Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS dəstəyi məhduddur. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
Məsaməli silisium hissəcikləri makroməsaməli hissəciklər əldə etmək üçün bəzi modifikasiyalarla sol-gel üsulu ilə hazırlanmışdır. Bu hissəciklər polistirolun (PMP) stasionar fazasının N-fenilmaleimid interkalasiyasını hazırlamaq üçün N-fenilmaleimid (PMI) və stirol ilə geri çevrilə bilən əlavə parçalanma zəncirinin ötürülməsi (RAFT) polimerləşməsi yolu ilə törəmələşdirilmişdir. Dar diametrli paslanmayan polad sütunlar (100 × 1.8 mm id) şlam qablaşdırması ilə qablaşdırılmışdır. Beş peptiddən (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) xromatoqrafik performansı) və insan serum albumininin (HAS) tripsin həzmindən ibarət peptid qarışığının PMP sütun ayrılması qiymətləndirilmişdir. Optimal elüsiya şəraitində peptid qarışığının nəzəri lövhə sayı 280.000 lövhə/m²-ə qədər yüksəkdir. İnkişaf etmiş hissəciklərin ayrılma performansının müqayisəsi kommersiya Ascentis Express RP-Amide sütunu ilə sütun arasında aparılan araşdırmada, PMP sütununun ayrılma performansının ayrılma səmərəliliyi və qətnamə baxımından kommersiya sütunundan daha üstün olduğu müşahidə edildi.
Son illərdə biofarmasevtika sənayesi bazar payının əhəmiyyətli dərəcədə artması ilə genişlənən qlobal bazara çevrilib. Biofarmasevtika sənayesinin partlayıcı böyüməsi ilə1,2,3 peptidlərin və zülalların təhlili çox arzuolunandır. Hədəf peptiddən əlavə, peptid sintezi zamanı bir neçə çirk əmələ gəlir və bu da istənilən təmizliyə malik peptidləri əldə etmək üçün xromatoqrafik təmizləmə tələb edir. Bədən mayelərində, toxumalarında və hüceyrələrində zülalların təhlili və xarakteristikası tək bir nümunədə potensial olaraq aşkar edilə bilən növlərin çox olması səbəbindən olduqca çətin bir işdir. Kütlə spektrometriyası peptid və zülal ardıcıllığı üçün təsirli bir vasitə olsa da, bu cür nümunələr kütlə spektrometrinə bir keçiddə yeridilərsə, ayrılma ideal olmayacaq. Bu problem, MS analizindən əvvəl maye xromatoqrafiyası (LC) ayrılmalarını tətbiq etməklə azaldıla bilər ki, bu da müəyyən bir zamanda kütlə spektrometrinə daxil olan analitlərin sayını azaldacaq4,5,6. Bundan əlavə, maye fazasının ayrılması zamanı analitlər dar bölgələrə fokuslana bilər və bununla da bu analitləri cəmləşdirə və MS aşkarlama həssaslığını artıra bilər. Maye Xromatoqrafiya (XX) son on ildə əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etmiş və proteomik analizdə məşhur bir texnikaya çevrilmişdir7,8,9,10.
Tərs fazalı maye xromatoqrafiyası (RP-LC), stasionar faza kimi oktadesil modifikasiya olunmuş silisiumdan (ODS) istifadə edərək peptid qarışıqlarının təmizlənməsi və ayrılması üçün geniş istifadə olunur11,12,13. Lakin, RP stasionar fazaları mürəkkəb quruluşu və amfifil təbiətinə görə peptidlərin və zülalların qənaətbəxş ayrılmasını təmin etmir14,15. Buna görə də, bu analitlərlə qarşılıqlı təsir göstərmək və saxlamaq üçün polyar və qeyri-polyar hissələrə malik peptidləri və zülalları təhlil etmək üçün xüsusi hazırlanmış stasionar fazalar tələb olunur16. Multimodal qarşılıqlı təsirlər təmin edən qarışıq rejimli xromatoqrafiya, peptidlərin, zülalların və digər mürəkkəb qarışıqların ayrılması üçün RP-LC-yə alternativ ola bilər. Bir neçə qarışıq rejimli stasionar faza hazırlanmış və bu fazalarla dolu sütunlar peptid və zülal ayrılması üçün istifadə edilmişdir17,18,19,20,21. Qarışıq rejimli stasionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polyar interkalasiya/RPLC) peptid və zülal üçün uyğundur. həm qütb, həm də qeyri-qütb qruplarının mövcudluğu səbəbindən ayrılmalar22,23,24,25,26,27,28. Eynilə, kovalent şəkildə əlaqəli qütb qrupları olan qütb interkalyasiya edən stasionar fazalar qütb və qeyri-qütb analitləri üçün yaxşı ayrılma gücü və unikal selektivlik göstərir, çünki ayrılma analit və stasionar faza arasındakı qarşılıqlı təsirdən asılıdır. Multimodal qarşılıqlı təsirlər29, 30, 31, 32. Bu yaxınlarda Zhang və başqaları. 30 dodesil ilə terminallaşdırılmış poliamin stasionar fazası hazırladı və karbohidrogenləri, antidepresanları, flavonoidləri, nukleozidləri, estrogenləri və bir neçə digər analitləri uğurla ayırdı. Qütb interkalatorunun həm qütb, həm də qeyri-qütb qrupları var, buna görə də həm hidrofob, həm də hidrofil hissələrə malik peptidləri və zülalları ayırmaq üçün istifadə edilə bilər. Qütblü sütunlar (məsələn, amidlə yerləşdirilmiş C18 sütunları) Ascentis Express RP-Amide sütunları ticarət adı altında kommersiya məqsədləri üçün mövcuddur, lakin bu sütunlar yalnız amin 33-ün təhlili üçün istifadə olunur.
Hazırkı tədqiqatda, HSA-nın peptidləri və tripsin həzmlərinin ayrılması üçün qütblü stasionar faza (N-fenilmaleimidlə stasionar polistirol) hazırlanmış və qiymətləndirilmişdir. Stasionar faza aşağıdakı strategiyadan istifadə etməklə hazırlanmışdır. Məsaməli silisium hissəcikləri hazırlama protokolunda bəzi dəyişikliklər edilməklə əvvəlki nəşrimizdə verilmiş prosedura uyğun olaraq hazırlanmışdır. Böyük məsamə ölçüsünə malik silisium hissəciklərini hazırlamaq üçün karbamid, polietilen qlikol (PEG), TMOS, su sirkə turşusunun nisbəti tənzimlənmişdir. İkincisi, yeni bir ligand, fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat sintez edilmiş və qütblü stasionar faza hazırlamaq üçün silisium hissəciklərini törəmələşdirmək üçün istifadə edilmişdir. Nəticədə yaranan stasionar faza optimallaşdırılmış qablaşdırma sxemindən istifadə edərək paslanmayan polad sütuna (100 × 1,8 mm id) qablaşdırılmışdır. Sütunun içərisində homojen bir təbəqənin əmələ gəlməsini təmin etmək üçün sütunun qablaşdırılmasına mexaniki vibrasiya kömək edir. Beş peptiddən ibarət peptid qarışıqlarının qablaşdırılmış sütun ayrılmasını qiymətləndirin; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) və insan serum albumininin (HAS) Tripsin həzmi. HSA-nın peptid qarışığı və tripsin həzminin yaxşı qətnamə və səmərəliliklə ayrıldığı müşahidə edildi. PMP sütununun ayrılma performansı Ascentis Express RP-Amide sütununun göstəricisi ilə müqayisə edildi. Həm peptidlərin, həm də zülalların PMP sütununda yaxşı həll olunduğu və səmərəli olduğu müşahidə edildi ki, bu da Ascentis Express RP-Amide sütunundan daha səmərəli idi.
PEG (Polietilen Qlikol), Karbamid, Sirkə Turşusu, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Xlorosilan (TMCS), Tripsin, İnsan Serum Albumini (HSA), Ammonium Xlorid, Karbamid, Heksan Metildisilazan (HMDS), Metakriloil Xlorid (MC), Stirol, 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoil Peroksid (BPO), HPLC Dərəcəli Asetonitril (ACN), Metanol, 2-Propanol və Aseton Sigma-Aldrich-dən (Sent-Luis, MO, ABŞ) alınıb.
Karbamid (8 q), polietilen qlikol (8 q) və 8 ml 0,01 N sirkə turşusu qarışığı 10 dəqiqə qarışdırıldı və sonra buz kimi soyuq şəraitdə üzərinə 24 ml TMOS əlavə edildi. Reaksiya qarışığı paslanmayan polad avtoklavda 40°C-də 6 saat, sonra isə 120°C-də 8 saat qızdırıldı. Su töküldü və qalıq material 70°C-də 12 saat quruduldu. Qurudulmuş yumşaq kütlə sobada hamar üyüdüldü və 550°C-də 12 saat kalsine edildi. Hissəcik ölçüsü, məsamə ölçüsü və səth sahəsi üzrə təkrarlanma qabiliyyətini yoxlamaq üçün üç partiya hazırlandı və xarakterizə edildi.
Silisium hissəciklərinin əvvəlcədən sintez edilmiş ligand fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) ilə səthi modifikasiyası və ardından stirol ilə radial polimerləşmə yolu ilə qütb qrupu tərkibli birləşmə hazırlanmışdır. Aqreqatlar və polistirol zəncirləri üçün stasionar faza. Hazırlama prosesi aşağıda təsvir edilmişdir.
N-fenilmaleimid (200 mq) və metil vinil izosiyanat (100 mq) quru toluolda həll edildi və fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat kopolimerini (PMCP) hazırlamaq üçün reaksiya kolbasına 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) əlavə edildi. Qarışıq 60°C-də 3 saat qızdırıldı, süzüldü və 40°C-də sobada 3 saat quruduldu.
Qurudulmuş silisium hissəcikləri (2 q) quru toluolda (100 ml) dispersiya edilmiş, qarışdırılmış və 500 ml dairəvi dibli kolbada 10 dəqiqə ərzində ultrasəslə işlənmişdir. PMCP (10 mq) toluolda həll edilmiş və damcılatma huni vasitəsilə reaksiya kolbasına damcı şəklində əlavə edilmişdir. Qarışıq 100°C-də 8 saat ərzində reflüks edilmiş, süzülmüş və asetonla yuyulmuş və 60°C-də 3 saat ərzində qurudulmuşdur. Daha sonra PMCP ilə əlaqəli silisium hissəcikləri (100 q) toluolda (200 ml) həll edilmiş və katalizator kimi 100 µL dibutiltin dilauratın iştirakı ilə 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) əlavə edilmişdir. Qarışıq 50°C-də 8 saat ərzində qarışdırılmış, süzülmüş və 50°C-də 3 saat ərzində qurudulmuşdur.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) və TEMPO-PMCP ilə birləşdirilmiş silisium hissəcikləri (1,5 q) toluolda dispersləşdirildi və azotla təmizləndi. Stirolun polimerləşməsi 100°C-də 12 saat ərzində aparıldı. Nəticədə alınan məhsul metanol ilə yuyuldu və 60°C-də bir gecədə quruduldu. Ümumi reaksiya sxemi Şəkil 1-də göstərilmişdir.
Nümunələr 10-3 Torr-dan az qalıq təzyiq əldə etmək üçün 393 K-də 1 saat ərzində qazsızlaşdırıldı. Ümumi məsamə həcmini təyin etmək üçün P/P0 = 0.99 nisbi təzyiqdə adsorbsiya olunmuş N2 miqdarından istifadə edildi. Çılpaq və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin morfologiyası skanedici elektron mikroskopiyası (Hitachi High Technologies, Tokio, Yaponiya) ilə araşdırıldı. Qurudulmuş nümunələr (çılpaq silisium və ligandla əlaqəli silisium hissəcikləri) yapışqan karbon lent istifadə edərək alüminium sütuna yerləşdirildi. Nümunələrin üzərinə Q150T püskürtmə örtüyü istifadə edərək qızıl çəkildi və nümunələrin üzərinə 5 nm Au təbəqəsi çəkildi. Bu, aşağı gərginliklərdən istifadə edərək prosesin səmərəliliyini artırır və incə dənəli, soyuq püskürtmə təmin edir. Element analizi üçün Thermo Electron (Waltham, MA, ABŞ) Flash EA1112 element analizatoru istifadə edildi. Zərrəcik ölçüsünü əldə etmək üçün Malvern (Worcestershire, Böyük Britaniya) Mastersizer 2000 hissəcik ölçüsü analizatoru istifadə edildi. paylanması. Çılpaq silisium hissəcikləri və ligandla əlaqəli silisium hissəcikləri (hər biri 5 mq) 5 ml izopropanolda dispersiya edilmiş, 10 dəqiqə ultrasəslə işlənmiş, 5 dəqiqə vorteks edilmiş və Mastersizer-in optik tezgahına yerləşdirilmişdir. Termoqravimetrik analiz 30 ilə 800 °C arasında temperatur diapazonunda dəqiqədə 5 °C sürətlə aparılmışdır.
Ölçüləri (100 × 1.8 mm id) olan şüşə ilə örtülmüş paslanmayan poladdan dar diametrli sütunlar, İstinadda istifadə edilən eyni prosedur tətbiq edilərək, şlamla qablaşdırma üsulu ilə qablaşdırıldı. 31. 1 µm frit ehtiva edən çıxış armaturu olan paslanmayan polad sütun (şüşə ilə örtülmüş, 100 × 1.8 mm id) şlam qablaşdırıcıya (Alltech Deerfield, IL, ABŞ) qoşulmuşdur. 1,2 ml metanola 150 mq stasionar faza əlavə edərək stasionar fazalı şlam hazırlayın və saxlama sütununa göndərin. Metanol şlam həlledicisi və itələyici həlledici kimi istifadə edilmişdir. Sütunu ardıcıl olaraq 10 dəqiqə 100 MP, 15 dəqiqə 80 MP və 30 dəqiqə 60 MP təzyiq tətbiq edərək doldurun. Qablaşdırma zamanı sütunun vahid qablaşdırılmasını təmin etmək üçün iki GC sütunu silkələyicisi (Alltech, Deerfield, IL, ABŞ) ilə mexaniki vibrasiya tətbiq edilmişdir. Şlam qablaşdırıcısını bağlayın və sütun daxilində hər hansı bir zədələnmənin qarşısını almaq üçün təzyiqi yavaşca buraxın. Sütunu şlam qablaşdırma qurğusundan ayırın və başqa bir armaturu girişə və LC sisteminə qoşun. performansını yoxlamaq üçün.
LC nasosu (10AD Shimadzu, Yaponiya), 50nL inyeksiya ilgəyi olan injektor (Valco (ABŞ) C14 W.05), membran deqazatoru (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilyar pəncərəsi quruldu. Xüsusi µLC cihaz detektoru (UV-2075) və şüşə ilə örtülmüş mikrosütunlar. Əlavə sütun zolağının genişlənməsinin təsirini minimuma endirmək üçün çox dar və qısa birləşdirici borulardan istifadə edin. Qablaşdırmadan sonra, reduksiya birləşməsi 1/16 düymlük çıxışına kapilyarlar (50 μm id 365 və reduksiya birləşməsi kapilyarları (50 μm) quraşdırıldı. Məlumatların toplanması və xromatoqrafik emal Multichro 2000 proqram təminatı istifadə edilərək aparıldı. 254 nm-də monitorinq Analitlər UB udma qabiliyyəti üçün sınaqdan keçirildi. Xromatoqrafik məlumatlar OriginPro8 (Northampton, MA) tərəfindən təhlil edildi.
İnsan serumundan alınan albumin, liofilizasiya olunmuş toz, ≥ 96% (aqaroza gel elektroforez) 3 mq tripsin (1,5 mq), 4,0 M karbamid (1 ml) və 0,2 M ammonium bikarbonat (1 ml) ilə qarışdırılıb. Məhlul 10 dəqiqə qarışdırılıb və 37°C-də su hamamında 6 saat saxlanılıb, sonra 1 ml 0,1% TFA ilə söndürülüb. Məhlulu süzün və 4°C-dən aşağı temperaturda saxlayın.
Peptid qarışıqlarının və HSA tripsin həzmlərinin ayrılması PMP sütunlarında ayrıca qiymətləndirildi. PMP sütunu tərəfindən HSA-nın peptid qarışığının və tripsin həzminin ayrılmasını yoxlayın və nəticələri Ascentis Express RP-Amide sütunu ilə müqayisə edin. Nəzəri lövhə nömrəsi aşağıdakı kimi hesablanır:
Çılpaq silisium hissəciklərinin və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin SEM görüntüləri Şəkil 2-də göstərilmişdir. Çılpaq silisium hissəciklərinin SEM görüntüləri (A, B) göstərir ki, əvvəlki tədqiqatlarımızdan fərqli olaraq, bu hissəciklər sferikdir və hissəciklər uzanmış və ya nizamsız simmetriyaya malikdir. Ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin (C, D) səthi çılpaq silisium hissəciklərinin səthindən daha hamardır ki, bu da silisium hissəciklərinin səthində polistirol zəncirlərinin örtülməsi ilə bağlı ola bilər.
Çılpaq silisium hissəciklərinin (A, B) və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin (C, D) skanlama elektron mikroskopu görüntüləri.
Çılpaq silisium hissəciklərinin və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin hissəcik ölçüsü paylanması Şəkil 3(A)-da göstərilmişdir. Həcmə əsaslanan hissəcik ölçüsü paylanması əyriləri kimyəvi modifikasiyadan sonra silisium hissəciklərinin ölçüsünün artdığını göstərdi (Şəkil 3A). Cari tədqiqatdan və əvvəlki tədqiqatdan silisium hissəciklərinin hissəcik ölçüsü paylanması məlumatları Cədvəl 1(A)-da müqayisə edilir. PMP-nin həcmə əsaslanan hissəcik ölçüsü, d(0.5), əvvəlki tədqiqatımızla müqayisədə 3.36 μm-dir, ad(0.5) dəyəri 3.05 μm (polistirolla əlaqəli silisium hissəcikləri)34. Reaksiya qarışığındakı PEG, karbamid, TMOS və sirkə turşusunun müxtəlif nisbətlərinə görə bu partiya əvvəlki tədqiqatımızla müqayisədə daha dar hissəcik ölçüsü paylanmasına malik idi. PMP fazasının hissəcik ölçüsü əvvəllər araşdırdığımız polistirolla əlaqəli silisium hissəcik fazasının ölçüsündən bir qədər böyükdür. Bu o deməkdir ki, silisium hissəciklərinin stirolla səth funksionallaşması silisium səthində yalnız bir polistirol təbəqəsi (0.97 µm) yerləşdirmişdir, halbuki PMP fazasında... təbəqənin qalınlığı 1,38 µm idi.
Çılpaq silisium hissəciklərinin və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin hissəcik ölçüsü paylanması (A) və məsamə ölçüsü paylanması (B).
Mövcud tədqiqatın silisium hissəciklərinin məsamə ölçüsü, məsamə həcmi və səth sahəsi Cədvəl 1(B)-də verilmişdir. Çılpaq silisium hissəciklərinin və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin PSD profilləri Şəkil 3(B)-də göstərilmişdir. Nəticələr əvvəlki tədqiqatımızla müqayisə edilə bilər. Çılpaq və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin məsamə ölçüləri müvafiq olaraq 310 və 241-dir ki, bu da Cədvəl 1(B)-də göstərildiyi kimi kimyəvi modifikasiyadan sonra məsamə ölçüsünün 69 azaldığını göstərir və əyrinin dəyişməsi Şəkil 3(B)-də göstərilmişdir. Eynilə, silisium hissəciklərinin məsamə həcmi kimyəvi modifikasiyadan sonra 0,67-dən 0,58 sm3/q-a qədər azalmışdır. Hal-hazırda öyrənilən silisium hissəciklərinin xüsusi səth sahəsi 116 m2/q-dır ki, bu da əvvəlki tədqiqatımızla (124 m2/q) müqayisə edilə bilər. Cədvəl 1(B)-də göstərildiyi kimi, silisium hissəciklərinin səth sahəsi (m2/q) da 116 m2/q-dan 105-ə qədər azalmışdır. kimyəvi modifikasiyadan sonra m2/q.
Stasionar fazanın elementar analizinin nəticələri Cədvəl 2-də göstərilmişdir. Cari stasionar fazanın karbon yükü 6,35% təşkil edir ki, bu da əvvəlki tədqiqatımızın karbon yükündən (polistirolla əlaqəli silisium hissəcikləri, müvafiq olaraq 7,93%35 və 10,21%) daha aşağıdır 42. Cari stasionar fazanın karbon yükü azdır, çünki cari SP-nin hazırlanmasında stiroldan əlavə, fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) və 4-hidroksi-TEMPO kimi bəzi polyar ligandlar istifadə edilmişdir. Cari stasionar fazanın azot çəki faizi əvvəlki tədqiqatlarda müvafiq olaraq 0,1735 və 0,85 çəki azotu ilə müqayisədə 2,21% təşkil edir. Bu o deməkdir ki, azotun çəki faizi cari stasionar fazada fenilmaleimid səbəbindən daha yüksəkdir. Eynilə, (4) və (5) məhsulların karbon yükü müvafiq olaraq 2,7% və 2,9% təşkil etmişdir, son məhsulun karbon yükü isə (6) Cədvəl 2-də göstərildiyi kimi 6.35% təşkil etmişdir. Çəki itkisi PMP stasionar fazası ilə yoxlanılmış və TGA əyrisi Şəkil 4-də göstərilmişdir. TGA əyrisi 8.6% çəki itkisi göstərir ki, bu da karbon yükü (6.35%) ilə yaxşı uyğunluq təşkil edir, çünki ligandlar yalnız C deyil, həm də N, O və H ehtiva edir.
Fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat ligandi silisium hissəciklərinin səth modifikasiyası üçün seçilmişdir, çünki onun polyar fenilmaleimid qrupları və vinilizosiyanat qrupları var. Vinil izosiyanat qrupları canlı radikal polimerləşmə yolu ilə stirol ilə daha da reaksiyaya girə bilər. İkinci səbəb, analitlə orta dərəcədə qarşılıqlı təsir göstərən və analit ilə stasionar faza arasında güclü elektrostatik qarşılıqlı təsir olmayan bir qrup daxil etməkdir, çünki fenilmaleimid hissəsinin normal pH-da virtual yükü yoxdur. Stasionar fazanın polyarlığı optimal stirol miqdarı və sərbəst radikal polimerləşmənin reaksiya müddəti ilə idarə oluna bilər. Reaksiyanın son mərhələsi (sərbəst radikal polimerləşmə) vacibdir və stasionar fazanın polyarlığını dəyişdirə bilər. Bu stasionar fazaların karbon yükünü yoxlamaq üçün elementar analiz aparılmışdır. Stirol miqdarının və reaksiya müddətinin artırılmasının stasionar fazanın karbon yükünü artırdığı və əksinə müşahidə edilmişdir. Müxtəlif konsentrasiyalı stirol ilə hazırlanmış SP-lər fərqli karbon yüklərinə malikdir. Yenə də bu stasionar fazaları paslanmayan polad sütunlara yükləyin və yoxlayın. Xromatoqrafik göstəricilər (selektivlik, qətnamə, N dəyəri və s.). Bu təcrübələrə əsasən, nəzarət edilən polyarlığı və yaxşı analit saxlanmasını təmin etmək üçün PMP stasionar fazasını hazırlamaq üçün optimallaşdırılmış formulasiya seçilmişdir.
Beş peptid qarışığı (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) də mobil fazadan istifadə edərək PMP sütunu ilə qiymətləndirilmişdir; 80 μL/dəq axın sürətində 60/40 (h/h) asetonitril/su (0.1% TFA). Optimal elüsiya şəraitində, hər sütun üçün nəzəri lövhə sayı (N) (100 × 1.8 mm id) 20.000 ± 100 (200.000 lövhə/m²)-dir. Cədvəl 3-də üç PMP sütunu üçün N dəyərləri verilmişdir və xromatoqramlar Şəkil 5A-da göstərilmişdir. Yüksək axın sürətində (700 μL/dəq) PMP sütununda sürətli analiz, bir dəqiqə ərzində beş peptid elüsiya edildi, N dəyərləri çox yaxşı idi, hər sütun üçün 13.500 ± 330 (100 × 1.8 mm id), 135.000 lövhə/m²-yə uyğundur (Şəkil 5B). Yoxlamaq üçün üç eyni ölçülü sütun (100 × 1.8 mm id) üç fərqli PMP stasionar faza ilə dolduruldu. təkrar istehsal qabiliyyəti. Hər sütun üçün analit konsentrasiyası optimal elusiya şərtləri və nəzəri lövhələrin sayı N və hər sütunda eyni sınaq qarışığını ayırmaq üçün saxlama müddəti istifadə edilərək qeydə alınıb. PMP sütunları üçün təkrar istehsal məlumatları Cədvəl 4-də göstərilib. Cədvəl 3-də göstərildiyi kimi, PMP sütununun təkrar istehsal qabiliyyəti çox aşağı %RSD dəyərləri ilə yaxşı korrelyasiya edir.
Peptid qarışığının PMP sütununda (B) və Ascentis Express RP-Amide sütununda (A) ayrılması; mobil fazalı 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP sütun ölçüləri (100 × 1.8 mm id); analitik Birləşmələrin elusiya sırası: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) və 5 (lösin) turşusu enkefalin)).
Yüksək performanslı maye xromatoqrafiyasında insan serum albumininin triptik digestlərinin ayrılması üçün PMP sütunu (100 × 1.8 mm id) qiymətləndirilmişdir. Şəkil 6-dakı xromatoqram nümunənin yaxşı ayrıldığını və qətnamənin çox yaxşı olduğunu göstərir. HSA digestləri 100 µL/dəq axın sürəti, mobil fazalı 70/30 asetonitril/su və 0.1% TFA istifadə edilərək təhlil edilmişdir. Xromatoqramda (Şəkil 6) göstərildiyi kimi, HSA digestasiyası 17 peptidə uyğun gələn 17 pikə bölünmüşdür. HSA digestindəki hər bir pikin ayrılma səmərəliliyi hesablanmış və dəyərlər Cədvəl 5-də verilmişdir.
HSA-nın triptik digesti (100 × 1.8 mm id) PMP sütununda ayrılmışdır; axın sürəti (100 µL/dəq), mobil fazalı 60/40 asetonitril/su, 0.1% TFA ilə.
burada L sütunun uzunluğu, η mobil fazanın özlülüyü, ΔP sütunun geri təzyiqi və u mobil fazanın xətti sürətidir. PMP sütununun keçiriciliyi 2,5 × 10-14 m2, axın sürəti 25 μL/dəq və 60/40 v/v ACN/su istifadə edilmişdir. PMP sütununun keçiriciliyi (100 × 1,8 mm id) əvvəlki tədqiqatımızın İstinad 34-dəkinə bənzəyirdi. Səthi məsaməli hissəciklərlə dolu sütunun keçiriciliyi: 1,3 μm hissəciklər üçün 1,7 × 10-15, 1,7 μm hissəciklər üçün 3,1 × 10-15, 2,6 μm hissəciklər üçün 5,2 × 10-15 və 2,5 × 10-14 m2-dir. 5 μm hissəciklər üçün 43. Buna görə də, PMP fazasının keçiriciliyi 5 μm nüvə-qabığın keçiriciliyinə bənzəyir. hissəciklər.
burada Wx xloroformla doldurulmuş sütunun çəkisidir, Wy metanolla doldurulmuş sütunun çəkisidir və ρ həlledicinin sıxlığıdır. Metanolun (ρ = 0.7866) və xloroformun (ρ = 1.484) sıxlıqları. Əvvəllər araşdırdığımız SILICA HİSSƏCİKLƏRİ-C18 sütunlarının (100 × 1.8 mm id) 34 və C18-Urea sütunlarının 31 ümumi məsaməliliyi müvafiq olaraq 0.63 və 0.55 idi. Bu o deməkdir ki, karbamid ligandlarının olması stasionar fazanın keçiriciliyini azaldır. Digər tərəfdən, PMP sütununun ümumi məsaməliliyi (100 × 1.8 mm id) 0.60-dır. PMP sütunlarının keçiriciliyi C18 ilə əlaqəli silisium hissəcikləri ilə doldurulmuş sütunların keçiriciliyindən daha aşağıdır, çünki C18 tipli stasionar fazalarda C18 ligandları silisium hissəciklərinə xətti zəncirlər kimi birləşir, polistirol tipli stasionar fazalarda isə A nisbətən qalındır. ətrafında polimer təbəqəsi əmələ gəlir. Tipik bir təcrübədə sütunun məsaməliliyi aşağıdakı kimi hesablanır:
Şəkil 7A və B-də van Deemter qrafikinin eyni elusiya şərtlərindən (yəni, 60/40 ACN/H2O və 0,1% TFA) istifadə edərək PMP sütununun (100 × 1,8 mm id) və Ascentis Express RP-Amide sütununun (100 × 1,8 mm id) təsviri verilmişdir. Seçilmiş peptid qarışıqları (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL/də hazırlanmışdır. Hər iki sütun üçün minimum axın sürəti 800 µL/dəq-dir. PMP sütunu və Ascentis Express RP-Amide sütunu üçün optimal axın sürətində (80 µL/dəq) minimum HETP dəyərləri müvafiq olaraq 2,6 µm və 3,9 µm olmuşdur. HETP dəyərləri göstərir ki, PMP sütununun ayrılma səmərəliliyi (100 × 1,8 mm id) ticari olaraq mövcud olan Ascentis Express RP-Amide sütunundan (100 × 1,8 mm id) daha yaxşıdır. Şəkil 7(A)-dakı van Deemter qrafiki göstərir ki, axın artdıqca N dəyərinin azalması əvvəlki tədqiqatımızla müqayisədə əhəmiyyətli deyil. PMP sütununun (100 ×) daha yüksək ayrılma səmərəliliyi Ascentis Express RP-Amide sütunu ilə müqayisədə 1.8 mm id), hazırkı işdə istifadə edilən hissəciklərin forması, ölçüsü və mürəkkəb sütun qablaşdırma prosedurlarındakı təkmilləşdirmələrə əsaslanır34.
(A) 0.1% TFA ilə 60/40 ACN/H2O-da PMP sütunundan (100 × 1.8 mm id) istifadə edilərək əldə edilən van Deemter qrafiki (HETP və mobil faza xətti sürəti).(B) 0.1% TFA ilə 60/40 ACN/H2O-da Ascentis Express RP-Amide sütunundan (100 × 1.8 mm id) istifadə edilərək əldə edilən van Deemter qrafiki (HETP və mobil faza xətti sürəti).
Yüksək performanslı maye xromatoqrafiyasında sintetik peptid qarışıqlarının və insan serum albumininin (HAS) tripsin həzmlərinin ayrılması üçün polyarlaşdırılmış polistirol stasionar faza hazırlanmış və qiymətləndirilmişdir. Peptid qarışıqları üçün PMP sütunlarının xromatoqrafik göstəriciləri ayrılma səmərəliliyi və qətnamə baxımından əladır. PMP sütunlarının təkmilləşdirilmiş ayrılma göstəriciləri müxtəlif səbəblərdən, məsələn, silisium hissəciklərinin hissəcik ölçüsü və məsamə ölçüsü, stasionar fazanın nəzarətli sintezi və mürəkkəb sütun qablaşdırması ilə əlaqədardır. Yüksək ayrılma səmərəliliyinə əlavə olaraq, yüksək axın sürətində aşağı sütun geri təzyiqi bu stasionar fazanın digər bir üstünlüyüdür. PMP sütunları yaxşı təkrar istehsal qabiliyyəti nümayiş etdirir və peptid qarışıqlarının təhlili və müxtəlif zülalların tripsin həzmi üçün istifadə edilə bilər. Bu sütundan maye xromatoqrafiyada təbii məhsulların, dərman bitkilərindən bioaktiv birləşmələrin və göbələk ekstraktlarının ayrılması üçün istifadə etməyi planlaşdırırıq. Gələcəkdə PMP sütunları da zülalların və monoklonal antikorların ayrılması üçün qiymətləndiriləcək.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Tərs Fazalı Xromatoqrafiya ilə Peptid Ayrılma Sistemləri üzrə Tədqiqat I Hissə: Sütun Xarakterizasiya Protokolunun İnkişafı. J. Xromatoqrafiya.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. və b. Yoluxucu xəstəliklərin müalicəsi üçün hazırlanmış təkmilləşdirilmiş aktiv peptidlər. Biotexnologiya. Qabaqcıl.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlər: elm və bazar. Dərman kəşfi.15 (1-2) bu gün, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Qabaqcıl Proteomik Maye Xromatoqrafiyası. J. Xromatoqrafiyası. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. və b. Qabaqcıl maye xromatoqrafiyası-kütlə spektrometriyası geniş hədəflənmiş metabolomika və proteomikanın daxil edilməsinə imkan verir. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM və Salisbury, JJ UHPLC-nin dərmanların hazırlanmasında rolu. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. və Clausen, AM Sürətli ayrılmalar üçün ultra yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının fundamental və praktik aspektləri. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA və Tchelitcheff, P. Dərmanların hazırlanmasında ultra yüksək performanslı maye xromatoqrafiyasının tətbiqi. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. və b. Enterovirusların səmərəli təmizlənməsi üçün suda yağlı yüksək daxili fazalı emulsiyalardan hazırlanmış monolit makroməsaməli hidrogellər. Kimya. Britaniya. J. 401, 126051 (2020).
Şi, Y., Xiang, R., Horváth, C. və Wilkins, JA Maye xromatoqrafiyasının proteomikada rolu. J. Xromatoqrafiya. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafiyası ilə ayrılmasında ortaya çıxan tendensiyalar: nəzəriyyə və tətbiqlər. J. Pharmacy. Biotibbi Elm. anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinci və ikinci ayırma ölçülərində fərqli pH dəyərlərindən istifadə edərək RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək peptidlərin ikiölçülü ayrılması. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. və digərləri. Tam və səthi məsaməli C18 sub-2 μm hissəcikləri ilə doldurulmuş yüksək səmərəli xromatoqrafik sütunların kütlə ötürmə xüsusiyyətləri və kinetik göstəriciləri araşdırılmışdır. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. və b. Bitki bioaktiv peptidlərinin təcrid olunması, identifikasiyası və validasiyasında son tendensiyalar və analitik çətinliklər. anus. bioloji anus. Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB və digərləri. Həyat krallığının proteomik mənzərəsi. Təbiət 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. və b. Terapevtik peptidlərin preparativ maye xromatoqrafiyası ilə aşağı axın emalı. Molecule (Bazel, İsveçrə) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi. J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. və Sun, Y. Qarışıq rejimli protein xromatoqrafiyası üçün ligandlar: prinsip, xarakteristika və dizayn. J. Biotexnologiya.144(1), 3-11 (2009).