Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu pre CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Pórovité častice oxidu kremičitého boli pripravené sol-gelovou metódou s niekoľkými modifikáciami na získanie makroporéznych častíc. Tieto častice boli derivatizované reverzibilnou adičnou fragmentačnou prenosovou reťazcou (RAFT) polymerizáciou s N-fenylmaleimid-metylvinylizokyanátom (PMI) a styrénom na prípravu stacionárnej fázy interkaláciou N-fenylmaleimidového polystyrénu (PMP). Úzke kolóny z nehrdzavejúcej ocele (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) boli naplnené suspenznou náplňou. Vyhodnotená separácia peptidovej zmesi pozostávajúcej z piatich peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucín enkefalín) na kolóne PMP (chromatografický výkon) a trypsínové štiepenie ľudského sérového albumínu (HAS). Za optimálnych elučných podmienok je teoretický počet platní peptidovej zmesi až 280 000 platní/m². Porovnanie separačného výkonu vyvinutej kolóny s komerčnou kolónou Ascentis Express. Na kolóne RP-Amide sa pozorovalo, že separačný výkon kolóny PMP bol lepší ako u komerčnej kolóny z hľadiska separačnej účinnosti a rozlíšenia.
V posledných rokoch sa biofarmaceutický priemysel stal rozširujúcim sa globálnym trhom s výrazným nárastom podielu na trhu. S explozívnym rastom biofarmaceutického priemyslu1,2,3 je analýza peptidov a proteínov veľmi žiadaná. Okrem cieľového peptidu sa počas syntézy peptidov vytvára niekoľko nečistôt, čo si vyžaduje chromatografické čistenie na získanie peptidov požadovanej čistoty. Analýza a charakterizácia proteínov v telesných tekutinách, tkanivách a bunkách je mimoriadne náročná úloha kvôli veľkému počtu potenciálne detekovateľných druhov v jednej vzorke. Hoci hmotnostná spektrometria je účinným nástrojom na sekvenovanie peptidov a proteínov, ak sa takéto vzorky vstreknú do hmotnostného spektrometra naraz, separácia nebude ideálna. Tento problém možno zmierniť implementáciou separácií kvapalinovou chromatografiou (LC) pred MS analýzou, čo zníži počet analytov vstupujúcich do hmotnostného spektrometra v danom čase4,5,6. Okrem toho, počas separácie v kvapalnej fáze sa analyty môžu sústrediť v úzkych oblastiach, čím sa tieto analyty koncentrujú a zlepšuje sa citlivosť MS detekcie. Kvapalinová chromatografia (LC) sa za posledné desaťročie výrazne posunula a stala sa populárnou technikou v... proteomická analýza7,8,9,10.
Kvapalinová chromatografia s reverznou fázou (RP-LC) sa široko používa na čistenie a separáciu peptidových zmesí s použitím oktadecyl-modifikovaného oxidu kremičitého (ODS) ako stacionárnej fázy11,12,13. Stacionárne fázy RP však neposkytujú uspokojivú separáciu peptidov a proteínov kvôli ich komplexnej štruktúre a amfifilnej povahe14,15. Preto sú na analýzu peptidov a proteínov s polárnymi a nepolárnymi skupinami potrebné špeciálne navrhnuté stacionárne fázy, ktoré interagujú s týmito analytmi a zadržiavajú ich16. Chromatografia so zmiešaným režimom, ktorá poskytuje multimodálne interakcie, môže byť alternatívou k RP-LC na separáciu peptidov, proteínov a iných komplexných zmesí. Bolo pripravených niekoľko stacionárnych fáz so zmiešaným režimom a kolóny naplnené týmito fázami sa použili na separáciu peptidov a proteínov17,18,19,20,21. Stacionárne fázy so zmiešaným režimom (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polárna interkalácia/RPLC) sú vhodné na separáciu peptidov a proteínov kvôli prítomnosti polárnych aj nepolárnych zložiek. skupiny22,23,24,25,26,27,28. Podobne polárne interkalačné stacionárne fázy s kovalentne viazanými polárnymi skupinami vykazujú dobrú separačnú schopnosť a jedinečnú selektivitu pre polárne a nepolárne analyty, pretože separácia závisí od interakcie medzi analytom a stacionárnou fázou. Multimodálne interakcie 29, 30, 31, 32. Nedávno Zhang a kol. 30 pripravili dodecyl-terminovanú polyamínovú stacionárnu fázu a úspešne oddelili uhľovodíky, antidepresíva, flavonoidy, nukleozidy, estrogény a niekoľko ďalších analytov. Polárny interkalátor má polárne aj nepolárne skupiny, takže sa môže použiť na separáciu peptidov a proteínov, ktoré majú hydrofóbne aj hydrofilné časti. Polárne vložené kolóny (napr. kolóny C18 vložené do amidu) sú komerčne dostupné pod obchodným názvom kolóny Ascentis Express RP-Amide, ale tieto kolóny sa používajú iba na analýzu amínu 33.
V súčasnej štúdii bola pripravená a vyhodnotená polárne zabudovaná stacionárna fáza (polystyrén zabudovaný do N-fenylmaleimidu) na separáciu peptidov a trypsínových digescií HSA. Stacionárna fáza bola pripravená pomocou nasledujúcej stratégie. Pórovité častice oxidu kremičitého boli pripravené podľa postupu uvedeného v našej predchádzajúcej publikácii s niekoľkými úpravami protokolu prípravy. Pomer močoviny, polyetylénglykolu (PEG), TMOS, vody a kyseliny octovej bol upravený na prípravu častíc oxidu kremičitého s veľkou veľkosťou pórov. Po druhé, bol syntetizovaný nový ligand, fenylmaleimid-metylvinylizokyanát, a použitý na derivatizáciu častíc oxidu kremičitého na prípravu polárne zabudovanej stacionárnej fázy. Výsledná stacionárna fáza bola naplnená do kolóny z nehrdzavejúcej ocele (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) s použitím optimalizovanej schémy plnenia. Plnenie kolóny je podporované mechanickými vibráciami, aby sa zabezpečilo vytvorenie homogénneho lôžka v kolóne. Vyhodnotenie separácie peptidových zmesí pozostávajúcich z piatich peptidov na naplnenej kolóne; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucín enkefalín) a trypsínový digest ľudského sérového albumínu (HAS). Zmes peptidov a trypsínový digest HSA sa pozorovali s dobrým rozlíšením a účinnosťou. Separačný výkon kolóny PMP sa porovnal s výkonom kolóny Ascentis Express RP-Amide. Peptidy aj proteíny sa na kolóne PMP, ktorá bola účinnejšia ako kolóna Ascentis Express RP-Amide, dobre rozlíšili a boli účinné.
PEG (polyetylénglykol), močovina, kyselina octová, trimetoxyortosilikát (TMOS), trimetylchlórsilán (TMCS), trypsín, ľudský sérový albumín (HSA), chlorid amónny, močovina, hexán, metyldisilazán (HMDS), metakryloylchlorid (MC), styrén, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxid (BPO), acetonitril (ACN) v kvalite HPLC, metanol, 2-propanol a acetón zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Zmes močoviny (8 g), polyetylénglykolu (8 g) a 8 ml 0,01 N kyseliny octovej sa miešala 10 minút a potom sa k nej za ľadového chladu pridalo 24 ml TMOS. Reakčná zmes sa zahrievala pri teplote 40 °C počas 6 hodín a potom pri teplote 120 °C počas 8 hodín v autokláve z nehrdzavejúcej ocele. Voda sa zliala a zvyšný materiál sa sušil pri teplote 70 °C počas 12 hodín. Vysušená mäkká hmota sa hladko rozomlela v peci a kalcinovala pri teplote 550 °C počas 12 hodín. Pripravili sa a charakterizovali tri šarže, aby sa preskúmala reprodukovateľnosť veľkosti častíc, veľkosti pórov a povrchovej plochy.
Modifikáciou povrchu častíc oxidu kremičitého vopred syntetizovaným ligandom fenylmaleimid-metylvinylizokyanátom (PCMP) a následnou radiálnou polymerizáciou so styrénom bola pripravená zlúčenina obsahujúca polárne skupiny. Stacionárna fáza pre agregáty a polystyrénové reťazce. Proces prípravy je opísaný nižšie.
N-fenylmaleimid (200 mg) a metylvinylizokyanát (100 mg) sa rozpustili v suchom toluéne a do reakčnej banky sa pridalo 0,1 ml 2,2'-azoizobutyronitrilu (AIBN), čím sa pripravil kopolymér fenylmaleimid-metylvinylizokyanát (PMCP). Zmes sa zahrievala pri teplote 60 °C počas 3 hodín, prefiltrovala sa a sušila sa v peci pri teplote 40 °C počas 3 hodín.
Vysušené častice oxidu kremičitého (2 g) sa dispergovali v suchom toluéne (100 ml), miešali a sonikovali v 500 ml banke s okrúhlym dnom počas 10 minút. PMCP (10 mg) sa rozpustil v toluéne a po kvapkách sa pridal do reakčnej banky pomocou prikvapkávacieho lievika. Zmes sa refluxovala pri 100 °C počas 8 hodín, prefiltrovala sa, premyla acetónom a sušila sa pri 60 °C počas 3 hodín. Potom sa častice oxidu kremičitého viazané na PMCP (100 g) rozpustili v toluéne (200 ml) a pridal sa 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) v prítomnosti 100 µl dibutylcíndilaurátu ako katalyzátora. Zmes sa miešala pri 50 °C počas 8 hodín, prefiltrovala sa a sušila sa pri 50 °C počas 3 hodín.
Styrén (1 ml), benzoylperoxid BPO (0,5 ml) a častice oxidu kremičitého viazané na TEMPO-PMCP (1,5 g) boli dispergované v toluéne a prepláchnuté dusíkom. Polymerizácia styrénu sa uskutočňovala pri teplote 100 °C počas 12 hodín. Výsledný produkt sa premyl metanolom a sušil pri teplote 60 °C cez noc. Celková reakčná schéma je znázornená na obrázku 1.
Vzorky boli odplynené pri teplote 393 K počas 1 hodiny, aby sa dosiahol zvyškový tlak menší ako 10-3 Torr. Množstvo N2 adsorbovaného pri relatívnom tlaku P/P0 = 0,99 bolo použité na stanovenie celkového objemu pórov. Morfológia holých a ligandmi viazaných častíc oxidu kremičitého bola skúmaná skenovacou elektrónovou mikroskopiou (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonsko). Vysušené vzorky (holé a ligandmi viazané častice oxidu kremičitého) boli umiestnené na hliníkovú kolónu pomocou lepiacej uhlíkovej pásky. Na vzorky bolo nanesené zlato pomocou naprašovacieho zariadenia Q150T a na vzorky bola nanesená 5 nm vrstva Au. To zlepšuje účinnosť procesu pri použití nízkych napätí a poskytuje jemnozrnné naprašovanie za studena. Na elementárnu analýzu bol použitý elementárny analyzátor Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Na získanie distribúcie veľkosti častíc bol použitý analyzátor veľkosti častíc Malvern (Worcestershire, Spojené kráľovstvo) Mastersizer 2000. Holé častice oxidu kremičitého a ligandmi viazané častice oxidu kremičitého (5 mg (každá) boli dispergované v 5 ml izopropanolu, sonikované 10 minút, vortexované 5 minút a umiestnené na optický stôl Mastersizeru. Termogravimetrická analýza sa vykonávala rýchlosťou 5 °C za minútu v teplotnom rozsahu 30 až 800 °C.
Sklenené stĺpce z nehrdzavejúcej ocele s úzkym otvorom a rozmermi (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) boli naplnené metódou suspenzného plnenia, pričom sa použil rovnaký postup ako v Ref. 31. Kolóna z nehrdzavejúcej ocele (s výstelkou zo skla, vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) s výstupným armatúrou obsahujúcou fritu s veľkosťou 1 µm bola pripojená k suspenznému baliču (Alltech Deerfield, IL, USA). Pripravte suspenziu stacionárnej fázy suspendovaním 150 mg stacionárnej fázy v 1,2 ml metanolu a odošlite ju do skladovacej kolóny. Ako rozpúšťadlo suspenzie, ako aj ako hnacie rozpúšťadlo, sa použil metanol. Kolónu postupne plňte tlakom 100 MP počas 10 minút, 80 MP počas 15 minút a 60 MP počas 30 minút. Počas plnenia sa aplikovali mechanické vibrácie pomocou dvoch GC trepačiek kolóny (Alltech, Deerfield, IL, USA), aby sa zabezpečilo rovnomerné naplnenie kolóny. Zatvorte suspenzný balič a pomaly uvoľňujte tlak, aby ste predišli poškodeniu v kolóne. Odpojte kolónu od suspenznej plniacej jednotky a pripojte ďalšiu armatúru k vstupu a k LC systému, aby ste skontrolovali jej výkon.
Bola skonštruovaná LC pumpa (10AD Shimadzu, Japonsko), injektor (Valco (USA) C14 W.05) s 50nL injekčnou slučkou, membránový odplyňovač (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilárne okno, špeciálny µLC detektor (UV-2075) a mikrokolóny so sklenenou výstelkou. Použili sa veľmi úzke a krátke spojovacie hadičky, aby sa minimalizoval vplyv dodatočného rozšírenia pásma kolóny. Po zabalení boli na výstup 1/16″ redukčného spoja nainštalované kapiláry (50 μm s vnútorným priemerom 365) a kapiláry redukčného spoja (50 μm). Zber údajov a chromatografické spracovanie sa uskutočnili pomocou softvéru Multichro 2000. Monitorovanie pri 254 nm. Analyty boli testované na UV absorbanciu. Chromatografické údaje boli analyzované pomocou OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumín z ľudského séra, lyofilizovaný prášok, ≥ 96 % (elektroforéza na agarózovom géli) 3 mg zmiešaný s trypsínom (1,5 mg), 4,0 M močovinou (1 ml) a 0,2 M hydrogenuhličitanom amónnym (1 ml). Roztok sa miešal 10 minút a udržiaval sa vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C počas 6 hodín, potom sa reakcia zastavila 1 ml 0,1 % TFA. Roztok sa prefiltroval a uchovával pri teplote do 4 °C.
Separácia peptidových zmesí a trypsínových štiepení HSA bola hodnotená samostatne na PMP kolónach. Skontrolujte separáciu peptidovej zmesi a trypsínového štiepenia HSA pomocou PMP kolóny a porovnajte výsledky s kolónou Ascentis Express RP-Amide. Teoretický počet platní sa vypočíta takto:
SEM snímky holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého s viazanými ligandami sú znázornené na obr. 2. SEM snímky holých častíc oxidu kremičitého (A, B) ukazujú, že na rozdiel od našich predchádzajúcich štúdií sú tieto častice guľovité, pričom častice sú predĺžené alebo majú nepravidelnú symetriu. Povrch častíc oxidu kremičitého s viazanými ligandami (C, D) je hladší ako povrch holých častíc oxidu kremičitého, čo môže byť spôsobené povlakom polystyrénových reťazcov na povrchu častíc oxidu kremičitého.
Snímky holých častíc oxidu kremičitého (A, B) a častíc oxidu kremičitého s viazanými ligandami (C, D) zo strany skenovacieho elektrónového mikroskopu.
Distribúcia veľkosti častíc holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého viazaných ligandom je znázornená na obrázku 3(A). Krivky distribúcie veľkosti častíc na základe objemu ukázali, že veľkosť častíc oxidu kremičitého sa po chemickej modifikácii zvýšila (obr. 3A). Údaje o distribúcii veľkosti častíc oxidu kremičitého zo súčasnej štúdie a predchádzajúcej štúdie sú porovnané v tabuľke 1(A). Objemová veľkosť častíc PMP, d(0,5), je 3,36 μm v porovnaní s našou predchádzajúcou štúdiou s hodnotou ad(0,5) 3,05 μm (častice oxidu kremičitého viazané na polystyrén)34. Táto várka mala užšiu distribúciu veľkosti častíc v porovnaní s našou predchádzajúcou štúdiou kvôli rôznym pomerom PEG, močoviny, TMOS a kyseliny octovej v reakčnej zmesi. Veľkosť častíc fázy PMP je o niečo väčšia ako veľkosť častíc fázy oxidu kremičitého viazaného na polystyrén, ktorú sme predtým študovali. To znamená, že povrchová funkcionalizácia častíc oxidu kremičitého styrénom uložila na povrch oxidu kremičitého iba polystyrénovú vrstvu (0,97 µm), zatiaľ čo vo fáze PMP bola hrúbka vrstvy... 1,38 µm.
Distribúcia veľkosti častíc (A) a distribúcia veľkosti pórov (B) holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého viazaného na ligand.
Veľkosť pórov, objem pórov a povrchová plocha častíc oxidu kremičitého v súčasnej štúdii sú uvedené v tabuľke 1(B). Profily PSD holých častíc oxidu kremičitého a častíc oxidu kremičitého s viazanými ligandami sú znázornené na obrázku 3(B). Výsledky sú porovnateľné s našou predchádzajúcou štúdiou. Veľkosti pórov holých a ligandom viazaných častíc oxidu kremičitého sú 310 a 241, čo naznačuje, že veľkosť pórov sa po chemickej modifikácii zmenšuje o 69, ako je znázornené v tabuľke 1(B), a zmena krivky je znázornená na obr. 3(B). Podobne sa objem pórov častíc oxidu kremičitého po chemickej modifikácii znížil z 0,67 na 0,58 cm3/g. Špecifická povrchová plocha aktuálne študovaných častíc oxidu kremičitého je 116 m2/g, čo je porovnateľné s našou predchádzajúcou štúdiou (124 m2/g). Ako je znázornené v tabuľke 1(B), povrchová plocha (m2/g) častíc oxidu kremičitého sa po chemickej modifikácii tiež znížila zo 116 m2/g na 105 m2/g. modifikácia.
Výsledky elementárnej analýzy stacionárnej fázy sú uvedené v tabuľke 2. Obsah uhlíka v súčasnej stacionárnej fáze je 6,35 %, čo je menej ako obsah uhlíka v našej predchádzajúcej štúdii (častice oxidu kremičitého viazané polystyrénom, 7,93 %35 a 10,21 %)42. Obsah uhlíka v súčasnej stacionárnej fáze je nízky, pretože pri príprave súčasnej SP sa okrem styrénu použili aj niektoré polárne ligandy, ako napríklad fenylmaleimid-metylvinylizokyanát (PCMP) a 4-hydroxy-TEMPO. Hmotnostné percento dusíka v súčasnej stacionárnej fáze je 2,21 % v porovnaní s 0,1735 a 0,85 % hmotnostnými dusíkom v predchádzajúcich štúdiách. To znamená, že hmotnostné percento dusíka je v súčasnej stacionárnej fáze vyššie v dôsledku fenylmaleimidu. Podobne obsah uhlíka v produktoch (4) a (5) bol 2,7 % a 2,9 %, zatiaľ čo obsah uhlíka v konečnom produkte (6) bol 6,35 %, ako je uvedené v tabuľke 2. Úbytok hmotnosti bol kontrolovaný so stacionárnou fázou PMP a krivka TGA je znázornená na obrázku 4. Krivka TGA ukazuje úbytok hmotnosti 8,6 %, čo je v dobrej zhode s obsahom uhlíka (6,35 %), pretože ligandy obsahujú nielen C, ale aj N, O a H.
Na modifikáciu povrchu častíc oxidu kremičitého bol zvolený ligand fenylmaleimid-metylvinylizokyanát, pretože má polárne fenylmaleimidové skupiny a vinylizokyanátové skupiny. Vinylizokyanátové skupiny môžu ďalej reagovať so styrénom živou radikálovou polymerizáciou. Druhým dôvodom je vloženie skupiny, ktorá má miernu interakciu s analytom a žiadnu silnú elektrostatickú interakciu medzi analytom a stacionárnou fázou, pretože fenylmaleimidová skupina nemá pri normálnom pH žiadny virtuálny náboj. Polaritu stacionárnej fázy možno riadiť optimálnym množstvom styrénu a reakčným časom radikálovej polymerizácie. Posledný krok reakcie (radikálová polymerizácia) je kritický a môže zmeniť polaritu stacionárnej fázy. Na kontrolu obsahu uhlíka v týchto stacionárnych fázach bola vykonaná elementárna analýza. Bolo pozorované, že zvýšenie množstva styrénu a reakčného času zvyšuje obsah uhlíka v stacionárnej fáze a naopak. SP pripravené s rôznymi koncentráciami styrénu majú rôzne obsahy uhlíka. Opäť sa tieto stacionárne fázy naložia do kolón z nehrdzavejúcej ocele a skontroluje sa ich chromatografický výkon (selektivita, rozlíšenie, hodnota N, atď.). Na základe týchto experimentov bola zvolená optimalizovaná formulácia na prípravu stacionárnej fázy PMP, aby sa zabezpečila kontrolovaná polarita a dobrá retencia analytu.
Päť peptidových zmesí (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucín enkefalín) bolo tiež hodnotených pomocou PMP kolóny s použitím mobilnej fázy; 60/40 (v/v) acetonitril/voda (0,1 % TFA) pri prietoku 80 μl/min. Za optimálnych elučných podmienok je teoretický počet platní (N) na kolónu (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) 20 000 ± 100 (200 000 platní/m²). Tabuľka 3 uvádza hodnoty N pre tri kolóny PMP a chromatogramy sú znázornené na obrázku 5A. Rýchla analýza na kolóne PMP pri vysokom prietoku (700 μl/min) uvádza päť peptidov eluovaných v priebehu jednej minúty, hodnoty N boli veľmi dobré, 13 500 ± 330 na kolónu (100 × 1,8 mm vnútorný priemer), čo zodpovedá 135 000 platniam/m² (obrázok 5B). Tri kolóny rovnakej veľkosti (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) boli naplnené tromi rôznymi šaržami stacionárnej fázy PMP na kontrolu reprodukovateľnosti. Koncentrácia analytu pre každú kolónu bola zaznamenaná s použitím optimálnych elučných podmienok a počtu teoretických platní N a retenčného času na oddelenie rovnakej testovanej zmesi na každej kolóne. Údaje o reprodukovateľnosti pre kolóny PMP sú uvedené v tabuľke 4. Reprodukovateľnosť kolóny PMP dobre koreluje s veľmi nízkymi hodnotami %RSD, ako je uvedené v tabuľke 3.
Separácia zmesi peptidov na kolóne PMP (B) a kolóne Ascentis Express RP-Amide (A); mobilná fáza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), rozmery kolóny PMP (100 × 1,8 mm vnútorný priemer); analytické. Elučné poradie zlúčenín: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (leucín) kyselina enkefalín).
Na separáciu tryptických digestov ľudského sérového albumínu vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii bola použitá PMP kolóna (s vnútorným priemerom 100 × 1,8 mm). Chromatogram na obrázku 6 ukazuje, že vzorka je dobre separovaná a rozlíšenie je veľmi dobré. Digesty HSA boli analyzované s použitím prietoku 100 µl/min, mobilnej fázy 70/30 acetonitril/voda a 0,1 % TFA. Ako je znázornené na chromatograme (obrázok 6), digescia HSA bola rozdelená do 17 píkov zodpovedajúcich 17 peptidom. Bola vypočítaná separačná účinnosť každého píku v digeste HSA a hodnoty sú uvedené v tabuľke 5.
Tryptický digest HSA (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) sa separoval na PMP kolóne; prietok (100 µl/min), mobilná fáza acetonitril/voda 60/40 s 0,1 % TFA.
kde L je dĺžka kolóny, η je viskozita mobilnej fázy, ΔP je spätný tlak v kolóne a u je lineárna rýchlosť mobilnej fázy. Permeabilita kolóny PMP bola 2,5 × 10⁻¹⁴ m², prietok bol 25 μl/min a bol použitý ACN/voda v pomere 60/40 obj./obj. Permeabilita kolóny PMP (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) bola podobná permeabilite kolóny PMP (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) bola podobná permeabilite našej predchádzajúcej štúdie Ref.34. Permeabilita kolóny naplnenej povrchovo pórovitými časticami je: 1,7 × 10⁻¹⁴ pre častice s veľkosťou 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁴ pre častice s veľkosťou 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁴ a 2,5 × 10⁻¹⁴ m² pre častice s veľkosťou 2,6 μm. Pre častice s veľkosťou 5 μm 43 je preto permeabilita fázy PMP podobná permeabilite častíc s veľkosťou jadra a obalu 5 μm.
kde Wx je hmotnosť kolóny naplnenej chloroformom, Wy je hmotnosť kolóny naplnenej metanolom a ρ je hustota rozpúšťadla. Hustoty metanolu (ρ = 0,7866) a chloroformu (ρ = 1,484). Celková pórovitosť kolón SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) 34 a kolón C18-Urea 31, ktoré sme predtým študovali, bola 0,63 a 0,55. To znamená, že prítomnosť ligandov močoviny znižuje priepustnosť stacionárnej fázy. Na druhej strane, celková pórovitosť kolóny PMP (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) je 0,60. Priepustnosť kolón PMP je nižšia ako priepustnosť kolón naplnených časticami oxidu kremičitého viazanými C18, pretože v stacionárnych fázach typu C18 sú ligandy C18 pripojené k časticiam oxidu kremičitého ako lineárne reťazce, zatiaľ čo v stacionárnych fázach typu polystyrénu sa okolo nej vytvára relatívne hrubá polymérna vrstva. V Pri typickom experimente sa pórovitosť kolóny vypočíta ako:
Obrázok 7A,B zobrazuje kolónu PMP (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) a kolónu Ascentis Express RP-Amide (vnútorný priemer 100 × 1,8 mm) s použitím rovnakých elučných podmienok (t. j. 60/40 ACN/H2O a 0,1 % TFA). ) van Deemterovho grafu. Vybrané zmesi peptidov (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucínový enkefalín) boli pripravené v 20 µL/. Minimálny prietok pre obe kolóny je 800 µL/min. Minimálne hodnoty HETP pri optimálnom prietoku (80 µL/min) pre kolónu PMP a kolónu Ascentis Express RP-Amide boli 2,6 µm a 3,9 µm. Hodnoty HETP naznačujú, že separačná účinnosť kolóny PMP (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) je oveľa lepšia ako u komerčne dostupnej kolóny Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm vnútorný priemer). Van Deemterov graf na obr. 7(A) ukazuje, že pokles hodnoty N so zvyšujúcim sa prietokom nie je významný v porovnaní s našou predchádzajúcou štúdiou. Vyššia separačná účinnosť kolóny PMP (100 × 1,8 mm vnútorný priemer)... id) v porovnaní s kolónou Ascentis Express RP-Amide je založený na zlepšeniach tvaru, veľkosti častíc a komplexných postupoch plnenia kolóny použitých v súčasnej práci34.
(A) van Deemterov graf (HETP verzus lineárna rýchlosť mobilnej fázy) získaný s použitím kolóny PMP (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) v zmesi ACN/H2O 60/40 s 0,1 % TFA. (B) van Deemterov graf (HETP verzus lineárna rýchlosť mobilnej fázy) získaný s použitím kolóny Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm vnútorný priemer) v zmesi ACN/H2O 60/40 s 0,1 % TFA.
Bola pripravená a vyhodnotená polárne zaliata polystyrénová stacionárna fáza na separáciu syntetických peptidových zmesí a trypsínových štiepení ľudského sérového albumínu (HAS) vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii. Chromatografický výkon PMP kolón pre peptidové zmesi je vynikajúci z hľadiska separačnej účinnosti a rozlíšenia. Zlepšený separačný výkon PMP kolón je spôsobený rôznymi dôvodmi, ako je veľkosť častíc a veľkosť pórov častíc oxidu kremičitého, kontrolovaná syntéza stacionárnej fázy a komplexné plnenie kolóny. Okrem vysokej separačnej účinnosti je ďalšou výhodou tejto stacionárnej fázy nízky spätný tlak v kolóne pri vysokých prietokoch. PMP kolóny vykazujú dobrú reprodukovateľnosť a možno ich použiť na analýzu peptidových zmesí a trypsínové štiepenie rôznych proteínov. Túto kolónu plánujeme použiť na separáciu prírodných produktov, bioaktívnych zlúčenín z liečivých rastlín a hubových extraktov v kvapalinovej chromatografii. V budúcnosti budú PMP kolóny hodnotené aj na separáciu proteínov a monoklonálnych protilátok.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Výskum systémov na separáciu peptidov pomocou chromatografie s reverznou fázou, časť I: Vývoj protokolu pre charakterizáciu kolóny. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. a kol. Vylepšené aktívne peptidy určené na liečbu infekčných ochorení. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Syntetické terapeutické peptidy: veda a trh. Objav liekov. 15 (1-2) dnes, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Pokročilá proteomická kvapalinová chromatografia. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. a kol. Pokročilá kvapalinová chromatografia s hmotnostnou spektrometriou umožňuje začlenenie široko cielenej metabolomiky a proteomiky. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM a Salisbury, JJ Úloha UHPLC vo vývoji liekov. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. a Clausen, AM Základné a praktické aspekty ultravysokotlakovej kvapalinovej chromatografie pre rýchle separácie. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA a Tchelitcheff, P. Aplikácia ultravysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie vo vývoji liekov. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. a kol. Monolitické makroporézne hydrogély pripravené z emulzií olej vo vode s vysokým obsahom vnútornej fázy na účinné čistenie enterovírusov. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA Úloha kvapalinovej chromatografie v proteomike. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. a Guillarme, D. Nové trendy v separácii terapeutických peptidov a proteínov pomocou kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou: teória a aplikácie. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE a Gebler, JC Dvojrozmerná separácia peptidov pomocou systému RP-RP-HPLC s použitím rôznych hodnôt pH v prvom a druhom separačnom rozmere. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. a kol. Boli skúmané charakteristiky prenosu hmoty a kinetický výkon vysokoúčinných chromatografických kolón naplnených plne a povrchovo poréznymi časticami C18 s veľkosťou menšou ako 2 μm. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. a kol. Najnovšie trendy a analytické výzvy v izolácii, identifikácii a validácii rastlinných bioaktívnych peptidov. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB a kol. Proteomická krajina ríše života. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. a kol. Následné spracovanie terapeutických peptidov preparatívnou kvapalinovou chromatografiou. Molecule (Bazilej, Švajčiarsko) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. a Geng, X. Zmiešaná chromatografia a jej aplikácia na biopolyméry. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. a Sun, Y. Ligandy pre zmiešanú proteínovú chromatografiu: princíp, charakterizácia a návrh. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).