Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Пористые частицы диоксида кремния были получены золь-гель методом с некоторыми модификациями для получения макропористых частиц. Эти частицы были модифицированы методом полимеризации с обратимым присоединением-фрагментацией цепи (RAFT) с использованием N-фенилмалеимид-метилвинилизоцианата (PMI) и стирола для получения стационарной фазы N-фенилмалеимида, интеркалированного в полистирол (PMP). Узкоканальные колонки из нержавеющей стали (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) были заполнены суспензией. Была оценена эффективность разделения на колонке PMP смеси пептидов, состоящей из пяти пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин), и трипсинового переваривания человеческого сывороточного альбумина (HAS). При оптимальных условиях элюирования теоретическое число тарелок смеси пептидов достигает высоких значений. 280 000 тарелок/м². Сравнивая эффективность разделения разработанной колонки с коммерческой колонкой Ascentis Express RP-Amide, было установлено, что эффективность разделения колонки PMP превосходит коммерческую колонку по эффективности разделения и разрешению.
В последние годы биофармацевтическая промышленность превратилась в расширяющийся глобальный рынок со значительным увеличением рыночной доли. В связи с взрывным ростом биофармацевтической промышленности1,2,3 анализ пептидов и белков становится крайне востребованным. Помимо целевого пептида, в процессе синтеза пептидов образуются различные примеси, что требует хроматографической очистки для получения пептидов желаемой чистоты. Анализ и характеристика белков в биологических жидкостях, тканях и клетках представляют собой чрезвычайно сложную задачу из-за большого количества потенциально обнаруживаемых веществ в одном образце. Хотя масс-спектрометрия является эффективным инструментом для секвенирования пептидов и белков, если такие образцы вводятся в масс-спектрометр за один проход, разделение будет неидеальным. Эту проблему можно смягчить, внедрив жидкостную хроматографию (ЖХ) перед масс-спектрометрическим анализом, что уменьшит количество аналитов, поступающих в масс-спектрометр в заданный момент времени4,5,6. Кроме того, во время жидкофазного разделения аналиты могут быть сфокусированы в узких областях, тем самым концентрируя эти аналиты и улучшая обнаружение в масс-спектрометре. чувствительность. Жидкостная хроматография (ЖХ) значительно продвинулась за последнее десятилетие и стала популярным методом протеомного анализа7,8,9,10.
Обращенно-фазовая жидкостная хроматография (ОФЖХ) широко используется для очистки и разделения смесей пептидов с использованием модифицированного октадецилсиликагеля (ОДС) в качестве стационарной фазы11,12,13. Однако стационарные фазы ОФЖХ не обеспечивают удовлетворительного разделения пептидов и белков из-за их сложной структуры и амфифильной природы14,15. Поэтому для анализа пептидов и белков с полярными и неполярными фрагментами, способными взаимодействовать с этими аналитами и удерживать их, необходимы специально разработанные стационарные фазы16. Хроматография смешанного режима, обеспечивающая многомодальные взаимодействия, может быть альтернативой ОФЖХ для разделения пептидов, белков и других сложных смесей. Было разработано несколько стационарных фаз смешанного режима, и колонки, заполненные этими фазами, использовались для разделения пептидов и белков17,18,19,20,21. Стационарные фазы смешанного режима (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярные) Интеркаляция/RPLC) подходят для разделения пептидов и белков благодаря наличию как полярных, так и неполярных групп22,23,24,25,26,27,28. Аналогично, полярные интеркалирующие стационарные фазы с ковалентно связанными полярными группами демонстрируют хорошую разделительную способность и уникальную селективность по отношению к полярным и неполярным аналитам, поскольку разделение зависит от взаимодействия между аналитом и стационарной фазой. Мультимодальные взаимодействия29, 30, 31, 32. Недавно Чжан и др. 30 подготовили стационарную фазу на основе полиамина с додециловыми концевыми группами и успешно разделили углеводороды, антидепрессанты, флавоноиды, нуклеозиды, эстрогены и ряд других аналитов. Полярный интеркалятор содержит как полярные, так и неполярные группы, поэтому его можно использовать для разделения пептидов и белков, имеющих как гидрофобные, так и гидрофильные фрагменты. Полярные колонки (например, колонки C18 с амидными группами) коммерчески доступны под торговой маркой Ascentis Express RP-Amide columns, но эти колонки используются только для анализа амина 33.
В данном исследовании была приготовлена ​​и оценена полярная стационарная фаза (полистирол, содержащий N-фенилмалеимид) для разделения пептидов и трипсиновых гидролизатов HSA. Стационарная фаза была приготовлена ​​с использованием следующей стратегии. Пористые частицы диоксида кремния были приготовлены в соответствии с процедурой, описанной в нашей предыдущей публикации, с некоторыми модификациями протокола приготовления. Соотношение мочевины, полиэтиленгликоля (ПЭГ), TMOS, воды и уксусной кислоты было скорректировано для получения частиц диоксида кремния с большим размером пор. Во-вторых, был синтезирован новый лиганд, фенилмалеимид-метилвинилизоцианат, и использован для дериватизации частиц диоксида кремния с целью приготовления полярной стационарной фазы. Полученная стационарная фаза была упакована в колонку из нержавеющей стали (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) с использованием оптимизированной схемы упаковки. Упаковка колонки осуществлялась с помощью механической вибрации для обеспечения образования однородного слоя внутри колонки. Была проведена оценка разделения смесей пептидов, состоящих из пяти пептидов, в упакованной колонке; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) и трипсиновый гидролизат человеческого сывороточного альбумина (HAS). Было установлено, что смесь пептидов и трипсиновый гидролизат HSA разделяются с хорошим разрешением и эффективностью. Эффективность разделения колонки PMP сравнивали с эффективностью колонки Ascentis Express RP-Amide. Было установлено, что как пептиды, так и белки хорошо разделяются и эффективно на колонке PMP, которая оказалась более эффективной, чем колонка Ascentis Express RP-Amide.
ПЭГ (полиэтиленгликоль), мочевина, уксусная кислота, триметоксиортосиликат (ТМОС), триметилхлорсилан (ТМКС), трипсин, человеческий сывороточный альбумин (HSA), хлорид аммония, мочевина, гексанметилдисилазан (HMDS), метакрилоилхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-ТЕМПО, бензоилпероксид (BPO), ацетонитрил (ACN) для ВЭЖХ, метанол, 2-пропанол и ацетон приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).
Смесь мочевины (8 г), полиэтиленгликоля (8 г) и 8 мл 0,01 N уксусной кислоты перемешивали в течение 10 минут, затем в условиях охлаждения льдом добавляли 24 мл ТМОС. Реакционную смесь нагревали при 40°C в течение 6 часов, а затем при 120°C в течение 8 часов в автоклаве из нержавеющей стали. Воду сливали, а остаточный материал сушили при 70°C в течение 12 часов. Высушенную мягкую массу измельчали ​​в печи и прокаливали при 550°C в течение 12 часов. Было приготовлено и охарактеризовано три партии для изучения воспроизводимости размера частиц, размера пор и площади поверхности.
Путем модификации поверхности частиц диоксида кремния предварительно синтезированным лигандом фенилмалеимид-метилвинилизоцианатом (PCMP) с последующей радиальной полимеризацией со стиролом было получено соединение, содержащее полярную группу. Стационарная фаза для агрегатов и полистирольных цепей. Процесс получения описан ниже.
N-фенилмалеимид (200 мг) и метилвинилизоцианат (100 мг) растворили в сухом толуоле, и в реакционную колбу добавили 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрила (АИБН) для получения сополимера фенилмалеимида и метилвинилизоцианата (ПМЦП). Смесь нагревали при 60°C в течение 3 часов, фильтровали и сушили в печи при 40°C в течение 3 часов.
Высушенные частицы диоксида кремния (2 г) диспергировали в сухом толуоле (100 мл), перемешивали и подвергали ультразвуковой обработке в круглодонной колбе объемом 500 мл в течение 10 мин. ПМЦП (10 мг) растворяли в толуоле и добавляли по каплям в реакционную колбу через капельную воронку. Смесь кипятили при 100°C в течение 8 часов, фильтровали, промывали ацетоном и сушили при 60°C в течение 3 часов. Затем частицы диоксида кремния, связанные с ПМЦП (100 г), растворяли в толуоле (200 мл), и добавляли 4-гидрокси-ТЕМПО (2 мл) в присутствии 100 мкл дибутилоловодилаурата в качестве катализатора. Смесь перемешивали при 50°C в течение 8 часов, фильтровали и сушили при 50°C в течение 3 часов.
Стирол (1 мл), бензоилпероксид (BPO) (0,5 мл) и частицы диоксида кремния, модифицированные TEMPO-PMCP (1,5 г), были диспергированы в толуоле и продуты азотом. Полимеризацию стирола проводили при 100°C в течение 12 часов. Полученный продукт промывали метанолом и сушили при 60°C в течение ночи. Общая схема реакции показана на рисунке 1.
Образцы дегазировали при 393 К в течение 1 часа для получения остаточного давления менее 10⁻³ Торр. Количество адсорбированного N₂ при относительном давлении P/P₀ = 0,99 использовали для определения общего объема пор. Морфологию чистых и связанных с лигандами частиц диоксида кремния исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии (Hitachi High Technologies, Токио, Япония). Высушенные образцы (чистые частицы диоксида кремния и частицы диоксида кремния, связанные с лигандами) помещали на алюминиевую колонку с помощью клейкой углеродной ленты. Золото наносили на образцы с помощью установки для магнетронного распыления Q150T, и на образцы наносили слой золота толщиной 5 нм. Это повышает эффективность процесса за счет использования низких напряжений и обеспечивает мелкозернистое холодное распыление. Для элементного анализа использовали элементный анализатор Thermo Electron (Waltham, MA, США) Flash EA1112. Для определения размера частиц использовали анализатор размера частиц Malvern (Worcestershire, Великобритания) Mastersizer 2000. Распределение. Непокрытые частицы диоксида кремния и частицы диоксида кремния, связанные с лигандами (по 5 мг каждая), диспергировали в 5 мл изопропанола, подвергали ультразвуковой обработке в течение 10 мин, перемешивали на вихревом смесителе в течение 5 мин и помещали на оптический стол прибора Mastersizer. Термогравиметрический анализ проводили со скоростью 5 °C в минуту в диапазоне температур от 30 до 800 °C.
Узкостенные колонны из нержавеющей стали с футеровкой из стекла размерами (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) были заполнены методом пульповой набивки с применением той же процедуры, что и в работе [ссылка]. 31. Колонка из нержавеющей стали (с футеровкой из стекла, 100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) с выходным фитингом, содержащим фритту 1 мкм, была подключена к устройству для упаковки суспензии (Alltech, Дирфилд, Иллинойс, США). Приготовьте суспензию стационарной фазы, суспендируя 150 мг стационарной фазы в 1,2 мл метанола, и подайте ее в накопительную колонку. Метанол использовался как в качестве растворителя суспензии, так и в качестве проталкивающего растворителя. Заполните колонку последовательно, подавая давление 100 МПа в течение 10 минут, 80 МПа в течение 15 минут и 60 МПа в течение 30 минут. Во время упаковки применялась механическая вибрация с помощью двух шейкеров для ГХ-колонок (Alltech, Дирфилд, Иллинойс, США) для обеспечения равномерной упаковки колонки. Закройте устройство для упаковки суспензии и медленно сбросьте давление, чтобы предотвратить повреждение колонки. Отсоедините колонку от устройства для упаковки суспензии и подключите Еще один фитинг к входному отверстию и к системе LC для проверки ее работоспособности.
Для хроматографического анализа были использованы: насос для жидкостной хроматографии (10AD Shimadzu, Япония), инжектор (Valco (США) C14 W.05) с петлей для ввода образца объемом 50 нл, мембранный дегазатор (Shimadzu DGU-14A), УФ-ВИС капиллярное окно, специальный детектор для микрожидкостной хроматографии (UV-2075) и микроколонки со стеклянной облицовкой. Для минимизации влияния расширения полосы на колонке использовались очень узкие и короткие соединительные трубки. После упаковки капилляры (50 мкм, внутренний диаметр 365) и редукционные капилляры (50 мкм) были установлены на выходе 1/16″ редукционного соединения. Сбор данных и хроматографическая обработка проводились с помощью программного обеспечения Multichro 2000. Мониторинг проводился при 254 нм. Аналиты тестировались на УФ-поглощение. Хроматографические данные анализировались с помощью OriginPro8 (Нортгемптон, Массачусетс).
Альбумин из сыворотки крови человека, лиофилизированный порошок, ≥ 96% (электрофорез в агарозном геле), 3 мг, смешанный с трипсином (1,5 мг), 4,0 М мочевиной (1 мл) и 0,2 М бикарбонатом аммония (1 мл). Раствор перемешивали в течение 10 минут и выдерживали на водяной бане при 37°C в течение 6 часов, затем реакцию останавливали добавлением 1 мл 0,1% ТФК. Раствор фильтровали и хранили при температуре ниже 4°C.
Разделение смесей пептидов и продуктов расщепления трипсином HSA оценивали отдельно на колонках PMP. Проверьте разделение смеси пептидов и продуктов расщепления трипсином HSA на колонке PMP и сравните результаты с колонкой Ascentis Express RP-Amide. Теоретическое число тарелок рассчитывается следующим образом:
На рис. 2 показаны изображения чистых частиц диоксида кремния и частиц диоксида кремния, связанных с лигандами, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). Изображения чистых частиц диоксида кремния (А, В) показывают, что, в отличие от наших предыдущих исследований, эти частицы имеют сферическую форму, при этом они вытянуты или обладают неправильной симметрией. Поверхность частиц диоксида кремния, связанных с лигандами (С, D), более гладкая, чем поверхность чистых частиц диоксида кремния, что может быть связано с покрытием поверхности частиц диоксида кремния цепями полистирола.
Изображения чистых частиц диоксида кремния (A, B) и частиц диоксида кремния, связанных с лигандами (C, D), полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Распределение размеров частиц чистых частиц диоксида кремния и частиц диоксида кремния, связанных с лигандами, показано на рисунке 3(A). Кривые распределения размеров частиц по объему показали, что размер частиц диоксида кремния увеличился после химической модификации (рис. 3A). Данные о распределении размеров частиц диоксида кремния из настоящего исследования и предыдущего исследования сравниваются в таблице 1(A). Размер частиц по объему, d(0,5), PMP составляет 3,36 мкм, по сравнению с нашим предыдущим исследованием, где значение ad(0,5) составляло 3,05 мкм (частицы диоксида кремния, связанные с полистиролом)34. Эта партия имела более узкое распределение размеров частиц по сравнению с нашим предыдущим исследованием из-за различного соотношения ПЭГ, мочевины, ТМОС и уксусной кислоты в реакционной смеси. Размер частиц фазы PMP немного больше, чем размер частиц фазы диоксида кремния, связанных с полистиролом, которую мы изучали ранее. Это означает, что функционализация поверхности частиц диоксида кремния стиролом привела только к осаждению слоя полистирола (0,97 µm) на поверхности диоксида кремния, тогда как в фазе PMP толщина слоя составляла 1,38 мкм.
Распределение размеров частиц (A) и распределение размеров пор (B) чистых частиц диоксида кремния и частиц диоксида кремния, связанных с лигандами.
Размер пор, объем пор и площадь поверхности частиц диоксида кремния, исследованных в данной работе, приведены в таблице 1(B). Профили распределения размеров пор (PSD) чистых частиц диоксида кремния и частиц диоксида кремния, связанных с лигандом, показаны на рисунке 3(B). Результаты сопоставимы с результатами нашего предыдущего исследования. Размеры пор чистых и связанных с лигандом частиц диоксида кремния составляют 310 и 241 соответственно, что указывает на уменьшение размера пор на 69 после химической модификации, как показано в таблице 1(B), а изменение кривой показано на рисунке 3(B). Аналогично, объем пор частиц диоксида кремния уменьшился с 0,67 до 0,58 см³/г после химической модификации. Удельная площадь поверхности исследуемых частиц диоксида кремния составляет 116 м²/г, что сопоставимо с результатами нашего предыдущего исследования (124 м²/г). Как показано в таблице 1(B), площадь поверхности (м²/г) частиц диоксида кремния также уменьшилась с После химической модификации концентрация веществ снизилась со 116 м2/г до 105 м2/г.
Результаты элементного анализа стационарной фазы представлены в таблице 2. Содержание углерода в текущей стационарной фазе составляет 6,35%, что ниже, чем содержание углерода в нашем предыдущем исследовании (частицы диоксида кремния, связанные с полистиролом, 7,93%35 и 10,21% соответственно)42. Низкое содержание углерода в текущей стационарной фазе объясняется тем, что при ее приготовлении, помимо стирола, использовались некоторые полярные лиганды, такие как фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) и 4-гидрокси-TEMPO. Массовая доля азота в текущей стационарной фазе составляет 2,21%, по сравнению с 0,1735 и 0,85% по массе азота в предыдущих исследованиях, соответственно. Это означает, что массовая доля азота в текущей стационарной фазе выше благодаря фенилмалеимиду. Аналогично, содержание углерода в продуктах (4) и (5) составило 2,7% и 2,9% соответственно, в то время как содержание углерода в конечном продукте (6) Содержание углерода составило 6,35%, как показано в таблице 2. Потеря веса была проверена с использованием стационарной фазы PMP, а кривая ТГА показана на рисунке 4. Кривая ТГА показывает потерю веса в 8,6%, что хорошо согласуется с содержанием углерода (6,35%), поскольку лиганды содержат не только C, но и N, O и H.
Для модификации поверхности частиц диоксида кремния был выбран лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианат, поскольку он содержит полярные фенилмалеимидные и винилизоцианатные группы. Винилизоцианатные группы могут далее реагировать со стиролом путем живой радикальной полимеризации. Вторая причина заключается в введении группы, которая имеет умеренное взаимодействие с аналитом и не имеет сильного электростатического взаимодействия между аналитом и стационарной фазой, поскольку фенилмалеимидная группа не имеет виртуального заряда при нормальном pH. Полярность стационарной фазы можно контролировать оптимальным количеством стирола и временем реакции свободнорадикальной полимеризации. Последний этап реакции (свободнорадикальная полимеризация) является критическим и может изменить полярность стационарной фазы. Для проверки содержания углерода в этих стационарных фазах был проведен элементный анализ. Было замечено, что увеличение количества стирола и времени реакции увеличивает содержание углерода в стационарной фазе и наоборот. Стационарные фазы, приготовленные с различными концентрациями стирола, имеют различное содержание углерода. Затем эти стационарные фазы были загружены. Фазы помещают в колонки из нержавеющей стали и проверяют их хроматографические характеристики (селективность, разрешение, значение N и т. д.). На основе этих экспериментов была выбрана оптимизированная рецептура для приготовления стационарной фазы PMP, обеспечивающая контролируемую полярность и хорошее удерживание аналита.
Также были исследованы пять смесей пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) с использованием колонки PMP и подвижной фазы; 60/40 (об/об) ацетонитрил/вода (0,1% ТФК) при скорости потока 80 мкл/мин. В оптимальных условиях элюирования теоретическое число тарелок (N) на колонку (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) составляет 20 000 ± 100 (200 000 тарелок/м²). В таблице 3 приведены значения N для трех колонок PMP, а хроматограммы показаны на рисунке 5A. Быстрый анализ на колонке PMP при высокой скорости потока (700 мкл/мин): пять пептидов элюировались в течение одной минуты, значения N были очень хорошими, 13 500 ± 330 на колонку (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра), что соответствует 135 000 тарелок/м² (рисунок 5B). Три Для проверки воспроизводимости были использованы колонки одинакового размера (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра), заполненные тремя различными партиями стационарной фазы PMP. Концентрация аналита для каждой колонки регистрировалась с использованием оптимальных условий элюирования, числа теоретических тарелок N и времени удерживания для разделения одной и той же тестовой смеси на каждой колонке. Данные о воспроизводимости для колонок PMP приведены в таблице 4. Воспроизводимость колонки PMP хорошо коррелирует с очень низкими значениями %RSD, как показано в таблице 3.
Разделение смеси пептидов на колонке PMP (B) и колонке Ascentis Express RP-Amide (A); подвижная фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), размеры колонки PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра); аналитический порядок элюции соединений: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(лейцин) (кислотный энкефалин).
Для разделения триптических гидролизатов человеческого сывороточного альбумина в высокоэффективной жидкостной хроматографии была исследована колонка PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра). Хроматограмма на рисунке 6 показывает, что образец хорошо разделен, а разрешение очень хорошее. Гидролизаты HSA анализировались при скорости потока 100 мкл/мин, подвижная фаза 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% ТФК. Как показано на хроматограмме (рисунок 6), гидролизат HSA разделился на 17 пиков, соответствующих 17 пептидам. Эффективность разделения каждого пика в гидролизате HSA была рассчитана, и значения приведены в таблице 5.
Триптический гидролизат HSA (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) был разделен на колонке PMP; скорость потока (100 мкл/мин), подвижная фаза 60/40 ацетонитрил/вода с 0,1% ТФК.
где L — длина колонки, η — вязкость подвижной фазы, ΔP — противодавление в колонке, а u — линейная скорость подвижной фазы. Проницаемость колонки PMP составляла 2,5 × 10⁻¹⁴ м², скорость потока — 25 мкл/мин, использовался раствор ацетонитрила в воде в соотношении 60/40 об./об. Проницаемость колонки PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) была аналогична проницаемости в нашем предыдущем исследовании (ссылка 34). Проницаемость колонки, заполненной поверхностно пористыми частицами, составляет: 1,7 × 10⁻¹⁵ для частиц размером 1,3 мкм, 3,1 × 10⁻¹⁵ для частиц размером 1,7 мкм, 5,2 × 10⁻¹⁵ и 2,5 × 10⁻¹⁴ м² для частиц размером 2,6 мкм. Для частиц размером 5 мкм 43. Следовательно, проницаемость фазы ПМП аналогична проницаемости частиц с ядром и оболочкой размером 5 мкм.
где Wx — вес колонки, заполненной хлороформом, Wy — вес колонки, заполненной метанолом, а ρ — плотность растворителя. Плотности метанола (ρ = 0,7866) и хлороформа (ρ = 1,484). Общая пористость колонок SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) 34 и колонок C18-Urea 31, которые мы изучали ранее, составляла 0,63 и 0,55 соответственно. Это означает, что присутствие лигандов мочевины снижает проницаемость стационарной фазы. С другой стороны, общая пористость колонки PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) составляет 0,60. Проницаемость колонок PMP ниже, чем у колонок, заполненных частицами диоксида кремния, связанными с C18, поскольку в стационарных фазах типа C18 лиганды C18 прикреплены к диоксиду кремния. Частицы образуют линейные цепочки, тогда как в стационарных фазах полистирольного типа вокруг них формируется относительно толстый полимерный слой. В типичном эксперименте пористость колонки рассчитывается следующим образом:
На рисунках 7A и 7B показаны колонка PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) и колонка Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) при одинаковых условиях элюирования (т.е., 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA) на графике ван Деемтера. Выбранные смеси пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) были приготовлены в объеме 20 мкл/мин. Минимальная скорость потока для обеих колонок составляет 800 мкл/мин. Минимальные значения HETP при оптимальной скорости потока (80 мкл/мин) для колонки PMP и колонки Ascentis Express RP-Amide составили 2,6 мкм и 3,9 мкм соответственно. Значения HETP указывают на то, что эффективность разделения колонки PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) значительно выше, чем у коммерчески доступной колонки Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра). График ван Деемтера на рис. 7(A) показывает, что уменьшение значения N с Увеличение потока незначительно по сравнению с результатами нашего предыдущего исследования. Более высокая эффективность разделения колонки PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) по сравнению с колонкой Ascentis Express RP-Amide основана на улучшении формы и размера частиц, а также сложных процедурах упаковки колонки, использованных в данной работе34.
(A) График ван Деемтера (HETP в зависимости от линейной скорости подвижной фазы), полученный с использованием колонки PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) в смеси ацетонитрила и воды 60/40 с 0,1% ТФК. (B) График ван Деемтера (HETP в зависимости от линейной скорости подвижной фазы), полученный с использованием колонки Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) в смеси ацетонитрила и воды 60/40 с 0,1% ТФК.
Была приготовлена ​​и исследована полярная полистироловая стационарная фаза для разделения смесей синтетических пептидов и продуктов расщепления сывороточного альбумина человека (HAS) трипсином в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматографические характеристики колонок PMP для смесей пептидов отличаются превосходной эффективностью разделения и разрешением. Улучшенные характеристики разделения колонок PMP обусловлены рядом причин, таких как размер частиц и размер пор частиц диоксида кремния, контролируемый синтез стационарной фазы и сложная упаковка колонки. Помимо высокой эффективности разделения, еще одним преимуществом этой стационарной фазы является низкое противодавление колонки при высоких скоростях потока. Колонки PMP демонстрируют хорошую воспроизводимость и могут использоваться для анализа смесей пептидов и продуктов расщепления различных белков трипсином. Мы планируем использовать эту колонку для разделения природных продуктов, биологически активных соединений из лекарственных растений и грибковых экстрактов в жидкостной хроматографии. В будущем колонки PMP также будут исследованы для разделения белков и моноклональных антител.
Филд, Дж. К., Эуэрби, М. Р., Лау, Дж., Тёгерсен, Х. и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов методом обращенно-фазовой хроматографии. Часть I: Разработка протокола характеризации колонки. Журнал хроматографии. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. и др. Улучшенные активные пептиды, разработанные для лечения инфекционных заболеваний. Биотехнология. Продвинутые. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. и Хрестчатиски, М. Синтетические терапевтические пептиды: наука и рынок. Открытие лекарств. 15 (1-2) сегодня, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Се, Ф., Смит, Р. Д. и Шен, И. Усовершенствованная протеомная жидкостная хроматография. Журнал хроматографии.А 1261, 78–90 (2012).
Лю, В. и др. Усовершенствованная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия позволяет использовать широкомасштабную метаболомику и протеомику. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. и Солсбери, Дж.Дж. Роль ВЭЖХ в разработке лекарств. Журнал сеп. наук. 30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. и Клаузен, А.М. Фундаментальные и практические аспекты сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии для быстрого разделения. Журнал сеп. наук. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. и Челищефф, П. Применение сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии в разработке лекарственных препаратов. Журнал хроматографии. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. и др. Монолитные макропористые гидрогели, полученные из эмульсий типа «масло в воде» с высокой внутренней фазой, для эффективной очистки энтеровирусов. Chemical Britain J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. и Уилкинс, Дж. А. Роль жидкостной хроматографии в протеомике. Журнал хроматографии.А 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вёте, Ж.-Л. и Гийарме, Д. Новые тенденции в жидкостной хроматографии с обращенной фазой для разделения терапевтических пептидов и белков: теория и приложения. Журнал фармации. Биомедицинская наука.anus.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, А.Е. и Геблер, Дж.К. Двумерное разделение пептидов с использованием системы RP-RP-HPLC с различными значениями pH в первом и втором измерениях разделения. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. и др. Были исследованы характеристики массопереноса и кинетические показатели высокоэффективных хроматографических колонок, заполненных полностью и поверхностно пористыми частицами C18 размером менее 2 мкм. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. и др. Последние тенденции и аналитические проблемы в выделении, идентификации и валидации растительных биоактивных пептидов. Биологический анус. Химический. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж. Б. и др. Протеомный ландшафт царства жизни. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, К. и др. Последующая обработка терапевтических пептидов с помощью препаративной жидкостной хроматографии. Молекула (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Ян, Ю. и Гэн, С. Хроматография смешанного режима и ее применение к биополимерам. Журнал хроматографии.А 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Дун, С.-Ю. и Сунь, Ю. Лиганды для хроматографии белков в смешанном режиме: принцип, характеристика и разработка. Журнал биотехнологии. 144(1), 3-11 (2009).