Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակը սահմանափակ աջակցություն ունի CSS-ի համար: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Ծակոտկեն սիլիկայի մասնիկները պատրաստվել են սոլ-գել մեթոդով՝ որոշ փոփոխություններով՝ մակրոպոտկեն մասնիկներ ստանալու համար: Այս մասնիկները դերիվատացվել են N-ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլվինիլիզոցիանատով (PMI) և ստիրոլով՝ N-ֆենիլմալեյմիդային ինտերկալացիա ստանալու համար: Նեղ տրամագծի չժանգոտվող պողպատե սյուները (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) փաթեթավորվել են շլամի փաթեթավորմամբ: Գնահատվել է հինգ պեպտիդներից (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, լեյցին էնկեֆալին) բաղկացած պեպտիդային խառնուրդի PMP սյունակի բաժանումը (քրոմատոգրաֆիկ կատարողականություն) և մարդու շիճուկային ալբումինի (HAS) տրիպսինային մարսումը: Օպտիմալ էլյուցիայի պայմաններում պեպտիդային խառնուրդի տեսական թիթեղների քանակը հասնում է մինչև 280,000 թիթեղ/մ²: Մշակված սյան բաժանման կատարողականությունը համեմատելով առևտրային Ascentis-ի հետ: Express RP-Ամիդ սյունակում նկատվել է, որ PMP սյունակի բաժանման արդյունավետությունը բաժանման արդյունավետության և լուծաչափի առումով գերազանցում էր առևտրային սյունակին։
Վերջին տարիներին կենսադեղագործական արդյունաբերությունը դարձել է ընդլայնվող համաշխարհային շուկա՝ շուկայական մասնաբաժնի զգալի աճով։ Կենսադեղագործական արդյունաբերության պայթյունային աճի հետ մեկտեղ1,2,3 պեպտիդների և սպիտակուցների վերլուծությունը խիստ ցանկալի է։ Բացի թիրախային պեպտիդից, պեպտիդների սինթեզի ընթացքում առաջանում են մի քանի խառնուրդներ, ուստի անհրաժեշտ է քրոմատոգրաֆիկ մաքրում՝ ցանկալի մաքրության պեպտիդներ ստանալու համար։ Մարմնի հեղուկներում, հյուսվածքներում և բջիջներում սպիտակուցների վերլուծությունը և բնութագրումը չափազանց մարտահրավերային խնդիր է՝ մեկ նմուշում պոտենցիալ հայտնաբերելի տեսակների մեծ թվի պատճառով։ Չնայած զանգվածային սպեկտրոմետրիան պեպտիդների և սպիտակուցների հաջորդականության որոշման արդյունավետ գործիք է, եթե նման նմուշները մեկ անցումով ներարկվեն զանգվածային սպեկտրոմետրի մեջ, տարանջատումը իդեալական չի լինի։ Այս խնդիրը կարող է մեղմվել՝ MS վերլուծությունից առաջ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի (LC) տարանջատումներ իրականացնելով, ինչը կնվազեցնի զանգվածային սպեկտրոմետր մտնող անալիտների քանակը տվյալ պահին4,5,6։ Բացի այդ, հեղուկ փուլի տարանջատման ընթացքում անալիտները կարող են կենտրոնացվել նեղ շրջաններում, այդպիսով կենտրոնացնելով այդ անալիտները և բարելավելով MS հայտնաբերման զգայունությունը։ Հեղուկ քրոմատոգրաֆիան (LC) զգալիորեն զարգացել է։ վերջին տասնամյակի ընթացքում և դարձել է պրոտեոմիկ վերլուծության մեջ տարածված տեխնիկա7,8,9,10:
Հակադարձ փուլային հեղուկ քրոմատոգրաֆիան (RP-LC) լայնորեն կիրառվում է պեպտիդային խառնուրդների մաքրման և բաժանման համար՝ օգտագործելով օկտադեցիլ-մոդիֆիկացված սիլիցիումի երկօքսիդ (ODS) որպես ստացիոնար փուլ11,12,13: Այնուամենայնիվ, RP ստացիոնար փուլերը չեն ապահովում պեպտիդների և սպիտակուցների բավարար բաժանում՝ իրենց բարդ կառուցվածքի և ամֆիֆիլային բնույթի պատճառով14,15: Հետևաբար, անհրաժեշտ են հատուկ նախագծված ստացիոնար փուլեր՝ պեպտիդներն ու սպիտակուցները վերլուծելու համար, որոնք ունեն բևեռային և ոչ բևեռային մասնիկներ՝ այդ անալիտների հետ փոխազդելու և դրանք պահպանելու համար16: Խառը ռեժիմային քրոմատոգրաֆիան, որն ապահովում է բազմամոդալ փոխազդեցություններ, կարող է լինել RP-LC-ի այլընտրանք՝ պեպտիդների, սպիտակուցների և այլ բարդ խառնուրդների բաժանման համար: Պատրաստվել են մի քանի խառը ռեժիմային ստացիոնար փուլեր, և այդ փուլերով լցված սյուներ են օգտագործվել պեպտիդների և սպիտակուցների բաժանման համար17,18,19,20,21: Խառը ռեժիմային ստացիոնար փուլերը (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, բևեռային ինտերկալացիա/RPLC) հարմար են պեպտիդների և սպիտակուցների բաժանման համար՝ ինչպես բևեռային, այնպես էլ ոչ բևեռային նյութերի առկայության պատճառով: խմբեր22,23,24,25,26,27,28: Նմանապես, բևեռային ինտերկալացված ստացիոնար փուլերը կովալենտորեն կապված բևեռային խմբերի հետ ցույց են տալիս լավ բաժանման հզորություն և եզակի ընտրողականություն բևեռային և ոչ բևեռային անալիտների համար, քանի որ բաժանումը կախված է անալիտի և ստացիոնար փուլի միջև փոխազդեցությունից: Բազմամոդալ փոխազդեցություններ29, 30, 31, 32: Վերջերս Չժանը և այլք30 պատրաստել են դոդեցիլ-վերջացված պոլիամինային ստացիոնար փուլ և հաջողությամբ բաժանել են ածխաջրածինները, հակադեպրեսանտները, ֆլավոնոիդները, նուկլեոզիդները, էստրոգենները և մի շարք այլ անալիտներ: Բևեռային ինտերկալատորն ունի ինչպես բևեռային, այնպես էլ ոչ բևեռային խմբեր, ուստի այն կարող է օգտագործվել պեպտիդներն ու սպիտակուցները բաժանելու համար, որոնք ունեն ինչպես հիդրոֆոբ, այնպես էլ հիդրոֆիլ մասնիկներ: Բևեռային ներդրված սյուները (օրինակ՝ ամիդային ներդրված C18 սյուները) առևտրային առումով հասանելի են Ascentis Express RP-Amide սյուներ առևտրային անվան տակ, բայց այս սյուները օգտագործվում են միայն ամին 33-ի վերլուծության համար:
Այս ուսումնասիրության մեջ պատրաստվել և գնահատվել է բևեռային ներդրված ստացիոնար փուլ (N-ֆենիլմալեյմիդով ներդրված պոլիստիրոլ)՝ HSA-ի պեպտիդների և տրիպսինային մարսեթների բաժանման համար։ Ստացիոնար փուլը պատրաստվել է հետևյալ ռազմավարությամբ։ Ծակոտկեն սիլիցիումի մասնիկները պատրաստվել են մեր նախորդ հրապարակման մեջ տրված ընթացակարգի համաձայն՝ պատրաստման արձանագրության որոշ փոփոխություններով։ Միզանյութի, պոլիէթիլենգլիկոլի (PEG), TMOS-ի, ջրի և քացախաթթվի հարաբերակցությունը կարգավորվել է՝ մեծ ծակոտիների չափի սիլիցիումի մասնիկներ պատրաստելու համար։ Երկրորդ, սինթեզվել է նոր լիգանդ՝ ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլ վինիլիզոցիանատ, որը օգտագործվել է սիլիցիումի մասնիկները դերիվատացնելու համար՝ բևեռային ներդրված ստացիոնար փուլ պատրաստելու համար։ Արդյունքում ստացված ստացիոնար փուլը փաթեթավորվել է չժանգոտվող պողպատե սյան մեջ (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագծով)՝ օգտագործելով օպտիմիզացված փաթեթավորման սխեման։ Սյան փաթեթավորումն իրականացվում է մեխանիկական թրթռման միջոցով՝ սյան ներսում համասեռ շերտի ձևավորումն ապահովելու համար։ Գնահատեք հինգ պեպտիդներից բաղկացած պեպտիդային խառնուրդների փաթեթավորված սյան բաժանումը։ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkephalin) և մարդու շիճուկային ալբումինի (HAS) տրիպսինային դիսիեստը։ HSA-ի պեպտիդային խառնուրդը և տրիպսինային դիսիեստը լավ լուծողականությամբ և արդյունավետությամբ են առանձնանում։ PMP սյունակի անջատման արդյունավետությունը համեմատվել է Ascentis Express RP-Amide սյունակի հետ։ PMP սյունակի վրա և՛ պեպտիդները, և՛ սպիտակուցները լավ լուծողականությամբ և արդյունավետությամբ են դիտվել, որն ավելի արդյունավետ էր, քան Ascentis Express RP-Amide սյունակը։
PEG (պոլիէթիլենգլիկոլ), միզանյութ, քացախաթթու, տրիմեթօքսի օրթոսիլիկատ (TMOS), տրիմեթիլ քլորոսիլան (TMCS), տրիպսին, մարդու շիճուկային ալբումին (HSA), ամոնիումի քլորիդ, միզանյութ, հեքսան մեթիլդիսիլազան (HMDS), մետակրիլոյլ քլորիդ (MC), ստիրոլ, 4-հիդրօքսի-TEMPO, բենզոիլ պերօքսիդ (BPO), HPLC կարգի ացետոնիտրիլ (ACN), մեթանոլ, 2-պրոպանոլ և ացետոն։ Գնված է Sigma-Aldrich-ից (Սենթ Լուիս, Միսսուրի, ԱՄՆ)։
Միզանյութի (8 գ), պոլիէթիլենգլիկոլի (8 գ) և 8 մլ 0.01 N քացախաթթվի խառնուրդը խառնվել է 10 րոպե, որից հետո սառցե պայմաններում դրան ավելացվել է 24 մլ TMOS: Ռեակցիայի խառնուրդը տաքացվել է 40°C ջերմաստիճանում 6 ժամ, ապա 120°C ջերմաստիճանում՝ 8 ժամ՝ չժանգոտվող պողպատե ավտոկլավում: Ջուրը թափվել է, և մնացորդային նյութը չորացվել է 70°C ջերմաստիճանում 12 ժամ: Չորացրած փափուկ զանգվածը հարթեցվել է ջեռոցում և կալցինացվել 550°C ջերմաստիճանում 12 ժամ: Պատրաստվել և բնութագրվել են երեք խմբաքանակ՝ մասնիկների չափի, ծակոտիների չափի և մակերեսի վերարտադրելիությունը ուսումնասիրելու համար:
Սիլիցիումի մասնիկների մակերեսային մոդիֆիկացիայի միջոցով՝ նախապես սինթեզված լիգանդ ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլվինիլիզոցիանատով (PCMP), որին հաջորդեց ստիրոլով ճառագայթային պոլիմերացումը, ստացվեց բևեռային խումբ պարունակող միացություն: Ագրեգատների և պոլիստիրոլային շղթաների համար ստացիոնար փուլ: Պատրաստման գործընթացը նկարագրված է ստորև:
N-ֆենիլմալեյմիդը (200 մգ) և մեթիլ վինիլիզոցիանատը (100 մգ) լուծվել են չոր տոլուոլում, և 0.1 մլ 2,2′-ազոիզոբուտիրոնիտրիլ (AIBN) ավելացվել է ռեակցիայի սրվակին՝ ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլ վինիլիզոցիանատ համապոլիմեր (PMCP) պատրաստելու համար։ Խառնուրդը տաքացվել է 60°C ջերմաստիճանում 3 ժամ, ֆիլտրվել և չորացվել է ջեռոցում 40°C ջերմաստիճանում 3 ժամ։
Չորացրած սիլիցիումի մասնիկները (2 գ) ցրվել են չոր տոլուոլի (100 մլ) մեջ, խառնվել և ուլտրաձայնային մշակման ենթարկվել 500 մլ կլոր հատակով սրվակում 10 րոպե։ PMCP-ն (10 մգ) լուծվել է տոլուոլի մեջ և կաթիլային եղանակով ավելացվել է ռեակցիայի սրվակին կաթիլային ձագարի միջոցով։ Խառնուրդը 8 ժամ թրմվել է 100°C ջերմաստիճանում, զտվել և լվացվել ացետոնով և չորացվել 60°C ջերմաստիճանում 3 ժամ։ Այնուհետև PMCP-ի հետ կապված սիլիցիումի մասնիկները (100 գ) լուծվել են տոլուոլի (200 մլ) մեջ և որպես կատալիզատոր ավելացվել է 4-հիդրօքսի-TEMPO (2 մլ)՝ 100 մկլ դիբուտիլտին դիլաուրատի առկայությամբ։ Խառնուրդը խառնվել է 50°C ջերմաստիճանում 8 ժամ, զտվել և չորացվել 50°C ջերմաստիճանում 3 ժամ։
Ստիրոլ (1 մլ), բենզոիլ պերօքսիդ BPO (0.5 մլ) և TEMPO-PMCP-ին կցված սիլիցիումի մասնիկներ (1.5 գ) ցրվել են տոլուոլի մեջ և լցվել ազոտով։ Ստիրոլի պոլիմերացումը կատարվել է 100°C ջերմաստիճանում 12 ժամ։ Արդյունքում ստացված արդյունքը լվացվել է մեթանոլով և չորացվել 60°C ջերմաստիճանում գիշերը։ Ընդհանուր ռեակցիայի սխեման ներկայացված է նկար 1-ում։
Նմուշները գազազերծվել են 393 Կ ջերմաստիճանում 1 ժամ՝ 10-3 Տորից պակաս մնացորդային ճնշում ստանալու համար: P/P0 = 0.99 հարաբերական ճնշման տակ ադսորբված N2-ի քանակը օգտագործվել է ընդհանուր ծակոտիների ծավալը որոշելու համար: Մերկ և լիգանդ-կապված սիլիկայի մասնիկների ձևաբանությունը ուսումնասիրվել է սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակով (Hitachi High Technologies, Տոկիո, Ճապոնիա): Չորացրած նմուշները (մերկ սիլիկա և լիգանդ-կապված սիլիկայի մասնիկներ) տեղադրվել են ալյումինե սյան վրա՝ օգտագործելով կպչուն ածխածնային ժապավեն: Նմուշները ոսկեզօծվել են Q150T փոշիացնող ծածկույթով, և նմուշների վրա նստեցվել է 5 նմ Au շերտ: Սա բարելավում է գործընթացի արդյունավետությունը՝ օգտագործելով ցածր լարումներ և ապահովում է մանրահատիկ, սառը փոշիացում: Տարրական վերլուծության համար օգտագործվել է Thermo Electron (Waltham, MA, ԱՄՆ) Flash EA1112 տարրական վերլուծիչ: Մասնիկների չափի բաշխումը ստանալու համար օգտագործվել է Malvern (Worcestershire, Մեծ Բրիտանիա) Mastersizer 2000 մասնիկների չափի վերլուծիչ: Մերկ սիլիկայի մասնիկներ և լիգանդ-կապված սիլիկա Մասնիկները (յուրաքանչյուրը 5 մգ) ցրվել են 5 մլ իզոպրոպանոլի մեջ, ուլտրաձայնային մշակման ենթարկվել 10 րոպե, 5 րոպե պտտվել և տեղադրվել Mastersizer-ի օպտիկական սեղանի վրա։ Ջերմագրավիմետրիկ վերլուծությունը կատարվել է րոպեում 5°C արագությամբ՝ 30-ից 800°C ջերմաստիճանային միջակայքում։
Ապակեպատ չժանգոտվող պողպատից նեղ տրամաչափի սյուները (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) փաթեթավորվել են շաղախի փաթեթավորման մեթոդով՝ կիրառելով հղումով նշված կետում օգտագործված նույն ընթացակարգը։ 31. 1 մկմ ֆրիտ պարունակող ելքային միացումով չժանգոտվող պողպատե սյունը (ապակեպատ, 100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) միացվել է շիճուկի փաթեթավորող սարքին (Alltech Deerfield, IL, ԱՄՆ): Պատրաստել ստացիոնար փուլի շիճուկ՝ 150 մգ ստացիոնար փուլը 1.2 մլ մեթանոլի մեջ կախույթի մեջ դնելով և այն ուղարկելով պահեստավորման սյուն: Որպես շիճուկի լուծիչ օգտագործվել է մեթանոլ, ինչպես նաև շարժիչ լուծիչ: Սյունը հաջորդաբար լցնել՝ կիրառելով 100 ՄՊ ճնշում 10 րոպե, 80 ՄՊ՝ 15 րոպե և 60 ՄՊ՝ 30 րոպե: Փաթեթավորման ընթացքում երկու գազային խտանյութի սյունակի թափահարիչներով (Alltech, Deerfield, IL, ԱՄՆ) կիրառվել է մեխանիկական թրթռում՝ սյան միատարր փաթեթավորումն ապահովելու համար: Փակել շիճուկի փաթեթավորողը և դանդաղորեն թուլացնել ճնշումը՝ սյան ներսում որևէ վնաս կանխելու համար: Անջատել սյունը շիճուկի փաթեթավորման միավորից և միացնել մեկ այլ միացում մուտքին և LC համակարգին՝ դրա աշխատանքը ստուգելու համար:
Կառուցվել է LC պոմպ (10AD Shimadzu, Ճապոնիա), ներարկիչ (Valco (ԱՄՆ) C14 W.05)՝ 50 նլ ներարկման օղակով, թաղանթային դեգազացնողով (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS մազանոթային պատուհան, հատուկ µLC սարք-դետեկտոր (UV-2075) և ապակեպատ միկրոսյուներ: Օգտագործվել են շատ նեղ և կարճ միացնող խողովակներ՝ սյունակի լրացուցիչ գոտու լայնացման ազդեցությունը նվազագույնի հասցնելու համար: Փաթեթավորումից հետո վերականգնող միացման 1/16″ ելքի մոտ տեղադրվել են մազանոթներ (50 մկմ id 365 և վերականգնող միացման մազանոթներ (50 մկմ): Տվյալների հավաքագրումը և քրոմատոգրաֆիկ մշակումը կատարվել են Multichro 2000 ծրագրաշարի միջոցով: Մոնիթորինգը 254 նմ-ում: Անալիզները ստուգվել են ուլտրամանուշակագույն կլանման համար: Քրոմատոգրաֆիկ տվյալները վերլուծվել են OriginPro8-ով (Նորթհեմփթոն, Մասաչուսեթս):
Մարդու շիճուկից ստացված ալբումին, լիոֆիլիզացված փոշի, ≥ 96% (ագարոզային գել էլեկտրոֆորեզ) 3 մգ խառնված տրիպսինի (1.5 մգ), 4.0 Մ միզանյութի (1 մլ) և 0.2 Մ ամոնիումի բիկարբոնատի (1 մլ) հետ։ Լուծույթը խառնվել է 10 րոպե և պահվել է ջրային բաղնիքում 37°C ջերմաստիճանում 6 ժամ, այնուհետև մարվել է 1 մլ 0.1% TFA-ով։ Լուծույթը զտել և պահել 4°C-ից ցածր ջերմաստիճանում։
Պեպտիդային խառնուրդների և HSA տրիպսինային մարսեթների բաժանումը գնահատվել է առանձին PMP սյուների վրա: Ստուգեք HSA-ի պեպտիդային խառնուրդի և տրիպսինային մարսեթի բաժանումը PMP սյունակով և համեմատեք արդյունքները Ascentis Express RP-Amide սյան հետ: Տեսական ափսեի համարը հաշվարկվում է հետևյալ կերպ.
Մերկ սիլիկայի մասնիկների և լիգանդ-կապված սիլիկայի մասնիկների ՍԷՄ պատկերները ներկայացված են Նկար 2-ում: Մերկ սիլիկայի մասնիկների (A, B) ՍԷՄ պատկերները ցույց են տալիս, որ մեր նախորդ ուսումնասիրություններից ի տարբերություն, այս մասնիկները գնդաձև են, որոնցում մասնիկները երկարավուն են կամ ունեն անկանոն համաչափություն: Լիգանդ-կապված սիլիկայի մասնիկների (C, D) մակերեսը ավելի հարթ է, քան մերկ սիլիկայի մասնիկներինը, ինչը կարող է պայմանավորված լինել սիլիկայի մասնիկների մակերեսին պոլիստիրոլային շղթաների ծածկույթով:
Սիլիցիումի մերկ մասնիկների (A, B) և լիգանդ-կապված սիլիցիումի մասնիկների (C, D) սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի պատկերներ։
Մերկ սիլիցիումի մասնիկների և լիգանդ-կապված սիլիցիումի մասնիկների մասնիկների չափերի բաշխումը ներկայացված է նկար 3(A)-ում: Ծավալի վրա հիմնված մասնիկների չափերի բաշխման կորերը ցույց են տվել, որ սիլիցիումի մասնիկների չափը մեծացել է քիմիական փոփոխությունից հետո (Նկար 3A): Ներկայիս և նախորդ ուսումնասիրություններից սիլիցիումի մասնիկների մասնիկների չափերի բաշխման տվյալները համեմատվում են աղյուսակ 1(A)-ում: PMP-ի ծավալի վրա հիմնված մասնիկի չափը՝ d(0.5), 3.36 մկմ է, համեմատած մեր նախորդ ուսումնասիրության հետ՝ 3.05 մկմ ad(0.5) արժեքով (պոլիստիրոլ-կապված սիլիցիումի մասնիկներ)34: Այս խմբաքանակն ուներ ավելի նեղ մասնիկի չափերի բաշխում՝ համեմատած մեր նախորդ ուսումնասիրության հետ՝ ռեակցիոն խառնուրդում PEG-ի, միզանյութի, TMOS-ի և քացախաթթվի տարբեր հարաբերակցությունների պատճառով: PMP փուլի մասնիկի չափը մի փոքր ավելի մեծ է, քան մեր կողմից նախկինում ուսումնասիրված պոլիստիրոլ-կապված սիլիցիումի մասնիկների փուլը: Սա նշանակում է, որ սիլիցիումի մասնիկների մակերեսային ֆունկցիոնալիզացիան ստիրոլով սիլիցիումի մակերեսին նստեցրել է միայն պոլիստիրոլային շերտ (0.97 մկմ), մինչդեռ PMP փուլում շերտի հաստությունը կազմել է 1.38 մկմ: մկմ
Մերկ սիլիցիումի մասնիկների և լիգանդին կապված սիլիցիումի մասնիկների մասնիկների չափի բաշխումը (A) և ծակոտիների չափի բաշխումը (B):
Ընթացիկ ուսումնասիրության մեջ ներառված սիլիցիումի մասնիկների ծակոտիների չափը, ծակոտիների ծավալը և մակերեսի մակերեսը ներկայացված են աղյուսակ 1(B)-ում: Մերկ սիլիցիումի մասնիկների և լիգանդ-կապված սիլիցիումի մասնիկների PSD պրոֆիլները ներկայացված են նկար 3(B)-ում: Արդյունքները համեմատելի են մեր նախորդ ուսումնասիրության հետ: Մերկ և լիգանդ-կապված սիլիցիումի մասնիկների ծակոտիների չափերը համապատասխանաբար 310 և 241 են, ինչը ցույց է տալիս, որ քիմիական մոդիֆիկացիայից հետո ծակոտիների չափը նվազում է 69-ով, ինչպես ցույց է տրված աղյուսակ 1(B)-ում, իսկ կորի փոփոխությունը ցույց է տրված նկար 3(B)-ում: Նմանապես, սիլիցիումի մասնիկների ծակոտիների ծավալը քիմիական մոդիֆիկացիայից հետո նվազել է 0.67-ից մինչև 0.58 սմ3/գ: Ներկայումս ուսումնասիրվող սիլիցիումի մասնիկների տեսակարար մակերեսը կազմում է 116 մ2/գ, որը համեմատելի է մեր նախորդ ուսումնասիրության հետ (124 մ2/գ): Ինչպես ցույց է տրված աղյուսակ 1(B)-ում, սիլիցիումի մասնիկների մակերեսի մակերեսը (մ2/գ) նույնպես նվազել է 116 մ2/գ-ից մինչև 105 մ2/գ: քիմիական փոփոխություն։
Ստացիոնար փուլի տարրական վերլուծության արդյունքները ներկայացված են աղյուսակ 2-ում: Ներկայիս ստացիոնար փուլի ածխածնային բեռնվածքը կազմում է 6.35%, որը ցածր է մեր նախորդ ուսումնասիրության ածխածնային բեռնվածքից (պոլիստիրոլային կապված սիլիցիումի մասնիկներ՝ համապատասխանաբար 7.93%35 և 10.21%): Ներկայիս ստացիոնար փուլի ածխածնային բեռնվածքը ցածր է, քանի որ ներկայիս SP-ի պատրաստման մեջ, ստիրոլից բացի, օգտագործվել են նաև որոշ բևեռային լիգանդներ, ինչպիսիք են ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլվինիլիզոցիանատը (PCMP) և 4-հիդրօքսի-TEMPO-ն: Ներկայիս ստացիոնար փուլի ազոտի քաշային տոկոսը կազմում է 2.21%, նախորդ ուսումնասիրություններում ազոտի համապատասխանաբար 0.1735 և 0.85% քաշային հարաբերակցության համեմատ: Սա նշանակում է, որ ազոտի քաշային տոկոսը ներկայիս ստացիոնար փուլում ավելի բարձր է ֆենիլմալեյմիդի պատճառով: Նմանապես, (4) և (5) արգասիքների ածխածնային բեռնվածքը կազմել է համապատասխանաբար 2.7% և 2.9%, մինչդեռ վերջնական արգասիքի ածխածնային բեռնվածքը... (6)-ը կազմել է 6.35%, ինչպես ցույց է տրված աղյուսակ 2-ում: Քաշի կորուստը ստուգվել է PMP ստացիոնար փուլով, և TGA կորը ցույց է տրված նկար 4-ում: TGA կորը ցույց է տալիս 8.6% քաշի կորուստ, որը լավ համապատասխանում է ածխածնի բեռնվածությանը (6.35%), քանի որ լիգանդները պարունակում են ոչ միայն C, այլև N, O և H:
Ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլվինիլիզոցիանատ լիգանդը ընտրվել է սիլիցիումի մասնիկների մակերեսային մոդիֆիկացիայի համար, քանի որ այն ունի բևեռային ֆենիլմալեյմիդային խմբեր և վինիլիզոցիանատային խմբեր: Վինիլիզոցիանատային խմբերը կարող են հետագայում ռեակցիայի մեջ մտնել ստիրոլի հետ՝ կենդանի ռադիկալ պոլիմերացման միջոցով: Երկրորդ պատճառն այն է, որ ներմուծվի մի խումբ, որը չափավոր փոխազդեցություն ունի անալիտի հետ և ուժեղ էլեկտրաստատիկ փոխազդեցություն չունի անալիտի և ստացիոնար փուլի միջև, քանի որ ֆենիլմալեյմիդի մասը նորմալ pH-ի դեպքում գործնական լիցք չունի: Ստացիոնար փուլի բևեռականությունը կարող է կարգավորվել ստիրոլի օպտիմալ քանակով և ազատ ռադիկալ պոլիմերացման ռեակցիայի ժամանակով: Ռեակցիայի վերջին քայլը (ազատ ռադիկալ պոլիմերացում) կարևոր է և կարող է փոխել ստացիոնար փուլի բևեռականությունը: Այս ստացիոնար փուլերի ածխածնային բեռնվածությունը ստուգելու համար կատարվել է տարրական վերլուծություն: Նկատվել է, որ ստիրոլի քանակի և ռեակցիայի ժամանակի ավելացումը մեծացնում է ստացիոնար փուլի ածխածնային բեռնվածությունը և հակառակը: Ստիրոլի տարբեր կոնցենտրացիաներով պատրաստված SP-ները ունեն տարբեր ածխածնային բեռնվածություններ: Կրկին, այս ստացիոնար փուլերը բեռնեք չժանգոտվող պողպատե սյուների մեջ և ստուգեք դրանց քրոմատոգրաֆիկական արդյունքները: կատարողականություն (ընտրողականություն, լուծաչափ, N արժեք և այլն): Այս փորձերի հիման վրա ընտրվել է օպտիմիզացված բանաձև՝ PMP ստացիոնար փուլը պատրաստելու համար՝ վերահսկվող բևեռականություն և անալիտի լավ պահպանում ապահովելու համար:
Հինգ պեպտիդային խառնուրդներ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, լեյցին էնկեֆալին) նույնպես գնահատվել են շարժական փուլ օգտագործող PMP սյունակի միջոցով։ 60/40 (v/v) ացետոնիտրիլ/ջուր (0.1% TFA) 80 մկլ/րոպե հոսքի արագությամբ։ Օպտիմալ էլյուցիայի պայմաններում, սյան մեջ տեսական թիթեղների քանակը (N) (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) կազմում է 20,000 ± 100 (200,000 թիթեղ/մ²)։ Աղյուսակ 3-ում ներկայացված են երեք PMP սյուների N արժեքները, իսկ քրոմատոգրամները ներկայացված են նկար 5Ա-ում։ PMP սյան վրա բարձր հոսքի արագությամբ (700 մկլ/րոպե) արագ վերլուծություն, հինգ պեպտիդներ էլուացվել են մեկ րոպեի ընթացքում, N արժեքները շատ լավ էին՝ 13,500 ± 330 սյան մեջ (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ), համապատասխանում է 135,000 թիթեղ/մ² (Նկար 5Բ)։ Երեք նույնական չափի սյուներ (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) լցվել են PMP ստացիոնար փուլի երեք տարբեր խմբաքանակներով՝ վերարտադրելիությունը ստուգելու համար։ Յուրաքանչյուր սյան համար անալիտի կոնցենտրացիան գրանցվել է օպտիմալ էլյուցիայի պայմանների և տեսական թիթեղների քանակի (N) և պահման ժամանակի միջոցով՝ յուրաքանչյուր սյան վրա նույն փորձարկման խառնուրդը առանձնացնելու համար: PMP սյուների վերարտադրելիության տվյալները ներկայացված են աղյուսակ 4-ում: PMP սյան վերարտադրելիությունը լավ համընկնում է շատ ցածր %RSD արժեքների հետ, ինչպես ցույց է տրված աղյուսակ 3-ում:
Պեպտիդային խառնուրդի բաժանումը PMP սյունակում (B) և Ascentis Express RP-Ամիդ սյունակում (A); շարժուն փուլ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP սյունակի չափսեր (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ); վերլուծական։ Միացությունների էլյուցիայի կարգը՝ 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) և 5 (լեյցին) թթու էնկեֆալին)։
Բարձր արդյունավետությամբ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի միջոցով մարդու շիճուկային ալբումինի տրիպտիկ մարսվածքների բաժանման համար գնահատվել է PMP սյունը (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ): Նկար 6-ում ներկայացված քրոմատոգրամը ցույց է տալիս, որ նմուշը լավ է բաժանված, և լուծաչափը շատ լավ է: HSA մարսվածքները վերլուծվել են 100 մկլ/րոպե հոսքի արագությամբ, շարժուն փուլ 70/30 ացետոնիտրիլ/ջուր և 0.1% TFA լուծույթով: Ինչպես ցույց է տրված քրոմատոգրամում (Նկար 6), HSA մարսումը բաժանվել է 17 պեպտիդի համապատասխանող 17 գագաթների: HSA մարսողության մեջ յուրաքանչյուր գագաթի բաժանման արդյունավետությունը հաշվարկվել է, և արժեքները տրված են աղյուսակ 5-ում:
HSA-ի տրիպսինային մարսողությունը (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) բաժանվել է PMP սյան վրա. հոսքի արագությունը (100 մկլ/րոպե), շարժուն փուլը՝ 60/40 ացետոնիտրիլ/ջուր՝ 0.1% TFA-ով։
որտեղ L-ը սյան երկարությունն է, η-ն՝ շարժական փուլի մածուցիկությունը, ΔP-ն՝ սյան հետադարձ ճնշումը, իսկ u-ն՝ շարժական փուլի գծային արագությունը։ PMP սյան թափանցելիությունը կազմել է 2.5 × 10-14 մ2, հոսքի արագությունը՝ 25 մկլ/րոպե, և օգտագործվել է 60/40 v/v ACN/ջուր։ PMP սյան թափանցելիությունը (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) նման էր մեր նախորդ ուսումնասիրության՝ Ref.34-ի թափանցելիությանը։ Մակերեսային ծակոտկեն մասնիկներով լցված սյան թափանցելիությունը կազմում է՝ 1.7 × 10-15՝ 1.3 մկմ մասնիկների համար, 3.1 × 10-15՝ 1.7 մկմ մասնիկների համար, 5.2 × 10-15 և 2.5 × 10-14 մ2՝ 2.6 մկմ մասնիկների համար՝ 5 մկմ մասնիկների համար 43։ Հետևաբար, PMP փուլի թափանցելիությունը նման է 5 մկմ միջուկ-շերտ մասնիկների թափանցելիությանը։
որտեղ Wx-ը քլորոֆորմով լցված սյան քաշն է, Wy-ը՝ մեթանոլով լցված սյան քաշը, իսկ ρ-ն՝ լուծիչի խտությունը։ Մեթանոլի (ρ = 0.7866) և քլորոֆորմի (ρ = 1.484) խտությունները։ Մեր կողմից նախկինում ուսումնասիրված SILICA PARTICLES-C18 սյուների (100 × 1.8 մմ id) 34 և C18-Urea սյուների 31 ընդհանուր ծակոտկենությունը համապատասխանաբար 0.63 և 0.55 էր։ Սա նշանակում է, որ միզանյութի լիգանդների առկայությունը նվազեցնում է ստացիոնար փուլի թափանցելիությունը։ Մյուս կողմից, PMP սյան ընդհանուր ծակոտկենությունը (100 × 1.8 մմ id) 0.60 է։ PMP սյուների թափանցելիությունն ավելի ցածր է, քան C18-կապված սիլիկայի մասնիկներով լցված սյուներինը, քանի որ C18 տիպի ստացիոնար փուլերում C18 լիգանդները միացված են սիլիկայի մասնիկներին որպես գծային շղթաներ, մինչդեռ պոլիստիրոլ տիպի ստացիոնար փուլերում ձևավորվում է համեմատաբար հաստ պոլիմերային շերտ։ դրա շուրջը։ Տիպիկ փորձի ժամանակ սյունակի ծակոտկենությունը հաշվարկվում է հետևյալ կերպ՝
Նկար 7A, B-ն ցույց է տալիս PMP սյունը (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) և Ascentis Express RP-Amide սյունը (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ)՝ օգտագործելով վան Դեմտերի գրաֆիկի նույն էլյուցիայի պայմանները (այսինքն՝ 60/40 ACN/H2O և 0.1% TFA): Ընտրված պեպտիդային խառնուրդները (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, լեյցին էնկեֆալին) պատրաստվել են 20 մկլ-ում: Երկու սյուների համար էլ նվազագույն հոսքի արագությունը 800 մկլ/րոպե է: PMP սյան և Ascentis Express RP-Amide սյան համար օպտիմալ հոսքի արագության (80 մկլ/րոպե) դեպքում HETP-ի նվազագույն արժեքները համապատասխանաբար 2.6 մկմ և 3.9 մկմ էին: HETP արժեքները ցույց են տալիս, որ PMP սյան բաժանման արդյունավետությունը (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) շատ ավելի լավ է, քան առևտրային առումով մատչելի Ascentis Express RP-Amide սյան (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ): Նկար 7(A)-ում վան Դեմտերի գրաֆիկը ցույց է տալիս, որ հոսքի աճին զուգընթաց N արժեքի նվազումը նշանակալի չէ մեր նախորդ ուսումնասիրության համեմատ: PMP սյան ավելի բարձր բաժանման արդյունավետությունը (100 × 1.8 մմ id)-ը Ascentis Express RP-Amide սյան հետ համեմատած հիմնված է մասնիկների ձևի, չափի և ներկայիս աշխատանքում օգտագործվող բարդ սյունակային փաթեթավորման ընթացակարգերի բարելավումների վրա34:
(A) Վան Դիմտերի գրաֆիկը (HETP ընդդեմ շարժական փուլի գծային արագության), որը ստացվել է PMP սյունակի (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) միջոցով 60/40 ACN/H2O-ում՝ 0.1% TFA-ով։ (B) Վան Դիմտերի գրաֆիկը (HETP ընդդեմ շարժական փուլի գծային արագության), որը ստացվել է Ascentis Express RP-Amide սյունակի (100 × 1.8 մմ ներքին տրամագիծ) միջոցով 60/40 ACN/H2O-ում՝ 0.1% TFA-ով։
Բևեռային ներդրված պոլիստիրոլային ստացիոնար փուլը պատրաստվել և գնահատվել է մարդու շիճուկային ալբումինի (HAS) սինթետիկ պեպտիդային խառնուրդների և տրիպսինային մարսողությունների բաժանման համար բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիայում: Պեպտիդային խառնուրդների համար նախատեսված PMP սյուների քրոմատոգրաֆիկ կատարողականությունը գերազանց է բաժանման արդյունավետության և լուծաչափի առումով: PMP սյուների բարելավված բաժանման կատարողականությունը պայմանավորված է մի շարք պատճառներով, ինչպիսիք են սիլիցիումի մասնիկների մասնիկների չափը և ծակոտիների չափը, ստացիոնար փուլի վերահսկվող սինթեզը և բարդ սյունակի փաթեթավորումը: Բարձր բաժանման արդյունավետությունից բացի, բարձր հոսքի արագությունների դեպքում սյունակի ցածր հետադարձ ճնշումը այս ստացիոնար փուլի մեկ այլ առավելություն է: PMP սյուները ցուցաբերում են լավ վերարտադրելիություն և կարող են օգտագործվել տարբեր սպիտակուցների պեպտիդային խառնուրդների և տրիպսինային մարսողության վերլուծության համար: Մենք մտադիր ենք օգտագործել այս սյունը բնական արտադրանքի, բուժիչ բույսերից կենսաակտիվ միացությունների և սնկային քաղվածքների բաժանման համար հեղուկ քրոմատոգրաֆիայում: Ապագայում PMP սյուները կգնահատվեն նաև սպիտակուցների և մոնոկլոնալ հակամարմինների բաժանման համար:
Ֆիլդ, Ջ.Կ., Էուերբի, Մ.Ռ., Լաու, Ջ., Թյոգերսեն, Հ. և Պետերսոն, Պ. Պեպտիդների բաժանման համակարգերի հետազոտություն հակադարձ փուլային քրոմատոգրաֆիայի միջոցով։ Մաս I. Սյունակի բնութագրման արձանագրության մշակում։ J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019)։
Գոմես, Բ. և այլք։ Վարակիչ հիվանդությունների բուժման համար նախատեսված բարելավված ակտիվ պեպտիդներ։ Կենսատեխնոլոգիա։ Առաջադեմ։ 36(2), 415-429։ https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018)։
Վլիեգե, Պ., Լիսովսկի, Վ., Մարտինես, Ջ. և Խրեստչատիսկի, Մ. Սինթետիկ թերապևտիկ պեպտիդներ. գիտություն և շուկա։ Դեղերի հայտնաբերում։ 15 (1-2) այսօր, 40-56։ https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010)։
Շիե, Ֆ., Սմիթ, ՌԴ և Շեն, Յ. Առաջադեմ պրոտեոմիկ հեղուկ քրոմատոգրաֆիա։ J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012)։
Լյու, Վ. և այլք։ Առաջադեմ հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-զանգվածային սպեկտրոմետրիան հնարավորություն է տալիս ներառել լայնորեն թիրախային մետաբոլոմիկա և պրոտեոմիկա։ anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019)։
Չեսնատ, ՍՄ և Սալիսբերի, ՋՋ։ UHPLC-ի դերը դեղերի մշակման գործում։ J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007)։
Վու, Ն. և Կլաուսեն, Ա.Մ. Արագ բաժանման համար գերբարձր ճնշման հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի հիմնարար և գործնական ասպեկտները: J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007):
Վրեն, Ս.Ա. և Չելիչեֆ, Պ. Գերբարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի կիրառումը դեղերի մշակման մեջ: J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006):
Գու, Հ. և այլք։ Մոնոլիտ մակրոպորոզ հիդրոգելներ, որոնք պատրաստված են յուղ-ջուր բարձր ներքին ֆազային էմուլսիաներից՝ էնտերովիրուսների արդյունավետ մաքրման համար։ Քեմիկալ։ Բրիտանական։ Ջ. 401, 126051 (2020)։
Շի, Յ., Շիանգ, Ռ., Հորվաթ, Ք. և Ուիլկինս, Ջ.Ա. Հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի դերը պրոտեոմիկայի մեջ։ J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004)։
Ֆեկետե, Ս., Վյութեյ, Ժ.-Լ. և Գիլյարմե, Դ. Բուժական պեպտիդների և սպիտակուցների հակադարձ փուլային հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի բաժանման ի հայտ եկող միտումները. տեսություն և կիրառություններ: J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012):
Գիլար, Մ., Օլիվովա, Պ., Դեյլի, Ա.Ե. և Գեբլեր, Ջ.Ս. Պեպտիդների երկչափ բաժանում RP-RP-HPLC համակարգի միջոցով՝ օգտագործելով pH-ի տարբեր արժեքներ առաջին և երկրորդ բաժանման չափումներում: J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005):
Ֆելետի, Ս. և այլք։ Հետազոտվել են C18 ենթա-2 մկմ լրիվ և մակերեսային ծակոտկեն մասնիկներով լցված բարձր արդյունավետ քրոմատոգրաֆիկ սյուների զանգվածի փոխանցման բնութագրերը և կինետիկ կատարողականությունը։ J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020)։
Պիովեսանա, Ս. և այլք։ Բույսերի կենսաակտիվ պեպտիդների մեկուսացման, նույնականացման և վավերացման վերջին միտումները և վերլուծական մարտահրավերները։ anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018)։
Մյուլլեր, Ջ.Բ. և այլք։ Կյանքի թագավորության պրոտեոմիկ լանդշաֆտը։ Nature 582(7813), 592-596։ https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020)։
ԴեԼուկա, Ս. և այլք։ Թերապևտիկ պեպտիդների մշակում նախապատրաստական ​​հեղուկային քրոմատոգրաֆիայի միջոցով։ Molecule (Բազել, Շվեյցարիա) 26(15), 4688(2021)։
Յանգ, Յ. և Գենգ, Շ. Խառը ռեժիմային քրոմատոգրաֆիա և դրա կիրառումը կենսապոլիմերների վրա: J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011):
Չժաո, Գ., Դոնգ, Շ.-Յ. և Սան, Յ. Լիգանդներ խառը ռեժիմի սպիտակուցային քրոմատոգրաֆիայի համար. սկզբունք, բնութագրում և նախագծում: J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009):