Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо аз браузери навшуда истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Зарраҳои кремнийи сӯрохдор бо усули сол-гел бо баъзе тағйиротҳо барои ба даст овардани зарраҳои макросӯрохдор омода карда шуданд. Ин зарраҳо бо роҳи полимеризатсияи интиқоли занҷири фрагментатсияи иловагии баръакс (RAFT) бо N-фенилмалеимид-метилвинилисоцианат (PMI) ва стирол барои тайёр кардани интеркалятсияи N-фенилмалеимид аз фазаи статсионарии полистирол (PMP) ҳосил карда шуданд. Сутунҳои пӯлоди зангногири борик (100 × 1.8 мм id) бо бастабандии суспензия бастабандӣ карда шуданд. Ҷудокунии сутуни PMP-и омехтаи пептидӣ, ки аз панҷ пептид (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) иборат аст, арзёбӣ карда шуд) ва ҳазми трипсин аз албумини зардоби инсон (HAS). Дар шароити беҳтарини элюсия, шумораи назариявии плитаҳои омехтаи пептидӣ то 280,000 плита/м² зиёд аст. Муқоисаи самаранокии ҷудокунии таҳияшуда Ҳангоми истифодаи сутун бо сутуни тиҷоратии Ascentis Express RP-Amide, мушоҳида шуд, ки самаранокии ҷудокунии сутуни PMP аз ҷиҳати самаранокӣ ва ҳалли ҷудокунӣ нисбат ба сутуни тиҷоратӣ бартарӣ дорад.
Дар солҳои охир, саноати биофармасевтӣ бо афзоиши назарраси саҳми бозор ба бозори ҷаҳонии густаришёбанда табдил ёфтааст. Бо афзоиши босуръати саноати биофармасевтӣ1,2,3, таҳлили пептидҳо ва сафедаҳо хеле дилхоҳ аст. Илова бар пептиди мақсаднок, ҳангоми синтези пептидҳо якчанд ифлосӣ ба вуҷуд меоянд, ки аз ин рӯ, барои ба даст овардани пептидҳои покизагии дилхоҳ тозакунии хроматографиро талаб мекунад. Таҳлил ва тавсифи сафедаҳо дар моеъҳои бадан, бофтаҳо ва ҳуҷайраҳо як вазифаи хеле душвор аст, зеро шумораи зиёди намудҳои эҳтимолан ошкоршаванда дар як намуна мавҷуданд. Гарчанде ки спектрометрияи массавӣ воситаи муассир барои пайдарпайии пептидҳо ва сафедаҳо мебошад, агар чунин намунаҳо дар як гузариш ба спектрометри массавӣ ворид карда шаванд, ҷудокунӣ беҳтарин нахоҳад буд. Ин мушкилотро метавон бо роҳи татбиқи ҷудокунии хроматографияи моеъ (LC) пеш аз таҳлили MS коҳиш дод, ки шумораи аналитҳои воридшаванда ба спектрометри массавӣ дар вақти муайян4,5,6. Илова бар ин, ҳангоми ҷудокунии фазаи моеъ, аналитҳоро метавон дар минтақаҳои танг тамаркуз кард, ки бо ин васила ин аналитҳоро мутамарказ кард ва ҳассосияти ошкоркунии MS-ро беҳтар кард. Моеъ Хроматография (ХХ) дар даҳсолаи охир ба таври назаррас пешрафт кардааст ва ба як усули маъмул дар таҳлили протеомӣ табдил ёфтааст7,8,9,10.
Хроматографияи моеъи фазаи баръакс (RP-LC) барои тозакунӣ ва ҷудо кардани омехтаҳои пептидӣ бо истифода аз кремнийи бо октадесил тағйирёфта (ODS) ҳамчун фазаи статсионарӣ васеъ истифода мешавад11,12,13. Аммо, фазаҳои статсионии RP аз сабаби сохтори мураккаб ва хусусияти амфифилии худ ҷудокунии қаноатбахши пептидҳо ва сафедаҳоро таъмин намекунанд14,15. Аз ин рӯ, барои таҳлили пептидҳо ва сафедаҳо бо қисмҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ барои ҳамкорӣ бо ин аналитҳо ва нигоҳ доштани онҳо фазаҳои статсионии махсус тарҳрезишуда лозиманд16. Хроматографияи режими омехта, ки таъсири мутақобилаи мултимодалиро таъмин мекунад, метавонад алтернатива ба RP-LC барои ҷудо кардани пептидҳо, сафедаҳо ва дигар омехтаҳои мураккаб бошад. Якчанд фазаҳои статсионии режими омехта омода карда шудаанд ва сутунҳое, ки бо ин фазаҳо пур карда шудаанд, барои ҷудокунии пептидҳо ва сафедаҳо истифода шудаанд17,18,19,20,21. Фазаҳои статсионии режими омехта (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, интеркалятсияи қутбӣ/RPLC) барои пептидҳо ва сафедаҳо мувофиқанд. ҷудошавӣ аз сабаби мавҷудияти гурӯҳҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ22,23,24,25,26,27,28. Ба ҳамин монанд, фазаҳои статсионарии байниқутбӣ бо гурӯҳҳои қутбии ковалентӣ қувваи хуби ҷудошавӣ ва интихоби беназирро барои аналитҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ нишон медиҳанд, зеро ҷудошавӣ аз таъсири мутақобилаи байни аналит ва фазаи статсионарӣ вобаста аст. Таъсири мутақобилаи бисёрмодалӣ 29, 30, 31, 32. Ба наздикӣ, Чжан ва дигарон. 30 фазаи статсионарии полиамин бо додесил-терминатсияро омода кард ва гидрокарбонҳо, антидепрессантҳо, флавоноидҳо, нуклеозидҳо, эстрогенҳо ва якчанд аналитҳои дигарро бомуваффақият ҷудо кард. Интеркалатори қутбӣ ҳам гурӯҳҳои қутбӣ ва ҳам ғайриқутбӣ дорад, аз ин рӯ онро барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳое, ки ҳам қисмҳои гидрофобӣ ва ҳам гидрофилӣ доранд, истифода бурдан мумкин аст. Сутунҳои дарунсохти қутбӣ (масалан, сутунҳои дарунсохти C18 бо амид) бо номи тиҷоратии сутунҳои Ascentis Express RP-Amide дастрасанд, аммо ин сутунҳо танҳо барои таҳлили амин 33 истифода мешаванд.
Дар таҳқиқоти ҷорӣ, фазаи статсионарии қутбӣ (полистиролизии N-фенилмалеимидӣ) барои ҷудо кардани пептидҳо ва ҳазмҳои трипсинии HSA омода ва арзёбӣ карда шуд. Марҳилаи статсионарии бо истифода аз стратегияи зерин омода карда шуд. Зарраҳои кремнийи сӯрохдор мувофиқи тартиби дар нашри қаблии мо овардашуда бо баъзе тағйирот дар протоколи тайёрӣ омода карда шуданд. Таносуби карбамид, полиэтиленгликол (PEG), TMOS, кислотаи сиркои об барои тайёр кардани зарраҳои кремний бо андозаи сӯрохиҳои калон танзим карда шуд. Дуюм, лиганд нав, фенилмалеимид-метилвинил изоцианат, синтез карда шуд ва барои ҳосил кардани зарраҳои кремний барои тайёр кардани фазаи статсионарии қутбӣ истифода шуд. Марҳилаи статсионарии ҳосилшуда бо истифода аз схемаи оптимизатсияшудаи бастабандӣ ба сутуни пӯлоди зангногир (100 × 1.8 мм id) бастабандӣ карда шуд. Бастабандии сутун бо ларзиши механикӣ кӯмак карда мешавад, то дар дохили сутун кати якхела ташаккул ёбад. Ҷудокунии бастабандишудаи омехтаҳои пептидӣ, ки аз панҷ пептид иборатанд, арзёбӣ кунед; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ва ҳазми трипсин аз албумини зардоби инсон (HAS). Омехтаи пептид ва ҳазми трипсин аз HSA бо қарори хуб ва самаранокӣ ҷудо карда шуданд. Иҷрои ҷудокунии сутуни PMP бо кори сутуни Ascentis Express RP-Amide муқоиса карда шуд. Мушоҳида шуд, ки ҳам пептидҳо ва ҳам сафедаҳо дар сутуни PMP хуб ҳал ва самаранок буданд, ки нисбат ба сутуни Ascentis Express RP-Amide самараноктар буд.
PEG (полиэтиленгликол), мочевина, кислотаи сирко, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, албумини зардоби инсон (HSA), хлориди аммоний, мочевина, гексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоилхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоил пероксид (BPO), ацетонитрили дараҷаи HPLC (ACN), метанол, 2-пропанол ва ацетон, ки аз Sigma-Aldrich (Сент-Луис, MO, ИМА) харидорӣ шудааст.
Омехтаи карбамид (8 г), полиэтиленгликол (8 г) ва 8 мл кислотаи сиркои 0,01 Н ба муддати 10 дақиқа омехта карда шуд ва сипас 24 мл TMOS дар шароити яхбаста ба он илова карда шуд. Омехтаи реаксия дар 40°C барои 6 соат ва сипас дар 120°C барои 8 соат дар автоклави пӯлоди зангногир гарм карда шуд. Об рехта шуд ва маводи боқимонда дар 70°C барои 12 соат хушк карда шуд. Массаи нарми хушкшуда дар танӯр ҳамвор карда шуда, дар 550°C барои 12 соат калсий карда шуд. Се партия барои санҷидани такроршавандагӣ аз рӯи андозаи зарраҳо, андозаи сӯрохиҳо ва масоҳати сатҳ омода ва тавсиф карда шуданд.
Бо роҳи тағйир додани сатҳи зарраҳои кремний бо лигандҳои пешакӣ синтезшуда фенилмалеимид-метилвинилисоцианат (PCMP) ва баъдан полимеризатсияи радиалӣ бо стирол, пайвастагии дорои гурӯҳи қутбӣ омода карда шуд. Марҳилаи статсионарӣ барои агрегатҳо ва занҷирҳои полистирол. Раванди тайёркунӣ дар зер тавсиф шудааст.
N-фенилмалеимид (200 мг) ва изоцианати метилвинил (100 мг) дар толуоли хушк ҳал карда шуданд ва 0,1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) барои тайёр кардани сополимери фенилмалеимид-метилвинил изоцианат (PMCP) ба колбаи реаксия илова карда шуд.. Омехта дар ҳарорати 60°C ба муддати 3 соат гарм карда шуд, филтр карда шуд ва дар танӯр дар ҳарорати 40°C ба муддати 3 соат хушк карда шуд.
Зарраҳои хушки кремний (2 г) дар толуоли хушк (100 мл) пароканда карда, дар колбаи поёнии мудаввари 500 мл барои 10 дақиқа омехта ва бо ултрасадо коркард карда шуданд. PMCP (10 мг) дар толуол ҳал карда шуд ва тавассути қифи қатрагӣ ба колбаи реаксия қатра илова карда шуд. Омехта дар ҳарорати 100°C барои 8 соат рефлюкс карда шуд, филтр карда шуд ва бо ацетон шуста шуд ва дар ҳарорати 60°C барои 3 соат хушк карда шуд. Сипас, зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо PMCP (100 г) дар толуол (200 мл) ҳал карда шуданд ва 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) дар ҳузури 100 мкл дибутилтин дилаурат ҳамчун катализатор илова карда шуданд. Омехта дар ҳарорати 50°C барои 8 соат омехта карда шуд, филтр карда шуд ва дар ҳарорати 50°C барои 3 соат хушк карда шуд.
Стирол (1 мл), пероксиди бензоил BPO (0,5 мл) ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо TEMPO-PMCP (1,5 г) дар толуол пароканда ва бо нитроген тоза карда шуданд. Полимеризатсияи стирол дар ҳарорати 100°C ба муддати 12 соат анҷом дода шуд. Маҳсулоти ҳосилшуда бо метанол шуста ва дар ҳарорати 60°C шабона хушк карда шуд. Схемаи умумии реаксия дар расми 1 нишон дода шудааст.
Намунаҳо дар ҳарорати 393 К ба муддати 1 соат дегазатсия карда шуданд, то фишори боқимондаи камтар аз 10-3 Торр ба даст оварда шавад. Миқдори N2, ки дар фишори нисбии P/P0 = 0.99 адсорбсия шудааст, барои муайян кардани ҳаҷми умумии сӯрохиҳо истифода шуд. Морфологияи зарраҳои кремнийи луч ва бо лиганд пайвастшуда бо микроскопияи электронии сканкунӣ (Hitachi High Technologies, Токио, Ҷопон) таҳқиқ карда шуд. Намунаҳои хушкшуда (зарраҳои кремнийи луч ва бо лиганд пайвастшуда) дар сутуни алюминий бо истифода аз лентаи карбонии часпак ҷойгир карда шуданд. Бо истифода аз рӯйпӯши пошидани Q150T ба намунаҳо тилло пӯшонида шуд ва қабати 5 нм Au ба намунаҳо гузошта шуд. Ин самаранокии равандро бо истифода аз шиддатҳои паст беҳтар мекунад ва пошидани хунуки донаҳои майдаро таъмин мекунад. Барои таҳлили элементҳо таҳлилгари элементҳои Thermo Electron (Waltham, MA, ИМА) Flash EA1112 истифода шуд. Барои ба даст овардани андозаи зарраҳо таҳлилгари андозаи зарраҳои Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 истифода шуд. тақсимот. Зарраҳои луч ва зарраҳои лигандии пайвастшудаи кремний (ҳар кадом 5 мг) дар 5 мл изопропанол пароканда карда шуданд, барои 10 дақиқа бо ултрасадо коркард карда шуданд, барои 5 дақиқа вортекс карда шуданд ва дар мизи оптикии Mastersizer ҷойгир карда шуданд. Таҳлили термогравиметрӣ бо суръати 5°C дар як дақиқа дар диапазони ҳарорати аз 30 то 800°C анҷом дода шуд.
Сутунҳои бо шиша пӯшонидашудаи пӯлоди зангногир бо андозаҳо (100 × 1.8 мм id) бо истифода аз усули бастабандии шлам ва бо ҳамон тартиби истифодашуда дар истинод бастабандӣ карда шуданд. 31. Сутуни пӯлоди зангногир (бо шиша пӯшонидашуда, андозаи 100 × 1.8 мм) бо фитинги баромади дорои фрити 1 мкм ба бастабандии шлам (Alltech Deerfield, IL, ИМА) пайваст карда шуд. Шлами фазаи статсионариро бо роҳи овезон кардани 150 мг фазаи статсионари дар 1.2 мл метанол ва фиристодани он ба сутуни нигоҳдорӣ омода кунед. Метанол ҳамчун ҳалкунандаи шлам ва инчунин ҳалкунандаи сӯзишворӣ истифода мешуд. Сутунро пайдарпай бо фишори 100 MP барои 10 дақиқа, 80 MP барои 15 дақиқа ва 60 MP барои 30 дақиқа пур кунед. Ҳангоми бастабандӣ, ларзиши механикӣ бо ду такондиҳандаи сутуни GC (Alltech, Deerfield, IL, ИМА) барои таъмини бастабандии якхелаи сутун истифода шуд. Бастабандии шламро пӯшед ва фишорро оҳиста раҳо кунед, то аз ҳама гуна осеб дар дохили сутун пешгирӣ кунед. Сутунро аз воҳиди бастабандии шлам ҷудо кунед ва фитинги дигарро ба вуруд ва системаи LC пайваст кунед. барои санҷидани самаранокии он.
Насоси LC (10AD Shimadzu, Ҷопон), инжектор (Valco (USA) C14 W.05) бо ҳалқаи тазриқи 50nL, дегазери мембрана (Shimadzu DGU-14A), тирезаи капиллярҳои UV-VIS сохта шуданд. Детектори махсуси дастгоҳи µLC (UV-2075) ва микросутунҳои бо шиша пӯшонидашуда. Барои кам кардани таъсири васеъшавии иловагии банди сутун аз найчаҳои пайвасткунандаи хеле танг ва кӯтоҳ истифода баред. Пас аз бастабандӣ, дар баромадгоҳи 1/16 дюймаи иттиҳоди редуктор капиллярҳо (50 мкм id 365 ва капиллярҳои иттиҳоди редуктор (50 мкм) насб карда шуданд. Ҷамъоварии маълумот ва коркарди хроматографӣ бо истифода аз нармафзори Multichro 2000 анҷом дода шуд. Мониторинг дар 254 нм. Аналитҳо барои ҷабби ултрабунафш санҷида шуданд. Маълумоти хроматографӣ аз ҷониби OriginPro8 (Нортгемптон, MA) таҳлил карда шуданд.
Албумин аз зардоби инсон, хокаи лиофилизатсияшуда, ≥ 96% (электрофорези гел агароза) 3 мг бо трипсин (1.5 мг), 4.0 М мочевина (1 мл) ва 0.2 М бикарбонати аммоний (1 мл) омехта карда шудааст. Маҳлул барои 10 дақиқа омехта карда шуд ва дар ваннаи обӣ дар ҳарорати 37°C барои 6 соат нигоҳ дошта шуд, сипас бо 1 мл 0.1% TFA хомӯш карда шуд. Маҳлулро филтр кунед ва дар ҳарорати аз 4°C паст нигоҳ доред.
Ҷудокунии омехтаҳои пептидӣ ва дайҷҳои трипсин HSA дар сутунҳои PMP алоҳида арзёбӣ карда шуданд. Ҷудокунии омехтаи пептидӣ ва дайҷҳои трипсин HSA-ро аз ҷониби сутуни PMP санҷед ва натиҷаҳоро бо сутуни Ascentis Express RP-Amide муқоиса кунед. Рақами назариявии пластина чунин ҳисоб карда мешавад:
Тасвирҳои SEM-и зарраҳои кремнийи луч ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо лиганд дар расми 2 нишон дода шудаанд. Тасвирҳои SEM-и зарраҳои кремнийи луч (A, B) нишон медиҳанд, ки бар хилофи таҳқиқоти қаблии мо, ин зарраҳо шакли курашакл доранд, ки дар онҳо зарраҳо дароз ё симметрияи номунтазам доранд. Сатҳи зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо лиганд (C, D) нисбат ба зарраҳои кремнийи луч ҳамвортар аст, ки ин метавонад аз сабаби пӯшиши занҷирҳои полистирол дар сатҳи зарраҳои кремний бошад.
Тасвирҳои электронии микроскопи сканкунии зарраҳои лучи кремний (A, B) ва зарраҳои кремнийи бо лиганд пайвастшуда (C, D).
Тақсимоти андозаи зарраҳои зарраҳои кремнийи луч ва зарраҳои кремнийи бо лиганд пайвастшуда дар расми 3(A) нишон дода шудаанд. Хатҳои тақсимоти андозаи зарраҳо дар асоси ҳаҷм нишон доданд, ки андозаи зарраҳои кремний пас аз тағирёбии кимиёвӣ афзоиш ёфтааст (Расми 3A). Маълумоти тақсимоти андозаи зарраҳои зарраҳои кремний аз таҳқиқоти ҷорӣ ва таҳқиқоти қаблӣ дар Ҷадвали 1(A) муқоиса карда шудаанд. Андозаи зарраҳои дар асоси ҳаҷм, d(0.5), PMP 3.36 мкм дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо бо арзиши ad(0.5) 3.05 мкм (зарраҳои кремнийи бо полистирол пайвастшуда)34 аст. Ин партия нисбат ба таҳқиқоти қаблии мо тақсимоти андозаи зарраҳои тангтар дошт, ки ин таносуби гуногуни PEG, мочевина, TMOS ва кислотаи сирко дар омехтаи реаксияро дар бар мегирад. Андозаи зарраҳои фазаи PMP нисбат ба фазаи зарраҳои кремнийи бо полистирол пайвастшуда, ки мо қаблан омӯхта будем, каме калонтар аст. Ин маънои онро дорад, ки функсионализатсияи сатҳии зарраҳои кремний бо стирол танҳо як қабати полистирол (0.97 мкм)-ро дар сатҳи кремний гузоштааст, дар ҳоле ки дар марҳилаи PMP... ғафсии қабат 1.38 мкм буд.
Тақсимоти андозаи зарраҳо (A) ва тақсимоти андозаи сӯрохиҳо (B)-и зарраҳои луч кремний ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо лиганд.
Андозаи сӯрохиҳо, ҳаҷми сӯрохиҳо ва масоҳати сатҳи зарраҳои кремний дар таҳқиқоти ҷорӣ дар Ҷадвали 1(B) оварда шудаанд. Профилҳои PSD-и зарраҳои кремнийи луч ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо лиганд дар Расми 3(B) нишон дода шудаанд. Натиҷаҳо бо таҳқиқоти қаблии мо қобили муқоисаанд. Андозаи сӯрохиҳои зарраҳои кремнийи луч ва пайвастшуда бо лиганд мутаносибан 310 ва 241 мебошанд, ки нишон медиҳад, ки андозаи сӯрохиҳо пас аз тағирёбии кимиёвӣ 69 кам мешавад, чунон ки дар Ҷадвали 1(B) нишон дода шудааст ва тағирёбии каҷ дар Расми 3(B) нишон дода шудааст. Ба ҳамин монанд, ҳаҷми сӯрохиҳои зарраҳои кремний пас аз тағирёбии кимиёвӣ аз 0,67 то 0,58 см3/г коҳиш ёфтааст. Масоҳати мушаххаси сатҳи зарраҳои кремнийи омӯхташуда 116 м2/г аст, ки бо таҳқиқоти қаблии мо (124 м2/г) қобили муқоиса аст. Тавре ки дар Ҷадвали 1(B) нишон дода шудааст, масоҳати сатҳи (м2/г) зарраҳои кремний низ аз 116 м2/г то 105 коҳиш ёфтааст. м2/г пас аз тағйири кимиёвӣ.
Натиҷаҳои таҳлили элементии фазаи статсионарӣ дар Ҷадвали 2 нишон дода шудаанд. Боркунии карбонии фазаи статсионии ҷорӣ 6,35% аст, ки аз боркунии карбонии таҳқиқоти қаблии мо (зарраҳои кремнийи бо полистирол пайвастшуда, мутаносибан 7,93%35 ва 10,21%) 42 камтар аст. Боркунии карбонии фазаи статсионии ҷорӣ паст аст, зеро ҳангоми тайёр кардани SP ҷорӣ, илова бар стирол, баъзе лигандҳои қутбӣ, ба монанди фенилмалеимид-метилвинилисоцианат (PCMP) ва 4-гидрокси-TEMPO истифода шудаанд. Фоизи вазни нитроген дар фазаи статсионии ҷорӣ 2,21% аст, дар муқоиса бо мутаносибан 0,1735 ва 0,85% аз рӯи вазни нитроген дар таҳқиқоти қаблӣ. Ин маънои онро дорад, ки фоизи вазнии нитроген дар фазаи статсионии ҷорӣ аз сабаби фенилмалеимид баландтар аст. Ба ҳамин монанд, боркунии карбонии маҳсулоти (4) ва (5) мутаносибан 2,7% ва 2,9% буданд, дар ҳоле ки боркунии карбонии маҳсулоти ниҳоӣ... (6) 6.35% буд, чунон ки дар Ҷадвали 2 нишон дода шудааст. Камшавии вазн бо фазаи статсионарии PMP санҷида шуд ва каҷи TGA дар Расми 4 нишон дода шудааст. Каҷи TGA камшавии вазни 8.6% -ро нишон медиҳад, ки бо боркунии карбон (6.35%) мувофиқати хуб дорад, зеро лигандҳо на танҳо C, балки N, O ва H-ро низ дар бар мегиранд.
Лиганди фенилмалеимид-метилвинилисоцианат барои тағир додани сатҳи зарраҳои кремний интихоб карда шуд, зеро он гурӯҳҳои фенилмалеимид қутбӣ ва гурӯҳҳои винилисоцианат дорад. Гурӯҳҳои изоцианати винилӣ метавонанд бо стирол тавассути полимеризатсияи радикалии зинда минбаъд реаксия кунанд. Сабаби дуюм ворид кардани гурӯҳе мебошад, ки бо аналит таъсири мутақобилаи мӯътадил дорад ва байни аналит ва фазаи статсионарӣ таъсири мутақобилаи қавии электростатикӣ надорад, зеро қисми фенилмалеимид дар рН муқаррарӣ заряди виртуалӣ надорад. Қутбии фазаи статсионариро метавон бо миқдори оптималии стирол ва вақти реаксияи полимеризатсияи радикалии озод идора кард. Қадами охирини реаксия (полимеризатсияи радикалии озод) муҳим аст ва метавонад қутбии фазаи статсионариро тағйир диҳад. Таҳлили элементӣ барои санҷидани боркунии карбон дар ин фазаҳои статсионарӣ гузаронида шуд. Мушоҳида шуд, ки зиёд кардани миқдори стирол ва вақти реаксия боркунии карбони фазаи статсионариро зиёд мекунад ва баръакс. SP-ҳо, ки бо консентратсияҳои гуногуни стирол омода шудаанд, боркунии гуногуни карбон доранд. Боз ҳам, ин фазаҳои статсионариро ба сутунҳои пӯлоди зангногир бор кунед ва онҳоро санҷед. иҷрои хроматографӣ (интихобӣ, ҳалли масъала, арзиши N ва ғайра). Дар асоси ин таҷрибаҳо, формулаи оптимизатсияшуда барои омода кардани фазаи статсионарии PMP барои таъмини қутбияти назоратшаванда ва нигоҳдории хуби аналит интихоб карда шуд.
Панҷ омехтаи пептидӣ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) низ бо истифода аз сутуни PMP бо истифода аз фазаи мобилӣ арзёбӣ карда шуданд; 60/40 (v/v) ацетонитрил/об (0.1% TFA) бо суръати ҷараёни 80 мкл/дақ. Дар шароити оптималии элюсия, рақами назариявии пластина (N) дар як сутун (100 × 1.8 мм id) 20,000 ± 100 (200,000 пластина/м²) аст. Ҷадвали 3 арзишҳои N-ро барои се сутуни PMP нишон медиҳад ва хроматограммаҳо дар расми 5A нишон дода шудаанд. Таҳлили зуд дар сутуни PMP бо суръати баланди ҷараёни (700 мкл/дақ), панҷ пептид дар давоми як дақиқа элюсия карда шуданд, арзишҳои N хеле хуб буданд, 13,500 ± 330 дар як сутун (100 × 1.8 мм id), ба 135,000 пластина/м² мувофиқат мекунад (Расми 5B). Се сутуни андозаи якхела (100 × 1.8 мм id) бо се партияи гуногуни фазаи статсионарии PMP пур карда шуданд, то санҷанд такроршавандагӣ. Консентратсияи аналит барои ҳар як сутун бо истифода аз шароити оптималии элютсия ва шумораи лавҳаҳои назариявӣ N ва вақти нигоҳдорӣ барои ҷудо кардани ҳамон омехтаи санҷишӣ дар ҳар як сутун сабт карда шуд. Маълумоти такроршавандагӣ барои сутунҳои PMP дар Ҷадвали 4 нишон дода шудааст. Такроршавандагии сутуни PMP бо арзишҳои хеле пасти %RSD, тавре ки дар Ҷадвали 3 нишон дода шудааст, хуб алоқаманд аст.
Ҷудо кардани омехтаи пептидӣ дар сутуни PMP (B) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (A); фазаи мобилӣ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), андозаи сутуни PMP (100 × 1.8 мм id); таҳлилӣ Тартиби элютсияи пайвастагиҳо: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ва 5 (лейцин) кислотаи энкефалин)).
Сутуни PMP (100 × 1.8 мм id) барои ҷудо кардани дайҷҳои триптикии албумини зардоби инсон дар хроматографияи моеъи баландсифат арзёбӣ карда шуд. Хроматограмма дар расми 6 нишон медиҳад, ки намуна хуб ҷудо карда шудааст ва қарори он хеле хуб аст. Дайҷҳои HSA бо истифода аз суръати ҷараёни 100 мкл/дақ, фазаи мобилӣ 70/30 ацетонитрил/об ва 0.1% TFA таҳлил карда шуданд. Тавре ки дар хроматограмма нишон дода шудааст (Расми 6), дайҷҳои HSA ба 17 қулла, ки ба 17 пептид мувофиқат мекунанд, тақсим карда шудаанд. Самаранокии ҷудокунии ҳар як қулла дар дайҷҳои HSA ҳисоб карда шуд ва арзишҳо дар Ҷадвали 5 оварда шудаанд.
Ҳаҷми триптикии HSA (100 × 1.8 мм id) дар сутуни PMP ҷудо карда шуд; суръати ҷараён (100 мкл/дақ), фазаи мобилӣ 60/40 ацетонитрил/об бо 0.1% TFA.
ки дар он L дарозии сутун, η часпакии фазаи мобилӣ, ΔP фишори бозгашти сутун ва u суръати хаттии фазаи мобилӣ мебошад. Гузариши сутуни PMP 2,5 × 10-14 м2, суръати ҷараён 25 мкл/дақ ва 60/40 v/v ACN/об истифода шудааст. Гузариши сутуни PMP (100 × 1,8 мм id) ба таҳқиқоти қаблии мо, Ref.34 монанд буд. Гузариши сутун, ки бо зарраҳои сатҳии сӯрохдор пур карда шудааст, чунин аст: 1,7 × 10-15 барои зарраҳои 1,3 мкм, 3,1 × 10-15 барои зарраҳои 1,7 мкм, 5,2 × 10-15 ва 2,5 × 10-14 м2 барои зарраҳои 2,6 мкм Барои зарраҳои 5 мкм 43. Аз ин рӯ, гузариши фазаи PMP ба гузариши 5 мкм ядро-пӯст монанд аст. зарраҳо
ки дар он Wx вазни сутуни пуркардашуда бо хлороформ, Wy вазни сутуни пуркардашуда бо метанол ва ρ зичии ҳалкунанда аст. Зичии метанол (ρ = 0.7866) ва хлороформ (ρ = 1.484). Сӯрохии умумии сутунҳои SILICA ZARRACHES-C18 (100 × 1.8 мм id) 34 ва сутунҳои C18-Urea 31, ки мо қаблан омӯхта будем, мутаносибан 0.63 ва 0.55 буданд. Ин маънои онро дорад, ки мавҷудияти лигандҳои карбамид гузариши фазаи статсионариро коҳиш медиҳад. Аз тарафи дигар, сӯрохии умумии сутуни PMP (100 × 1.8 мм id) 0.60 аст. Гузариши сутунҳои PMP нисбат ба сутунҳои пуркардашуда бо зарраҳои кремнийи пайвастшудаи C18 пасттар аст, зеро дар фазаҳои статсионарии навъи C18 лигандҳои C18 ба зарраҳои кремний ҳамчун занҷирҳои хаттӣ пайваст мешаванд, дар ҳоле ки дар фазаҳои статсионарии навъи полистирол, A нисбатан ғафс аст. қабати полимерӣ дар атрофи он ташаккул меёбад. Дар як таҷрибаи маъмулӣ, сӯрохии сутун чунин ҳисоб карда мешавад:
Дар расми 7A, B сутуни PMP (100 × 1.8 мм id) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 мм id) бо истифода аз шароити якхелаи элюсия (яъне, 60/40 ACN/H2O ва 0.1% TFA) дар диаграммаи ван Деемтер нишон дода шудаанд. Омехтаҳои пептидҳои интихобшуда (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) дар 20 µL/ омода карда шуданд. Суръати ҳадди ақали ҷараён барои ҳарду сутун 800 µL/дақ аст. Арзишҳои ҳадди ақали HETP дар суръати оптималии ҷараён (80 µL/дақ) барои сутуни PMP ва сутуни Ascentis Express RP-Amide мутаносибан 2.6 µm ва 3.9 µm буданд. Арзишҳои HETP нишон медиҳанд, ки самаранокии ҷудокунии сутуни PMP (100 × 1.8 mm id) нисбат ба сутуни Ascentis Express RP-Amide, ки дар тиҷорат дастрас аст (100 × 1.8 mm id) хеле беҳтар аст. Нақшаи ван Деемтер дар расми 7(A) нишон медиҳад, ки коҳиши арзиши N бо афзоиши ҷараён дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо назаррас нест. Самаранокии баланди ҷудокунии сутуни PMP (100 × 1.8 мм id) дар муқоиса бо сутуни Ascentis Express RP-Amide бар асоси беҳбудиҳо дар шакл, андозаи зарраҳо ва тартиботи мураккаби бастабандии сутун, ки дар кори ҷорӣ истифода мешаванд, анҷом дода шудааст34.
(A) графики ван Димтер (HETP нисбат ба суръати хаттии фазаи мобилӣ), ки бо истифода аз сутуни PMP (100 × 1.8 мм id) дар 60/40 ACN/H2O бо 0.1% TFA ба даст оварда шудааст.(B) графики ван Димтер (HETP нисбат ба суръати хаттии фазаи мобилӣ), ки бо истифода аз сутуни Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 мм id) дар 60/40 ACN/H2O бо 0.1% TFA ба даст оварда шудааст.
Фазаи статсионарии полистиролии қутбӣ бо ҷойгиркунии қутбӣ барои ҷудо кардани омехтаҳои пептидҳои синтетикӣ ва ҳазмҳои трипсинӣ аз албумини зардоби инсон (HAS) дар хроматографияи моеъи баландсифат омода ва арзёбӣ карда шуд. Иҷрои хроматографии сутунҳои PMP барои омехтаҳои пептидӣ аз ҷиҳати самаранокӣ ва ҳалли ҷудокунӣ аъло аст. Иҷрои беҳтаршудаи ҷудокунии сутунҳои PMP аз сабабҳои гуногун, ба монанди андозаи зарраҳо ва андозаи сӯрохиҳои зарраҳои кремний, синтези назоратшавандаи фазаи статсионарӣ ва бастабандии мураккаби сутун вобаста аст. Илова бар самаранокии баланди ҷудокунӣ, фишори пасти сутун дар суръати баланди ҷараён як бартарии дигари ин фазаи статсионарӣ мебошад. Сутунҳои PMP такроршавандагии хубро нишон медиҳанд ва метавонанд барои таҳлили омехтаҳои пептидӣ ва ҳазми трипсинӣ сафедаҳои гуногун истифода шаванд. Мо ният дорем, ки ин сутунро барои ҷудо кардани маҳсулоти табиӣ, пайвастагиҳои биоактивӣ аз растаниҳои доруворӣ ва экстрактҳои замбӯруғӣ дар хроматографияи моеъ истифода барем. Дар оянда, сутунҳои PMP инчунин барои ҷудо кардани сафедаҳо ва антителоҳои моноклоналӣ арзёбӣ карда мешаванд.
Филд, Ҷ.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ҷ., Тогерсен, Х. ва Петерссон, П. Таҳқиқот оид ба системаҳои ҷудокунии пептидҳо бо истифода аз хроматографияи фазаи баръакс Қисми I: Таҳияи протоколи тавсифи сутун. Ҷ. Хроматография.1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. ва дигарон. Пептидҳои фаъоли такмилёфта, ки барои табобати бемориҳои сироятӣ тарҳрезӣ шудаанд. Биотехнология. Пешрафта. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Ҷ. ва Хрестчатиский, М. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: илм ва бозор. Кашфи доруворӣ.15 (1-2) имрӯз, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сие, Ф., Смит, РД ва Шен, Ю. Хроматографияи моеъи протеомии пешрафта. Ҷ. Хроматография. А 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ва дигарон. Спектрометрияи массавии хроматографияи пешрафтаи моеъ имкон медиҳад, ки метаболомика ва протеомикаи ба таври васеъ мақсаднок ворид карда шаванд. anus. Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. ва Салисбери, Ҷ.Ҷ. Нақши UHPLC дар таҳияи доруҳо. Ҷ. Сен. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. ва Клаузен, А.М. Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори ултрабаланд барои ҷудокунии босуръат. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. ва Челитчефф, П. Татбиқи хроматографияи моеъи ултра-баландсифат дар таҳияи доруворӣ. Ҷ. Хроматография. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. ва диг. Гидрогелҳои макросӯрохии монолитӣ, ки аз эмульсияҳои фазаи дохилии баланди равған дар об барои тозакунии самараноки энтеровирусҳо омода карда шудаанд. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. ва Вилкинс, ҶА Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика. Ҷ. Хроматография. А 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вейтей, Ҷ.-Л. ва Гилларм, Д. Тамоюлҳои пайдошаванда дар ҷудокунии хроматографияи моеъи фазаи баръаксшавандаи пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ: назария ва татбиқ. Ҷ. Фармация. Илми биотиббӣ. анус.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. ва Геблер, Ҷ.К. Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо истифода аз арзишҳои гуногуни рН дар андозаҳои якум ва дуюми ҷудокунӣ. Ҷ. Сен. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. ва дигарон. Хусусиятҳои интиқоли масса ва иҷрои кинетикии сутунҳои хроматографии баландсамар, ки бо зарраҳои пурра ва сатҳӣ сӯрохдори C18 sub-2 μm пур карда шудаанд, таҳқиқ карда шуданд. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. ва дигарон. Тамоюлҳои охирин ва мушкилоти таҳлилӣ дар ҷудокунӣ, муайянкунӣ ва тасдиқи пептидҳои биоактивии растанӣ. анус. ануси биологӣ. Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Ҷ.Б. ва дигарон. Манзараи протеомикии салтанати ҳаёт. Табиат 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, С. ва диг. Коркарди пептидҳои терапевтӣ бо истифода аз хроматографияи моеъи тайёрӣ. Молекула (Базел, Швейтсария) 26(15), 4688(2021).
Янг, Ю. ва Генг, Х. Хроматографияи омехта ва татбиқи он дар биополимерҳо. Ҷ. Хроматография. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Жао, Г., Донг, Х.-Й. ва Сун, Й. Лигандҳо барои хроматографияи сафедаи режими омехта: принсип, тавсиф ва тарҳрезӣ. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).