Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Porozne čestice silicijevog dioksida pripremljene su sol-gel metodom s nekim modifikacijama kako bi se dobile makroporozne čestice. Ove čestice su derivatizirane polimerizacijom reverzibilne adicije fragmentacije lanca (RAFT) s N-fenilmaleimid-metilvinilizocijanatom (PMI) i stirenom kako bi se pripremila stacionarna faza interkalacijom N-fenilmaleimida s polistirenom (PMP). Kolone od nehrđajućeg čelika uskog promjera (100 × 1,8 mm unutarnji promjer) pakirane su pakiranjem u suspenziju. Procijenjena je separacija smjese peptida koja se sastoji od pet peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) na PMP koloni (kromatografske performanse) i digestija humanog serumskog albumina (HAS) tripsinom. Pod optimalnim uvjetima eluiranja, teorijski broj ploča smjese peptida je čak 280 000 ploča/m². Uspoređujući performanse separacije razvijene kolone s komercijalnom Ascentis Express kolonom. RP-amidna kolona, ​​uočeno je da je učinkovitost odvajanja PMP kolone bila superiornija u odnosu na komercijalnu kolonu u smislu učinkovitosti odvajanja i rezolucije.
Posljednjih godina, biofarmaceutska industrija postala je rastuće globalno tržište sa značajnim povećanjem tržišnog udjela. S eksplozivnim rastom biofarmaceutske industrije1,2,3, analiza peptida i proteina je vrlo poželjna. Osim ciljnog peptida, tijekom sinteze peptida nastaje nekoliko nečistoća, što zahtijeva kromatografsko pročišćavanje kako bi se dobili peptidi željene čistoće. Analiza i karakterizacija proteina u tjelesnim tekućinama, tkivima i stanicama izuzetno je izazovan zadatak zbog velikog broja potencijalno detektabilnih vrsta u jednom uzorku. Iako je masena spektrometrija učinkovit alat za sekvenciranje peptida i proteina, ako se takvi uzorci ubrizgavaju u maseni spektrometar u jednom prolazu, odvajanje neće biti idealno. Ovaj se problem može ublažiti primjenom odvajanja tekućinskom kromatografijom (LC) prije MS analize, što će smanjiti broj analita koji ulaze u maseni spektrometar u određenom trenutku4,5,6. Osim toga, tijekom odvajanja tekuće faze, analiti se mogu fokusirati u uskim područjima, čime se ti analiti koncentriraju i poboljšava osjetljivost MS detekcije. Tekuća kromatografija (LC) značajno je napredovala tijekom posljednjeg desetljeća i postala je popularna tehnika u proteomska analiza7,8,9,10.
Tekućinska kromatografija obrnute faze (RP-LC) široko se koristi za pročišćavanje i odvajanje peptidnih smjesa korištenjem oktadecil-modificiranog silicija (ODS) kao stacionarne faze11,12,13. Međutim, RP stacionarne faze ne pružaju zadovoljavajuće odvajanje peptida i proteina zbog svoje složene strukture i amfifilne prirode14,15. Stoga su potrebne posebno dizajnirane stacionarne faze za analizu peptida i proteina s polarnim i nepolarnim dijelovima kako bi interagirale s tim analitima i zadržale ih16. Kromatografija miješanog načina rada, koja omogućuje multimodalne interakcije, može biti alternativa RP-LC za odvajanje peptida, proteina i drugih složenih smjesa. Pripremljeno je nekoliko stacionarnih faza miješanog načina rada, a kolone napunjene tim fazama korištene su za odvajanje peptida i proteina17,18,19,20,21. Stacionarne faze miješanog načina rada (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacija/RPLC) prikladne su za odvajanje peptida i proteina zbog prisutnosti i polarnih i nepolarnih faza. skupine22,23,24,25,26,27,28. Slično tome, polarne interkalirajuće stacionarne faze s kovalentno vezanim polarnim skupinama pokazuju dobru moć odvajanja i jedinstvenu selektivnost za polarne i nepolarne analite, jer odvajanje ovisi o interakciji između analita i stacionarne faze. Multimodalne interakcije 29, 30, 31, 32. Nedavno su Zhang i sur.30 pripremili dodecil-terminiranu poliaminsku stacionarnu fazu i uspješno odvojili ugljikovodike, antidepresive, flavonoide, nukleozide, estrogene i nekoliko drugih analita. Polarni interkalator ima i polarne i nepolarne skupine, pa se može koristiti za odvajanje peptida i proteina koji imaju i hidrofobne i hidrofilne dijelove. Polarno ugrađene kolone (npr. C18 kolone ugrađene u amid) komercijalno su dostupne pod trgovačkim nazivom Ascentis Express RP-Amide kolone, ali te se kolone koriste samo za analizu amina 33.
U trenutnoj studiji, pripremljena je polarno ugrađena stacionarna faza (polistiren ugrađen u N-fenilmaleimid) i procijenjena za odvajanje peptida i tripsin digestija HSA. Stacionarna faza pripremljena je korištenjem sljedeće strategije. Porozne čestice silicija pripremljene su prema postupku navedenom u našoj prethodnoj publikaciji s nekim izmjenama protokola pripreme. Omjer uree, polietilen glikola (PEG), TMOS-a, vode i octene kiseline prilagođen je kako bi se pripremile čestice silicija s velikom veličinom pora. Drugo, sintetiziran je novi ligand, fenilmaleimid-metil vinil izocijanat, i korišten je za derivatizaciju čestica silicija kako bi se pripremila polarno ugrađena stacionarna faza. Dobivena stacionarna faza pakirana je u kolonu od nehrđajućeg čelika (100 × 1,8 mm unutarnji promjer) korištenjem optimizirane sheme pakiranja. Pakiranje kolone potpomognuto je mehaničkim vibracijama kako bi se osiguralo stvaranje homogenog sloja unutar kolone. Procijenite odvajanje smjesa peptida koje se sastoje od pet peptida u pakiranoj koloni; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkefalin) i tripsin razgradnjom humanog serumskog albumina (HAS). Uočeno je da se smjesa peptida i tripsin razgradnjom HSA odvajaju s dobrom rezolucijom i učinkovitošću. Performanse odvajanja PMP kolone uspoređene su s performansama Ascentis Express RP-Amide kolone. Uočeno je da su i peptidi i proteini dobro razdvojeni i učinkoviti na PMP koloni, koja je bila učinkovitija od Ascentis Express RP-Amide kolone.
PEG (polietilen glikol), urea, octena kiselina, trimetoksi ortosilikat (TMOS), trimetil klorosilan (TMCS), tripsin, ljudski serumski albumin (HSA), amonijev klorid, urea, heksan metildisilazan (HMDS), metakriloil klorid (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), acetonitril (ACN) HPLC čistoće, metanol, 2-propanol i aceton kupljeni od tvrtke Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD).
Smjesa uree (8 g), polietilen glikola (8 g) i 8 mL 0,01 N octene kiseline miješana je 10 minuta, a zatim je dodano 24 mL TMOS-a pod ledeno hladnim uvjetima. Reakcijska smjesa zagrijavana je na 40 °C tijekom 6 sati, a zatim na 120 °C tijekom 8 sati u autoklavu od nehrđajućeg čelika. Voda je izlivena, a preostali materijal sušen je na 70 °C tijekom 12 sati. Osušena meka masa glatko je samljevena u pećnici i kalcinirana na 550 °C tijekom 12 sati. Pripremljene su i karakterizirane tri serije kako bi se ispitala ponovljivost veličine čestica, veličine pora i površine.
Površinskom modifikacijom čestica silicijevog dioksida prethodno sintetiziranim ligandom fenilmaleimid-metilvinilizocijanatom (PCMP), a zatim radijalnom polimerizacijom sa stirenom, pripremljen je spoj koji sadrži polarnu skupinu. Stacionarna faza za agregate i polistirenske lance. Postupak pripreme opisan je u nastavku.
N-fenilmaleimid (200 mg) i metil vinil izocijanat (100 mg) otopljeni su u suhom toluenu, a 0,1 mL 2,2'-azoizobutironitrila (AIBN) dodano je u reakcijsku tikvicu za pripremu kopolimera fenilmaleimid-metil vinil izocijanata (PMCP). Smjesa je zagrijavana na 60°C tijekom 3 sata, filtrirana i sušena u pećnici na 40°C tijekom 3 sata.
Osušene čestice silicija (2 g) dispergirane su u suhom toluenu (100 mL), miješane i sonicirane u tikvici s okruglim dnom od 500 mL tijekom 10 minuta. PMCP (10 mg) otopljen je u toluenu i kap po kap dodan u reakcijsku tikvicu putem lijevka za kapanje. Smjesa je refluksirana na 100°C tijekom 8 sati, filtrirana i isprana acetonom te sušena na 60°C tijekom 3 sata. Zatim su čestice silicija vezane na PMCP (100 g) otopljene u toluenu (200 ml) i dodan je 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) u prisutnosti 100 µL dibutilkositrovog dilaurata kao katalizatora. Smjesa je miješana na 50°C tijekom 8 sati, filtrirana i sušena na 50°C tijekom 3 sata.
Stiren (1 mL), benzoil peroksid BPO (0,5 mL) i čestice silicijevog dioksida vezane za TEMPO-PMCP (1,5 g) dispergirane su u toluenu i propuhane dušikom. Polimerizacija stirena provedena je na 100°C tijekom 12 sati. Dobiveni produkt ispran je metanolom i sušen na 60°C preko noći. Ukupna shema reakcije prikazana je na slici 1.
Uzorci su degazirani na 393 K tijekom 1 sata kako bi se postigao rezidualni tlak manji od 10-3 Torr. Količina N2 adsorbiranog pri relativnom tlaku P/P0 = 0,99 korištena je za određivanje ukupnog volumena pora. Morfologija golih i ligandima vezanih čestica silicija ispitana je skenirajućom elektronskom mikroskopijom (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Osušeni uzorci (goli silicijev dioksid i čestice silicija vezane ligandima) postavljeni su na aluminijski stupac pomoću ljepljive ugljične trake. Zlato je naneseno na uzorke pomoću raspršivača Q150T, a na uzorke je nanesen sloj Au od 5 nm. To poboljšava učinkovitost procesa korištenjem niskih napona i osigurava fino zrnato, hladno raspršivanje. Za elementarnu analizu korišten je elementarni analizator Thermo Electron (Waltham, MA, SAD) Flash EA1112. Za dobivanje raspodjele veličine čestica korišten je analizator veličine čestica Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Gole čestice silicija i čestice silicija vezane ligandima (5 mg svaki) su dispergirani u 5 mL izopropanola, sonicirani 10 minuta, vrtloženi 5 minuta i postavljeni na optički stol Mastersizera. Termogravimetrijska analiza provedena je brzinom od 5 °C u minuti u temperaturnom rasponu od 30 do 800 °C.
Kolone od nehrđajućeg čelika s uskim promjerom obložene staklom dimenzija (100 × 1,8 mm unutarnji promjer) pakirane su metodom pakiranja u suspenziji, primjenjujući isti postupak korišten u Ref. 31. Kolona od nehrđajućeg čelika (obložena staklom, unutarnji promjer 100 × 1,8 mm) s izlaznim priključkom koji sadrži fritu od 1 µm spojena je na pakirni uređaj za suspenziju (Alltech Deerfield, IL, SAD). Pripremite suspenziju stacionarne faze suspendiranjem 150 mg stacionarne faze u 1,2 mL metanola i pošaljite je u kolonu za skladištenje. Metanol je korišten kao otapalo za suspenziju, kao i kao pogonsko otapalo. Kolonu napunite sekvencijalno primjenom tlaka od 100 MP tijekom 10 minuta, 80 MP tijekom 15 minuta i 60 MP tijekom 30 minuta. Tijekom pakiranja, primijenjene su mehaničke vibracije s dvije GC tresilice za kolone (Alltech, Deerfield, IL, SAD) kako bi se osiguralo ravnomjerno pakiranje kolone. Zatvorite pakirni uređaj za suspenziju i polako otpustite tlak kako biste spriječili bilo kakvo oštećenje unutar kolone. Odvojite kolonu od jedinice za pakiranje suspenzije i spojite drugi priključak na ulaz i na LC sustav kako biste provjerili njezine performanse.
Konstruirana je LC pumpa (10AD Shimadzu, Japan), injektor (Valco (SAD) C14 W.05) s injekcijskom petljom od 50 nL, membranski degazator (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilarni prozor, poseban µLC detektor (UV-2075) i mikrokolone obložene staklom. Korištene su vrlo uske i kratke spojne cijevi kako bi se smanjio učinak dodatnog širenja vrpce kolone. Nakon pakiranja, kapilare (50 μm id 365) i kapilare redukcijskog spoja (50 μm) ugrađene su na izlaz od 1/16″ redukcijskog spoja. Prikupljanje podataka i kromatografska obrada provedeni su pomoću softvera Multichro 2000. Praćenje na 254 nm. Analiti su testirani na UV apsorbanciju. Kromatografski podaci analizirani su pomoću OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin iz ljudskog seruma, liofilizirani prašak, ≥ 96% (elektroforeza na agaroznom gelu) 3 mg pomiješan s tripsinom (1,5 mg), 4,0 M ureom (1 mL) i 0,2 M amonijevim bikarbonatom (1 mL). Otopina je miješana 10 minuta i držana u vodenoj kupelji na 37°C tijekom 6 sati, zatim ugašena s 1 mL 0,1% TFA. Otopina se filtrira i čuva na temperaturi ispod 4°C.
Razdvajanje peptidnih smjesa i tripsinskih digestija HSA odvojeno je procijenjeno na PMP kolonama. Provjerite razdvajanje peptidne smjese i tripsinske digestije HSA pomoću PMP kolone i usporedite rezultate s Ascentis Express RP-Amide kolonom. Teorijski broj ploča izračunava se na sljedeći način:
SEM slike golih čestica silicija i čestica silicija vezanih ligandima prikazane su na SLICI 2. SEM slike golih čestica silicija (A, B) pokazuju da su, za razliku od naših prethodnih studija, te čestice sferne, izdužene ili imaju nepravilnu simetriju. Površina čestica silicija vezanih ligandima (C, D) je glatkija od površine golih čestica silicija, što može biti posljedica premaza polistirenskih lanaca na površini čestica silicija.
Slike skenirajućeg elektronskog mikroskopa golih čestica silicija (A, B) i čestica silicija vezanih ligandom (C, D).
Raspodjela veličine čestica golih čestica silicija i čestica silicija vezanih ligandima prikazana je na slici 3(A). Krivulje raspodjele veličine čestica na temelju volumena pokazale su da se veličina čestica silicija povećala nakon kemijske modifikacije (slika 3A). Podaci o raspodjeli veličine čestica silicija iz trenutne studije i prethodne studije uspoređeni su u tablici 1(A). Veličina čestica PMP-a na temelju volumena, d(0,5), iznosi 3,36 μm, u usporedbi s našom prethodnom studijom s vrijednošću ad(0,5) od 3,05 μm (čestice silicija vezane za polistiren)34. Ova serija imala je užu raspodjelu veličine čestica u usporedbi s našom prethodnom studijom zbog različitih omjera PEG-a, uree, TMOS-a i octene kiseline u reakcijskoj smjesi. Veličina čestica PMP faze nešto je veća od veličine čestica faze silicija vezanih za polistiren koju smo prethodno proučavali. To znači da je površinska funkcionalizacija čestica silicija stirenom nanijela samo sloj polistirena (0,97 µm) na površinu silicija, dok je u PMP fazi debljina sloja bila 1,38 µm.
Raspodjela veličine čestica (A) i raspodjela veličine pora (B) čestica silicijevog dioksida bez primjesa i čestica silicijevog dioksida vezanih za ligand.
Veličina pora, volumen pora i površina čestica silicija u trenutnoj studiji prikazani su u Tablici 1(B). PSD profili golih čestica silicija i čestica silicija vezanih ligandima prikazani su na Slici 3(B). Rezultati su usporedivi s našom prethodnom studijom. Veličine pora golih i ligandima vezanih čestica silicija su 310 odnosno 241, što ukazuje na to da se veličina pora smanjuje za 69 nakon kemijske modifikacije, kao što je prikazano u Tablici 1(B), a promjena krivulje prikazana je na Slici 3(B). Slično tome, volumen pora čestica silicija smanjio se s 0,67 na 0,58 cm3/g nakon kemijske modifikacije. Specifična površina trenutno proučavanih čestica silicija iznosi 116 m2/g, što je usporedivo s našom prethodnom studijom (124 m2/g). Kao što je prikazano u Tablici 1(B), površina (m2/g) čestica silicija također se smanjila sa 116 m2/g na 105 m2/g nakon kemijske modifikacije. modifikacija.
Rezultati elementarne analize stacionarne faze prikazani su u Tablici 2. Udio ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi iznosi 6,35%, što je niže od udjela ugljika u našoj prethodnoj studiji (čestice silicijevog dioksida vezane polistirenom, 7,93%35 i 10,21%)42. Udio ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi je nizak jer su u pripremi trenutnog SP-a, osim stirena, korišteni i neki polarni ligandi poput fenilmaleimid-metilvinilizocijanata (PCMP) i 4-hidroksi-TEMPO. Težinski postotak dušika u trenutnoj stacionarnoj fazi iznosi 2,21%, u usporedbi s 0,1735 i 0,85 težinskih % dušika u prethodnim studijama. To znači da je težinski postotak dušika veći u trenutnoj stacionarnoj fazi zbog fenilmaleimida. Slično tome, udio ugljika u produktima (4) i (5) iznosio je 2,7% i 2,9%, dok je udio ugljika u konačnom produktu (6) bio 6,35%, kao što je prikazano u Tablici 2. Gubitak težine provjeren je stacionarnom fazom PMP-a, a TGA krivulja prikazana je na Slici 4. TGA krivulja pokazuje gubitak težine od 8,6%, što je u dobrom skladu s udjelom ugljika (6,35%) jer ligandi sadrže ne samo C već i N, O i H.
Fenilmaleimid-metilvinilizocijanatni ligand odabran je za modifikaciju površine čestica silicijevog dioksida jer ima polarne fenilmaleimidne skupine i vinilizocijanatne skupine. Vinil izocijanatne skupine mogu dalje reagirati sa stirenom polimerizacijom živih radikala. Drugi razlog je umetanje skupine koja ima umjerenu interakciju s analitom i nema jaku elektrostatsku interakciju između analita i stacionarne faze, budući da fenilmaleimidni dio nema virtualni naboj pri normalnom pH. Polaritet stacionarne faze može se kontrolirati optimalnom količinom stirena i vremenom reakcije polimerizacije slobodnih radikala. Posljednji korak reakcije (polimerizacija slobodnih radikala) je kritičan i može promijeniti polaritet stacionarne faze. Elementarna analiza provedena je kako bi se provjerilo opterećenje ugljikom u ovim stacionarnim fazama. Uočeno je da povećanje količine stirena i vremena reakcije povećava opterećenje ugljikom u stacionarnoj fazi i obrnuto. SP pripremljeni s različitim koncentracijama stirena imaju različito opterećenje ugljikom. Ponovno, stavite ove stacionarne faze u kolone od nehrđajućeg čelika i provjerite njihove kromatografske performanse (selektivnost, rezolucija, vrijednost N, itd.). Na temelju ovih eksperimenata odabrana je optimizirana formulacija za pripremu stacionarne faze PMP-a kako bi se osigurala kontrolirana polarnost i dobro zadržavanje analita.
Pet peptidnih smjesa (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) također je procijenjeno korištenjem PMP kolone s mobilnom fazom; 60/40 (v/v) acetonitril/voda (0,1% TFA) pri protoku od 80 μL/min. Pod optimalnim uvjetima eluacije, teorijski broj ploča (N) po koloni (100 × 1,8 mm un. promjera) je 20 000 ± 100 (200 000 ploča/m²). Tablica 3 daje vrijednosti N za tri PMP kolone, a kromatogrami su prikazani na slici 5A. Brza analiza na PMP koloni pri visokoj brzini protoka (700 μL/min), pet peptida je eluirano unutar jedne minute, vrijednosti N bile su vrlo dobre, 13 500 ± 330 po koloni (100 × 1,8 mm un. promjera), što odgovara 135 000 ploča/m² (slika 5B). Tri kolone identične veličine (100 × 1,8 mm un. promjera) bile su napunjene s tri različite serije stacionarne faze PMP-a kako bi se provjerila ponovljivost. Koncentracija analita za svaku kolonu zabilježena je korištenjem optimalnih uvjeta elucije i broja teorijskih ploča N te vremena zadržavanja za odvajanje iste testne smjese na svakoj koloni. Podaci o reproducibilnosti za PMP kolone prikazani su u Tablici 4. Reprodukcijnost PMP kolone dobro korelira s vrlo niskim vrijednostima %RSD, kao što je prikazano u Tablici 3.
Odvajanje smjese peptida na PMP koloni (B) i Ascentis Express RP-Amide koloni (A); mobilna faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimenzije PMP kolone (100 × 1,8 mm un. promjer); analitički. Redoslijed eluiranja spojeva: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (leucin) kiseli enkefalin).
PMP kolona (100 × 1,8 mm un. promjera) procijenjena je za odvajanje tripsinskih digestija humanog serumskog albumina visokoučinkovitom tekućinskom kromatografijom. Kromatogram na slici 6 pokazuje da je uzorak dobro odvojen i da je rezolucija vrlo dobra. Digestije HSA analizirane su korištenjem brzine protoka od 100 µL/min, mobilne faze 70/30 acetonitril/voda i 0,1% TFA. Kao što je prikazano na kromatogramu (slika 6), digestija HSA podijeljena je na 17 vrhova koji odgovaraju 17 peptida. Izračunata je učinkovitost odvajanja svakog vrha u digestiji HSA, a vrijednosti su dane u tablici 5.
Triptički razgradni produkt HSA (100 × 1,8 mm un. promjera) odvojen je na PMP koloni; brzina protoka (100 µL/min), mobilna faza 60/40 acetonitril/voda s 0,1% TFA.
gdje je L duljina kolone, η viskoznost mobilne faze, ΔP protutlak kolone, a u linearna brzina mobilne faze. Propusnost PMP kolone bila je 2,5 × 10-14 m2, brzina protoka bila je 25 μL/min, a korišten je ACN/voda omjera 60/40 v/v. Propusnost PMP kolone (100 × 1,8 mm un. promjera) bila je slična onoj iz naše prethodne studije Ref. 34. Propusnost kolone ispunjene površinski poroznim česticama je: 1,7 × 10-15 za čestice od 1,3 μm, 3,1 × 10-15 za čestice od 1,7 μm, 5,2 × 10-15 i 2,5 × 10-14 m2 za čestice od 2,6 μm za čestice od 5 μm 43. Stoga je propusnost PMP faze slična onoj čestica s jezgrom i ljuskom od 5 μm.
gdje je Wx težina kolone napunjene kloroformom, Wy je težina kolone napunjene metanolom, a ρ je gustoća otapala. Gustoće metanola (ρ = 0,7866) i kloroforma (ρ = 1,484). Ukupna poroznost kolona SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 i kolona C18-Urea 31 koje smo prethodno proučavali bila je 0,63 odnosno 0,55. To znači da prisutnost liganada uree smanjuje propusnost stacionarne faze. S druge strane, ukupna poroznost PMP kolone (100 × 1,8 mm id) je 0,60. Propusnost PMP kolona je niža od one kolona napunjenih česticama silicija vezanim C18 jer su u stacionarnim fazama tipa C18 ligandi C18 vezani za čestice silicija kao linearni lanci, dok se u stacionarnim fazama tipa polistirena oko njega formira relativno debeli polimerni sloj. U U tipičnom eksperimentu, poroznost kolone se izračunava kao:
Slika 7A i B prikazuje PMP kolonu (100 × 1,8 mm un. promjera) i Ascentis Express RP-Amide kolonu (100 × 1,8 mm un. promjera) korištenjem istih uvjeta elucije (tj. 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA). ) van Deemterovog dijagrama. Odabrane smjese peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkefalin) pripremljene su u 20 µL/min. Minimalna brzina protoka za obje kolone je 800 µL/min. Minimalne vrijednosti HETP-a pri optimalnoj brzini protoka (80 µL/min) za PMP kolonu i Ascentis Express RP-Amide kolonu bile su 2,6 µm odnosno 3,9 µm. Vrijednosti HETP-a ukazuju na to da je učinkovitost odvajanja PMP kolone (100 × 1,8 mm un. promjera) mnogo bolja od komercijalno dostupne Ascentis Express RP-Amide kolone (100 × 1,8 mm un. promjera). Van Deemterov dijagram na slici 7(A) pokazuje da smanjenje vrijednosti N s povećanjem protoka nije značajno u usporedbi s našom prethodnom studijom. Veća učinkovitost odvajanja PMP kolone (100 × 1,8 mm id) u usporedbi s Ascentis Express RP-Amide kolonom temelji se na poboljšanjima oblika, veličine čestica i složenih postupaka pakiranja kolone korištenih u trenutnom radu34.
(A) van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobiven korištenjem PMP kolone (100 × 1,8 mm un. promjer) u 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA. (B) van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobiven korištenjem Ascentis Express RP-Amide kolone (100 × 1,8 mm un. promjer) u 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA.
Pripremljena je i procijenjena polarno ugrađena stacionarna faza od polistirena za odvajanje sintetičkih peptidnih smjesa i tripsin digestije humanog serumskog albumina (HAS) u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti. Kromatografske performanse PMP kolona za peptidne smjese izvrsne su u učinkovitosti i rezoluciji odvajanja. Poboljšane performanse odvajanja PMP kolona posljedica su različitih razloga, kao što su veličina čestica i veličina pora čestica silicijevog dioksida, kontrolirana sinteza stacionarne faze i složeno pakiranje kolone. Osim visoke učinkovitosti odvajanja, nizak povratni tlak kolone pri visokim protocima još je jedna prednost ove stacionarne faze. PMP kolone pokazuju dobru ponovljivost i mogu se koristiti za analizu peptidnih smjesa i tripsin digestiju različitih proteina. Namjeravamo koristiti ovu kolonu za odvajanje prirodnih proizvoda, bioaktivnih spojeva iz ljekovitog bilja i gljivičnih ekstrakata u tekućinskoj kromatografiji. U budućnosti će se PMP kolone također procijeniti za odvajanje proteina i monoklonskih antitijela.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Istraživanje sustava za odvajanje peptida kromatografijom obrnute faze, I. dio: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. i dr. Poboljšani aktivni peptidi dizajnirani za liječenje zaraznih bolesti. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetski terapijski peptidi: znanost i tržište. Otkriće lijekova. 15 (1-2) danas, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Napredna proteomska tekućinska kromatografija. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i dr. Napredna tekućinska kromatografija-masena spektrometrija omogućuje uključivanje široko ciljane metabolomike i proteomike. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u razvoju lijekova. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Temeljni i praktični aspekti ultravisokotlačne tekućinske kromatografije za brza odvajanja. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Primjena tekućinske kromatografije ultravisoke učinkovitosti u razvoju lijekova. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i dr. Monolitni makroporozni hidrogeli pripremljeni iz emulzija ulja u vodi s visokim udjelom unutarnje faze za učinkovito pročišćavanje enterovirusa. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Uloga tekućinske kromatografije u proteomici. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. i Guillarme, D. Novi trendovi u odvajanju terapijskih peptida i proteina tekućinskom kromatografijom obrnute faze: teorija i primjena. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sustava s različitim pH vrijednostima u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. i dr. Istražene su karakteristike prijenosa mase i kinetičke performanse visokoučinkovitih kromatografskih kolona punjenih potpuno i površinski poroznim česticama C18 sub-2 μm. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. i dr. Nedavni trendovi i analitički izazovi u izolaciji, identifikaciji i validaciji biljnih bioaktivnih peptida. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB i dr. Proteomski krajolik carstva života. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. i dr. Obrada terapijskih peptida preparativnom tekućinskom kromatografijom. Molecule (Basel, Švicarska) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. i Geng, X. Mješovita kromatografija i njezina primjena na biopolimere. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. i Sun, Y. Ligandi za miješanu proteinsku kromatografiju: princip, karakterizacija i dizajn. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).