Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana ny CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na hamono ny fomba mifanaraka amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia hampiseho ny tranonkala tsy misy styles sy JavaScript izahay.
Nomanina tamin'ny fomba sol-gel ireo poti-silica misy lavaka miaraka amin'ny fanovana sasany mba hahazoana poti-macroporous. Ireo poti-silica ireo dia nohavaozina tamin'ny alàlan'ny polymerization reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) miaraka amin'ny N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) sy styrene mba hanomanana ny intercalation N-phenylmaleimide amin'ny dingana tsy mihetsika polystyrene (PMP). Ireo tsanganana vy tsy misy harafesina tery (100 × 1.8 mm id) dia nofonosina tamin'ny alàlan'ny slurry packing. Nojerena ny fisarahana tsanganana PMP amin'ny fangaro peptide misy peptide dimy (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) (chromatographic performance) ary ny trypsin digestion of human serum albumin (HAS). Eo ambanin'ny fepetra elution tsara indrindra, ny isan'ny takelaka teorika amin'ny fangaro peptide dia mahatratra 280,000 takelaka/m². Raha ampitahaina ny fahombiazan'ny fisarahana amin'ny tsanganana novolavolaina amin'ny Ascentis ara-barotra. Tao amin'ny tsanganana Express RP-Amide, dia hita fa ny fahombiazan'ny fisarahana amin'ny tsanganana PMP dia tsara kokoa noho ny tsanganana ara-barotra raha ny amin'ny fahombiazan'ny fisarahana sy ny famahana azy.
Tato anatin'ny taona vitsivitsy, ny indostrian'ny biopharmaceutique dia lasa tsena manerantany mivelatra miaraka amin'ny fitomboan'ny tsena be dia be. Miaraka amin'ny fitomboan'ny indostrian'ny biopharmaceutique1,2,3, ny famakafakana peptides sy proteinina dia tena ilaina. Ankoatra ny peptide kendrena, dia misy loto maromaro vokarina mandritra ny fananganana peptide, ka mitaky fanadiovana chromatografika mba hahazoana peptides manana ny fahadiovana irina. Ny famakafakana sy ny famaritana ny proteinina ao amin'ny tsiranoka, tavy ary sela ao amin'ny vatana dia asa tena sarotra noho ny habetsahan'ny karazana mety ho hita ao anaty santionany tokana. Na dia fitaovana mahomby amin'ny filaharan'ny peptide sy proteinina aza ny spectrometry faobe, raha ampidirina ao amin'ny spectrometer faobe indray mandeha ireo santionany ireo, dia tsy ho tonga lafatra ny fisarahana. Azo ahena ity olana ity amin'ny alàlan'ny fampiharana ny fisarahana chromatography ranoka (LC) alohan'ny famakafakana MS, izay hampihena ny isan'ny analytes miditra ao amin'ny spectrometer faobe amin'ny fotoana iray4,5,6. Ho fanampin'izany, mandritra ny fisarahana dingana ranoka, dia azo ifantohana amin'ny faritra tery ny analytes, ka mampifantoka ireo analytes ireo ary manatsara ny fahatsapana ny fahitana MS. Ny chromatography ranoka (LC) dia manana nandroso be nandritra ny folo taona lasa ary lasa teknika malaza amin'ny fanadihadiana proteomika7,8,9,10.
Ny chromatography ranoka dingana mivadika (RP-LC) dia ampiasaina betsaka amin'ny fanadiovana sy fanasarahana ny fangaro peptide amin'ny fampiasana silica octadecyl-modified (ODS) ho dingana tsy mihetsika11,12,13. Na izany aza, ny dingana tsy mihetsika RP dia tsy manome fanasarahana mahafa-po ny peptides sy proteinina noho ny rafitra sarotra sy ny toetra amphiphilic 14,15. Noho izany, ilaina ny dingana tsy mihetsika namboarina manokana mba handinihana ny peptides sy proteinina misy singa polar sy tsy polar mba hifaneraserana sy hitazonana ireo analytes ireo16. Ny chromatography fomba mifangaro, izay manome fifandraisana multimodal, dia mety ho safidy hafa amin'ny RP-LC ho an'ny fanasarahana ny peptides, proteinina ary fangaro sarotra hafa. Efa nomanina ny dingana tsy mihetsika fomba mifangaro maromaro, ary ny tsanganana feno ireo dingana ireo dia nampiasaina ho an'ny fanasarahana peptide sy proteinina17,18,19,20,21. Ny dingana tsy mihetsika fomba mifangaro (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation polar/RPLC) dia mety amin'ny fanasarahana peptide sy proteinina noho ny fisian'ny polar sy vondrona tsy polar22,23,24,25,26,27,28. Toy izany koa, ny dingana tsy mihetsika intercalating polar miaraka amin'ny vondrona polar mifamatotra covalently dia mampiseho hery fisarahana tsara sy fifantenana miavaka ho an'ny analytes polar sy tsy polar, satria ny fisarahana dia miankina amin'ny fifandraisana misy eo amin'ny analyte sy ny dingana tsy mihetsika. Fifandraisana multimodal 29, 30, 31, 32. Vao haingana, Zhang et al. 30 dia nanomana dingana tsy mihetsika polyamine dodecyl-terminated ary nanasaraka soa aman-tsara ny hydrocarbons, antidepressants, flavonoids, nucleosides, estrogens, ary analytes maromaro hafa. Ny intercalator polar dia manana vondrona polar sy tsy polar, ka azo ampiasaina hanasarahana peptides sy proteinina izay manana moieties hydrophobic sy hydrophilic. Ny tsanganana polar-embedded (ohatra, tsanganana C18 amide-embedded) dia azo vidiana ara-barotra amin'ny anarana ara-barotra Ascentis Express RP-Amide tsanganana, saingy ireo tsanganana ireo dia ampiasaina amin'ny famakafakana ny amine 33 ihany.
Tao amin'ny fanadihadiana ankehitriny, dia nomanina sy nojerena ny dingana tsy mihetsika misy polar (polystyrene misy N-phenylmaleimide) mba hanasarahana ny peptides sy ny trypsin digests an'ny HSA. Nomanina tamin'ny alalan'ity paikady manaraka ity ny dingana tsy mihetsika. Nomanina araka ny fomba fiasa nomena tao amin'ny boky navoakanay teo aloha ny poti-silica porous miaraka amin'ny fanovana sasany amin'ny protocole fanomanana. Nohavaozina ny tahan'ny urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS, asidra asetika rano mba hanomanana poti-silica manana habe mason-koditra lehibe. Faharoa, nisy ligand vaovao, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, novokarina ary nampiasaina mba hamokarana poti-silica mba hanomanana dingana tsy mihetsika misy polar. Ny dingana tsy mihetsika vokarina dia nofonosina tao anaty tsanganana vy tsy misy harafesina (100 × 1.8 mm id) tamin'ny fampiasana ny tetika famonosana nohatsaraina. Ny famonosana tsanganana dia ampian'ny hovitrovitra mekanika mba hahazoana antoka fa misy fandriana homogeneous miforona ao anatin'ny tsanganana. Tombano ny fanasarahana tsanganana feno amin'ny fangaro peptide misy peptide dimy; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) sy ny Trypsin digest an'ny albumin'ny sérum olombelona (HAS). Hita fa nisaraka tsara ny fangaroan'ny peptide sy ny trypsin digest an'ny HSA ary nahomby tsara. Noharina tamin'ny an'ny tsanganana Ascentis Express RP-Amide ny fahombiazan'ny fisarahana amin'ny tsanganana PMP. Samy voavaha tsara sy mahomby amin'ny tsanganana PMP ny peptide sy ny proteinina, izay nahomby kokoa noho ny tsanganana Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, Asidra Acetic, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Albumin'ny Serum Human (HSA), Ammonium Chloride, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Methanol, 2-Propanol, ary Acetone Novidina avy any Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Etazonia).
Nafangaro nandritra ny 10 minitra ny fangaroan'ny urea (8 g), polyethylene glycol (8 g), ary 8 mL ny asidra asetika 0.01 N, ary avy eo dia nampiana TMOS 24 mL tao anatin'izany tao anaty toe-javatra mangatsiaka be. Nafanaina tamin'ny 40°C nandritra ny 6 ora ny fangaro ary avy eo tamin'ny 120°C nandritra ny 8 ora tao anaty autoclave vy tsy misy harafesina. Araraka ny rano ary maina tamin'ny 70°C nandritra ny 12 ora ny akora sisa tavela. Nototoina malama tao anaty lafaoro ny vovoka malemilemy maina ary nokapohina tamin'ny 550°C nandritra ny 12 ora. Nisy andiany telo nomanina sy nofaritana mba handinihana ny fahafaha-mamerina ny haben'ny poti-javatra, ny haben'ny mason-koditra ary ny velaran'ny velarany.
Tamin'ny alalan'ny fanovana ny velaran'ny poti-silica tamin'ny alalan'ny phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) ligand efa voafintina mialoha arahin'ny polymerization radial tamin'ny styrene, dia nomanina ny singa misy vondrona polar. Dingana tsy mihetsika ho an'ny aggregate sy rojo polystyrene. Hazavaina etsy ambany ny dingana fanomanana.
Nolevonina tao anaty toluene maina ny N-phenylmaleimide (200 mg) sy ny methyl vinyl isocyanate (100 mg), ary nampiana 0.1 mL ny 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) tao anaty tavoara fanaovana fihetsiketsehana mba hanomanana ny phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate copolymer (PMCP). Nafanaina tamin'ny 60°C nandritra ny 3 ora ny fangaro, nosivana ary nohamainina tao anaty lafaoro tamin'ny 40°C nandritra ny 3 ora.
Naparitaka tao anaty toluene maina (100 mL) ireo poti-silica maina (2 g), nafangaro ary nohamainina tao anaty tavoara boribory 500 mL nandritra ny 10 minitra. Ny PMCP (10 mg) dia natsonika tao anaty toluene ary nampiana tsikelikely tao anaty tavoara tamin'ny alalan'ny "funnel" fandatsahana rano. Natsonika tamin'ny 100°C nandritra ny 8 ora ny fangaro, nosivana ary nosasana tamin'ny acétone ary nohamainina tamin'ny 60°C nandritra ny 3 ora. Avy eo, ny poti-silica mifamatotra amin'ny PMCP (100 g) dia natsonika tao anaty toluene (200 ml) ary nampiana 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) teo anatrehan'ny dibutyltin dilaurate 100 µL ho toy ny katalista. Natsonika tamin'ny 50°C nandritra ny 8 ora ny fangaro, nosivana ary nohamainina tamin'ny 50°C nandritra ny 3 ora.
Naparitaka tao anaty toluene ny styrene (1 mL), ny benzoyl peroxide BPO (0.5 mL), ary ny poti-silica miraikitra amin'ny TEMPO-PMCP (1.5 g) ary nodiovina tamin'ny azota. Natao tamin'ny 100°C nandritra ny 12 ora ny polymerization ny styrene. Nosasana tamin'ny methanol ny vokatra azo ary nohamainina tamin'ny 60°C nandritra ny alina. Aseho amin'ny Sary 1 ny tetika fihetsika ankapobeny.
Nesorina tamin'ny 393 K nandritra ny adiny 1 ireo santionany mba hahazoana tsindry sisa tavela latsaky ny 10-3 Torr. Ny habetsaky ny N2 voatsindrona tamin'ny tsindry mifandraika amin'ny P/P0 = 0.99 dia nampiasaina mba hamaritana ny volume mason-koditra manontolo. Ny endriky ny poti-silica miboridana sy mifamatotra amin'ny ligand dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny mikroskopia elektronika scanning (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japon). Ny santionany maina (silica miboridana sy poti-silica mifamatotra amin'ny ligand) dia napetraka teo amin'ny tsanganana aluminium mampiasa karbônina lakaoly. Ny volamena dia nopetahana takelaka teo amin'ireo santionany tamin'ny fampiasana coater sputter Q150T, ary ny sosona Au 5 nm dia napetraka teo amin'ireo santionany. Izany dia manatsara ny fahombiazan'ny dingana amin'ny fampiasana voltazy ambany ary manome voamaina tsara sy mangatsiaka sputtering. Ny mpandinika singa Thermo Electron (Waltham, MA, Etazonia) Flash EA1112 dia nampiasaina ho an'ny fanadihadiana singa. Ny mpandinika haben'ny poti-Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 dia nampiasaina mba hahazoana ny fizarana haben'ny poti-. Ny poti-silica miboridana sy ny silica mifamatotra amin'ny ligand Naparitaka tao anaty isopropanol 5 mL ny poti-javatra (5 mg avy), nojerena nandritra ny 10 minitra, nohozongozonina nandritra ny 5 minitra, ary napetraka teo amin'ny dabilio optika an'ny Mastersizer. Natao tamin'ny tahan'ny 5 °C isan-minitra ny fanadihadiana thermogravimetrika tamin'ny mari-pana 30 ka hatramin'ny 800 °C.
Nofonosina tamin'ny alalan'ny fomba famonosana slurry ireo tsanganana vy tsy misy harafesina misy vera ary manana refy (100 × 1.8 mm id), izay nampihatra ny fomba fiasa mitovy amin'ny ampiasaina ao amin'ny Ref. 31. Andry vy tsy misy harafesina (voarakotra fitaratra, 100 × 1.8 mm id) misy fantsona fivoahana misy frit 1 µm no nampifandraisina tamin'ny milina famonosana slurry (Alltech Deerfield, IL, Etazonia). Manomàna slurry dingana tsy mihetsika amin'ny alàlan'ny fampiatoana 150 mg ny dingana tsy mihetsika ao anaty methanol 1.2 mL ary alefaso any amin'ny andry fitahirizana. Ny methanol dia nampiasaina ho toy ny solvent slurry ary koa ho toy ny solvent manosika. Fenoy tsikelikely ny andry amin'ny alàlan'ny fanerena 100 MP mandritra ny 10 minitra, 80 MP mandritra ny 15 minitra, ary 60 MP mandritra ny 30 minitra. Nandritra ny famonosana, dia nampiharina ny hovitrovitra mekanika tamin'ny alàlan'ny mpanetsiketsika andry GC roa (Alltech, Deerfield, IL, Etazonia) mba hahazoana antoka fa famonosana mitovy ny andry. Akombony ny milina famonosana slurry ary avoahy miadana ny tsindry mba hisorohana ny fahasimbana ao anatin'ny andry. Esory ny andry amin'ny singa famonosana slurry ary ampifandraiso amin'ny fantsona fidirana sy amin'ny rafitra LC ny fitting hafa mba hijerena ny fahombiazany.
Paompy LC (10AD Shimadzu, Japon), mpanindrona (Valco (Etazonia) C14 W.05) misy tadivavarana fampidirana 50nL, mpanala gazy amin'ny membrane (Shimadzu DGU-14A), varavarankely kapila UV-VIS no namboarina. Fitaovana mpitsikilo µLC manokana (UV-2075) sy tsanganana kely misy fitaratra no nampiasaina. Ampiasao fantsona mampitohy tery sy fohy mba hampihenana ny vokatry ny fanitarana ny tarika tsanganana fanampiny. Rehefa avy nofonosina, dia napetraka teo amin'ny fivoahan'ny 1/16″ an'ny fampivondronana ny kapila (50 μm id 365 sy ny kapila mampivondrona (50 μm) ny kapila. Natao tamin'ny alalan'ny rindrambaiko Multichro 2000 ny fanangonana angon-drakitra sy ny fanodinana chromatography. Notsapaina ny fanaraha-maso amin'ny 254 nm Analytes mba hahitana ny fidiran'ny UV. Nohadihadiana tamin'ny alalan'ny OriginPro8 (Northampton, MA) ny angon-drakitra chromatography.
Albumina avy amin'ny sérum-n'olombelona, ​​vovoka lyophilized, ≥ 96% (electrophoresis gel agarose) 3 mg afangaro amin'ny trypsin (1.5 mg), urea 4.0 M (1 mL), ary bikarbonate ammonium 0.2 M (1 mL). Nohetsehina nandritra ny 10 minitra ny vahaolana ary notehirizina tao anaty rano fandroana tamin'ny 37°C nandritra ny 6 ora, avy eo dia novonoina tamin'ny 1 mL an'ny 0.1% TFA. Sivanina ny vahaolana ary tehirizo ambanin'ny 4 °C.
Nodinihina misaraka tamin'ny tsanganana PMP ny fisarahana ny fangaro peptide sy ny digest trypsin HSA. Jereo ny fisarahana ny fangaro peptide sy ny digest trypsin an'ny HSA amin'ny tsanganana PMP ary ampitahao amin'ny tsanganana Ascentis Express RP-Amide ny valiny. Kajy toy izao manaraka izao ny laharan'ny takelaka teorika:
Aseho amin'ny SARY 2 ny sary SEM an'ny poti silika miboridana sy ny poti silika mifamatotra amin'ny ligand. Ny sary SEM an'ny poti silika miboridana (A, B) dia mampiseho fa, mifanohitra amin'ny fanadihadiana nataonay teo aloha, ireo poti ireo dia boribory izay lava na tsy mitovy ny simetria. Ny velaran'ny poti silika mifamatotra amin'ny ligand (C, D) dia malama kokoa noho ny an'ny poti silika miboridana, izay mety ho vokatry ny rojo polystyrene eo amin'ny velaran'ny poti silika.
Sary avy amin'ny mikraoskaopy elektrôna scanning an'ireo poti-silica miboridana (A, B) sy ireo poti-silica mifamatotra amin'ny ligand (C, D).
Aseho amin'ny Sary 3(A) ny fizarazarana haben'ny poti-javatra amin'ny poti-javatra silika miboridana sy ny poti-javatra silika mifamatotra amin'ny ligand. Ny fiolahana fizarazarana haben'ny poti-javatra mifototra amin'ny habetsahana dia naneho fa nitombo ny haben'ny poti-javatra silika taorian'ny fanovana simika (Sary 3A). Ny angon-drakitra fizarazarana haben'ny poti-javatra amin'ny poti-javatra silika avy amin'ny fandalinana ankehitriny sy ny fandalinana teo aloha dia ampitahaina amin'ny Tabilao 1(A). Ny haben'ny poti-javatra mifototra amin'ny habetsahana, d(0.5), an'ny PMP dia 3.36 μm, raha oharina amin'ny fandalinana teo aloha miaraka amin'ny sandan'ny ad(0.5) 3.05 μm (poti-javatra silika mifamatotra amin'ny polystyrene)34. Ity andiany ity dia nanana fizarazarana haben'ny poti-javatra tery kokoa raha oharina amin'ny fandalinana teo aloha noho ny tahan'ny PEG, urea, TMOS, ary asidra asetika miovaova ao amin'ny fangaro fihetsika. Ny haben'ny poti-javatra amin'ny dingana PMP dia somary lehibe kokoa noho ny an'ny dingana poti-javatra silika mifamatotra amin'ny polystyrene izay nodinihinay teo aloha. Midika izany fa ny fiasan'ny ety ambonin'ny poti-javatra silika miaraka amin'ny styrene dia nametraka sosona polystyrene (0.97 µm) teo amin'ny ety ambonin'ny silika, raha toa kosa ka tamin'ny dingana PMP ny hatevin'ny sosona dia 1.38 µm.
Fizarana haben'ny poti (A) sy fizarana haben'ny mason-koditra (B) an'ny poti silika miboridana sy ny poti silika mifamatotra amin'ny ligand.
Ny haben'ny mason-koditra, ny haben'ny mason-koditra ary ny velaran'ny poti-silica amin'ity fandalinana ity dia omena ao amin'ny Tabilao 1(B). Ny mombamomba ny PSD amin'ny poti-silica miboridana sy ny poti-silica mifamatotra amin'ny ligand dia aseho amin'ny Sary 3(B). Ny valiny dia azo ampitahaina amin'ny fandalinanay teo aloha. Ny haben'ny mason-koditra amin'ny poti-silica miboridana sy mifamatotra amin'ny ligand dia 310 sy 241, izay midika fa mihena 69 ny haben'ny mason-koditra aorian'ny fanovana simika, araka ny aseho amin'ny Tabilao 1(B), ary ny fiovan'ny fiolahana dia aseho amin'ny Sary 3(B). Toy izany koa, ny haben'ny mason-koditra amin'ny poti-silica dia nihena avy amin'ny 0.67 ka hatramin'ny 0.58 cm3/g taorian'ny fanovana simika. Ny velaran'ny velaran'ny poti-silica ianarana amin'izao fotoana izao dia 116 m2/g, izay azo ampitahaina amin'ny fandalinanay teo aloha (124 m2/g). Araka ny aseho amin'ny Tabilao 1(B), ny velaran'ny velaran'ny poti-silica (m2/g) dia nihena ihany koa avy amin'ny 116 m2/g ka hatramin'ny 105 m2/g taorian'ny fanovana simika. fanovana.
Aseho ao amin'ny Tabilao 2 ny valin'ny fanadihadiana singa momba ny dingana tsy mihetsika. Ny enta-mavesatry ny karbônina amin'ny dingana tsy mihetsika ankehitriny dia 6.35%, izay ambany noho ny enta-mavesatry ny karbônina tamin'ny fanadihadiana teo aloha (polystyrene bonded silica particles, 7.93%35 sy 10.21%, tsirairay avy) 42. Ambany ny enta-mavesatry ny karbônina amin'ny dingana tsy mihetsika ankehitriny, satria amin'ny fanomanana ny SP ankehitriny, ankoatra ny styrene, dia nampiasaina ny ligand polar sasany toy ny phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) sy 4-hydroxy-TEMPO. Ny isan-jaton'ny lanjan'ny azota amin'ny dingana tsy mihetsika ankehitriny dia 2.21%, raha oharina amin'ny 0.1735 sy 0.85% amin'ny lanjan'ny azota tamin'ny fanadihadiana teo aloha. Midika izany fa ambony kokoa ny wt % amin'ny azota amin'ny dingana tsy mihetsika ankehitriny noho ny phenylmaleimide. Toy izany koa, ny enta-mavesatry ny karbônina amin'ny vokatra (4) sy (5) dia 2.7% sy 2.9%, tsirairay avy, raha ny enta-mavesatry ny karbônina amin'ny farany Ny vokatra (6) dia 6.35%, araka ny aseho amin'ny Tabilao 2. Ny fihenan-danja dia nojerena tamin'ny dingana tsy mihetsika PMP, ary ny fiolahana TGA dia aseho amin'ny Sary 4. Ny fiolahana TGA dia mampiseho fihenan-danja 8.6%, izay mifanaraka tsara amin'ny enta-mavesatry ny karbônina (6.35%) satria ny ligand dia tsy ahitana C ihany fa misy N, O, ary H koa.
Ny ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate no nofidina ho an'ny fanovana ny velaran'ny poti-silica satria manana vondrona phenylmaleimide polar sy vondrona vinylisocyanate izy. Ny vondrona vinyl isocyanate dia afaka mihetsika bebe kokoa amin'ny styrene amin'ny alàlan'ny polymerization radical velona. Ny antony faharoa dia ny fampidirana vondrona izay manana fifandraisana antonony amin'ny analyte ary tsy misy fifandraisana elektrostatika matanjaka eo amin'ny analyte sy ny dingana tsy mihetsika, satria ny ampahany phenylmaleimide dia tsy manana fiampangana virtoaly amin'ny pH ara-dalàna. Ny polarity amin'ny dingana tsy mihetsika dia azo fehezina amin'ny alàlan'ny habetsahan'ny styrene tsara indrindra sy ny fotoana fihetsehan'ny polymerization radical afaka. Ny dingana farany amin'ny fihetsehana (polymerization radical afaka) dia tena ilaina ary afaka manova ny polarity amin'ny dingana tsy mihetsika. Natao ny fanadihadiana singa mba hijerena ny enta-mavesatry ny karbônina amin'ireo dingana tsy mihetsika ireo. Hita fa ny fampitomboana ny habetsahan'ny styrene sy ny fotoana fihetsehana dia nampitombo ny enta-mavesatry ny karbônina amin'ny dingana tsy mihetsika ary ny mifamadika amin'izany. Ny SP voaomana amin'ny fifantohana styrene samihafa dia manana enta-mavesatry ny karbônina samihafa. Averina indray, ampidiro ao anaty tsanganana vy tsy misy harafesina ireo dingana tsy mihetsika ireo ary jereo ny fahombiazan'ny chromatographic. (fifantenana, famaha, sanda N, sns.). Mifototra amin'ireo andrana ireo, dia nofantenana ny raikipohy nohatsaraina mba hanomanana ny dingana tsy mihetsika PMP mba hahazoana antoka fa voafehy ny polarité sy ny fitazonana tsara ny analyte.
Nodinihina ihany koa ny fangaroan'ny peptide dimy (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) tamin'ny fampiasana tsanganana PMP mampiasa dingana finday; 60/40 (v/v) acetonitrile/rano (0.1% TFA) amin'ny tahan'ny fikorianan'ny 80 μL/min. Ao anatin'ny fepetra elution tsara indrindra, ny isan'ny takelaka teorika (N) isaky ny tsanganana (100 × 1.8 mm id) dia 20,000 ± 100 (200,000 takelaka/m²). Ny Tabilao 3 dia manome ny sanda N ho an'ny tsanganana PMP telo ary ny chromatograms dia aseho amin'ny Sary 5A. Fanadihadiana haingana amin'ny tsanganana PMP amin'ny tahan'ny fikorianan'ny rano avo (700 μL/min), peptide dimy no nesorina tao anatin'ny iray minitra, ny sanda N dia tena tsara, 13,500 ± 330 isaky ny tsanganana (100 × 1.8 mm id), Mifanitsy amin'ny takelaka 135,000/m (Sary 5B). Andry telo mitovy habe (100 × 1.8 mm id) no nofenoina dingana tsy mihetsika PMP telo samihafa mba hanamarinana ny fahafaha-mamerina. Ny Noraisina an-tsoratra ny fifantohan'ny analyte ho an'ny tsanganana tsirairay tamin'ny fampiasana ny fepetra elution tsara indrindra sy ny isan'ny takelaka teorika N ary ny fotoana fitazonana mba hanasarahana ny fangaro fitsapana mitovy amin'ny tsanganana tsirairay. Aseho ao amin'ny Tabilao 4 ny angon-drakitra momba ny famerimberenana ho an'ny tsanganana PMP. Ny famerimberenana ny tsanganana PMP dia mifandray tsara amin'ny sanda %RSD ambany dia ambany, araka ny aseho ao amin'ny Tabilao 3.
Fanasarahana ny fangaroan'ny peptide eo amin'ny tsanganana PMP (B) sy ny tsanganana Ascentis Express RP-Amide (A); dingana finday 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), refy tsanganana PMP (100 × 1.8 mm id); famakafakana Ny filaharan'ny elution an'ireo fitambarana: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ary 5 (leucine) asidra enkephalin)).
Nodinihina ny tsanganana PMP (100 × 1.8 mm id) mba hanasarahana ny digest tryptic an'ny albumin'ny serum olombelona amin'ny alàlan'ny chromatography liquide avo lenta. Ny chromatogram ao amin'ny Sary 6 dia mampiseho fa misaraka tsara ny santionany ary tena tsara ny vahaolana. Nodinihina ny digest HSA tamin'ny fampiasana tahan'ny fikorianan'ny 100 µL/min, phase mobile 70/30 acetonitrile/rano ary 0.1% TFA. Araka ny aseho amin'ny chromatogram (Sary 6), ny digest HSA dia nozaraina ho tendrony 17 mifanaraka amin'ny peptide 17. Nokajiana ny fahombiazan'ny fisarahana ny tendrony tsirairay ao amin'ny digest HSA ary omena ao amin'ny Tabilao 5 ny sandany.
Nosarahina teo amin'ny tsanganana PMP ny digest tryptic an'ny HSA (100 × 1.8 mm id); tahan'ny fikorianan'ny rano (100 µL/min), dingana finday 60/40 acetonitrile/rano miaraka amin'ny 0.1% TFA.
izay L ny halavan'ny tsanganana, η ny viscosity-n'ny dingana finday, ΔP ny tsindry miverina amin'ny tsanganana, ary u ny hafainganam-pandeha linear-n'ny dingana finday. Ny permeability an'ny tsanganana PMP dia 2.5 × 10-14 m2, ny tahan'ny fikorianan'ny rano dia 25 μL/min, ary 60/40 v/v ACN/rano no nampiasaina. Ny permeability an'ny tsanganana PMP (100 × 1.8 mm id) dia mitovy amin'ny tamin'ny fianarana teo aloha Ref.34. Ny permeability an'ny tsanganana feno poti-javatra porous dia: 1.7 × 10-15 ho an'ny poti-javatra 1.3 μm, 3.1 × 10-15 ho an'ny poti-javatra 1.7 μm, 5.2 × 10-15 ary 2.5 × 10-14 m2 ho an'ny poti-javatra 2.6 μm Ho an'ny poti-javatra 5 μm 43. Noho izany, ny permeability an'ny dingana PMP dia mitovy amin'ny an'ny poti-javatra core-shell 5 μm.
izay Wx ny lanjan'ny tsanganana feno klôrofôma, Wy ny lanjan'ny tsanganana feno methanol, ary ρ ny hakitroky ny solvent. Ny hakitroky ny methanol (ρ = 0.7866) sy ny klôrofôma (ρ = 1.484). Ny porosity manontolo amin'ny tsanganana SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 sy ny tsanganana C18-Urea 31 izay nodinihinay teo aloha dia 0.63 sy 0.55 tsirairay avy. Midika izany fa ny fisian'ny ligand urea dia mampihena ny permeability amin'ny dingana tsy mihetsika. Etsy ankilany, ny porosity manontolo amin'ny tsanganana PMP (100 × 1.8 mm id) dia 0.60. Ny permeability amin'ny tsanganana PMP dia ambany noho ny an'ny tsanganana feno poti silika mifamatotra amin'ny C18 satria amin'ny dingana tsy mihetsika karazana C18 dia mifamatotra amin'ny poti silika ho toy ny rojo linear ny ligand C18, raha amin'ny dingana tsy mihetsika karazana polystyrene kosa, ny sosona polymer matevina A dia miforona manodidina Amin'ny andrana mahazatra, ny porosity an'ny tsanganana dia kajy toy izao:
Ny Sary 7A, B dia mampiseho ny tsanganana PMP (100 × 1.8 mm id) sy ny tsanganana Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) mampiasa ireo fepetra elution mitovy (ohatra, 60/40 ACN/H2O sy 0.1% TFA). ) amin'ny teti-bolan'ny van Deemter. Ireo fangaro peptide voafantina (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) dia nomanina tao anaty 20 µL/. Ny tahan'ny fikorianan'ny rano kely indrindra ho an'ny tsanganana roa dia 800 µL/min. Ny sandan'ny HETP kely indrindra amin'ny tahan'ny fikorianan'ny rano tsara indrindra (80 µL/min) ho an'ny tsanganana PMP sy ny tsanganana Ascentis Express RP-Amide dia 2.6 µm sy 3.9 µm tsirairay avy. Ny sandan'ny HETP dia manondro fa ny fahombiazan'ny fisarahana amin'ny tsanganana PMP (100 × 1.8 mm id) dia tsara lavitra noho ny tsanganana Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) azo vidiana eny an-tsena. Ny sary van Deemter ao amin'ny Sary 7(A) dia mampiseho fa ny fihenan'ny sandan'ny N miaraka amin'ny fitomboan'ny fikorianan'ny rano dia tsy manan-danja raha oharina amin'ny fanadihadiana teo aloha. Ny fahombiazan'ny fisarahana ambony kokoa amin'ny tsanganana PMP (100 × 1.8 mm id) raha oharina amin'ny tsanganana Ascentis Express RP-Amide dia mifototra amin'ny fanatsarana ny endriky ny poti, ny habeny ary ny fomba fiasa sarotra amin'ny famonosana tsanganana ampiasaina amin'ny asa ankehitriny34.
(A) teti-bolana van Deemter (HETP mifanandrina amin'ny hafainganam-pandeha linearin'ny dingana finday) azo tamin'ny fampiasana tsanganana PMP (100 × 1.8 mm id) ao anaty 60/40 ACN/H2O miaraka amin'ny 0.1% TFA. (B) teti-bolana van Deemter (HETP mifanandrina amin'ny hafainganam-pandeha linearin'ny dingana finday) azo tamin'ny fampiasana tsanganana Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) ao anaty 60/40 ACN/H2O miaraka amin'ny 0.1% TFA.
Nomanina sy nojerena ny dingana tsy mihetsika vita amin'ny polystyrene polar-embedded mba hanasarahana ny fangaro peptide sentetika sy ny trypsin digests amin'ny albumin'ny serum olombelona (HAS) amin'ny alàlan'ny chromatography liquide avo lenta. Ny fahombiazan'ny chromatography an'ny tsanganana PMP ho an'ny fangaro peptide dia tena tsara amin'ny fahombiazan'ny fisarahana sy ny famahana. Ny fahombiazan'ny fisarahana nohatsaraina amin'ny tsanganana PMP dia noho ny antony maro samihafa, toy ny haben'ny poti sy ny haben'ny mason'ny poti silica, ny synthesis voafehy ny dingana tsy mihetsika, ary ny fonosana tsanganana sarotra. Ankoatra ny fahombiazan'ny fisarahana avo lenta, ny tsindry ambany amin'ny tsanganana amin'ny tahan'ny fikorianan'ny rano avo dia tombony iray hafa amin'ity dingana tsy mihetsika ity. Ny tsanganana PMP dia mampiseho famerimberenana tsara ary azo ampiasaina amin'ny famakafakana ny fangaro peptide sy ny fandevonan'ny trypsin ny proteinina isan-karazany. Mikasa ny hampiasa ity tsanganana ity izahay amin'ny fanasarahana ny vokatra voajanahary, ny akora bioactive avy amin'ny zavamaniry fanafody ary ny fitrandrahana holatra amin'ny chromatography liquide. Amin'ny ho avy, ny tsanganana PMP dia hojerena ihany koa amin'ny fanasarahana ny proteinina sy ny antikôra monoclonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Fikarohana momba ny Rafitra Fisarahana Peptide amin'ny alàlan'ny Chromatography Dingana Mivadika Fizarana I: Fampivoarana ny Protocol momba ny Famaritana ny Tsanganana.J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptide mavitrika nohatsaraina natao hitsaboana aretina mifindra. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptide fitsaboana sentetika: siansa sy ny tsena.fikarohana fanafody.15 (1-2) androany, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografia Ranoka Proteomika Mandroso.J. Kromatografia.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Ny chromatography ranoka mandroso-spectrometry faobe dia ahafahana mampiditra metabolomika sy proteomika mikendry amin'ny ankapobeny.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ny anjara asan'ny UHPLC amin'ny fampivoarana fanafody.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Lafiny fototra sy azo ampiharina amin'ny chromatography ranoka amin'ny tsindry avo lenta ho an'ny fisarahana haingana. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Fampiharana ny chromatography ranoka avo lenta amin'ny fampivoarana fanafody. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogela monolithic macroporous voaomana avy amin'ny emulsions misy dingana anatiny avo lenta misy menaka ao anaty rano ho an'ny fanadiovana mahomby ny enterovirus.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ny anjara asan'ny chromatography ranoka amin'ny proteomics.J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Fironana vao misondrotra amin'ny fanasarahana peptide sy proteinina ara-pahasalamana amin'ny alalan'ny chromatography ranoka dingana mivadika: teoria sy fampiharana. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Fisarahana peptides amin'ny lafiny roa mampiasa rafitra RP-RP-HPLC mampiasa sanda pH samihafa amin'ny lafiny fisarahana voalohany sy faharoa. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Nodinihina ny toetran'ny famindrana lanja sy ny fahombiazan'ny kinetika amin'ny tsanganana chromatografika mahomby feno poti-javatra C18 sub-2 μm feno sy ambonin'ny poti-javatra misy lavaka. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Fironana vao haingana sy fanamby ara-analytika amin'ny fanasarahana, famantarana ary fanamarinana ny peptides bioactive avy amin'ny zavamaniry. anus. biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Ny tontolo proteomika amin'ny fanjakan'ny fiainana. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Fanodinana peptides fitsaboana amin'ny alàlan'ny chromatography ranoka fanomanana. Molecule (Basel, Soisa) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia fomba mifangaro sy ny fampiharana azy amin'ny biopolymer.J. Kromatografia.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligand ho an'ny chromatography proteinina mifangaro: fitsipika, toetra mampiavaka azy, ary famolavolana.J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).