Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки аз браузери навшуда истифода баред (ё ҳолати мувофиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар ҳамин ҳол, барои таъмини идомаи дастгирӣ, мо сайтро бидуни услуб ва JavaScript намоиш медиҳем.
Зарраҳои кремнийи рахнок бо усули сол-гел бо баъзе тағиротҳо барои ба даст овардани зарраҳои макропороз омода карда шуданд. Ин зарраҳо бо роҳи полимеризатсияи иловагии интиқоли фрагментатсионӣ (RAFT) бо N-фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PMI) ва стирол барои тайёр кардани N-фенилмалеимиди полимеримерӣ (Н-фенилмалеимид) ҳосил карда шуданд. марҳила. Сутунҳои аз пӯлоди зангногир танг (100 × 1,8 мм id) бо бастабандии slurry печонида шуданд. Ҷудокунии сутуни PMP арзёбӣшудаи омехтаи пептид, ки аз панҷ пептид иборат аст (Гли-Тир, Гли-Лю-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-ал-Арг, Тир-Иле-Арг) иҷрои хроматографӣ) ва ҳозими трипсин аз альбумини хунобаи инсон (HAS). Дар шароити оптималии элюсия, ҳисобкунии табақҳои назариявии омехтаи пептидӣ то 280,000 плита/м² аст. Муқоисаи иҷрои ҷудокунии сутуни таҳияшуда бо сутуни тиҷории Ascentis Express RP-Amide, мушоҳида карда шуд, ки самаранокии сутуни ҷудокунии тиҷории сутуни сутун ва истилоҳҳои супермаркази ҷудокунии сутуни PMP буд. резолюция.
Дар солҳои охир, саноати биофармасевтӣ ба бозори васеъшавандаи ҷаҳонӣ бо афзоиши назарраси ҳиссаи бозор табдил ёфт. Бо афзоиши босуръати саноати биофармасевтӣ1,2,3, таҳлили пептидҳо ва сафедаҳо хеле зарур аст. Илова ба пептидҳои мақсаднок, ҳангоми синтези пептидҳо, якчанд ифлосиҳо ба вуҷуд меоянд, аз ин рӯ, хоҳиши ба даст овардани пептидҳои хроматографиро талаб мекунад. покӣ.Таҳлил ва тавсифи сафедаҳо дар моеъҳои бадан, бофтаҳо ва ҳуҷайраҳо аз сабаби шумораи зиёди намудҳои эҳтимолан ошкоршаванда дар як намуна як вазифаи ниҳоят душвор аст. Ҳарчанд масс-спектрометрия як воситаи муассир барои пайдарпайии пептидҳо ва сафедаҳо аст, агар чунин намунаҳо ба спектрометри масса дар як гузариш ворид карда шаванд, ҷудокунии он бо ёрии chrommitigaT LC метавонад идеалӣ бошад. ҷудокунӣ пеш аз таҳлили MS, ки шумораи таҳлилгаронро дар вақти муайян ба спектрометри масса ворид мекунад4,5,6. Илова бар ин, ҳангоми ҷудокунии фазаи моеъ, таҳлилҳоро метавон дар минтақаҳои танг равона кард ва ба ин васила ин таҳлилҳоро тамаркуз кард ва ҳассосияти муайянкунии MS-ро беҳтар гардонад. Хроматографияи моеъ (LC) дар тӯли солҳои охир ба таври назаррас пеш рафтааст ва техникаи маъмулӣ шудааст. таҳлил7,8,9,10.
Хроматографияи моеъи баръакс (RP-LC) барои тоза кардан ва ҷудо кардани омехтаҳои пептидӣ бо истифода аз кремнийи октадесил тағирёфта (ODS) ҳамчун марҳилаи статсионарӣ васеъ истифода мешавад11,12,13. Бо вуҷуди ин, фазаҳои статсионарии RP аз сабаби сохтори мураккаб ва амфиликӣ ҷудошавии қаноатбахши пептидҳо ва сафедаҳоро таъмин намекунанд14. Барои таҳлили пептидҳо ва сафедаҳо бо қисмҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ барои ҳамкорӣ кардан ва нигоҳ доштани ин таҳлилҳо фазаҳои статсионерии махсус тарҳрезишуда талаб карда мешаванд16. Хроматографияи омехта, ки таъсири мутақобилаи мултиподалӣ таъмин мекунад, метавонад алтернатива ба RP-LC барои ҷудо кардани пептидҳо, сафедаҳо ва дигар омехтаҳои мураккаб бошад. барои ҷудошавии пептидҳо ва сафедаҳо17,18,19,20,21 истифода шудааст. Фазаҳои статсионарии режими омехта (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation қутбӣ/RPLC) аз сабаби мавҷудияти ҳам гурӯҳҳои қутбӣ ва ҳам ғайриқутбӣ22,23,24,275,228, 22,23,24,275,228, 22,23,24,275,228, 22,23,24,275,228, 22,23,24,27,22,22,23,23,24,27,22,22,22,23,23,24 қутблар қутбсиз қутбли ва қутбсиз протеин ажратишлар учун протеинлар ва протеинларни ажратиш учун мувофиқ. фазаҳое, ки гурӯҳҳои қутбӣ бо ковалентӣ пайвастанд, қудрати хуби ҷудокунӣ ва интихоби беназирро барои таҳлилҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ нишон медиҳанд, зеро ҷудошавӣ аз таъсири мутақобилаи байни аналитӣ ва фазаи статсионарӣ вобаста аст. Муносибатҳои мултимодалӣ 29, 30, 31, 32. Ба наздикӣ, Чжан ва дигарон. 30 фазаи стационарии полиаминии додецил хотимаёфтаро омода кард ва карбогидридҳо, антидепрессантҳо, флавоноидҳо, нуклеозидҳо, эстрогенҳо ва якчанд дигар таҳлилҳоро бомуваффақият ҷудо кард. Интеркалатори қутбӣ ҳам гурӯҳҳои қутбӣ ва ҳам ғайриқутбӣ дорад, аз ин рӯ онро метавон барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳое истифода бурд, ки ҳам сутунҳои гидрофобӣ ва ҳам гидрофобӣ доранд. сутунҳои амидии C18) зери номи тиҷоратии Ascentis Express RP-Amide сутунҳо дастрасанд, аммо ин сутунҳо танҳо барои таҳлили амин 33 истифода мешаванд.
Дар тадқиқоти ҷорӣ, як марҳилаи статсионарии қутбӣ дарунсохташуда (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) барои ҷудо кардани пептидҳо ва трипсинҳои HSA таҳия ва арзёбӣ карда шуд. Марҳилаи статсионарӣ бо истифода аз стратегияи зерин омода карда шуд. Зарраҳои кремнийи рахна мувофиқи тартиби дар нашрияи қаблии мо бо таносуби протеиленҳои полиэтиленӣ овардашуда омода карда шуданд. гликол (PEG), TMOS, кислотаи сиркои об барои тайёр кардани зарраҳои кремний бо андозаи калонтар танзим карда шуд. Дуюм, як лиганд нав, фенилмалейид-метил винил изоцианат, синтез карда шуд ва барои ҳосил кардани зарраҳои кремний барои омода кардани як қутбӣ дарунсохтаи марҳилаи статсионарӣ истифода шуд. 1,8 мм id) бо истифода аз схемаи бастабандии оптимизатсияшуда. Ба бастабандии сутун бо ларзиши механикӣ ёрӣ мерасонад, то ки дар дохили сутун қабати якхела ташкил карда шавад. Ҷудокунии сутуни печонидашудаи омехтаҳои пептидҳои иборат аз панҷ пептидҳоро арзёбӣ кунед; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ва Trypsin digest аз альбумин хуноба инсон (HAS). Дар омехтаи пептид ва трипсин ҳазм аз HSA мушоҳида карда шуданд, ки бо ҳалли хуб ҷудо карда шуд ва самаранокии сутуни Экспресс, ки дар муқоиса бо самаранокии сутуни. Сутуни RP-Amide.Ҳам пептидҳо ва ҳам сафедаҳо дар сутуни PMP, ки аз сутуни Ascentis Express RP-Amide самараноктар буд, хуб ҳаллу фасл ва самаранок буданд.
PEG (полиэтиленгликол), мочевина, кислотаи уксусӣ, триметокси ортосиликат (TMOS), триметил хлоросилан (TMCS), трипсин, альбуми хунобаи инсон (HSA), хлориди аммоний, мочевина, гексан метилдисилазан (HMDS), метакрило, ст. 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Метанол, 2-Пропанол ва Ацетон аз Сигма-Олдрих (Сент-Луис, МО, ИМА) харида шудааст.
Омехтаи мочевина (8 г), полиэтиленгликол (8 г) ва 8 мл кислотаи 0,01 Н сирко барои 10 дақиқа омехта карда шуд ва сипас ба он 24 мл TMOS дар шароити яхбаста илова карда шуд. Омехтаи реаксия дар 40 ° C барои 6 соат гарм карда шуд ва сипас дар ҳарорати 128 ° C дар ҳарорати бе об нигоҳ дошта шуд. рехта шуд ва маводи боқимонда дар 70°C барои 12 соат хушк карда шуд. Массаи мулоими хушкшудаи хушкшуда дар танӯр ҳамвор карда шуд ва дар 550°C барои 12 соат калсина карда шуд. Се партия барои санҷиши такроршавандагӣ дар андозаи заррачаҳо, андозаи сӯрохҳо ва майдони рӯизаминӣ тавсиф карда шуданд.
Бо тағир додани сатҳи зарраҳои кремний бо лигандҳои қаблан синтезшудаи фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PCMP) ва пас аз полимеризатсияи радиалӣ бо стирол, пайвастагии қутбӣ дорои гурӯҳи қутбӣ омода карда шуд. Марҳилаи статсионарӣ барои агрегатҳо ва занҷирҳои полистирол. Раванди омодагӣ дар зер тавсиф карда мешавад.
N-фенилмалеймид (200 мг) ва изоцианати метилвинил (100 мг) дар толуол хушк гудохта шуда, ба колба реаксия 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) илова карда шуд, то омехтаи фенилмалеймид-метилвинилвинил CPPM гарм карда шавад. 60 ° C барои 3 соат, филтр карда ва дар танӯр дар 40 ° C барои 3 соат хушк карда мешавад.
Зарраҳои кремнийи хушк (2 г) дар толуолҳои хушк (100 мл) пароканда карда шуданд ва дар колбачаи мудаввари поёни 500 мл барои 10 дақиқа соникатсионӣ карда шуданд. PMCP (10 мг) дар толуол гудохта шуд ва ба колба реаксия ба воситаи воҳиди қатра илова карда шуд. Омехта дар давоми соат 108 филтр карда шуд. ацетон ва дар 60°C дар давоми 3 соат хушк карда шуд. Сипас, заррачаҳои кремнийи бо PMCP пайвастшуда (100 г) дар толуол (200 мл) гудохта шуданд ва 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) дар ҳузури 100 мкл дибутилтин дилаурат дар як соат ҳамчун катализатор 58°С филтр карда шуд. ва дар 50°С 3 соат хушк карда мешавад.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиди BPO (0,5 мл) ва заррачаҳои кремнийи ба TEMPO-PMCP пайвастшуда (1,5 г) дар толуол пароканда карда шуданд ва бо нитроген тоза карда шуданд. Полимеризатсияи стирол дар 100°C барои 12 соат гузаронида шуд. Маҳсулоти натиҷавӣ дар ҳарорати шабона шуста шуд60. схемаи умумии реаксия дар расми 1 нишон дода шудааст.
Намунаҳо дар 393 К дар давоми 1 соат дегаз карда шуданд, то фишори боқимонда камтар аз 10-3 Torr ба даст ояд. Миқдори N2, ки дар фишори нисбии P/P0 = 0,99 адсорб карда шудааст, барои муайян кардани ҳаҷми умумии сӯрохиҳо истифода шуд. Морфологияи зарраҳои силикии луч ва лиганд бо сканерҳои электротехникӣ тафтиш карда шуданд. Токио, Ҷопон). Намунаҳои хушкшуда (заррачаҳои кремнийи бараҳна ва ligand-bonded кремний) дар як сутуни алюминий бо истифода аз навори карбон илтиёмї ҷойгир карда шуданд. Тилло дар бораи намунаҳо бо истифода аз coater sputter Q150T plated шуд, ва қабати 5 nm Au дар samples.This супорида шуд. (Waltham, Ma, ИМА) flash.ablecation Transecentatcher Ҳадафи элемент. дар давоми 5 дақиқа гирдоб карда, дар курсии оптикии Mastersizer ҷойгир карда шуд. Таҳлили термогравиметрӣ бо суръати 5 °C дар як дақиқа дар доираи ҳарорати аз 30 то 800 °C анҷом дода шуд.
Сутунҳои танги аз пӯлоди зангногир бо шишагини андозааш (100 × 1,8 мм id) бо усули бастабандии slurry бо истифода аз ҳамон тартиби дар Ref. 31.Сутуни аз пӯлоди зангногир (бо шишагин, 100 × 1,8 мм id) бо васлаки дорои фрити 1 мкм ба як бастабандии slurry (Alltech Deerfield, IL, ИМА) пайваст карда шуд. Бо таваққуф кардани 150 мг аз нигоҳдории 150 мг фазаи статсионарӣ ва 1 мкм фаза фиристед. сутун. Метанол ҳамчун ҳалкунандаи slurry ва инчунин ҳалкунандаи ҳаракаткунанда истифода шуд. Сутунро пайдарпай бо фишори 100 МП барои 10 дақиқа, 80 МП барои 15 дақиқа ва 60 МП барои 30 дақиқа пур кунед. Ҳангоми бастабандӣ, ларзиши механикӣ бо ду шайкери сутуни GC, Defielding USA (All tech), бастабандии ягона истифода шуд. сутун. Пакери slurry-ро пӯшед ва фишорро оҳиста раҳо кунед, то аз ягон осеб дар дохили сутун пешгирӣ кунед. Сутунро аз воҳиди бастабандии slurry ҷудо кунед ва арматураи дигарро ба даромадгоҳ ва системаи LC пайваст кунед, то кори онро тафтиш кунед.
Насоси LC (10AD Shimadzu, Ҷопон), инжектор (Valco (ИМА) C14 W.05) бо ҳалқаи сӯзандоруи 50nL, дегазатори мембрана (Shimadzu DGU-14A), равзанаи капиллярии UV-VIS детектори махсуси дастгоҳи μLC (UV-2075) сохта шудааст ва қубурҳои шишагинро барои пайваст кардани микроскопҳо хеле кӯтоҳ мекунад. Пас аз бастабандӣ капиллярҳо (50 мкм id 365 ва капиллярҳои коҳишдиҳандаи иттифоқӣ (50 мкм) дар баромади 1/16" иттиҳодияи коҳишдиҳанда насб карда шуданд. Ҷамъоварии маълумот ва коркарди хроматографӣ бо истифода аз нармафзори Multichro 2000 анҷом дода шуд. Мониторинг барои абсорбиши Chromatographic U4 дар Anahromatographic. маълумот аз ҷониби OriginPro8 (Northampton, MA) таҳлил карда шуданд.
Альбумин аз хунобаи инсон, хокаи лиофилизатсияшуда, ≥ 96% (электрофорези агароз гели) 3 мг омехта бо трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) ва 0,2 М аммоний бикарбонати (1 мл). Маҳлул барои 10 дақиқа омехта карда шуд ва баъд дар ванна об дар ҳарорати 36 соат нигоҳ дошта шуд. мл 0,1% TFA. Маҳлулро филтр кунед ва дар ҳарорати зери 4 °C нигоҳ доред.
Ҷудокунии омехтаҳои пептидӣ ва ҳазми трипсинҳои HSA дар сутунҳои PMP алоҳида арзёбӣ карда шуданд. Ҷудокунии омехтаи пептидҳо ва дайджести трипсинҳои HSA-ро аз ҷониби сутуни PMP тафтиш кунед ва натиҷаҳоро бо сутуни Ascentis Express RP-Amide муқоиса кунед. Рақами таблиғи назариявӣ ба таври зерин ҳисоб карда мешавад:
Тасвирҳои SEM аз зарраҳои кремнийи бараҳна ва зарраҳои кремнийи бо лиганд пайвастшуда дар расми нишон дода шудаанд. 2 .Тасвирҳои SEM заррачаҳои кремнийи урён (A, B) нишон медиҳанд, ки дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо, ин зарраҳо курашакл мебошанд, ки дар онҳо зарраҳо дароз карда шудаанд ё симметрияи номунтазам доранд. Сатҳи зарраҳои кремнийи лиганд (C, D) ҳамвортар аст, нисбат ба заррачаҳои силикии бараҳна, ки дар натиҷаи coine аз полиинҳо иборатанд. сатҳи зарраҳои кремний.
Тасвирҳои сканкунии микроскопи электронии зарраҳои кремнийи бараҳна (A, B) ва зарраҳои кремнийи бо лиганд пайвастшуда (C, D).
Дар тақсимоти андозаи зарраҳои заррачаҳои кремний луч ва заррачаҳои кремний-ligand-bonded дар расми 3 (A) нишон дода шудааст. Каҷҳои тақсимоти андозаи зарраҳо дар асоси ҳаҷми зарраҳо нишон доданд, ки андозаи зарраҳои кремний пас аз тағйири кимиёвӣ зиёд (расми. 3A) .Дар маълумот тақсимоти андозаи зарраҳои заррачаҳои кремний аз тадқиқоти ҷорӣ ва ҳаҷми пештара дар муқоисаи ҳаҷми заррачаҳои кремний-1 мебошанд. d(0,5), аз PMP 3,36 мкм аст, дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо бо арзиши ad(0,5) 3,05 мкм (заррачаҳои кремнийи бо полистирол алоқаманд) 34. Ин партия дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо аз ҳисоби таносуби мухталифи PEG, мочевина, кислотаи TMOS, ва андозаи омехтаи зарраҳои кислотаи PMP каме тақсимоти андозаи зарраҳо дошт. калонтар аз марҳилаи заррачаҳои силикати полистирол, ки мо қаблан омӯхта будем. Ин маънои онро дорад, ки функсионализатсияи сатҳи заррачаҳои кремний бо стирол танҳо як қабати полистиролро (0,97 микрон) дар сатҳи кремний гузоштааст, дар ҳоле ки дар марҳилаи PMP ғафсии қабат 1,38 микрон буд.
Тақсимоти андозаи зарраҳо (A) ва тақсимоти андозаи сӯрохҳо (B) зарраҳои кремнийи бараҳна ва зарраҳои кремнийи бо лиганд алоқаманд.
Андозаи сӯрохҳо, ҳаҷми сӯрохҳо ва майдони сатҳи зарраҳои кремнийи таҳқиқоти ҷорӣ дар ҷадвали 1(B) оварда шудаанд. Профилҳои PSD зарраҳои кремнийи бараҳна ва зарраҳои кремнийи лиганд дар расми 3(B) нишон дода шудаанд. Натиҷаҳо бо таҳқиқоти қаблии мо муқоиса карда мешаванд. мутаносибан, ки ин нишон медиҳад, ки андозаи сӯрохҳо пас аз тағир додани кимиёвӣ, тавре ки дар ҷадвали 1(B) нишон дода шудааст, 69 кам мешавад ва тағирёбии хат дар расми 3(B) нишон дода шудааст. Ба ҳамин монанд, ҳаҷми сӯрохи зарраҳои кремний пас аз тағирёбии кимиёвӣ аз 0,67 то 0,58 см3/г кам шуд. м2/г аст, ки бо таҳқиқоти қаблии мо (124 м2/г) муқоиса карда мешавад. Тавре ки дар ҷадвали 1(Б) нишон дода шудааст, пас аз тағир додани кимиёвӣ масоҳати сатҳи (м2/г) зарраҳои кремний низ аз 116 м2/г ба 105 м2/г коҳиш ёфт.
Натиљаи тањлили элементарии фазаи статсионарї дар љадвали 2 нишон дода шудааст. Сарбории карбон дар фазаи стационарии љараён 6,35% -ро ташкил медињад, ки нисбат ба боркунии карбонии тањќиќоти пештараи мо камтар аст (заррањои силикати полистирол, мутаносибан 7,93% 35 ва 10,21%) SP, ба ғайр аз стирол, баъзе лигандҳои қутбӣ ба монанди фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PCMP) ва 4-гидрокси-TEMPO истифода шуданд. Вазни нитроген дар марҳилаи ҳозираи статсионарӣ 2,21% аст, дар муқоиса бо вазни 0,1735 ва 0,85% дар муқоиса бо вазни қаблии Т. нитроген дар марҳилаи ҳозираи статсионарӣ аз ҳисоби фенилмалеймид баландтар аст. Ба ҳамин монанд, боркунии карбон аз маҳсулот (4) ва (5) мутаносибан 2,7% ва (5) 2,7% ва 2,9% буд, дар ҳоле ки боркунии карбон аз маҳсулоти ниҳоӣ (6) 6,35% буд, тавре ки дар ҷадвали 2 нишон дода шудааст. хатти каҷ талафоти вазн 8,6% -ро нишон медиҳад, ки ин бо боркунии карбон мувофиқат мекунад (6,35%), зеро лигандҳо на танҳо C, балки N, O ва H низ доранд.
Лиганди фенилмалеймид-метилвинилизосианат барои тағир додани сатҳи зарраҳои кремний интихоб карда шуд, зеро он дорои гурӯҳҳои фенилмалеймиди қутбӣ ва гурӯҳҳои винилизоцианат мебошад. Гурӯҳҳои изоцианати винилӣ минбаъд бо стирол тавассути полимеризатсияи радикалии зинда реаксия мекунанд. Сабаби дуюм ин дохил кардани гурӯҳе мебошад, ки бо таъсири байниҳамдигарии мӯътадили электромагнитӣ мавҷуд аст. таҳлилшаванда ва марҳилаи статсионарӣ, азбаски қисми фенилмалеймид дар рН муқаррарӣ заряди виртуалӣ надорад. Қутбнокии марҳилаи статсионариро метавон бо миқдори оптималии стирол ва вақти реаксияи полимеризатсияи радикалҳои озод назорат кард. Марҳилаи охирини реаксия (полимеризатсияи радикалии озод) муҳим аст ва метавонад қутбияти ин статсионариро тағир диҳад. Мушоҳида карда шуд, ки афзоиши миқдори стирол ва вақти реаксия боркунии карбонии фазаи статсариро зиёд мекунад ва баръакс. SP-ҳои бо консентратсияи гуногуни стирол омодашуда борҳои гуногуни карбон доранд. Боз ин фазаҳои статсионариро ба сутунҳои аз пӯлоди зангногир бор кунед ва иҷрои хроматографии онҳоро тафтиш кунед (интихобӣ, ҳалкунанда, арзиши N ва ғ.). қутбияти назоратшаванда ва нигоҳдории хуби таҳлилӣ.
Панҷ омехтаи пептидӣ (Гли-Тир, Гли-Лю-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин энкефалин) инчунин бо истифода аз сутуни PMP бо истифода аз марҳилаи мобилӣ арзёбӣ карда шуданд; 60/40 (в/в) ацетонитрил/об (0,1% TFA) бо суръати ҷараёни 80 мкЛ/дақ. Дар шароити оптималии элюсия рақами таблиғи назариявӣ (N) дар як сутун (100 × 1,8 мм id) 20,000 ± 100 (200,000 ± 100) (200,000 қиматҳои P/m²T барои се плиткаи МП) медиҳад. сутунҳо ва хроматограммаҳо дар расми 5А нишон дода шудаанд. Таҳлили зуд дар сутуни PMP бо суръати баланд (700 мкЛ/дақ), панҷ пептид дар давоми як дақиқа элюта карда шуданд, N арзишҳои хеле хуб буданд, 13,500 ± 330 дар як сутун (100 × 1,8 мм id), мувофиқат ба 0 0 м35, фит / 01 г. 5B).Се сутуни андозаи якхела (100 × 1,8 мм id) бо се лотҳои гуногуни марҳилаи статсионарии PMP барои санҷиши такрорӣ печонида шуданд. Консентратсияи таҳлилшаванда барои ҳар як сутун бо истифода аз шароити оптималии элюсия ва шумораи плитаҳои назариявии N ва вақти нигоҳдорӣ барои ҷудо кардани ҳамон омехтаи санҷишӣ дар ҳар як сутун сабт карда шуд. такроршавандагии сутуни PMP бо арзишҳои хеле пасти %RSD, тавре ки дар ҷадвали 3 нишон дода шудааст, хуб алоқаманд аст.
Ҷудокунии омехтаи пептидӣ дар сутуни PMP (B) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (A); марҳилаи мобилӣ 60/40 ACN / H2O (TFA 0,1%), андозаҳои сутуни PMP (100 × 1,8 мм id); Таҳлилӣ Тартиби элюсияи пайвастагиҳо: 1 (Гли-Тир), 2 (Гли-Лю-Тир), 3 (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) ва 5 (лейцин) кислотаи энкефалин)).
Сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) барои ҷудо кардани ҳазмҳои триптии альбумин хунобаи инсон дар хроматографияи моеъи баланд арзёбӣ карда шуд. Хроматограмма дар расми 6 нишон медиҳад, ки намуна хуб ҷудо карда шудааст ва ҳалли хеле хуб аст. Диҷестҳои HSA бо истифода аз суръати ҷараёни 100 μL/000-и фазаи мобилӣ таҳлил карда шуданд. 0,1% TFA. Тавре ки дар хроматограмма нишон дода шудааст (расми 6), ҳозимаи HSA ба 17 қуллаи мувофиқ ба 17 пептидҳо тақсим карда шудааст. Самаранокии ҷудошавии ҳар як қулла дар дайджести HSA ҳисоб карда шуда, арзишҳо дар ҷадвали 5 оварда шудаанд.
Ҳаҷми триптии HSA (100 × 1,8 мм id) дар сутуни PMP ҷудо карда шуд; суръати ҷараён (100 мкЛ/дақ), марҳилаи мобилӣ 60/40 ацетонитрил/об бо 0,1% TFA.
ки дар он L дарозии сутун, η часпакии марҳилаи мобилӣ, ΔP фишори бозгашти сутун ва u суръати хаттии марҳилаи мобилӣ мебошад. Гузаришпазирии сутуни PMP 2,5 × 10-14 м2, суръати ҷараён 25 мкЛ/дақ ва 60/40 в/в/қобилияти об барои ҳар як сутуни P10M истифода шудааст. 1,8 мм id) ба тадқиқоти қаблии Ref.34 монанд буд. Гузариши сутуни печонидани бо зарраҳои сатҳи рӯизаминӣ ин аст: 1,7 × 10-15 барои зарраҳои 1,3 мкм, 3,1 × 10-15 барои зарраҳои 1,7 мкм, 5,2 × 10-15 барои зарраҳои 1,7 μm, 5,2 × 10-12,- Зарраҳои 2,6 мкм Барои зарраҳои 5 мкм 43. Аз ин рӯ, гузариши марҳилаи PMP ба зарраҳои 5 мкм-и ядроӣ монанд аст.
ки Wx вазни сутуни пур аз хлороформ аст, Wy вазни сутуни пурборшуда бо метанол ва ρ зичии ҳалкунанда мебошад. Зичии метанол (ρ = 0,7866) ва хлороформ (ρ = 1,484). Порозияи умумии сутунҳои SILICA-1018 mm. id) Сутунҳои 34 ва C18-Urea 31, ки мо қаблан омӯхта будем, мутаносибан 0,63 ва 0,55 буд. Ин маънои онро дорад, ки мавҷудияти лигандҳои мочевина гузариши марҳилаи статсионериро коҳиш медиҳад. Аз тарафи дигар, porozity умумии сутуни PMP (100 × 1,8 мм) нисбат ба сутуни PMP камтар аст. аз сутунҳои печонидани бо зарраҳои силикии C18 басташуда, зеро дар фазаҳои стационарии навъи C18 лигандҳои C18 ба зарраҳои кремний ҳамчун занҷирҳои хаттӣ пайваст мешаванд, дар ҳоле ки дар фазаҳои стационарии типи полистирол дар атрофи он қабати нисбатан ғафси полимерӣ ба вуҷуд меояд. Дар як таҷрибаи маъмулӣ, сӯрохии сутун ҳамчун ҳисоб карда мешавад:
Дар расми 7А, В сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм id) бо истифода аз шароити якхела (яъне, 60/40 ACN/H2O ва 0,1% TFA) нишон дода шудаанд. ) участкаи Ван Димтер. Омехтаҳои пептидҳои интихобшуда (Гли-Тир, Гли-Лю-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Лейцин Энкефалин) дар 20 мкл омода карда шуданд/ Меъёри ҳадди ақали ҷараёни ҳарду сутун 800 мкЛ/дақ аст. сутун ва сутуни Ascentis Express RP-Amide мутаносибан 2,6 мкм ва 3,9 мкм буданд. Қиматҳои HETP нишон медиҳанд, ки самаранокии ҷудокунии сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) нисбат ба сутуни Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм) хеле беҳтар аст. камшавии арзиши N бо афзоиши ҷараён дар муқоиса бо тадқиқоти қаблии мо назаррас нест. Самаранокии баландтари ҷудокунии сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) дар муқоиса бо сутуни Ascentis Express RP-Amide ба такмил додани шакли зарраҳо, андоза ва расмиёти мураккаби бастабандии сутунҳо, ки дар кори ҷорӣ истифода мешаванд34 асос ёфтааст.
(A) нақшаи ван Димтер (HETP ба муқобили суръати хатии фазаи мобилӣ) бо истифода аз сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) дар 60/40 ACN/H2O бо 0,1% TFA.(B) ван Димтер (HETP дар муқоиса бо суръати хатти фазаи мобилӣ) бо истифода аз сутуни RP-1010-и Ascent. id) дар 60/40 ACN/H2O бо 0,1% TFA.
Фазаи статсионарии полистироли қутбӣ барои ҷудо кардани омехтаҳои пептидҳои синтетикӣ ва ҳазми трипсин аз альбумин хунобаи инсон (HAS) дар хроматографияи моеъи баланд омода ва арзёбӣ карда шуд. Иҷрои хроматографии сутунҳои PMP барои омехтаҳои пептидӣ дар самаранокии ҷудокунӣ ва ҳалли аъло аст. андозаи зарраҳои кремний, синтези назоратшавандаи марҳилаи статсионарӣ ва бастабандии мураккаби сутунҳо. Илова ба самаранокии баланди ҷудокунӣ, фишори пасти бозгашти сутун бо суръати баланди ҷараёни баланд бартарии дигари ин марҳилаи статсионарӣ мебошад. Сутунҳои PMP такроршавандагии хуб нишон медиҳанд ва метавонанд барои таҳлили омехтаҳои пептидҳо ва ҳазми трипсин аз сафедаҳои гуногун истифода шаванд. растаниҳои шифобахш ва иқтибосҳои занбӯруғ дар хроматографияи моеъ.Дар оянда сутунҳои PMP инчунин барои ҷудо кардани сафедаҳо ва антителоҳои моноклоналӣ арзёбӣ карда мешаванд.
Филд, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тадқиқот оид ба системаҳои ҷудокунии пептидҳо тавассути хроматографияи баръакси марҳилаи I Қисми I: Таҳияи Протоколи тавсифи сутунҳо. Хроматография.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б.
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: илм ва бозор. Кашфи маводи мухаддир.15 (1-2) имрӯз, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009. (1020.).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Хроматография.A 1261, 78–90 (2012).
Лю, В. ва дигарон. Хроматография-масс-спектрометрияи моеъи пешрафта имкон медиҳад, ки метаболомика ва протеомикаҳои ба таври васеъ мақсаднок ворид карда шаванд.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Нақши UHPLC дар рушди маводи мухаддир.J. Сентябри Sci.30 (8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Ҷанбаҳои бунёдӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори ултрабаланд барои separations.J. Сентябри Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Татбиқи хроматографияи моеъи ултра-баланд дар рушди маводи мухаддир.J. Хроматография.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hydrogels macroporous monolithic омода аз нафт-дар-об эмульсияҳои марҳилаи дохилӣ баланд барои тоза самаранок enteroviruses.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Нақши хроматографияи моеъ дар proteomics.J. Хроматография.A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Тамоюлҳои пайдошаванда дар ҷудошавии хроматографияи моеъи баръакси пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ: назария ва татбиқ.J. Фарматсия.Биомедикӣ.анус.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, АЕ & Геблер, ҶК Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо истифода аз арзишҳои гуногуни рН дар андозаҳои ҷудокунии якум ва дуюм. Сентябри Sci.28 (14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. ва дигарон. Хусусиятҳои интиқоли масса ва иҷрои кинетикии сутунҳои хроматографии пуриқтидор, ки бо зарраҳои C18 зери 2 мкм пурра ва сатҳи рӯякӣ баста шудаанд, таҳқиқ карда шуданд. Сентябри Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Тамоюлҳои охирин ва мушкилоти таҳлилӣ дар ҷудокунӣ, муайянкунӣ ва тасдиқи пептидҳои биоактивии растанӣ.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s002168-02 (s002168-02).
Мюллер, ҶБ ва дигарон. Манзараи протеомикии салтанати ҳаёт. Табиат 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Коркарди поёнии пептидҳои терапевтӣ тавассути хроматографияи моеъи тайёрӣ. Молекула (Базел, Швейтсария) 26(15), 4688(2021).
Янг, Ю. & Генг, X. Хроматографияи омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо.Ҷ. Хроматография.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.-Y. & Sun, Y. Лигандҳо барои хроматографияи омехтаи сафеда: принсип, тавсиф ва тарҳрезӣ. Биотехнология.144(1), 3-11 (2009).