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E particelle di silice porosa sò state preparate cù un metudu sol-gel cù alcune mudificazioni per ottene particelle macroporose. Queste particelle sò state derivatizate per polimerizazione di trasferimentu di catena di frammentazione di addizione reversibile (RAFT) cù N-fenilmaleimide-metilvinilisocianato (PMI) è stirene per preparà l'intercalazione di N-fenilmaleimide di a fase stazionaria di polistirene (PMP). E colonne d'acciaio inox à calibru strettu (100 × 1,8 mm id) sò state imballate per imballaggio in sospensione. A separazione di a colonna PMP di una miscela di peptidi cumposta da cinque peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) hà valutatu e prestazioni cromatografiche) è a digestione cù tripsina di l'albumina di serum umanu (HAS). In cundizioni di eluzione ottimali, u conteggio teoricu di e piastre di a miscela di peptidi hè finu à 280.000 piastre/m². Cunfruntendu e prestazioni di separazione di a colonna sviluppata cù quelle cummerciale Cù a colonna Ascentis Express RP-Amide, hè statu osservatu chì a prestazione di separazione di a colonna PMP era superiore à a colonna cummerciale in termini di efficienza di separazione è risoluzione.
In l'ultimi anni, l'industria biofarmaceutica hè diventata un mercatu glubale in espansione cù un aumentu sustanziale di a quota di mercatu. Cù a crescita esplusiva di l'industria biofarmaceutica1,2,3, l'analisi di peptidi è proteine ​​hè assai desiderata. In più di u peptide bersagliu, parechje impurità sò generate durante a sintesi di peptidi, chì richiedenu cusì una purificazione cromatografica per ottene peptidi di a purezza desiderata. L'analisi è a caratterizazione di e proteine ​​in i fluidi corporei, i tessuti è e cellule hè un compitu estremamente difficiule per via di u gran numeru di spezie potenzialmente rilevabili in un unicu campione. Ancu se a spettrometria di massa hè un strumentu efficace per u sequenziamentu di peptidi è proteine, se tali campioni sò iniettati in u spettrometru di massa in un solu passu, a separazione ùn serà micca ideale. Stu prublema pò esse mitigatu implementendu separazioni di cromatografia liquida (LC) prima di l'analisi MS, chì riducerà u numeru di analiti chì entranu in u spettrometru di massa in un mumentu datu4,5,6. Inoltre, durante a separazione di fase liquida, l'analiti ponu esse focalizati in regioni strette, cuncentrendu cusì questi analiti è migliurendu a sensibilità di rilevazione MS. A cromatografia liquida (LC) hà avanzatu significativamente in l'ultima dicada è hè diventata una tecnica pupulare in analisi proteomica7,8,9,10.
A cromatografia liquida à fase inversa (RP-LC) hè largamente aduprata per a purificazione è a separazione di miscele di peptidi utilizendu silice mudificata cù ottadecil (ODS) cum'è fase stazionaria11,12,13. Tuttavia, e fasi stazionarie RP ùn furniscenu micca una separazione soddisfacente di peptidi è proteine ​​per via di a so struttura cumplessa è di a so natura anfifila14,15. Dunque, sò necessarie fasi stazionarie appositamente cuncepite per analizà peptidi è proteine ​​cù gruppi polari è non polari per interagisce è mantene questi analiti16. A cromatografia à modu mistu, chì furnisce interazioni multimodali, pò esse una alternativa à RP-LC per a separazione di peptidi, proteine ​​è altre miscele cumplesse. Parechje fasi stazionarie à modu mistu sò state preparate, è e colonne imbottite cù queste fasi sò state aduprate per separazioni di peptidi è proteine17,18,19,20,21. E fasi stazionarie à modu mistu (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalazione polare/RPLC) sò adatte per separazioni di peptidi è proteine ​​per via di a presenza di fasi sia polari sia non polari. gruppi22,23,24,25,26,27,28. In listessu modu, e fasi stazionarie intercalanti polari cù gruppi polari ligati covalentemente mostranu un bonu putere di separazione è una selettività unica per analiti polari è non polari, postu chì a separazione dipende da l'interazione trà l'analita è a fase stazionaria. Interazzione multimodali 29, 30, 31, 32. Recentemente, Zhang et al. 30 anu preparatu una fase stazionaria di poliammina terminata da dodecil è anu separatu cù successu idrocarburi, antidepressivi, flavonoidi, nucleosidi, estrogeni è parechji altri analiti. L'intercalatore polare hà gruppi sia polari sia non polari, dunque pò esse adupratu per separà peptidi è proteine ​​chì anu sia gruppi idrofobichi sia idrofili. E colonne incluse in polari (per esempiu, colonne C18 incluse in ammide) sò dispunibili in cummerciu sottu u nome cummerciale colonne Ascentis Express RP-Amide, ma queste colonne sò aduprate solu per l'analisi di l'amina 33.
In u studiu attuale, una fase stazionaria incrustata polare (polistirene incrustatu in N-fenilmaleimide) hè stata preparata è valutata per a separazione di peptidi è digesti di tripsina di HSA. A fase stazionaria hè stata preparata utilizendu a seguente strategia. E particelle di silice porosa sò state preparate secondu a prucedura data in a nostra publicazione precedente cù alcune mudificazioni à u protocolu di preparazione. U rapportu di urea, polietilenglicole (PEG), TMOS, acqua è acidu aceticu hè statu aghjustatu per preparà particelle di silice cù pori di grande dimensione. Siconda, un novu ligante, fenilmaleimide-metil vinilisocianato, hè statu sintetizatu è utilizatu per derivatizà e particelle di silice per preparà una fase stazionaria incrustata polare. A fase stazionaria risultante hè stata imballata in una colonna d'acciaio inox (100 × 1,8 mm id) utilizendu u schema di imballaggio ottimizzato. L'imballaggio di a colonna hè assistitu da vibrazioni meccaniche per assicurà chì un lettu omogeneu sia furmatu in a colonna. Valutate a separazione di a colonna imballata di miscele di peptidi cumposte da cinque peptidi; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Enkefalina) è digestu di tripsina di albumina di serum umanu (HAS). A mistura di peptidi è u digestu di tripsina di HSA sò stati osservati si separanu cù una bona risoluzione è efficienza. A prestazione di separazione di a colonna PMP hè stata paragunata cù quella di a colonna Ascentis Express RP-Amide. Sia i peptidi sia e proteine ​​sò stati osservati esse ben risolti è efficienti nantu à a colonna PMP, chì era più efficiente chè a colonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polietilene Glicole), Urea, Acidu Aceticu, Trimetossi Ortosilicatu (TMOS), Trimetil Clorosilanu (TMCS), Tripsina, Albumina di Serum Umanu (HSA), Cloruru d'Ammoniu, Urea, Esano Metildisilazanu (HMDS), Cloruru di Metacriloile (MC), Stirene, 4-Idrossi-TEMPO, Perossidu di Benzoile (BPO), Acetonitrile di Grado HPLC (ACN), Metanolu, 2-Propanolo è Acetone Acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Una mistura d'urea (8 g), polietilenglicole (8 g) è 8 mL d'acidu aceticu 0,01 N hè stata agitata per 10 minuti, è dopu 24 mL di TMOS sò stati aghjunti in cundizioni di ghiaccio. A mistura di reazione hè stata riscaldata à 40 °C per 6 ore è dopu à 120 °C per 8 ore in un'autoclave d'acciaio inox. L'acqua hè stata versata via è u materiale residuale hè statu asciugatu à 70 °C per 12 ore. A massa dolce secca hè stata macinata liscia in un fornu è calcinata à 550 °C per 12 ore. Trè lotti sò stati preparati è caratterizati per esaminà a riproducibilità in termini di dimensione di e particelle, dimensione di i pori è area superficiale.
Per mudificazione superficiale di e particelle di silice cù u ligante fenilmaleimide-metilvinilisocianatu (PCMP) presintetizatu seguita da polimerizazione radiale cù stirene, hè statu preparatu un cumpostu chì cuntene gruppi polari. Fase stazionaria per aggregati è catene di polistirene. U prucessu di preparazione hè discrittu quì sottu.
N-fenilmaleimide (200 mg) è metilvinil isocianatu (100 mg) sò stati dissolti in toluene seccu, è 0,1 mL di 2,2'-azoisobutironitrile (AIBN) hè statu aghjuntu à u matrazzu di reazione per preparà u copolimeru fenilmaleimide-metilvinil isocianatu (PMCP). A mistura hè stata riscaldata à 60 °C per 3 ore, filtrata è asciugata in un fornu à 40 °C per 3 ore.
E particelle di silice secche (2 g) sò state disperse in toluene seccu (100 mL), agitate è sonicate in un matracciu à fondu tondu di 500 mL per 10 min. PMCP (10 mg) hè statu dissoltu in toluene è aghjuntu goccia à goccia à u matracciu di reazione per mezu di un imbutu di goccia. A mistura hè stata refluxa à 100 °C per 8 ore, filtrata è lavata cù acetone è asciugata à 60 °C per 3 ore. Dopu, e particelle di silice legate à PMCP (100 g) sò state dissolte in toluene (200 ml) è 4-idrossi-TEMPO (2 mL) hè statu aghjuntu in presenza di 100 µL di dilaurato di dibutilstagno cum'è catalizatore. A mistura hè stata agitata à 50 °C per 8 ore, filtrata è asciugata à 50 °C per 3 ore.
U stirene (1 mL), u perossidu di benzoile BPO (0,5 mL) è e particelle di silice attaccate à TEMPO-PMCP (1,5 g) sò state disperse in toluene è purgate cù azotu. A polimerizazione di u stirene hè stata realizata à 100 °C per 12 ore. U pruduttu risultante hè statu lavatu cù metanolu è asciugatu à 60 °C per tutta a notte. U schema generale di reazione hè mostratu in a Figura 1.
I campioni sò stati degassati à 393 K per 1 ora per ottene una pressione residuale inferiore à 10-3 Torr. A quantità di N2 adsorbita à una pressione relativa di P/P0 = 0,99 hè stata aduprata per determinà u vulume tutale di i pori. A morfologia di e particelle di silice nude è ligate à ligandi hè stata esaminata cù microscopia elettronica à scansione (Hitachi High Technologies, Tokyo, Giappone). I campioni secchi (silice nuda è particelle di silice ligate à ligandi) sò stati posti nantu à una colonna d'aluminiu aduprendu un nastro di carbone adesivo. L'oru hè statu placcatu nantu à i campioni aduprendu un sputter coater Q150T, è un stratu di Au di 5 nm hè statu depositatu nantu à i campioni. Questu migliora l'efficienza di u prucessu aduprendu basse tensioni è furnisce un sputtering à grana fina è à fretu. Un analizzatore elementale Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 hè statu adupratu per l'analisi elementale. Un analizzatore di dimensione di e particelle Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 hè statu adupratu per ottene a distribuzione di a dimensione di e particelle. Particelle di silice nude è E particelle di silice ligate à ligandi (5 mg ciascuna) sò state disperse in 5 mL d'isopropanolu, sonicate per 10 minuti, vortexate per 5 minuti è piazzate nantu à u bancu otticu di u Mastersizer. L'analisi termogravimetrica hè stata realizata à una velocità di 5 °C per minutu in un intervallu di temperatura da 30 à 800 °C.
Culonne strette in acciaio inox rivestite di vetro di dimensioni (100 × 1,8 mm di diametru internu) sò state imballate cù u metudu di imballaggio in fanghi, applicendu a stessa prucedura aduprata in Ref. 31. Una colonna d'acciaio inox (rivestita di vetru, 100 × 1,8 mm di diametru internu) cù un raccordu di uscita chì cuntene una fritta di 1 µm hè stata cunnessa à un imballatore di fanghi (Alltech Deerfield, IL, USA). Preparate una fanghiglia di fase stazionaria suspendendu 150 mg di fase stazionaria in 1,2 mL di metanolu è mandatela à a colonna di almacenamentu. U metanolu hè statu utilizatu cum'è solvente di fanghiglia è ancu cum'è solvente propulsore. Riempite a colonna sequenzialmente applicendu pressioni di 100 MP per 10 minuti, 80 MP per 15 minuti è 60 MP per 30 minuti. Durante l'impacchettamentu, a vibrazione meccanica hè stata applicata cù dui agitatori di colonna GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) per assicurà un imballaggio uniforme di a colonna. Chiudete l'imballatore di fanghiglia è rilasciate a pressione lentamente per impedisce ogni dannu in a colonna. Scollegate a colonna da l'unità di imballaggio di fanghiglia è cunnette un altru raccordu à l'entrata è à u sistema LC per verificà e so prestazioni.
Una pompa LC (10AD Shimadzu, Giappone), un iniettore (Valco (USA) C14 W.05) cù un ciclu d'iniezione di 50 nL, un degassatore di membrana (Shimadzu DGU-14A), una finestra capillare UV-VIS sò stati custruiti. Un rilevatore di dispositivi µLC speciale (UV-2075) è microcolonne rivestite di vetro. Aduprate tubi di cunnessione assai stretti è corti per minimizà l'effettu di l'allargamentu di a banda di colonna extra. Dopu l'imballaggio, i capillari (50 μm id 365 è i capillari di l'unione riducente (50 μm) sò stati installati à l'uscita di 1/16″ di l'unione riducente. A raccolta di dati è l'elaborazione cromatografica sò state effettuate cù u software Multichro 2000. U monitoraghju à 254 nm. L'analiti sò stati testati per l'assorbanza UV. I dati cromatografici sò stati analizzati da OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina da serum umanu, polvere liofilizzata, ≥ 96% (elettroforesi in gel d'agarosio) 3 mg mischiati cù tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) è bicarbonatu d'ammoniu 0,2 M (1 mL). A suluzione hè stata agitata per 10 minuti è mantenuta in un bagnu d'acqua à 37 °C per 6 ore, poi raffreddata cù 1 mL di TFA 0,1%. Filtrate a suluzione è cunservate sottu à 4 °C.
A separazione di e miscele di peptidi è di i digesti di tripsina HSA hè stata valutata separatamente nantu à e colonne PMP. Verificate a separazione di a miscela di peptidi è di u digestu di tripsina di HSA da a colonna PMP è paragunate i risultati à a colonna Ascentis Express RP-Amide. U numeru teoricu di piastra hè calculatu cusì:
L'imagine SEM di particelle di silice nude è particelle di silice ligate à ligandi sò mostrate in a FIG. 2. L'imagine SEM di particelle di silice nude (A, B) mostranu chì, à u cuntrariu di i nostri studii precedenti, queste particelle sò sferiche in cui e particelle sò allungate o anu una simmetria irregulare. A superficia di e particelle di silice ligate à ligandi (C, D) hè più liscia di quella di e particelle di silice nude, ciò chì pò esse duvutu à u rivestimentu di catene di polistirene nantu à a superficia di e particelle di silice.
Imagine di microscopiu elettronicu à scansione di particelle di silice nude (A, B) è particelle di silice ligate à ligandi (C, D).
E distribuzioni di a dimensione di e particelle di e particelle di silice nude è di e particelle di silice ligate à ligandi sò mostrate in a Figura 3 (A). E curve di distribuzione di a dimensione di e particelle basate nantu à u vulume anu dimustratu chì a dimensione di e particelle di silice hè aumentata dopu a mudificazione chimica (Fig. 3A). I ​​dati di distribuzione di a dimensione di e particelle di e particelle di silice di u studiu attuale è di u studiu precedente sò paragunati in a Tavula 1 (A). A dimensione di e particelle basata nantu à u vulume, d (0,5), di PMP hè 3,36 μm, paragunata à u nostru studiu precedente cù un valore ad (0,5) di 3,05 μm (particelle di silice ligate à u polistirene) 34. Stu batch avia una distribuzione di a dimensione di e particelle più stretta paragunata à u nostru studiu precedente per via di i rapporti variabili di PEG, urea, TMOS è acidu aceticu in a mistura di reazione. A dimensione di e particelle di a fase PMP hè ligeramente più grande di quella di a fase di particelle di silice ligata à u polistirene chì avemu studiatu prima. Questu significa chì a funziunalizazione superficiale di e particelle di silice cù u stirene hà depositatu solu un stratu di polistirene (0,97 µm) nantu à a superficia di silice, mentre chì in a fase PMP U spessore di u stratu era di 1,38 µm.
Distribuzione di a dimensione di e particelle (A) è distribuzione di a dimensione di i pori (B) di e particelle di silice nude è di e particelle di silice ligate à i ligante.
A dimensione di i pori, u vulume di i pori è a superficia di e particelle di silice di u studiu attuale sò dati in a Tavula 1 (B). I profili PSD di e particelle di silice nude è di e particelle di silice ligate à ligandi sò mostrati in a Figura 3 (B). I risultati sò paragunabili à u nostru studiu precedente. E dimensioni di i pori di e particelle di silice nude è ligate à ligandi sò 310 è 241, rispettivamente, ciò chì indica chì a dimensione di i pori diminuisce di 69 dopu a mudificazione chimica, cum'è mostratu in a Tavula 1 (B), è u cambiamentu di a curva hè mostratu in a Fig. 3 (B). Similmente, u vulume di i pori di e particelle di silice hè diminuitu da 0,67 à 0,58 cm3 / g dopu a mudificazione chimica. A superficia specifica di e particelle di silice attualmente studiate hè 116 m2 / g, chì hè paragunabile à u nostru studiu precedente (124 m2 / g). Cum'è mostratu in a Tavula 1 (B), a superficia (m2 / g) di e particelle di silice hè ancu diminuita da 116 m2 / g à 105 m2 / g dopu a mudificazione chimica. mudificazione.
I risultati di l'analisi elementale di a fase stazionaria sò mostrati in a Tavula 2. A carica di carbone di a fase stazionaria attuale hè 6,35%, chì hè più bassa di a carica di carbone di u nostru studiu precedente (particelle di silice ligate à u polistirene, 7,93%35 è 10,21%, rispettivamente) 42. A carica di carbone di a fase stazionaria attuale hè bassa, perchè in a preparazione di l'attuale SP, in più di u stirene, sò stati aduprati alcuni ligandi polari cum'è fenilmaleimmide-metilvinilisocianatu (PCMP) è 4-idrossi-TEMPO. A percentuale di pesu di azotu di a fase stazionaria attuale hè 2,21%, paragunata à 0,1735 è 0,85% in pesu di azotu in studii precedenti, rispettivamente. Questu significa chì a percentuale in pesu di azotu hè più alta in a fase stazionaria attuale per via di a fenilmaleimmide. Similmente, e cariche di carbone di i prudutti (4) è (5) eranu 2,7% è 2,9%, rispettivamente, mentre chì a carica di carbone di a fase finale U pruduttu (6) era 6,35%, cum'è mostratu in a Tavula 2. A perdita di pesu hè stata verificata cù a fase stazionaria PMP, è a curva TGA hè mostrata in a Figura 4. A curva TGA mostra una perdita di pesu di 8,6%, chì hè in bon accordu cù a carica di carbone (6,35%) perchè i ligandi cuntenenu micca solu C ma ancu N, O è H.
U ligante fenilmaleimide-metilvinilisocianatu hè statu sceltu per a mudificazione di a superficia di e particelle di silice perchè hà gruppi fenilmaleimide polari è gruppi vinilisocianati. I gruppi isocianati di vinile ponu reagisce ulteriormente cù u stirene per polimerizazione radicalica viva. A seconda ragione hè di inserisce un gruppu chì hà una interazione moderata cù l'analita è nisuna forte interazione elettrostatica trà l'analita è a fase stazionaria, postu chì a parte fenilmaleimide ùn hà micca carica virtuale à pH nurmale. A polarità di a fase stazionaria pò esse cuntrullata da a quantità ottima di stirene è u tempu di reazione di a polimerizazione radicalica libera. L'ultima tappa di a reazione (polimerizazione radicalica libera) hè critica è pò cambià a polarità di a fase stazionaria. L'analisi elementale hè stata realizata per verificà a carica di carbone di queste fasi stazionarie. Hè statu osservatu chì aumentà a quantità di stirene è u tempu di reazione hà aumentatu a carica di carbone di a fase stazionaria è vice versa. I SP preparati cù diverse concentrazioni di stirene anu diverse cariche di carbone. Di novu, caricate queste fasi stazionarie in colonne d'acciaio inox è verificate e so caratteristiche cromatografiche. prestazione (selettività, risoluzione, valore N, ecc.). Basatu annantu à sti esperimenti, hè stata scelta una formulazione ottimizzata per preparà a fase stazionaria PMP per assicurà una polarità cuntrullata è una bona ritenzione di l'analiti.
Cinque miscele di peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) sò state ancu valutate aduprendu una colonna PMP aduprendu una fase mobile; 60/40 (v/v) acetonitrile/acqua (0,1% TFA) à una velocità di flussu di 80 μL/min. In cundizioni di eluzione ottimali, u numeru teoricu di piastre (N) per colonna (100 × 1,8 mm id) hè 20.000 ± 100 (200.000 piastre/m²). A Tavula 3 dà i valori N per e trè colonne PMP è i cromatogrammi sò mostrati in a Figura 5A. Analisi rapida nantu à una colonna PMP à alta velocità di flussu (700 μL/min), cinque peptidi sò stati eluiti in un minutu, i valori N eranu assai boni, 13.500 ± 330 per colonna (100 × 1,8 mm id), currisponde à 135.000 piastre/m (Figura 5B). Trè colonne di dimensioni identiche (100 × 1,8 mm id) sò state imballate cù trè lotti diversi di fase stazionaria PMP per verificà a riproducibilità. U A cuncentrazione di l'analiti per ogni colonna hè stata registrata utilizendu e cundizioni di eluzione ottimali è u numeru di piastre teoriche N è u tempu di ritenzione per separà a stessa mistura di prova in ogni colonna. I dati di riproducibilità per e colonne PMP sò mostrati in a Tabella 4. A riproducibilità di a colonna PMP si correla bè cù valori di %RSD assai bassi, cum'è mostratu in a Tabella 3.
Separazione di a mistura di peptidi nantu à a colonna PMP (B) è a colonna Ascentis Express RP-Amide (A); fase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensioni di a colonna PMP (100 × 1,8 mm id); analitica L'ordine di eluzione di i cumposti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) è 5 (leucina) encefalina àcida).
Una colonna PMP (100 × 1,8 mm id) hè stata valutata per a separazione di digesti triptici di albumina di serum umanu in cromatografia liquida ad alte prestazioni. U cromatogramma in a Figura 6 mostra chì u campione hè ben separatu è a risoluzione hè assai bona. I digesti HSA sò stati analizati utilizendu una velocità di flussu di 100 µL/min, fase mobile 70/30 acetonitrile/acqua è 0,1% TFA. Cum'è mostratu in u cromatogramma (Figura 6), a digestione HSA hè stata divisa in 17 picchi currispondenti à 17 peptidi. L'efficienza di separazione di ogni piccu in u digestu HSA hè stata calculata è i valori sò dati in a Tabella 5.
Un digestu tripticu di HSA (100 × 1,8 mm diametri interni) hè statu siparatu nantu à una colonna PMP; velocità di flussu (100 µL/min), fase mobile 60/40 acetonitrile/acqua cù 0,1% TFA.
induve L hè a lunghezza di a colonna, η hè a viscosità di a fase mobile, ΔP hè a contropressione di a colonna, è u hè a velocità lineare di a fase mobile. A permeabilità di a colonna PMP era 2,5 × 10-14 m2, a velocità di flussu era 25 μL/min, è hè statu utilizatu 60/40 v/v ACN/acqua. A permeabilità di a colonna PMP (100 × 1,8 mm id) era simile à quella di u nostru studiu precedente Ref.34. A permeabilità di a colonna piena di particelle superficialmente porose hè: 1,7 × 10-15 per particelle di 1,3 μm, 3,1 × 10-15 per particelle di 1,7 μm, 5,2 × 10-15 è 2,5 × 10-14 m2 per particelle di 2,6 μm Per particelle di 5 μm 43. Dunque, a permeabilità di a fase PMP hè simile à quella di e particelle core-shell di 5 μm.
induve Wx hè u pesu di a colonna piena di cloroformu, Wy hè u pesu di a colonna piena di metanolu, è ρ hè a densità di u solvente. Densità di metanolu (ρ = 0,7866) è cloroformu (ρ = 1,484). A porosità tutale di e colonne SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 è e colonne C18-Urea 31 chì avemu studiatu prima eranu 0,63 è 0,55, rispettivamente. Questu significa chì a presenza di ligandi urea riduce a permeabilità di a fase stazionaria. D’altronde, a porosità tutale di a colonna PMP (100 × 1,8 mm id) hè 0,60. A permeabilità di e colonne PMP hè più bassa di quella di e colonne piena di particelle di silice legate à C18 perchè in e fasi stazionarie di tipu C18 i ligandi C18 sò attaccati à e particelle di silice cum'è catene lineari, mentre chì in e fasi stazionarie di tipu polistirene, u stratu di polimeru relativamente grossu hè furmatu intornu à ellu. In un esperimentu tipicu, a porosità di a colonna hè calculata cum'è:
E figure 7A,B mostranu a colonna PMP (100 × 1,8 mm id) è a colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) utilizendu e stesse cundizioni di eluzione (vale à dì, 60/40 ACN/H2O è 0,1% TFA). ) di u graficu di van Deemter. E miscele di peptidi selezziunate (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) sò state preparate in 20 µL/. A velocità di flussu minima per e duie colonne hè 800 µL/min. I valori minimi HETP à a velocità di flussu ottima (80 µL/min) per a colonna PMP è a colonna Ascentis Express RP-Amide eranu 2,6 µm è 3,9 µm, rispettivamente. I valori HETP indicanu chì l'efficienza di separazione di a colonna PMP (100 × 1,8 mm id) hè assai megliu cà a colonna Ascentis Express RP-Amide dispunibule in cummerciu (100 × 1,8 mm id). U graficu di van Deemter in Fig. 7(A) mostra chì a diminuzione di u valore N cù l'aumentu di u flussu ùn hè micca significativa paragunata à u nostru studiu precedente. A più alta efficienza di separazione di a colonna PMP (100 × 1,8 mm id) paragunata à a colonna Ascentis Express RP-Amide hè basata annantu à migliuramenti in a forma di e particelle, a dimensione è e prucedure cumplesse di imballaggio di e colonne aduprate in u travagliu attuale34.
(A) graficu di van Deemter (HETP versus velocità lineare di a fase mobile) ottenutu aduprendu una colonna PMP (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O cù 0,1% TFA. (B) graficu di van Deemter (HETP versus velocità lineare di a fase mobile) ottenutu aduprendu una colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O cù 0,1% TFA.
Una fase stazionaria di polistirene incrustatu polare hè stata preparata è valutata per a separazione di miscele di peptidi sintetici è digesti di tripsina di albumina di serum umanu (HAS) in cromatografia liquida ad alte prestazioni. A prestazione cromatografica di e colonne PMP per e miscele di peptidi hè eccellente in efficienza è risoluzione di separazione. A prestazione di separazione migliorata di e colonne PMP hè dovuta à una varietà di ragioni, cum'è a dimensione di e particelle è a dimensione di i pori di e particelle di silice, a sintesi cuntrullata di a fase stazionaria è l'impacchettamentu cumplessu di e colonne. Oltre à l'alta efficienza di separazione, a bassa contropressione di a colonna à alte velocità di flussu hè un altru vantaghju di sta fase stazionaria. E colonne PMP mostranu una bona riproducibilità è ponu esse aduprate per l'analisi di miscele di peptidi è a digestione di tripsina di varie proteine. Avemu intenzione di aduprà sta colonna per a separazione di prudutti naturali, cumposti bioattivi da piante medicinali è estratti fungini in cromatografia liquida. In u futuru, e colonne PMP saranu ancu valutate per a separazione di proteine ​​è anticorpi monoclonali.
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