Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu kongruecan reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Poraj silikaj partikloj estis preparitaj per sol-ĝela metodo kun kelkaj modifoj por akiri makroporajn partiklojn. Ĉi tiuj partikloj estis derivigitaj per reigebla aldona fragmentiĝa ĉentranslokigo (RAFT) polimerigo kun N-fenilmaleimido-metilvinilisocianato (PMI) kaj stireno por prepari N-fenilmaleimidan interkaladon de polistirena (PMP) senmova fazo. Mallarĝ-kalibraj rustorezistaŝtalaj kolonoj (100 × 1.8 mm id) estis pakitaj per ŝlima pakado. Taksis PMP-kolonapartigon de peptida miksaĵo konsistanta el kvin peptidoj (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leŭcina enkefalino) kromatografian rendimenton) kaj tripsinan digestadon de homa seruma albumino (HAS). Sub optimumaj eluciaj kondiĉoj, la teoria platkalkulo de la peptida miksaĵo estas tiel alta kiel 280,000 platoj/m². Komparante la apartigan rendimenton de la evoluinta kolono kun la komerca... Uzante kolumnon Ascentis Express RP-Amide, oni observis, ke la apartiga efikeco de la PMP-kolono estis supera al la komerca kolumno rilate al apartiga efikeco kaj distingivo.
En la lastaj jaroj, la biofarmacia industrio fariĝis kreskanta tutmonda merkato kun konsiderinda kresko de merkatparto. Kun la eksploda kresko de la biofarmacia industrio1,2,3, la analizo de peptidoj kaj proteinoj estas tre dezirata. Aldone al la cela peptido, pluraj malpuraĵoj estas generitaj dum peptida sintezo, tiel postulante kromatografian purigon por akiri peptidojn de la dezirata pureco. La analizo kaj karakterizado de proteinoj en korpaj fluidoj, histoj kaj ĉeloj estas ekstreme malfacila tasko pro la granda nombro da eble detekteblaj specioj en ununura specimeno. Kvankam mas-spektrometrio estas efika ilo por peptida kaj proteina sekvencado, se tiaj specimenoj estas injektitaj en la mas-spektrometron en unu trairo, la apartigo ne estos ideala. Ĉi tiu problemo povas esti mildigita per efektivigo de likva kromatografia (LC) apartigoj antaŭ MS-analizo, kiu reduktos la nombron da analitoj enirantaj la mas-spektrometron en difinita tempo4,5,6. Krome, dum likva faza apartigo, analitoj povas esti fokusitaj en mallarĝajn regionojn, tiel koncentrante ĉi tiujn analitojn kaj plibonigante MS-detektan sentemon. Likva kromatografio (LC) signife progresis dum la pasinta jardeko kaj fariĝis... populara tekniko en proteomika analizo7,8,9,10.
Inversa faza likva kromatografio (RP-LC) estas vaste uzata por purigi kaj apartigi peptidajn miksaĵojn uzante oktadecil-modifitan silician oksidon (ODS) kiel la senmovan fazon11,12,13. Tamen, RP-senmovaj fazoj ne provizas kontentigan apartigon de peptidoj kaj proteinoj pro sia kompleksa strukturo kaj amfifila naturo14,15. Tial, speciale dizajnitaj senmovaj fazoj estas necesaj por analizi peptidojn kaj proteinojn kun polusaj kaj nepolusaj partoj por interagi kun kaj reteni ĉi tiujn analitojn16. Miksitreĝima kromatografio, kiu provizas multimodalajn interagojn, povas esti alternativo al RP-LC por la apartigo de peptidoj, proteinoj kaj aliaj kompleksaj miksaĵoj. Pluraj mikstreĝimaj senmovaj fazoj estis preparitaj, kaj kolonoj plenigitaj per ĉi tiuj fazoj estis uzitaj por peptidaj kaj proteinaj apartigoj17,18,19,20,21. Miksitreĝimaj senmovaj fazoj (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polusa interkalado/RPLC) taŭgas por peptidaj kaj proteinaj apartigoj pro la ĉeesto de kaj polusaj kaj nepolusaj... grupoj22,23,24,25,26,27,28. Simile, polusaj interkaliĝantaj senmovaj fazoj kun kovalente ligitaj polusaj grupoj montras bonan apartigpovon kaj unikan selektivecon por polusaj kaj nepolusaj analitoj, ĉar apartigo dependas de la interago inter la analito kaj la senmova fazo. Multimodalaj interagoj 29, 30, 31, 32. Lastatempe, Zhang et al. 30 preparis dodecil-finitan poliaminan senmovan fazon kaj sukcese apartigis hidrokarbonojn, antidepresiaĵojn, flavonoidojn, nukleozidojn, estrogenojn kaj plurajn aliajn analitojn. La polusa interkaligilo havas kaj polusajn kaj nepolusajn grupojn, do ĝi povas esti uzata por apartigi peptidojn kaj proteinojn, kiuj havas kaj hidrofobajn kaj hidrofilajn partojn. Poluse enigitaj kolumnoj (ekz., amid-enigitaj C18 kolumnoj) estas komerce haveblaj sub la komerca nomo Ascentis Express RP-Amide kolumnoj, sed ĉi tiuj kolumnoj estas uzataj nur por la analizo de amino 33.
En la nuna studo, poluse enigita senmova fazo (N-fenilmaleimido-enigita polistireno) estis preparita kaj taksita por apartigo de peptidoj kaj tripsinaj digestoj de HSA. La senmova fazo estis preparita uzante la jenan strategion. Poraj silikaj partikloj estis preparitaj laŭ la proceduro donita en nia antaŭa publikaĵo kun kelkaj modifoj al la prepara protokolo. La proporcio de ureo, polietilena glikolo (PEG), TMOS, akvo kaj acetata acido estis adaptita por prepari silikajn partiklojn kun granda pora grandeco. Due, nova ligando, fenilmaleimido-metila vinila izocianato, estis sintezita kaj uzita por derivigi silikajn partiklojn por prepari poluse enigitan senmovan fazon. La rezulta senmova fazo estis pakita en rustorezistan ŝtalan kolonon (100 × 1.8 mm interna diametro) uzante la optimumigitan pakoskemon. La kolumna pakado estas helpata per mekanika vibrado por certigi, ke homogena lito estas formita ene de la kolono. Taksu la pakitan kolumnan apartigon de peptidaj miksaĵoj konsistantaj el kvin peptidoj; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leŭcina Enkefalino) kaj Tripsina digesto de homa seruma albumino (HAS). La peptida miksaĵo kaj tripsina digesto de HSA estis observitaj apartigi kun bona distingivo kaj efikeco. La apartiga agado de la PMP-kolumno estis komparita kun tiu de la Ascentis Express RP-Amida kolumno. Kaj peptidoj kaj proteinoj estis bone solvitaj kaj efikaj sur la PMP-kolumno, kiu estis pli efika ol la Ascentis Express RP-Amida kolumno.
PEG (Polietilena Glikolo), Ureo, Aceta Acido, Trimetokso-Ortosilikato (TMOS), Trimetila Klorosilano (TMCS), Tripsino, Homa Seruma Albumino (HSA), Amonia Klorido, Ureo, Heksana Metildisilazano (HMDS), Metakriloila Klorido (MC), Stireno, 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoila Peroksido (BPO), HPLC-Grada Acetonitrilo (ACN), Metanolo, 2-Propanolo, kaj Acetono aĉetitaj de Sigma-Aldrich (Sankta Luiso, Misurio, Usono).
Miksaĵo de ureo (8 g), polietilen-glikolo (8 g), kaj 8 mL de 0.01 N acetata acido estis kirita dum 10 minutoj, kaj poste 24 mL de TMOS estis aldonitaj al ĝi sub glacie malvarmaj kondiĉoj. La reakcia miksaĵo estis varmigita je 40 °C dum 6 horoj kaj poste je 120 °C dum 8 horoj en aŭtoklavo el neoksidebla ŝtalo. La akvo estis verŝita kaj la resta materialo estis sekigita je 70 °C dum 12 horoj. La sekigita mola maso estis glate muelita en forno kaj kalcinita je 550 °C dum 12 horoj. Tri aroj estis preparitaj kaj karakterizitaj por ekzameni reprodukteblecon laŭ partikla grandeco, pora grandeco kaj surfaca areo.
Per surfaca modifo de siliciaj partikloj kun antaŭsintezita ligando fenilmaleimido-metilvinilisocianato (PCMP) sekvata de radiala polimerigo kun stireno, polusa grupo-entenanta kombinaĵo estis preparita. Senmova fazo por agregaĵoj kaj polistirenaj ĉenoj. La preparprocezo estas priskribita sube.
N-fenilmaleimido (200 mg) kaj metilvinilizocianato (100 mg) estis solvitaj en seka tolueno, kaj 0,1 mL de 2,2′-azoizobutironitrilo (AIBN) estis aldonita al la reakcia flakono por prepari fenilmaleimido-metilvinilizocianata kopolimeron (PMCP). La miksaĵo estis varmigita je 60 °C dum 3 horoj, filtrita kaj sekigita en forno je 40 °C dum 3 horoj.
Sekigitaj siliciaj partikloj (2 g) estis disigitaj en seka tolueno (100 mL), kirlitaj kaj sonigitaj en 500 mL rondfunda flakono dum 10 minutoj. PMCP (10 mg) estis dissolvita en tolueno kaj aldonita gute al la reakcia flakono per gutfunelo. La miksaĵo estis refluigita je 100 °C dum 8 horoj, filtrita kaj lavita per acetono kaj sekigita je 60 °C dum 3 horoj. Poste, PMCP-ligitaj siliciaj partikloj (100 g) estis dissolvitaj en tolueno (200 ml) kaj 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) estis aldonita en la ĉeesto de 100 µL da dibutilstana dilaŭrato kiel katalizilo. La miksaĵo estis kirlita je 50 °C dum 8 horoj, filtrita kaj sekigita je 50 °C dum 3 horoj.
Stireno (1 mL), benzoila peroksido BPO (0,5 mL), kaj TEMPO-PMCP-alkroĉitaj siliciaj partikloj (1,5 g) estis dispersigitaj en tolueno kaj purigitaj per nitrogeno. La polimerigo de stireno estis efektivigita je 100 °C dum 12 horoj. La rezulta produkto estis lavita per metanolo kaj sekigita je 60 °C dumnokte. La ĝenerala reakcia skemo estas montrita en Figuro 1.
La specimenoj estis sengasigitaj je 393 K dum 1 horo por atingi restan premon malpli ol 10-3 Torr. La kvanto de N2 adsorbita je relativa premo de P/P0 = 0.99 estis uzata por determini la totalan porvolumenon. La morfologio de nudaj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estis ekzamenita per skana elektrona mikroskopio (Hitachi High Technologies, Tokio, Japanio). Sekigitaj specimenoj (nudaj siliciaj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj) estis metitaj sur aluminian kolonon uzante gluan karbonan bendon. Oro estis tegita sur la specimenoj uzante Q150T ŝpruc-tegaĵon, kaj 5 nm Au-tavolo estis deponita sur la specimenoj. Ĉi tio plibonigas la procesefikecon uzante malaltajn tensiojn kaj provizas fajnan grenon, malvarman ŝprucadon. Elementa analizilo Thermo Electron (Waltham, MA, Usono) Flash EA1112 estis uzata por elementa analizo. Partikla grandecanalizilo Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 estis uzata por akiri la partiklan grandecdistribuon. Nudaj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj (po 5 mg) estis disigitaj en 5 mL da izopropanolo, sonikigitaj dum 10 minutoj, kirlite dum 5 minutoj, kaj metitaj sur la optikan benkon de la Mastersizer. Termogravimetria analizo estis farita je rapideco de 5 °C minute super temperaturintervalo de 30 ĝis 800 °C.
Vitro-kovritaj rustorezista ŝtalo mallarĝkalibraj kolonoj kun dimensioj (100 × 1.8 mm internaj dimensioj) estis pakitaj uzante la ŝlaman pakmetodon, aplikante la saman proceduron uzitan en Ref. 31. Kolono el neoksidebla ŝtalo (vitrokovrita, 100 × 1.8 mm interna diametro) kun elira konektilo enhavanta 1 µm friton estis konektita al ŝlima pakilo (Alltech Deerfield, IL, Usono). Preparu senmovan fazan ŝlimon suspendante 150 mg da senmova fazo en 1.2 mL da metanolo kaj sendu ĝin al la stoka kolono. Metanolo estis uzata kiel la ŝlima solvilo same kiel la propulsa solvilo. Plenigu la kolonon sinsekve aplikante premojn de 100 MP dum 10 minutoj, 80 MP dum 15 minutoj, kaj 60 MP dum 30 minutoj. Dum la pakado, mekanika vibrado estis aplikita per du GC-kolumnaj skuiloj (Alltech, Deerfield, IL, Usono) por certigi unuforman pakadon de la kolono. Fermu la ŝliman pakilon kaj malrapide liberigu la premon por malhelpi ian ajn difekton ene de la kolono. Malkonektu la kolonon de la ŝlima pakilo kaj konektu alian konektilon al la eniro kaj al la LC-sistemo por kontroli ĝian funkciadon.
LC-pumpilo (10AD Shimadzu, Japanio), injektilo (Valco (Usono) C14 W.05) kun 50nL injekta buklo, membrana sengasigilo (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS-kapilara fenestro estis konstruitaj. Speciala µLC-aparata detektilo (UV-2075) kaj vitro-kovritaj mikrokolumnoj estis uzataj. Tre mallarĝaj kaj mallongaj konektaj tuboj estis uzataj por minimumigi la efikon de plilarĝigo de la kolumna bendo. Post pakado, kapilaroj (50 μm id 365) kaj reduktaj uniĝaj kapilaroj (50 μm) estis instalitaj ĉe la 1/16″ elirejo de la redukta unio. Datenkolektado kaj kromatografia prilaborado estis faritaj per la programaro Multichro 2000. Monitorado je 254 nm. Analitoj estis testitaj pri UV-absorbo. Kromatografiaj datumoj estis analizitaj per OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumino el homa serumo, liofiligita pulvoro, ≥ 96% (agaroza ĝelelektroforezo) 3 mg miksita kun tripsino (1.5 mg), 4.0 M ureo (1 mL), kaj 0.2 M amonia bikarbonato (1 mL). La solvaĵo estis kirita dum 10 minutoj kaj konservita en akvobano je 37 °C dum 6 horoj, poste sensoifigita per 1 mL da 0.1% TFA. Filtru la solvaĵon kaj konservu sub 4 °C.
Apartigo de peptidaj miksaĵoj kaj HSA-tripsinaj digestoj estis taksita aparte sur PMP-kolumnoj. Kontrolu la apartigon de la peptida miksaĵo kaj tripsina digesto de HSA per la PMP-kolumno kaj komparu la rezultojn kun la Ascentis Express RP-Amide-kolumno. La teoria platnombro estas kalkulita jene:
SEM-bildoj de nudaj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estas montritaj en FIG. 2. SEM-bildoj de nudaj siliciaj partikloj (A, B) montras, ke, kontraste al niaj antaŭaj studoj, ĉi tiuj partikloj estas sferaj, en kiuj la partikloj estas plilongigitaj aŭ havas neregulan simetrion. La surfaco de la ligando-ligitaj siliciaj partikloj (C, D) estas pli glata ol tiu de la nudaj siliciaj partikloj, kio povas ŝuldiĝi al la tegaĵo de polistirenaj ĉenoj sur la surfaco de la siliciaj partikloj.
Skanantaj elektronmikroskopaj bildoj de nudaj siliciaj partikloj (A, B) kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj (C, D).
La distribuoj de partiklaj grandecoj de nudaj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estas montritaj en Figuro 3(A). Volumen-bazitaj kurboj de partiklaj grandecoj montris, ke la grandeco de la siliciaj partikloj pliiĝis post kemia modifo (Fig. 3A). La datumoj pri partiklaj grandecoj de la siliciaj partikloj de la nuna studo kaj la antaŭa studo estas komparitaj en Tabelo 1(A). La volumen-bazita partikla grandeco, d(0.5), de PMP estas 3.36 μm, kompare kun nia antaŭa studo kun ad(0.5) valoro de 3.05 μm (polistiren-ligitaj siliciaj partikloj)34. Ĉi tiu aro havis pli mallarĝan partiklan grandecon kompare kun nia antaŭa studo pro la variaj proporcioj de PEG, ureo, TMOS kaj acetata acido en la reakcia miksaĵo. La partikla grandeco de la PMP-fazo estas iomete pli granda ol tiu de la polistiren-ligita silicia partikla fazo, kiun ni antaŭe studis. Ĉi tio signifas, ke surfaca funkciigo de siliciaj partikloj kun stireno nur deponis polistirenan tavolon (0.97 µm) sur la silicia surfaco, dum en la PMP-fazo... la tavoldikeco estis 1,38 µm.
Partikla grandecdistribuo (A) kaj pora grandecdistribuo (B) de nudaj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj.
La porgrandeco, porvolumeno kaj surfacareo de la siliciaj partikloj de la nuna studo estas donitaj en Tabelo 1(B). La PSD-profiloj de nudaj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estas montritaj en Figuro 3(B). La rezultoj estas kompareblaj al nia antaŭa studo. La porgrandecoj de la nudaj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estas 310 kaj 241, respektive, kio indikas, ke la porgrandeco malpliiĝas je 69 post kemia modifo, kiel montrite en Tabelo 1(B), kaj la ŝanĝo de la kurbo estas montrita en Figuro 3(B). Simile, la porvolumeno de la siliciaj partikloj malpliiĝis de 0,67 ĝis 0,58 cm3/g post kemia modifo. La specifa surfacareo de la nuntempe studitaj siliciaj partikloj estas 116 m2/g, kio estas komparebla al nia antaŭa studo (124 m2/g). Kiel montrite en Tabelo 1(B), la surfacareo (m2/g) de la siliciaj partikloj ankaŭ malpliiĝis de 116 m2/g ĝis 105 m2/g post kemia modifo. modifo.
La rezultoj de elementa analizo de la senmova fazo estas montritaj en Tabelo 2. La karbona ŝarĝo de la nuna senmova fazo estas 6,35%, kio estas pli malalta ol la karbona ŝarĝo de nia antaŭa studo (polistireno-ligitaj silikaj partikloj, 7,93%35 kaj 10,21%, respektive)42. La karbona ŝarĝo de la nuna senmova fazo estas malalta, ĉar en la preparado de la nuna SP, krom stireno, kelkaj polusaj ligandoj kiel fenilmaleimido-metilvinilisocianato (PCMP) kaj 4-hidroksi-TEMPO estis uzitaj. La nitrogena peza procento de la nuna senmova fazo estas 2,21%, kompare kun 0,1735 kaj 0,85% laŭ pezo de nitrogeno en antaŭaj studoj, respektive. Ĉi tio signifas, ke la pezprocento de nitrogeno estas pli alta en la nuna senmova fazo pro fenilmaleimido. Simile, la karbonaj ŝarĝoj de produktoj (4) kaj (5) estis 2,7% kaj 2,9%, respektive, dum la karbona ŝarĝo de la fina La produkto (6) estis 6,35%, kiel montrite en Tabelo 2. La pezperdo estis kontrolita per PMP-stacionara fazo, kaj la TGA-kurbo estas montrita en Figuro 4. La TGA-kurbo montras pezperdon de 8,6%, kio bone kongruas kun la karbona ŝarĝo (6,35%) ĉar la ligandoj enhavas ne nur C sed ankaŭ N, O kaj H.
La fenilmaleimido-metilvinilisocianata ligando estis elektita por surfaca modifo de siliciaj partikloj ĉar ĝi havas polusajn fenilmaleimidajn grupojn kaj vinilisocianatajn grupojn. Vinilizocianataj grupoj povas plue reagi kun stireno per viva radikala polimerigo. La dua kialo estas enmeti grupon, kiu havas moderan interagadon kun la analito kaj neniun fortan elektrostatikan interagadon inter la analito kaj la senmova fazo, ĉar la fenilmaleimida parto ne havas virtualan ŝargon ĉe normala pH. La poluseco de la senmova fazo povas esti kontrolita per la optimuma kvanto de stireno kaj la reakcia tempo de libera radikala polimerigo. La lasta paŝo de la reakcio (libera radikala polimerigo) estas kritika kaj povas ŝanĝi la polusecon de la senmova fazo. Elementa analizo estis farita por kontroli la karbonan ŝarĝon de ĉi tiuj senmovaj fazoj. Oni observis, ke pliigo de la kvanto de stireno kaj la reakcia tempo pliigis la karbonan ŝarĝon de la senmova fazo kaj inverse. SP-oj preparitaj kun malsamaj koncentriĝoj de stireno havas malsamajn karbonajn ŝarĝojn. Denove, ŝarĝu ĉi tiujn senmovajn fazojn en rustorezistŝtalajn kolonojn kaj kontrolu ilian kromatografian... rendimento (selektiveco, distingivo, N-valoro, ktp.). Surbaze de ĉi tiuj eksperimentoj, optimumigita formulo estis elektita por prepari la PMP-stacionaran fazon por certigi kontrolitan polusecon kaj bonan analitretenon.
Kvin peptidaj miksaĵoj (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leŭcina enkefalino) ankaŭ estis taksitaj uzante PMP-kolumnon uzantan moveblan fazon; 60/40 (v/v) acetonitrilo/akvo (0.1% TFA) je flukvanto de 80 μL/min. Sub optimumaj eluciaj kondiĉoj, la teoria platnombro (N) por kolumno (100 × 1.8 mm id) estas 20,000 ± 100 (200,000 platoj/m²). Tabelo 3 donas la N-valorojn por la tri PMP-kolumnoj kaj la kromatogramoj estas montritaj en Figuro 5A. Rapida analizo sur PMP-kolumno je alta flukvanto (700 μL/min), kvin peptidoj estis eluitaj ene de unu minuto, N-valoroj estis tre bonaj, 13,500 ± 330 por kolumno (100 × 1.8 mm id), Respondas al 135,000 platoj/m² (Figuro 5B). Tri identgrandaj kolumnoj (100 × 1.8 mm id) estis pakitaj kun tri malsamaj aroj de PMP-stacionara fazo por kontroli reprodukteblecon. La La koncentriĝo de analitoj por ĉiu kolono estis registrita uzante la optimumajn eluciajn kondiĉojn kaj la nombron de teoriaj platoj N kaj retentempon por apartigi la saman testmiksaĵon sur ĉiu kolono. La reprodukteblecaj datumoj por la PMP-kolumnoj estas montritaj en Tabelo 4. La reprodukteblo de la PMP-kolumno bone korelacias kun tre malaltaj %RSD-valoroj, kiel montrite en Tabelo 3.
Apartigo de peptida miksaĵo sur PMP-kolumno (B) kaj Ascentis Express RP-Amide-kolumno (A); movebla fazo 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP-kolumnaj dimensioj (100 × 1.8 mm id); analiza. La eluordo de la kombinaĵoj: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) kaj 5 (leŭcino) acida enkefalino).
PMP-kolumno (100 × 1.8 mm id) estis taksita por apartigo de triptikaj digestoj de homa seruma albumino en alt-efikeca likva kromatografio. La kromatogramo en Figuro 6 montras, ke la specimeno estas bone apartigita kaj la rezolucio estas tre bona. HSA-digestoj estis analizitaj uzante flukvanton de 100 µL/min, moveblan fazon 70/30 acetonitrilo/akvo kaj 0.1% TFA. Kiel montrite en la kromatogramo (Figuro 6), la HSA-digesto estis dividita en 17 pintojn respondantajn al 17 peptidoj. La apartiga efikeco de ĉiu pinto en la HSA-digesto estis kalkulita kaj la valoroj estas donitaj en Tabelo 5.
Triptika digesto de HSA (100 × 1.8 mm id) estis apartigita sur PMP-kolono; flukvanto (100 µL/min), movebla fazo 60/40 acetonitrilo/akvo kun 0.1% TFA.
kie L estas la longo de la kolono, η estas la viskozeco de la movebla fazo, ΔP estas la kontraŭpremo de la kolono, kaj u estas la lineara rapido de la movebla fazo. La permeablo de la PMP-kolono estis 2,5 × 10⁻¹⁴ m², la flukvanto estis 25 μL/min, kaj 60/40 v/v ACN/akvo estis uzata. La permeablo de la PMP-kolono (100 × 1,8 mm id) estis simila al tiu de nia antaŭa studo Ref.34. La permeablo de la kolono pakita per supraĵe poraj partikloj estas: 1,7 × 10⁻¹⁵ por 1,3 μm partikloj, 3,1 × 10⁻¹⁵ por 1,7 μm partikloj, 5,2 × 10⁻¹⁵ kaj 2,5 × 10⁻¹⁴ m² por 2,6 μm partikloj. Por 5 μm partikloj 43. Tial, la permeablo de la PMP-fazo estas simila al tiu de 5 μm kerno-ŝelaj partikloj.
kie Wx estas la pezo de la kolono pakita per kloroformo, Wy estas la pezo de la kolono pakita per metanolo, kaj ρ estas la denseco de la solvilo. Densecoj de metanolo (ρ = 0,7866) kaj kloroformo (ρ = 1,484). La totala poreco de SILICA PARTICLES-C18 kolonoj (100 × 1,8 mm id) 34 kaj C18-Ureo kolonoj 31, kiujn ni antaŭe studis, estis 0,63 kaj 0,55, respektive. Ĉi tio signifas, ke la ĉeesto de ureo-ligandoj reduktas la permeablon de la senmova fazo. Aliflanke, la totala poreco de la PMP kolono (100 × 1,8 mm id) estas 0,60. La permeablo de PMP kolonoj estas pli malalta ol tiu de kolonoj pakita per C18-ligitaj siliciaj partikloj, ĉar en C18-tipaj senmovaj fazoj la C18-ligandoj estas ligitaj al la siliciaj partikloj kiel liniaj ĉenoj, dum en polistiren-tipaj senmovaj fazoj, la relative dika polimera tavolo estas formita ĉirkaŭ ĝi. En tipa eksperimento, la kolona poreco estas kalkulata kiel:
Figuro 7A,B montras la PMP-kolumnon (100 × 1,8 mm id) kaj la Ascentis Express RP-Amide-kolumnon (100 × 1,8 mm id) uzante la samajn eluciajn kondiĉojn (t.e., 60/40 ACN/H2O kaj 0,1% TFA).) de la van Deemter-diagramo. Elektitaj peptidaj miksaĵoj (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leŭcina Enkefalino) estis preparitaj en 20 µL/. La minimuma flukvanto por ambaŭ kolumnoj estas 800 µL/min. La minimumaj HETP-valoroj ĉe la optimuma flukvanto (80 µL/min) por la PMP-kolumno kaj la Ascentis Express RP-Amida kolumno estis 2,6 µm kaj 3,9 µm, respektive. La HETP-valoroj indikas, ke la apartiga efikeco de la PMP-kolumno (100 × 1,8 mm id) estas multe pli bona ol la komerce havebla Ascentis Express RP-Amida kolumno (100 × 1,8 mm id). La van Deemter-diagramo en Fig. 7(A) montras, ke la malpliiĝo de N-valoro kun kreskanta fluo ne estas signifa kompare kun nia antaŭa studo. La pli alta apartiga efikeco de la PMP-kolumno (100 × 1,8 mm id) kompare... al la Ascentis Express RP-Amide kolumno baziĝas sur plibonigoj en partikla formo, grandeco, kaj kompleksaj kolonaj pakaj proceduroj uzitaj en la nuna laboro34.
(A) grafikaĵo de van Deemter (HETP kontraŭ lineara rapido de la movebla fazo) akirita per PMP-kolumno (100 × 1,8 mm interna diametro) en 60/40 ACN/H2O kun 0,1% TFA. (B) grafikaĵo de van Deemter (HETP kontraŭ lineara rapido de la movebla fazo) akirita per Ascentis Express RP-Amide-kolumno (100 × 1,8 mm interna diametro) en 60/40 ACN/H2O kun 0,1% TFA.
Polus-enigita polistirena stacionara fazo estis preparita kaj taksita por apartigo de sintezaj peptidaj miksaĵoj kaj tripsinaj digestoj de homa seruma albumino (HAS) en alt-efikeca likva kromatografio. La kromatografia agado de PMP-kolonoj por peptidaj miksaĵoj estas bonega laŭ apartiga efikeco kaj rezolucio. La plibonigita apartiga agado de PMP-kolonoj ŝuldiĝas al diversaj kialoj, kiel ekzemple la partikla grandeco kaj pora grandeco de la silikaj partikloj, kontrolita sintezo de la stacionara fazo, kaj kompleksa kolumna pakado. Aldone al alta apartiga efikeco, malalta kolumna malantaŭa premo ĉe altaj flukvantoj estas alia avantaĝo de ĉi tiu stacionara fazo. PMP-kolonoj montras bonan reprodukteblecon kaj povas esti uzataj por la analizo de peptidaj miksaĵoj kaj tripsina digesto de diversaj proteinoj. Ni intencas uzi ĉi tiun kolonon por la apartigo de naturaj produktoj, bioaktivaj kombinaĵoj de kuracherboj kaj fungaj ekstraktoj en likva kromatografio. Estonte, PMP-kolonoj ankaŭ estos taksitaj por la apartigo de proteinoj kaj monoklonaj antikorpoj.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Esploro pri Peptidaj Apartigaj Sistemoj per Inversa Faza Kromatografio Parto I: Disvolviĝo de Kolona Karakteriza Protokolo. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Plibonigitaj aktivaj peptidoj destinitaj por la traktado de infektaj malsanoj. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintezaj terapiaj peptidoj: scienco kaj la merkato. drug discovery. 15 (1-2) hodiaŭ, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Altnivela Proteomika Likva Kromatografio. J. Kromatografio. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Altnivela likva kromatografio-amasa spektrometrio ebligas la enkorpigon de larĝe celitaj metabolomikoj kaj proteomikoj. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ La rolo de UHPLC en medikamentevoluigo. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentaj kaj praktikaj aspektoj de ultraaltaprema likva kromatografio por rapidaj apartigoj. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Apliko de ultra-alta rendimenta likva kromatografio en medikament-disvolviĝo. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolitaj makroporaj hidroĝeloj preparitaj el oleo-en-akvo kun alta interna fazo de emulsioj por efika purigo de enterovirusoj. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA La rolo de likva kromatografio en proteomiko. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Aperantaj tendencoj en inversfazaj likvakromatografiaj apartigoj de terapiaj peptidoj kaj proteinoj: teorio kaj aplikoj. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dudimensia apartigo de peptidoj uzante RP-RP-HPLC-sistemon uzante malsamajn pH-valorojn en la unua kaj dua apartigaj dimensioj. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. La karakterizaĵoj de amastranslokigo kaj kineta agado de alt-efikecaj kromatografiaj kolumnoj plenigitaj per C18 sub-2 μm tute kaj supraĵe poraj partikloj estis esplorataj. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Lastatempaj tendencoj kaj analizaj defioj en la izolado, identigo kaj validigo de plantaj bioaktivaj peptidoj. anus. biologia anus. kemia. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. La proteomika pejzaĝo de la regno de vivo. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Malsuprenflua prilaborado de terapiaj peptidoj per prepara likva kromatografio. Molecule (Bazel, Svislando) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Miksitreĝima kromatografio kaj ĝia apliko al biopolimeroj. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligandoj por miksreĝima proteina kromatografio: principo, karakterizado kaj dizajno. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).