برای دستیابی به ذرات ماکرومتخلخل تهیه شدند. این ذرات با پلیمریزاسیون انتقال زنجیره قطعه قطعه شدن افزایشی برگشت‌پذیر (RAFT) با N-فنیل مالیمید-متیل وینیل ایزوسیانات (PMI) و استایرن مشتق شدند تا N-فنیل مالیمید بین لایه‌ای از فاز ساکن پلی استایرن (PMP) تهیه شود. ستون‌های باریک از جنس فولاد ضد زنگ (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) با روش بسته‌بندی دوغابی بسته‌بندی شدند. جداسازی ستون PMP از مخلوط پپتیدی متشکل از پنج پپتید (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، لوسین انکفالین) و هضم تریپسین آلبومین سرم انسانی (HAS) ارزیابی شد. تحت شرایط بهینه شستشو، تعداد صفحات نظری مخلوط پپتیدی به 280000 می‌رسد. صفحات/متر مربع. با مقایسه عملکرد جداسازی ستون توسعه‌یافته با ستون تجاری Ascentis Express RP-Amide، مشاهده شد که عملکرد جداسازی ستون PMP از نظر راندمان جداسازی و وضوح، برتر از ستون تجاری است.
در سال‌های اخیر، صنعت زیست‌دارو به یک بازار جهانی در حال گسترش با افزایش قابل توجه سهم بازار تبدیل شده است. با رشد انفجاری صنعت زیست‌دارو1،2،3، تجزیه و تحلیل پپتیدها و پروتئین‌ها بسیار مورد توجه است. علاوه بر پپتید هدف، ناخالصی‌های متعددی در طول سنتز پپتید تولید می‌شوند، بنابراین برای به دست آوردن پپتیدهایی با خلوص مطلوب، نیاز به خالص‌سازی کروماتوگرافی است. تجزیه و تحلیل و توصیف پروتئین‌ها در مایعات بدن، بافت‌ها و سلول‌ها به دلیل تعداد زیاد گونه‌های بالقوه قابل تشخیص در یک نمونه واحد، یک کار بسیار چالش برانگیز است. اگرچه طیف‌سنجی جرمی ابزاری مؤثر برای تعیین توالی پپتید و پروتئین است، اما اگر چنین نمونه‌هایی در یک پاس به طیف‌سنج جرمی تزریق شوند، جداسازی ایده‌آل نخواهد بود. این مشکل را می‌توان با اجرای جداسازی‌های کروماتوگرافی مایع (LC) قبل از تجزیه و تحلیل MS کاهش داد، که تعداد آنالیت‌های ورودی به طیف‌سنج جرمی را در یک زمان معین کاهش می‌دهد4،5،6. علاوه بر این، در طول جداسازی فاز مایع، آنالیت‌ها را می‌توان در مناطق باریک متمرکز کرد، در نتیجه این آنالیت‌ها را متمرکز کرده و تشخیص MS را بهبود می‌بخشد. حساسیت. کروماتوگرافی مایع (LC) در طول دهه گذشته پیشرفت قابل توجهی داشته و به یک تکنیک محبوب در تجزیه و تحلیل پروتئوم تبدیل شده است7،8،9،10.
کروماتوگرافی مایع فاز معکوس (RP-LC) به طور گسترده برای خالص‌سازی و جداسازی مخلوط‌های پپتیدی با استفاده از سیلیکای اصلاح‌شده با اکتادسیل (ODS) به عنوان فاز ساکن استفاده می‌شود11،12،13. با این حال، فازهای ساکن RP به دلیل ساختار پیچیده و ماهیت آمفی‌فیلیک خود، جداسازی رضایت‌بخشی از پپتیدها و پروتئین‌ها ارائه نمی‌دهند14،15. بنابراین، برای تجزیه و تحلیل پپتیدها و پروتئین‌ها با بخش‌های قطبی و غیرقطبی برای تعامل و حفظ این آنالیت‌ها، به فازهای ساکن با طراحی ویژه نیاز است16. کروماتوگرافی حالت مختلط، که تعاملات چندوجهی را فراهم می‌کند، می‌تواند جایگزینی برای RP-LC برای جداسازی پپتیدها، پروتئین‌ها و سایر مخلوط‌های پیچیده باشد. چندین فاز ساکن حالت مختلط تهیه شده است و ستون‌های پر شده با این فازها برای جداسازی پپتید و پروتئین استفاده شده‌اند17،18،19،20،21. فازهای ساکن حالت مختلط (WAX/RPLC، HILIC/RPLC، قطبی (روش‌های میان‌لایه‌ای/RPLC) به دلیل وجود گروه‌های قطبی و غیرقطبی برای جداسازی پپتید و پروتئین مناسب هستند22،23،24،25،26،27،28. به طور مشابه، فازهای ساکن میان‌لایه‌ای قطبی با گروه‌های قطبی پیوند کووالانسی، قدرت جداسازی خوب و گزینش‌پذیری منحصر به فردی را برای آنالیت‌های قطبی و غیرقطبی نشان می‌دهند، زیرا جداسازی به برهمکنش بین آنالیت و فاز ساکن بستگی دارد. برهمکنش‌های چندوجهی29، 30، 31، 32. اخیراً، ژانگ و همکارانش... 30 یک فاز ساکن پلی‌آمین با انتهای دودسیل تهیه کردند و با موفقیت هیدروکربن‌ها، داروهای ضد افسردگی، فلاونوئیدها، نوکلئوزیدها، استروژن‌ها و چندین آنالیت دیگر را جدا کردند. واسطه قطبی دارای گروه‌های قطبی و غیرقطبی است، بنابراین می‌توان از آن برای جداسازی پپتیدها و پروتئین‌هایی که دارای بخش‌های آبگریز و آبدوست هستند، استفاده کرد. ستون‌های قطبی جاسازی شده (به عنوان مثال، ستون‌های C18 جاسازی شده با آمید) با نام تجاری ستون‌های Ascentis Express RP-Amide به صورت تجاری در دسترس هستند، اما این ستون‌ها فقط برای تجزیه و تحلیل آمین 33 استفاده می‌شوند.
در مطالعه حاضر، یک فاز ساکن قطبی جاسازی‌شده (پلی‌استایرن جاسازی‌شده با N-فنیل‌مالینامید) تهیه و برای جداسازی پپتیدها و هضم‌های تریپسین HSA ارزیابی شد. فاز ساکن با استفاده از استراتژی زیر تهیه شد. ذرات سیلیس متخلخل طبق روشی که در نشریه قبلی ما ارائه شده بود، با کمی تغییر در پروتکل آماده‌سازی، تهیه شدند. نسبت اوره، پلی‌اتیلن گلیکول (PEG)، TMOS و آب استیک اسید برای تهیه ذرات سیلیس با اندازه منافذ بزرگ تنظیم شد. سپس، یک لیگاند جدید، فنیل‌مالینامید-متیل وینیل ایزوسیانات، سنتز و برای مشتق‌سازی ذرات سیلیس برای تهیه یک فاز ساکن قطبی جاسازی‌شده استفاده شد. فاز ساکن حاصل با استفاده از طرح بسته‌بندی بهینه‌شده در یک ستون فولاد ضد زنگ (100 × 1.8 میلی‌متر در اینچ مربع) بسته‌بندی شد. بسته‌بندی ستون با ارتعاش مکانیکی پشتیبانی می‌شود تا از تشکیل یک بستر همگن در داخل ستون اطمینان حاصل شود. جداسازی ستون متراکم مخلوط‌های پپتیدی متشکل از پنج پپتید را ارزیابی کنید. (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، لوسین انکفالین) و هضم تریپسین آلبومین سرم انسانی (HAS). مشاهده شد که مخلوط پپتیدی و هضم تریپسین HSA با وضوح و کارایی خوبی جداسازی می‌شوند. عملکرد جداسازی ستون PMP با ستون Ascentis Express RP-Amide مقایسه شد. مشاهده شد که هم پپتیدها و هم پروتئین‌ها در ستون PMP به خوبی حل شده و کارآمد هستند، که از ستون Ascentis Express RP-Amide کارآمدتر بود.
PEG (پلی اتیلن گلیکول)، اوره، اسید استیک، تری متوکسی ارتوسیلیکات (TMOS)، تری متیل کلروسیلان (TMCS)، تریپسین، آلبومین سرم انسانی (HSA)، کلرید آمونیوم، اوره، هگزان متیل دی سیلازان (HMDS)، متاکریلوئیل کلرید (MC)، استایرن، 4-هیدروکسی-TEMPO، بنزوئیل پراکسید (BPO)، استونیتریل (ACN) با گرید HPLC، متانول، 2-پروپانول و استون خریداری شده از سیگما-آلدریچ (سنت لوئیس، میسوری، ایالات متحده آمریکا).
مخلوطی از اوره (8 گرم)، پلی‌اتیلن گلیکول (8 گرم) و 8 میلی‌لیتر اسید استیک 0.01 نرمال به مدت 10 دقیقه هم زده شد و سپس 24 میلی‌لیتر TMOS در شرایط یخ به آن اضافه شد. مخلوط واکنش به مدت 6 ساعت در دمای 40 درجه سانتیگراد و سپس به مدت 8 ساعت در دمای 120 درجه سانتیگراد در یک اتوکلاو از جنس استیل ضد زنگ حرارت داده شد. آب تخلیه و مواد باقیمانده به مدت 12 ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد خشک شدند. توده نرم خشک شده در یک آون به صورت صاف آسیاب و به مدت 12 ساعت در دمای 550 درجه سانتیگراد کلسینه شد. سه دسته تهیه و برای بررسی تکرارپذیری در اندازه ذرات، اندازه منافذ و مساحت سطح، مشخصه‌یابی شدند.
با اصلاح سطح ذرات سیلیس با لیگاند از پیش سنتز شده فنیل مالئیمید-متیل وینیل ایزوسیانات (PCMP) و به دنبال آن پلیمریزاسیون شعاعی با استایرن، یک ترکیب حاوی گروه قطبی تهیه شد. فاز ساکن برای سنگدانه‌ها و زنجیره‌های پلی استایرن. فرآیند تهیه در زیر شرح داده شده است.
N-فنیل مالئیمید (200 میلی‌گرم) و متیل وینیل ایزوسیانات (100 میلی‌گرم) در تولوئن خشک حل شدند و 0.1 میلی‌لیتر 2،2′-آزوایزوبوتیرونیتریل (AIBN) به فلاسک واکنش اضافه شد تا کوپلیمر فنیل مالئیمید-متیل وینیل ایزوسیانات (PMCP) تهیه شود. مخلوط به مدت 3 ساعت در دمای 60 درجه سانتیگراد حرارت داده شد، فیلتر شد و به مدت 3 ساعت در فر با دمای 40 درجه سانتیگراد خشک شد.
ذرات سیلیس خشک (2 گرم) در تولوئن خشک (100 میلی‌لیتر) پراکنده شدند، هم زده شدند و به مدت 10 دقیقه در یک بالن ته گرد 500 میلی‌لیتری سونیکیت شدند. PMCP (10 میلی‌گرم) در تولوئن حل شد و به صورت قطره‌ای از طریق قیف قطره‌چکان به بالن واکنش اضافه شد. مخلوط به مدت 8 ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد رفلاکس شد، فیلتر شده و با استون شسته شد و به مدت 3 ساعت در دمای 60 درجه سانتیگراد خشک شد. سپس، ذرات سیلیس متصل به PMCP (100 گرم) در تولوئن (200 میلی‌لیتر) حل شدند و 4-هیدروکسی-TEMPO (2 میلی‌لیتر) در حضور 100 میکرولیتر دی‌بوتیل‌تین دی‌لورات به عنوان کاتالیزور اضافه شد. مخلوط به مدت 8 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد هم زده شد، فیلتر شده و به مدت 3 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد خشک شد.
استایرن (1 میلی‌لیتر)، بنزوئیل پراکسید BPO (0.5 میلی‌لیتر) و ذرات سیلیس متصل به TEMPO-PMCP (1.5 گرم) در تولوئن پراکنده و با نیتروژن تصفیه شدند. پلیمریزاسیون استایرن در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 12 ساعت انجام شد. محصول حاصل با متانول شسته و در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت یک شب خشک شد. طرح کلی واکنش در شکل 1 نشان داده شده است.
نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۹۳ کلوین گاززدایی شدند تا فشار باقیمانده کمتر از ۱۰-۳ تور به دست آید. مقدار N2 جذب شده در فشار نسبی P/P0 = 0.99 برای تعیین حجم کل منافذ استفاده شد. مورفولوژی ذرات سیلیس لخت و متصل به لیگاند با میکروسکوپ الکترونی روبشی (Hitachi High Technologies، توکیو، ژاپن) بررسی شد. نمونه‌های خشک شده (سیلیس لخت و ذرات سیلیس متصل به لیگاند) با استفاده از نوار چسب کربنی روی یک ستون آلومینیومی قرار داده شدند. طلا با استفاده از یک پوشش‌دهنده کندوپاش Q150T روی نمونه‌ها آبکاری شد و یک لایه طلا ۵ نانومتری روی نمونه‌ها رسوب داده شد. این کار راندمان فرآیند را با استفاده از ولتاژهای پایین بهبود می‌بخشد و کندوپاش سرد دانه ریز را فراهم می‌کند. برای تجزیه و تحلیل عنصری از یک دستگاه تجزیه و تحلیل عنصری Thermo Electron (Waltham، MA، ایالات متحده آمریکا) Flash EA1112 استفاده شد. برای به دست آوردن توزیع اندازه ذرات از یک دستگاه تجزیه و تحلیل اندازه ذرات Malvern (Worcestershire، انگلستان) Mastersizer 2000 استفاده شد. ذرات سیلیس و ذرات سیلیس متصل به لیگاند (هر کدام 5 میلی‌گرم) در 5 میلی‌لیتر ایزوپروپانول پراکنده شدند، به مدت 10 دقیقه سونیکیت شدند، به مدت 5 دقیقه ورتکس شدند و روی میز نوری Mastersizer قرار داده شدند. آنالیز ترموگراویمتری با سرعت 5 درجه سانتیگراد در دقیقه در محدوده دمایی 30 تا 800 درجه سانتیگراد انجام شد.
ستون‌های باریک فولادی ضد زنگ با روکش شیشه‌ای و ابعاد (100 × 1.8 میلی‌متر) با استفاده از روش دوغابی و با همان روشی که در مرجع ... استفاده شده است، بسته‌بندی شدند. ۳۱. یک ستون از جنس استیل ضد زنگ (با روکش شیشه‌ای، با قطر داخلی ۱۰۰ × ۱.۸ میلی‌متر) با یک اتصال خروجی حاوی یک فریت ۱ میکرومتری به یک بسته‌بندی دوغاب (Alltech Deerfield، IL، USA) متصل شد. با معلق کردن ۱۵۰ میلی‌گرم فاز ثابت در ۱.۲ میلی‌لیتر متانول و ارسال آن به ستون ذخیره‌سازی، یک دوغاب فاز ساکن تهیه کنید. متانول به عنوان حلال دوغاب و همچنین حلال پیش‌برنده استفاده شد. ستون را به ترتیب با اعمال فشارهای ۱۰۰ MP به مدت ۱۰ دقیقه، ۸۰ MP به مدت ۱۵ دقیقه و ۶۰ MP به مدت ۳۰ دقیقه پر کنید. در حین بسته‌بندی، ارتعاش مکانیکی با دو شیکر ستون GC (Alltech، Deerfield، IL، USA) اعمال شد تا از بسته‌بندی یکنواخت ستون اطمینان حاصل شود. بسته‌بندی دوغاب را ببندید و فشار را به آرامی آزاد کنید تا از هرگونه آسیبی در داخل ستون جلوگیری شود. ستون را از واحد بسته‌بندی دوغاب جدا کنید و یک اتصال دیگر را به ورودی وصل کنید. و به سیستم LC برای بررسی عملکرد آن.
یک پمپ LC (10AD Shimadzu، ژاپن)، انژکتور (Valco (USA) C14 W.05) با حلقه تزریق 50 نانولیتر، گاززدای غشایی (Shimadzu DGU-14A)، پنجره مویرگی UV-VIS ساخته شد. آشکارساز دستگاه µLC مخصوص (UV-2075) و میکروستون‌های شیشه‌ای. از لوله‌های اتصال بسیار باریک و کوتاه برای به حداقل رساندن اثر پهن شدن اضافی نوار ستون استفاده شد. پس از بسته‌بندی، مویرگ‌ها (50 میکرومتر در 365 و مویرگ‌های اتصال کاهنده (50 میکرومتر) در خروجی 1/16 اینچی اتصال کاهنده نصب شدند. جمع‌آوری داده‌ها و پردازش کروماتوگرافی با استفاده از نرم‌افزار Multichro 2000 انجام شد. پایش در طول موج 254 نانومتر انجام شد. آنالیت‌ها برای جذب UV آزمایش شدند. داده‌های کروماتوگرافی توسط OriginPro8 (Northampton، MA) تجزیه و تحلیل شدند.
آلبومین از سرم انسانی، پودر لیوفیلیزه، ≥ ۹۶٪ (الکتروفورز ژل آگارز) ۳ میلی‌گرم مخلوط با تریپسین (۱.۵ میلی‌گرم)، اوره ۴.۰ مولار (۱ میلی‌لیتر) و بی‌کربنات آمونیوم ۰.۲ مولار (۱ میلی‌لیتر). محلول به مدت ۱۰ دقیقه هم زده شد و به مدت ۶ ساعت در حمام آب با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری شد، سپس با ۱ میلی‌لیتر TFA ۰.۱٪ خاموش شد. محلول را فیلتر کرده و در دمای زیر ۴ درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
جداسازی مخلوط‌های پپتیدی و هضم‌های تریپسین HSA به طور جداگانه روی ستون‌های PMP ارزیابی شدند. جداسازی مخلوط پپتیدی و هضم تریپسین HSA توسط ستون PMP را بررسی کنید و نتایج را با ستون Ascentis Express RP-Amide مقایسه کنید. شماره پلیت نظری به شرح زیر محاسبه می‌شود:
تصاویر SEM از ذرات سیلیس لخت و ذرات سیلیس متصل به لیگاند در شکل 2 نشان داده شده است. تصاویر SEM از ذرات سیلیس لخت (A، B) نشان می‌دهند که برخلاف مطالعات قبلی ما، این ذرات کروی هستند که در آن ذرات کشیده یا دارای تقارن نامنظم هستند. سطح ذرات سیلیس متصل به لیگاند (C، D) صاف‌تر از ذرات سیلیس لخت است که ممکن است به دلیل پوشش زنجیره‌های پلی‌استایرن روی سطح ذرات سیلیس باشد.
تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از ذرات سیلیس بدون پوشش (A، B) و ذرات سیلیس متصل به لیگاند (C، D).
توزیع اندازه ذرات ذرات سیلیس بدون پوشش و ذرات سیلیس متصل به لیگاند در شکل 3 (A) نشان داده شده است. منحنی‌های توزیع اندازه ذرات بر اساس حجم نشان دادند که اندازه ذرات سیلیس پس از اصلاح شیمیایی افزایش یافته است (شکل 3A). داده‌های توزیع اندازه ذرات ذرات سیلیس از مطالعه حاضر و مطالعه قبلی در جدول 1 (A) مقایسه شده‌اند. اندازه ذرات بر اساس حجم، d(0.5)، برای PMP، 3.36 میکرومتر است، در مقایسه با مطالعه قبلی ما که مقدار ad(0.5) آن 3.05 میکرومتر بود (ذرات سیلیس متصل به پلی‌استایرن)34. این دسته به دلیل نسبت‌های متغیر PEG، اوره، TMOS و اسید استیک در مخلوط واکنش، توزیع اندازه ذرات باریک‌تری در مقایسه با مطالعه قبلی ما داشت. اندازه ذرات فاز PMP کمی بزرگتر از فاز ذرات سیلیس متصل به پلی‌استایرن است که قبلاً مطالعه کردیم. این بدان معناست که عامل‌دار کردن سطحی ذرات سیلیس با استایرن فقط یک لایه پلی‌استایرن (0.97 میکرومتر) را روی سطح سیلیس رسوب می‌دهد، در حالی که در در فاز PMP، ضخامت لایه 1.38 میکرومتر بود.
توزیع اندازه ذرات (A) و توزیع اندازه منافذ (B) ذرات سیلیس بدون پوشش و ذرات سیلیس متصل به لیگاند.
اندازه منافذ، حجم منافذ و مساحت سطح ذرات سیلیس مطالعه حاضر در جدول 1 (B) آورده شده است. پروفیل‌های PSD ذرات سیلیس بدون پوشش و ذرات سیلیس متصل به لیگاند در شکل 3 (B) نشان داده شده است. نتایج با مطالعه قبلی ما قابل مقایسه است. اندازه منافذ ذرات سیلیس بدون پوشش و متصل به لیگاند به ترتیب 310 و 241 است که نشان می‌دهد اندازه منافذ پس از اصلاح شیمیایی 69 درصد کاهش می‌یابد، همانطور که در جدول 1 (B) نشان داده شده است، و تغییر منحنی در شکل 3 (B) نشان داده شده است. به طور مشابه، حجم منافذ ذرات سیلیس پس از اصلاح شیمیایی از 0.67 به 0.58 سانتی‌متر مکعب بر گرم کاهش یافت. مساحت سطح ویژه ذرات سیلیس مورد مطالعه فعلی 116 متر مربع بر گرم است که با مطالعه قبلی ما (124 متر مربع بر گرم) قابل مقایسه است. همانطور که در جدول 1 (B) نشان داده شده است، مساحت سطح (متر مربع بر گرم) ذرات سیلیس نیز از 116 متر مربع بر گرم به 105 کاهش یافته است. متر مربع بر گرم پس از اصلاح شیمیایی.
نتایج آنالیز عنصری فاز ساکن در جدول 2 نشان داده شده است. میزان کربن فاز ساکن فعلی 6.35٪ است که کمتر از میزان کربن مطالعه قبلی ما (ذرات سیلیس پیوند یافته با پلی استایرن، به ترتیب 7.93٪35 و 10.21٪) 42 است. میزان کربن فاز ساکن فعلی کم است، زیرا در تهیه SP فعلی، علاوه بر استایرن، از برخی لیگاندهای قطبی مانند فنیل مالئیمید-متیل وینیل ایزوسیانات (PCMP) و 4-هیدروکسی-TEMPO استفاده شده است. درصد وزنی نیتروژن فاز ساکن فعلی 2.21٪ است، در حالی که در مطالعات قبلی به ترتیب 0.1735 و 0.85٪ وزنی نیتروژن بوده است. این بدان معناست که درصد وزنی نیتروژن در فاز ساکن فعلی به دلیل فنیل مالئیمید بیشتر است. به طور مشابه، میزان کربن محصولات (4) و (5) به ترتیب 2.7٪ و 2.9٪ بود، در حالی که میزان کربن محصول نهایی (6) همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است، 6.35٪ بود. کاهش وزن با فاز ساکن PMP بررسی شد و منحنی TGA در شکل 4 نشان داده شده است. منحنی TGA کاهش وزن 8.6٪ را نشان می‌دهد که با بارگذاری کربن (6.35٪) مطابقت خوبی دارد زیرا لیگاندها نه تنها حاوی C بلکه N، O و H نیز هستند.
لیگاند فنیل مالئیمید-متیل وینیل ایزوسیانات برای اصلاح سطح ذرات سیلیس انتخاب شد زیرا دارای گروه‌های فنیل مالئیمید قطبی و گروه‌های وینیل ایزوسیانات است. گروه‌های وینیل ایزوسیانات می‌توانند از طریق پلیمریزاسیون رادیکالی زنده با استایرن واکنش بیشتری نشان دهند. دلیل دوم، وارد کردن گروهی است که برهمکنش متوسطی با آنالیت دارد و هیچ برهمکنش الکترواستاتیکی قوی بین آنالیت و فاز ساکن ندارد، زیرا بخش فنیل مالئیمید در pH طبیعی هیچ بار مجازی ندارد. قطبیت فاز ساکن را می‌توان با مقدار بهینه استایرن و زمان واکنش پلیمریزاسیون رادیکال آزاد کنترل کرد. آخرین مرحله واکنش (پلیمریزاسیون رادیکال آزاد) حیاتی است و می‌تواند قطبیت فاز ساکن را تغییر دهد. آنالیز عنصری برای بررسی بارگذاری کربن این فازهای ساکن انجام شد. مشاهده شد که افزایش مقدار استایرن و زمان واکنش، بارگذاری کربن فاز ساکن را افزایش می‌دهد و برعکس. SP های تهیه شده با غلظت‌های مختلف استایرن، بارگذاری کربن متفاوتی دارند. مجدداً، این فازهای ساکن را در ستون‌های فولاد ضد زنگ بارگذاری کنید و عملکرد کروماتوگرافی آنها (گزینش‌پذیری، تفکیک‌پذیری، مقدار N و غیره) را بررسی کنید. بر اساس این آزمایش‌ها، یک فرمولاسیون بهینه برای تهیه فاز ساکن PMP انتخاب شد تا قطبیت کنترل‌شده و حفظ خوب آنالیت تضمین شود.
پنج مخلوط پپتیدی (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، لوسین انکفالین) نیز با استفاده از یک ستون PMP با استفاده از فاز متحرک ارزیابی شدند؛ 60/40 (حجمی/حجمی) استونیتریل/آب (0.1% TFA) با سرعت جریان 80 میکرولیتر در دقیقه. تحت شرایط بهینه شستشو، تعداد پلیت نظری (N) در هر ستون (100 × 1.8 میلی‌متر در اینچ مربع) 20000 ± 100 (200000 پلیت در متر مربع) است. جدول 3 مقادیر N را برای سه ستون PMP نشان می‌دهد و کروماتوگرام‌ها در شکل 5A نشان داده شده‌اند. تجزیه و تحلیل سریع روی یک ستون PMP با سرعت جریان بالا (700 میکرولیتر در دقیقه)، پنج پپتید در عرض یک دقیقه شسته شدند، مقادیر N بسیار خوب بود، 13500 ± 330 در هر ستون (100 × 1.8 میلی‌متر در اینچ مربع)، مربوط به 135000 پلیت در متر مربع (شکل 5B). سه ستون با اندازه یکسان (100 × 1.8 میلی‌متر در اینچ مربع) با ... پر شدند. سه سری مختلف از فاز ساکن PMP برای بررسی تکرارپذیری. غلظت آنالیت برای هر ستون با استفاده از شرایط شویش بهینه و تعداد صفحات نظری N و زمان ماند برای جداسازی مخلوط آزمایشی یکسان در هر ستون ثبت شد. داده‌های تکرارپذیری برای ستون‌های PMP در جدول 4 نشان داده شده است. تکرارپذیری ستون PMP با مقادیر بسیار پایین %RSD، همانطور که در جدول 3 نشان داده شده است، همبستگی خوبی دارد.
جداسازی مخلوط پپتیدی روی ستون PMP (B) و ستون Ascentis Express RP-Amide (A)؛ فاز متحرک 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)، ابعاد ستون PMP (100 × 1.8 میلی‌متر در اینچ مربع)؛ تحلیلی ترتیب شویش ترکیبات: 1 (Gly-Tyr)، 2 (Gly-Leu-Tyr)، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) و 5 (لوسین) اسید انکفالین).
یک ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) برای جداسازی هضم‌های تریپتیک آلبومین سرم انسانی در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) مورد ارزیابی قرار گرفت. کروماتوگرام شکل 6 نشان می‌دهد که نمونه به خوبی جداسازی شده و وضوح آن بسیار خوب است. هضم‌های HSA با استفاده از سرعت جریان 100 میکرولیتر در دقیقه، فاز متحرک 70/30 استونیتریل/آب و 0.1٪ TFA تجزیه و تحلیل شدند. همانطور که در کروماتوگرام (شکل 6) نشان داده شده است، هضم HSA به 17 پیک مربوط به 17 پپتید تقسیم شده است. راندمان جداسازی هر پیک در هضم HSA محاسبه شد و مقادیر آن در جدول 5 ارائه شده است.
هضم تریپتیک HSA (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) روی ستون PMP با سرعت جریان (100 میکرولیتر در دقیقه)، فاز متحرک 60/40 استونیتریل/آب با 0.1٪ TFA جدا شد.
که در آن L طول ستون، η ویسکوزیته فاز متحرک، ΔP فشار برگشتی ستون و u سرعت خطی فاز متحرک است. نفوذپذیری ستون PMP برابر با 2.5 × 10-14 متر مربع، سرعت جریان 25 میکرولیتر در دقیقه و 60/40 ولت بر ولت ACN/آب بود. نفوذپذیری ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) مشابه مطالعه قبلی ما در مرجع 34 بود. نفوذپذیری ستون پر شده با ذرات متخلخل سطحی عبارت است از: 1.7 × 10-15 برای ذرات 1.3 میکرومتر، 3.1 × 10-15 برای ذرات 1.7 میکرومتر، 5.2 × 10-15 و 2.5 × 10-14 متر مربع برای ذرات 2.6 میکرومتر. برای ذرات 5 میکرومتر 43. بنابراین، نفوذپذیری فاز PMP مشابه ... است. که مربوط به ذرات هسته-پوسته ۵ میکرومتری است.
که در آن Wx وزن ستون پر شده با کلروفرم، Wy وزن ستون پر شده با متانول و ρ چگالی حلال است. چگالی متانول (ρ = 0.7866) و کلروفرم (ρ = 1.484). تخلخل کل ستون‌های SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 و C18-Urea 31 که قبلاً مطالعه کردیم به ترتیب 0.63 و 0.55 بود. این بدان معناست که وجود لیگاندهای اوره، نفوذپذیری فاز ساکن را کاهش می‌دهد. از سوی دیگر، تخلخل کل ستون PMP (100 × 1.8 mm id) 0.60 است. نفوذپذیری ستون‌های PMP کمتر از ستون‌های پر شده با ذرات سیلیس متصل به C18 است زیرا در فازهای ساکن از نوع C18، لیگاندهای C18 به صورت زنجیره‌های خطی به ذرات سیلیس متصل هستند، در حالی که در در فازهای ساکن از نوع پلی‌استایرن، یک لایه پلیمری نسبتاً ضخیم در اطراف آن تشکیل می‌شود. در یک آزمایش معمول، تخلخل ستون به صورت زیر محاسبه می‌شود:
شکل‌های 7A و 7B ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) و ستون Ascentis Express RP-Amide (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) را با استفاده از شرایط شستشوی یکسان (یعنی 60/40 ACN/H2O و 0.1% TFA) از نمودار ون دیمتر نشان می‌دهند. مخلوط‌های پپتیدی انتخاب‌شده (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، لوسین انکفالین) در 20 میکرولیتر/ساعت تهیه شدند. حداقل سرعت جریان برای هر دو ستون 800 میکرولیتر در دقیقه است. حداقل مقادیر HETP در سرعت جریان بهینه (80 میکرولیتر در دقیقه) برای ستون PMP و ستون Ascentis Express RP-Amide به ترتیب 2.6 میکرومتر و 3.9 میکرومتر بود. مقادیر HETP نشان می‌دهد که راندمان جداسازی ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) بسیار بهتر از ستون Ascentis Express RP-Amide موجود در بازار (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) است. نمودار ون دیمتر در شکل 7 (A) نشان می‌دهد که کاهش مقدار N با افزایش جریان در مقایسه با مطالعه قبلی ما قابل توجه نیست. راندمان جداسازی بالاتر ستون ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) در مقایسه با ستون Ascentis Express RP-Amide بر اساس بهبود در شکل، اندازه ذرات و رویه‌های پیچیده بسته‌بندی ستون مورد استفاده در کار فعلی است34.
(الف) نمودار ون دیمتر (HETP در مقابل سرعت خطی فاز متحرک) که با استفاده از ستون PMP (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) در محلول 60/40 ACN/H2O با 0.1٪ TFA به دست آمده است. (ب) نمودار ون دیمتر (HETP در مقابل سرعت خطی فاز متحرک) که با استفاده از ستون Ascentis Express RP-Amide (با قطر داخلی 100 × 1.8 میلی‌متر) در محلول 60/40 ACN/H2O با 0.1٪ TFA به دست آمده است.
یک فاز ساکن پلی‌استایرن قطبی‌شده برای جداسازی مخلوط‌های پپتیدی مصنوعی و هضم‌های تریپسین آلبومین سرم انسانی (HAS) در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا تهیه و ارزیابی شد. عملکرد کروماتوگرافی ستون‌های PMP برای مخلوط‌های پپتیدی از نظر راندمان جداسازی و تفکیک‌پذیری عالی است. عملکرد جداسازی بهبود یافته ستون‌های PMP به دلایل مختلفی مانند اندازه ذرات و اندازه منافذ ذرات سیلیس، سنتز کنترل‌شده فاز ساکن و بسته‌بندی پیچیده ستون است. علاوه بر راندمان جداسازی بالا، فشار برگشتی کم ستون در سرعت‌های جریان بالا یکی دیگر از مزایای این فاز ساکن است. ستون‌های PMP تکرارپذیری خوبی از خود نشان می‌دهند و می‌توانند برای تجزیه و تحلیل مخلوط‌های پپتیدی و هضم تریپسین پروتئین‌های مختلف مورد استفاده قرار گیرند. ما قصد داریم از این ستون برای جداسازی محصولات طبیعی، ترکیبات زیست‌فعال از گیاهان دارویی و عصاره‌های قارچی در کروماتوگرافی مایع استفاده کنیم. در آینده، ستون‌های PMP برای جداسازی پروتئین‌ها و آنتی‌بادی‌های مونوکلونال نیز ارزیابی خواهند شد.
فیلد، جی. کی.، یوئربی، ام. آر.، لاو، جی.، توگرسن، اچ. و پترسون، پی. تحقیق در مورد سیستم‌های جداسازی پپتید با استفاده از کروماتوگرافی فاز معکوس بخش اول: توسعه یک پروتکل توصیف ستون. مجله کروماتوگرافی. 1603، 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
گومز، ب. و همکاران. پپتیدهای فعال بهبود یافته طراحی شده برای درمان بیماری‌های عفونی. بیوتکنولوژی. پیشرفته. 36(2)، 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
ولیگه، پ.، لیسوفسکی، و.، مارتینز، ج. و خرسچاتیسکی، م. پپتیدهای درمانی مصنوعی: علم و بازار. کشف دارو. 15 (1-2) امروز، 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
شی، اف.، اسمیت، آر. دی. و شن، وای. کروماتوگرافی مایع پروتئومیک پیشرفته. مجله کروماتوگرافی. ای. ۱۲۶۱، ۷۸–۹۰ (۲۰۱۲).
لیو، دبلیو. و همکاران. کروماتوگرافی مایع پیشرفته-طیف‌سنجی جرمی، امکان ادغام متابولومیکس و پروتئومیکس با هدف‌گیری گسترده را فراهم می‌کند. anus.Chim.Acta 1069، 89–97 (2019).
چسنات، اس‌ام و سالیسبوری، جی‌جی. نقش UHPLC در توسعه دارو. مجله علمی سپتامبر 30(8)، 1183-1190 (2007).
وو، ن. و کلاوزن، ای. ام. جنبه‌های اساسی و عملی کروماتوگرافی مایع با فشار فوق بالا برای جداسازی‌های سریع. مجله علمی سپتامبر. 30(8)، 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
رن، اس. ای. و چلیچف، پی. کاربرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بسیار بالا در توسعه دارو. مجله کروماتوگرافی. 1119(1-2)، 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
گو، اچ. و همکاران. هیدروژل‌های ماکرومتخلخل یکپارچه تهیه‌شده از امولسیون‌های فاز داخلی بالای روغن در آب برای خالص‌سازی کارآمد انتروویروس‌ها. شیمی. بریتانیا. مجله 401، 126051 (2020).
شی، ی.، شیانگ، ر.، هورواث، سی. و ویلکینز، جی. ای. نقش کروماتوگرافی مایع در پروتئومیکس. مجله کروماتوگرافی. آ 1053(1-2)، 27-36 (2004).
فکت، س.، ووتی، ج.-ل. و گیلارم، د. روندهای نوظهور در جداسازی‌های کروماتوگرافی مایع فاز معکوس پپتیدها و پروتئین‌های درمانی: نظریه و کاربردها. مجله داروسازی. علوم زیست پزشکی. آنوس. 69، 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC جداسازی دو بعدی پپتیدها با استفاده از سیستم RP-RP-HPLC با استفاده از مقادیر pH مختلف در ابعاد جداسازی اول و دوم. مجله علمی سپتامبر 28 (14)، 1694-1703 (2005).
فلتی، س. و همکاران. ویژگی‌های انتقال جرم و عملکرد جنبشی ستون‌های کروماتوگرافی با راندمان بالا که با ذرات C18 زیر 2 میکرومتر کاملاً متخلخل و سطحی پر شده‌اند، بررسی شد. مجله علمی سپتامبر. 43 (9-10)، 1737-1745 (2020).
پیووِسانا، س. و همکاران. روندهای اخیر و چالش‌های تحلیلی در جداسازی، شناسایی و اعتبارسنجی پپتیدهای زیست‌فعال گیاهی. anus.biological anus.Chemical.410(15)، 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
مولر، جی.بی و همکاران. چشم‌انداز پروتئومیک قلمرو حیات. نیچر 582(7813)، 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca، C. و همکاران. پردازش پایین‌دستی پپتیدهای درمانی با استفاده از کروماتوگرافی مایع مقدماتی. Molecule (بازل، سوئیس) 26(15)، 4688(2021).
یانگ، وای. و گنگ، ایکس. کروماتوگرافی حالت ترکیبی و کاربرد آن در بیوپلیمرها. مجله کروماتوگرافی. A 1218(49)، 8813–8825 (2011).
ژائو، جی.، دونگ، ایکس.-وای. و سان، وای. لیگاندها برای کروماتوگرافی پروتئینی حالت مختلط: اصول، توصیف و طراحی. مجله بیوتکنولوژی. 144(1)، 3-11 (2009).