Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да искључите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Порозне честице силицијум диоксида су припремљене сол-гел методом са неким модификацијама да би се добиле макропорозне честице. Ове честице су дериватизоване полимеризацијом реверзибилне адиционе фрагментације преноса ланца (RAFT) са N-фенилмалеимид-метилвинилизоцијанатом (PMI) и стиреном да би се припремила стационарна фаза интеркалације N-фенилмалеимида полистиреном (PMP). Колоне од нерђајућег челика уског пречника (100 × 1,8 mm унутрашњи пречник) су набијене паковањем у суспензију. Процењене су перформансе раздвајања пептидне смеше која се састоји од пет пептида (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, леуцин енкефалин) на PMP колони (хроматографске перформансе) и варење хуманог серумског албумина (HAS) трипсином. Под оптималним условима елуције, теоријски број плоча пептидне смеше је чак 280.000 плоча/m². Поређење перформанси раздвајања развијене колоне са комерцијалном Ascentis Express колоном. RP-амидна колона, примећено је да су перформансе раздвајања PMP колоне биле супериорније у односу на комерцијалну колону у погледу ефикасности раздвајања и резолуције.
Последњих година, биофармацеутска индустрија је постала растуће глобално тржиште са значајним повећањем тржишног удела. Са експлозивним растом биофармацеутске индустрије1,2,3, анализа пептида и протеина је веома тражена. Поред циљног пептида, током синтезе пептида настаје неколико нечистоћа, што захтева хроматографско пречишћавање да би се добили пептиди жељене чистоће. Анализа и карактеризација протеина у телесним течностима, ткивима и ћелијама је изузетно изазован задатак због великог броја потенцијално детектабилних врста у једном узорку. Иако је масена спектрометрија ефикасан алат за секвенцирање пептида и протеина, ако се такви узорци убризгају у масени спектрометар у једном пролазу, раздвајање неће бити идеално. Овај проблем се може ублажити применом раздвајања течном хроматографијом (LC) пре MS анализе, што ће смањити број аналита који улазе у масени спектрометар у датом тренутку4,5,6. Поред тога, током раздвајања у течној фази, аналити се могу фокусирати у уским регионима, чиме се ови аналити концентришу и побољшава осетљивост MS детекције. Течна хроматографија (LC) је значајно напредовала током последње деценије и постала је популарна техника у протеомска анализа7,8,9,10.
Течна хроматографија са обрнутом фазом (RP-LC) се широко користи за пречишћавање и раздвајање пептидних смеша користећи октадецил-модификовани силицијум диоксид (ODS) као стационарну фазу11,12,13. Међутим, стационарне фазе RP не пружају задовољавајуће раздвајање пептида и протеина због своје сложене структуре и амфифилне природе14,15. Стога су потребне посебно дизајниране стационарне фазе за анализу пептида и протеина са поларним и неполарним деловима како би интераговале са овим аналитима и задржале их16. Хроматографија мешовитог режима, која пружа мултимодалне интеракције, може бити алтернатива RP-LC за раздвајање пептида, протеина и других сложених смеша. Припремљено је неколико стационарних фаза мешовитог режима, а колоне напуњене овим фазама коришћене су за раздвајање пептида и протеина17,18,19,20,21. Стационарне фазе мешовитог режима (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, поларна интеркалација/RPLC) су погодне за раздвајање пептида и протеина због присуства и поларних и неполарних групе22,23,24,25,26,27,28. Слично томе, поларне интеркалирајуће стационарне фазе са ковалентно везаним поларним групама показују добру моћ раздвајања и јединствену селективност за поларне и неполарне аналите, јер раздвајање зависи од интеракције између аналита и стационарне фазе. Мултимодалне интеракције 29, 30, 31, 32. Недавно су Жанг и др.30 припремили додецил-терминирану полиаминску стационарну фазу и успешно раздвојили угљоводонике, антидепресиве, флавоноиде, нуклеозиде, естрогене и неколико других аналита. Поларни интеркалатор има и поларне и неполарне групе, тако да се може користити за раздвајање пептида и протеина који имају и хидрофобне и хидрофилне делове. Поларно уграђене колоне (нпр., амидно уграђене C18 колоне) су комерцијално доступне под трговачким називом Ascentis Express RP-Amide колоне, али се ове колоне користе само за анализу амина 33.
У овој студији, припремљена је поларно уграђена стационарна фаза (полистирен уграђен у N-фенилмалеимид) и процењена за раздвајање пептида и трипсинског дигеста HSA. Стационарна фаза је припремљена коришћењем следеће стратегије. Порозне честице силицијум диоксида су припремљене према поступку датом у нашој претходној публикацији са неким модификацијама протокола припреме. Однос урее, полиетилен гликола (PEG), TMOS, воде и сирћетне киселине је подешен да би се припремиле честице силицијум диоксида са великом величином пора. Друго, синтетисан је нови лиганд, фенилмалеимид-метил винил изоцијанат, и коришћен је за дериватизацију честица силицијум диоксида да би се припремила поларно уграђена стационарна фаза. Добијена стационарна фаза је упакована у колону од нерђајућег челика (100 × 1,8 мм унутрашњег пречника) користећи оптимизовану шему паковања. Паковање колоне је потпомогнуто механичким вибрацијама како би се осигурало формирање хомогеног слоја унутар колоне. Процена раздвајања пептидних смеша које се састоје од пет пептида у упакованој колони; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) и трипсински раствор хуманог серумског албумина (HAS). Уочено је да се смеша пептида и трипсински раствор HSA раздвајају са добром резолуцијом и ефикасношћу. Перформансе раздвајања PMP колоне упоређене су са перформансама Ascentis Express RP-Amide колоне. Уочено је да су и пептиди и протеини добро раздвојени и ефикасни на PMP колони, која је била ефикаснија од Ascentis Express RP-Amide колоне.
ПЕГ (полиетилен гликол), уреа, сирћетна киселина, триметокси ортосиликат (ТМОС), триметил хлоросилан (ТМЦС), трипсин, хумани серумски албумин (ХСА), амонијум хлорид, уреа, хексан метилдисилазан (ХМДС), метакрилоил хлорид (МЦ), стирен, 4-хидрокси-ТЕМПО, бензоил пероксид (БПО), ацетонитрил (АЦН) ХПЛЦ квалитета, метанол, 2-пропанол и ацетон, купљени од компаније Сигма-Олдрич (Сент Луис, Мисури, САД).
Смеша урее (8 г), полиетилен гликола (8 г) и 8 мл 0,01 N сирћетне киселине мешана је 10 минута, а затим је додато 24 мл TMOS-а под ледено хладним условима. Реакциона смеша је загрејана на 40°C током 6 сати, а затим на 120°C током 8 сати у аутоклаву од нерђајућег челика. Вода је одливена, а преостали материјал је сушен на 70°C током 12 сати. Осушена мека маса је глатко самљена у пећи и калцинисана на 550°C током 12 сати. Припремљене су и окарактерисане три серије како би се испитала репродуктивност величине честица, величине пора и површине.
Површинском модификацијом честица силицијум диоксида претходно синтетизованим лигандом фенилмалеимид-метилвинилизоцијанатом (PCMP), а затим радијалном полимеризацијом са стиреном, припремљено је једињење које садржи поларну групу. Стационарна фаза за агрегате и ланце полистирена. Процес припреме је описан у наставку.
N-фенилмалеимид (200 мг) и метил винил изоцијанат (100 мг) су растворени у сувом толуену, а 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрила (AIBN) је додато у реакциону посуду да би се припремио фенилмалеимид-метил винил изоцијанат кополимер (PMCP). Смеша је загрејана на 60°C током 3 сата, филтрирана и сушена у рерни на 40°C током 3 сата.
Осушене честице силицијум диоксида (2 г) су дисперговане у сувом толуену (100 мл), мешане и сонициране у тиквици са округлим дном од 500 мл током 10 минута. ПМЦП (10 мг) је растворен у толуену и кап по кап додат у реакциону тиквицу преко левка за капање. Смеша је рефлуксована на 100°C током 8 сати, филтрирана и испрана ацетоном и сушена на 60°C током 3 сата. Затим, честице силицијум диоксида везане за ПМЦП (100 г) су растворене у толуену (200 мл) и додат је 4-хидрокси-ТЕМПО (2 мл) у присуству 100 µЛ дибутилтин дилаурата као катализатора. Смеша је мешана на 50°C током 8 сати, филтрирана и сушена на 50°C током 3 сата.
Стирен (1 mL), бензоил пероксид BPO (0,5 mL) и честице силицијум диоксида везане за TEMPO-PMCP (1,5 g) су дисперговане у толуену и прочишћене азотом. Полимеризација стирена је спроведена на 100°C током 12 сати. Добијени производ је испран метанолом и осушен на 60°C преко ноћи. Укупна реакциона шема је приказана на слици 1.
Узорци су дегазирани на 393 K током 1 сата да би се добио резидуални притисак мањи од 10-3 Torr. Количина N2 адсорбована при релативном притиску P/P0 = 0,99 коришћена је за одређивање укупне запремине пора. Морфологија чистих и лигандно везаних честица силицијум диоксида испитана је скенирајућом електронском микроскопијом (Hitachi High Technologies, Токио, Јапан). Осушени узорци (чисти силицијум диоксид и честице силицијум диоксида везане лигандом) постављени су на алуминијумску колону помоћу лепљиве угљеничне траке. Злато је нанесено на узорке помоћу Q150T распршивача, а на узорке је нанесен слој Au од 5 nm. Ово побољшава ефикасност процеса коришћењем ниских напона и обезбеђује финозрнасто, хладно распршивање. За елементарну анализу коришћен је елементарни анализатор Thermo Electron (Waltham, MA, САД) Flash EA1112. За добијање расподеле величине честица коришћен је анализатор величине честица Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Честице силицијум диоксида без гасова и честице силицијум диоксида везане лигандом (5 мг сваки) су дисперговани у 5 мл изопропанола, соницирани 10 минута, вортексовани 5 минута и постављени на оптички сто Мастерсајзера. Термогравиметријска анализа је извршена брзином од 5 °C у минути у температурном опсегу од 30 до 800 °C.
Колоне од нерђајућег челика обложене стаклом, уског пречника димензија (100 × 1,8 мм унутрашњи пречник) су набијене методом паковања у суспензију, примењујући исти поступак коришћен у реф. 31. Колона од нерђајућег челика (обложена стаклом, унутрашњи пречник 100 × 1,8 мм) са излазним фитингом који садржи фриту од 1 µм повезана је са пакером за суспензију (Alltech Deerfield, IL, САД). Припремити суспензију стационарне фазе суспендовањем 150 мг стационарне фазе у 1,2 мл метанола и послати је у колону за складиштење. Метанол је коришћен као растварач за суспензију, као и као потисни растварач. Колону пунити секвенцијално применом притиска од 100 MP током 10 минута, 80 MP током 15 минута и 60 MP током 30 минута. Током паковања, примењиване су механичке вибрације помоћу два GC шејкера ​​за колоне (Alltech, Deerfield, IL, САД) како би се осигурало равномерно паковање колоне. Затворити пакер за суспензију и полако отпустити притисак како би се спречило било какво оштећење унутар колоне. Искључити колону из јединице за паковање суспензије и повезати други фитинг на улаз и на LC систем да би се провериле њене перформансе.
Конструисана је LC пумпа (10AD Shimadzu, Јапан), инјектор (Valco (САД) C14 W.05) са петљом за убризгавање од 50nL, мембрански дегазер (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капиларни прозор. Конструисан је специјални µLC детектор уређаја (UV-2075) и микроколоне обложене стакленом облогом. Коришћене су веома уске и кратке спојне цеви како би се минимизирао ефекат додатног ширења опсега колоне. Након паковања, капиларе (50 μm унутрашњег пречника 365) и капиларе редукционог споја (50 μm) су инсталиране на излазу од 1/16″ редукционог споја. Прикупљање података и хроматографска обрада су обављени помоћу софтвера Multichro 2000. Праћење на 254 nm. Аналити су тестирани на UV апсорбанцију. Хроматографски подаци су анализирани помоћу OriginPro8 (Northampton, MA).
Албумин из људског серума, лиофилизовани прах, ≥ 96% (електрофореза на агарозном гелу) 3 mg помешан са трипсином (1,5 mg), 4,0 M уреом (1 mL) и 0,2 M амонијум бикарбонатом (1 mL). Раствор је мешан 10 минута и држан у воденом купатилу на 37°C током 6 сати, а затим је додато 1 mL 0,1% TFA. Филтрирати раствор и чувати на температури испод 4°C.
Раздвајање пептидних смеша и HSA трипсинског варења је одвојено процењено на PMP колонама. Проверите раздвајање пептидне смеше и трипсинског варења HSA помоћу PMP колоне и упоредите резултате са Ascentis Express RP-Amide колоном. Теоријски број плоча се израчунава на следећи начин:
СЕМ снимци честица силицијум диоксида без игле и честица силицијум диоксида везаних лигандима приказани су на слици 2. СЕМ снимци честица силицијум диоксида без игле (А, Б) показују да су, за разлику од наших претходних студија, ове честице сферне, издужене или имају неправилну симетрију. Површина честица силицијум диоксида везаних лигандима (Ц, Д) је глађа од површине честица силицијум диоксида без игле, што може бити последица премаза полистиренских ланаца на површини честица силицијум диоксида.
Слике добијене скенирајућом електронском микроскопијом, добиле су голе честице силицијум диоксида (А, Б) и честице силицијум диоксида везане за лиганд (Ц, Д).
Расподела величине честица голих честица силицијум диоксида и честица силицијум диоксида везаних лигандом приказана је на слици 3(А). Криве расподеле величине честица засноване на запремини показале су да се величина честица силицијум диоксида повећала након хемијске модификације (слика 3А). Подаци о расподели величине честица силицијум диоксида из тренутне студије и претходне студије упоређени су у Табели 1(А). Величина честица заснована на запремини, d(0,5), ПМП-а је 3,36 μм, у поређењу са нашом претходном студијом са вредношћу ad(0,5) од 3,05 μм (честице силицијум диоксида везане за полистирен)34. Ова серија је имала ужу расподелу величине честица у поређењу са нашом претходном студијом због различитих односа ПЕГ-а, урее, ТМОС-а и сирћетне киселине у реакционој смеши. Величина честица ПМП фазе је нешто већа од величине честица силицијум диоксида везаних за полистирен коју смо претходно проучавали. То значи да је површинска функционализација честица силицијум диоксида стиреном само нанела слој полистирена (0,97 µм) на површину силицијум диоксида, док је у ПМП фази дебљина слоја била 1,38 µm.
Расподела величине честица (А) и расподела величине пора (Б) честица силицијум диоксида без присуства силицијума и честица силицијум диоксида везаних за лиганд.
Величина пора, запремина пора и површина честица силицијум диоксида у овој студији дате су у Табели 1(Б). PSD профили честица силицијум диоксида без и лиганда и честица силицијум диоксида везаних за лиганд приказани су на Слици 3(Б). Резултати су упоредиви са нашом претходном студијом. Величине пора честица силицијум диоксида без и лиганда везаних за лиганд су 310 и 241, респективно, што указује да се величина пора смањује за 69 након хемијске модификације, као што је приказано у Табели 1(Б), а промена криве је приказана на Слици 3(Б). Слично томе, запремина пора честица силицијум диоксида смањила се са 0,67 на 0,58 цм3/г након хемијске модификације. Специфична површина тренутно проучаваних честица силицијум диоксида је 116 м2/г, што је упоредиво са нашом претходном студијом (124 м2/г). Као што је приказано у Табели 1(Б), површина (м2/г) честица силицијум диоксида такође се смањила са 116 м2/г на 105 м2/г након хемијске модификације. модификација.
Резултати елементарне анализе стационарне фазе приказани су у Табели 2. Садржај угљеника у тренутној стационарној фази је 6,35%, што је ниже од садржаја угљеника у нашој претходној студији (честице силицијум диоксида везане за полистирен, 7,93%35 и 10,21%, респективно)42. Садржај угљеника у тренутној стационарној фази је низак, јер су у припреми тренутног СП, поред стирена, коришћени и неки поларни лиганди као што су фенилмалеимид-метилвинилизоцијанат (PCMP) и 4-хидрокси-TEMPO. Тежински проценат азота у тренутној стационарној фази је 2,21%, у поређењу са 0,1735 и 0,85% по тежини азота у претходним студијама, респективно. То значи да је тежински проценат азота већи у тренутној стационарној фази због фенилмалеимида. Слично, садржај угљеника у производима (4) и (5) био је 2,7% и 2,9%, респективно, док је садржај угљеника у финалном производу (6) био 6,35%, као што је приказано у Табели 2. Губитак тежине је проверен помоћу стационарне фазе ПМП, а ТГА крива је приказана на Слици 4. ТГА крива показује губитак тежине од 8,6%, што је у доброј сагласности са садржајем угљеника (6,35%) јер лиганди садрже не само C већ и N, O и H.
Фенилмалеимид-метилвинилизоцијанатни лиганд је изабран за модификацију површине честица силицијум диоксида јер има поларне фенилмалеимидне групе и винилизоцијанатне групе. Винил изоцијанатне групе могу даље реаговати са стиреном полимеризацијом живих радикала. Други разлог је уметање групе која има умерену интеракцију са аналитом и нема јаку електростатичку интеракцију између аналита и стационарне фазе, пошто фенилмалеимидни део нема виртуелно наелектрисање при нормалном pH. Поларитет стационарне фазе може се контролисати оптималном количином стирена и временом реакције полимеризације слободних радикала. Последњи корак реакције (полимеризација слободних радикала) је критичан и може променити поларитет стационарне фазе. Елементарна анализа је извршена да би се проверило оптерећење угљеником ових стационарних фаза. Примећено је да повећање количине стирена и времена реакције повећава оптерећење угљеником стационарне фазе и обрнуто. SP припремљени са различитим концентрацијама стирена имају различито оптерећење угљеником. Поново, ставите ове стационарне фазе у колоне од нерђајућег челика и проверите њихове хроматографске перформансе (селективност, резолуција, вредност N, итд.). На основу ових експеримената, одабрана је оптимизована формулација за припрему стационарне фазе ПМП-а како би се осигурала контролисана поларност и добро задржавање аналита.
Пет пептидних смеша (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, леуцин енкефалин) су такође процењене коришћењем PMP колоне са мобилном фазом; 60/40 (v/v) ацетонитрил/вода (0,1% TFA) при брзини протока од 80 μL/min. Под оптималним условима елуције, теоријски број плоча (N) по колони (100 × 1,8 mm id) је 20.000 ± 100 (200.000 плоча/m²). Табела 3 даје вредности N за три PMP колоне, а хроматограми су приказани на слици 5A. Брза анализа на PMP колони при високој брзини протока (700 μL/min), пет пептида је елуирано у року од једног минута, вредности N су биле веома добре, 13.500 ± 330 по колони (100 × 1,8 mm id), што одговара 135.000 плоча/m (слика 5B). Три колоне идентичне величине (100 × 1,8 mm id) су биле напуњене са три различите серије стационарне фазе PMP ради провере репродуктивности. Концентрација аналита за сваку колону је забележена коришћењем оптималних услова елуције и броја теоријских плоча N и времена задржавања за раздвајање исте тест смеше на свакој колони. Подаци о репродуктивности за PMP колоне су приказани у Табели 4. Репродуктивност PMP колоне је у доброј корелацији са веома ниским вредностима %RSD, као што је приказано у Табели 3.
Раздвајање смеше пептида на ПМП колони (Б) и Асценс Експрес РП-Амид колони (А); мобилна фаза 60/40 АЦН/Х2О (ТФА 0,1%), димензије ПМП колоне (100 × 1,8 мм унутрашњи пречник); аналитички. Редослед елуирања једињења: 1 (Гли-Тир), 2 (Гли-Леу-Тир), 3 (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) и 5 ​​(леуцин) киселински енкефалин).
ПМП колона (100 × 1,8 мм унутрашњег пречника) је процењена за раздвајање трипсинских дигеста људског серумског албумина у високоефикасној течној хроматографији. Хроматограм на слици 6 показује да је узорак добро раздвојен и да је резолуција веома добра. Дигестије ХСА су анализиране коришћењем брзине протока од 100 µL/мин, мобилне фазе 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% TFA. Као што је приказано на хроматограму (слика 6), дигестија ХСА је подељена на 17 пикова који одговарају 17 пептида. Ефикасност раздвајања сваког пика у дигестији ХСА је израчуната и вредности су дате у Табели 5.
Триптички дигест HSA (100 × 1,8 mm уд) је одвојен на PMP колони; брзина протока (100 µL/min), мобилна фаза 60/40 ацетонитрил/вода са 0,1% TFA.
где је L дужина колоне, η вискозност мобилне фазе, ΔP је повратни притисак у колони, а u је линеарна брзина мобилне фазе. Пропустљивост PMP колоне била је 2,5 × 10⁻¹⁴ м², брзина протока је била 25 μL/min, а коришћен је ACN/вода односа 60/40 v/v. Пропустљивост PMP колоне (100 × 1,8 mm унутрашњи пречник) била је слична оној из наше претходне студије, реф. 34. Пропустљивост колоне напуњене површински порозним честицама је: 1,7 × 10⁻¹⁴ за честице од 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁴ за честице од 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁴ и 2,5 × 10⁻¹⁴ м² за честице од 2,6 μm. За честице од 5 μm 43. Стога је пропустљивост PMP фазе слична оној код честица језгро-љуска од 5 μm.
где је Wx тежина колоне напуњене хлороформом, Wy је тежина колоне напуњене метанолом, а ρ је густина растварача. Густине метанола (ρ = 0,7866) и хлороформа (ρ = 1,484). Укупна порозност колона SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 и колона C18-Urea 31 које смо претходно проучавали била је 0,63 и 0,55, респективно. То значи да присуство лиганда урее смањује пропустљивост стационарне фазе. С друге стране, укупна порозност PMP колоне (100 × 1,8 mm id) је 0,60. Пропустљивост PMP колона је нижа од колона напуњених C18-везаним честицама силицијум диоксида, јер су у стационарним фазама типа C18 лиганди C18 везани за честице силицијум диоксида као линеарни ланци, док се у стационарним фазама типа полистирена око њега формира релативно дебели полимерни слој. У У типичном експерименту, порозност колоне се израчунава као:
Слика 7А,Б приказује ПМП колону (100 × 1,8 мм унутрашњи пречник) и Асценс Експрес РП-Амид колону (100 × 1,8 мм унутрашњи пречник) користећи исте услове елуције (тј. 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA). ) ван Демтеровог дијаграма. Одабране смеше пептида (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) су припремљене у 20 µL/. Минимална брзина протока за обе колоне је 800 µL/min. Минималне вредности HETP-а при оптималној брзини протока (80 µL/min) за PMP колону и Ascentis Express RP-Amide колону биле су 2,6 µm и 3,9 µm, респективно. Вредности HETP-а указују да је ефикасност раздвајања PMP колоне (100 × 1,8 mm id) много боља од комерцијално доступне Ascentis Express RP-Amide колоне (100 × 1,8 mm id). Ван Демтеров графикон на слици 7(A) показује да смањење вредности N са повећањем протока није значајно у поређењу са нашом претходном студијом. Већа ефикасност раздвајања PMP колоне (100 × 1,8 mm id) у поређењу са колоном Ascentis Express RP-Amide засновано је на побољшањима у облику честица, величини и сложеним поступцима паковања колоне који се користе у тренутном раду34.
(А) ван Демтеров дијаграм (HETP у односу на линеарну брзину мобилне фазе) добијен коришћењем PMP колоне (100 × 1,8 mm унутрашњи пречник) у 60/40 ACN/H2O са 0,1% TFA. (Б) ван Демтеров дијаграм (HETP у односу на линеарну брзину мобилне фазе) добијен коришћењем Ascentis Express RP-Amide колоне (100 × 1,8 mm унутрашњи пречник) у 60/40 ACN/H2O са 0,1% TFA.
Припремљена је и процењена стационарна фаза од поларно уграђеног полистирена за раздвајање синтетичких пептидних смеша и трипсинског варења хуманог серумског албумина (HAS) у течној хроматографији високих перформанси. Хроматографске перформансе PMP колона за пептидне смеше су одличне у ефикасности раздвајања и резолуцији. Побољшане перформансе раздвајања PMP колона су последица различитих разлога, као што су величина честица и величина пора честица силицијум диоксида, контролисана синтеза стационарне фазе и сложено паковање колоне. Поред високе ефикасности раздвајања, низак повратни притисак у колони при високим брзинама протока је још једна предност ове стационарне фазе. PMP колоне показују добру репродуктивност и могу се користити за анализу пептидних смеша и варење различитих протеина трипсином. Намеравамо да користимо ову колону за раздвајање природних производа, биоактивних једињења из лековитих биљака и гљивичних екстраката у течној хроматографији. У будућности ће PMP колоне такође бити процењене за раздвајање протеина и моноклонских антитела.
Филд, ЈК, Ојерби, МР, Лау, Ј., Тегерсен, Х. и Петерсон, П. Истраживање система за раздвајање пептида помоћу хроматографије са обрнутом фазом, Део I: Развој протокола за карактеризацију колоне. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомез, Б. и др. Побољшани активни пептиди дизајнирани за лечење заразних болести. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиге, П., Лисовски, В., Мартинез, Ј. и Хрестчатиски, М. Синтетички терапеутски пептиди: наука и тржиште. Откривање лекова. 15 (1-2) данас, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сје, Ф., Смит, Р. Д. и Шен, Ј. Напредна протеомска течна хроматографија. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Лиу, В. и др. Напредна течна хроматографија-масена спектрометрија омогућава укључивање широко циљане метаболомике и протеомике. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. и Салисбери, Џ.Џ. Улога UHPLC-а у развоју лекова. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. и Клаузен, АМ Фундаментални и практични аспекти течне хроматографије ултрависоког притиска за брза раздвајања. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Врен, СА и Челичев, П. Примена ултрависоко ефикасне течне хроматографије у развоју лекова. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. и др. Монолитни макропорозни хидрогелови припремљени од емулзија уље-у-води са високим садржајем унутрашње фазе за ефикасно пречишћавање ентеровируса. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ј., Сјанг, Р., Хорват, К. и Вилкинс, Ј.А. Улога течне хроматографије у протеомици. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Веутеј, Ж.-Л. и Гиларме, Д. Нови трендови у раздвајању терапеутских пептида и протеина обрнуто-фазном течном хроматографијом: теорија и примене. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дејли, А.Е. и Геблер, ЈЦ. Дводимензионално раздвајање пептида коришћењем RP-RP-HPLC система са различитим pH вредностима у првој и другој димензији раздвајања. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Фелети, С. и др. Испитане су карактеристике преноса масе и кинетичке перформансе високоефикасних хроматографских колона напуњених потпуно и површински порозним честицама C18 величине испод 2 μm. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. и др. Недавни трендови и аналитички изазови у изолацији, идентификацији и валидацији биљних биоактивних пептида. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Милер, ЈБ и др. Протеомски пејзаж царства живота. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, К. и др. Даљња обрада терапеутских пептида препаративном течном хроматографијом. Molecule (Базел, Швајцарска) 26(15), 4688(2021).
Јанг, Ј. и Генг, Кс. Мешовита хроматографија и њена примена на биополимере. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Жао, Г., Донг, Кс.-Ј. и Сун, Ј. Лиганди за мешану протеинску хроматографију: принцип, карактеризација и дизајн. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).