Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Các hạt silica xốp được điều chế bằng phương pháp sol-gel với một số sửa đổi để thu được các hạt có cấu trúc lỗ rỗng lớn. Các hạt này được dẫn xuất bằng phản ứng trùng hợp chuyển chuỗi phân mảnh cộng hợp thuận nghịch (RAFT) với N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) và styren để điều chế pha tĩnh polystyren xen kẽ N-phenylmaleimide (PMP). Các cột thép không gỉ đường kính nhỏ (100 × 1,8 mm đường kính trong) được đóng gói bằng phương pháp đóng gói dạng huyền phù. Hiệu suất tách cột PMP của hỗn hợp peptide gồm năm peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) và sự phân giải trypsin của albumin huyết thanh người (HAS) được đánh giá. Dưới điều kiện rửa giải tối ưu, số đĩa lý thuyết của hỗn hợp peptide cao tới 280.000 đĩa/m². So sánh hiệu suất tách của Khi phát triển cột sắc ký với cột Ascentis Express RP-Amide thương mại, người ta nhận thấy rằng hiệu suất tách của cột PMP vượt trội hơn so với cột thương mại về hiệu quả tách và độ phân giải.
Trong những năm gần đây, ngành công nghiệp dược phẩm sinh học đã trở thành một thị trường toàn cầu đang phát triển mạnh mẽ với sự gia tăng đáng kể về thị phần. Với sự bùng nổ của ngành công nghiệp dược phẩm sinh học1,2,3, việc phân tích peptide và protein ngày càng được mong muốn. Bên cạnh peptide mục tiêu, một số tạp chất được tạo ra trong quá trình tổng hợp peptide, do đó cần phải tinh chế bằng phương pháp sắc ký để thu được peptide có độ tinh khiết mong muốn. Việc phân tích và đặc trưng hóa protein trong dịch cơ thể, mô và tế bào là một nhiệm vụ vô cùng khó khăn do số lượng lớn các loài có thể phát hiện được trong một mẫu duy nhất. Mặc dù phép đo khối phổ là một công cụ hiệu quả để giải trình tự peptide và protein, nhưng nếu các mẫu như vậy được đưa vào máy đo khối phổ trong một lần, sự tách biệt sẽ không lý tưởng. Vấn đề này có thể được giảm thiểu bằng cách thực hiện tách sắc ký lỏng (LC) trước khi phân tích MS, điều này sẽ làm giảm số lượng chất phân tích đi vào máy đo khối phổ tại một thời điểm nhất định4,5,6. Ngoài ra, trong quá trình tách pha lỏng, các chất phân tích có thể được tập trung trong các vùng hẹp, do đó làm tăng nồng độ các chất phân tích này và cải thiện độ nhạy phát hiện của MS. Sắc ký lỏng (LC) đã có những tiến bộ đáng kể trong thời gian qua. trong thập kỷ qua và đã trở thành một kỹ thuật phổ biến trong phân tích protein7,8,9,10.
Sắc ký lỏng pha đảo (RP-LC) được sử dụng rộng rãi để tinh chế và tách hỗn hợp peptide bằng cách sử dụng silica biến tính octadecyl (ODS) làm pha tĩnh11,12,13. Tuy nhiên, pha tĩnh RP không cung cấp khả năng tách peptide và protein một cách thỏa đáng do cấu trúc phức tạp và bản chất lưỡng cực của chúng14,15. Do đó, cần có các pha tĩnh được thiết kế đặc biệt để phân tích peptide và protein với các phần tử phân cực và không phân cực để tương tác và giữ lại các chất phân tích này16. Sắc ký hỗn hợp, cung cấp các tương tác đa phương thức, có thể là một giải pháp thay thế cho RP-LC để tách peptide, protein và các hỗn hợp phức tạp khác. Một số pha tĩnh hỗn hợp đã được điều chế và các cột được đóng gói bằng các pha này đã được sử dụng để tách peptide và protein17,18,19,20,21. Các pha tĩnh hỗn hợp (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, xen kẽ phân cực/RPLC) phù hợp cho việc tách peptide và protein do sự hiện diện của cả các phần tử phân cực và không phân cực. Các nhóm không phân cực22,23,24,25,26,27,28. Tương tự, các pha tĩnh xen kẽ phân cực với các nhóm phân cực liên kết cộng hóa trị cho thấy khả năng tách tốt và tính chọn lọc độc đáo đối với các chất phân tích phân cực và không phân cực, vì sự tách phụ thuộc vào tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh. Tương tác đa phương thức 29, 30, 31, 32. Gần đây, Zhang et al. 30 đã điều chế một pha tĩnh polyamine kết thúc bằng dodecyl và đã tách thành công các hydrocarbon, thuốc chống trầm cảm, flavonoid, nucleoside, estrogen và một số chất phân tích khác. Chất xen kẽ phân cực có cả nhóm phân cực và không phân cực, do đó nó có thể được sử dụng để tách các peptide và protein có cả phần kỵ nước và ưa nước. Các cột nhúng phân cực (ví dụ: cột C18 nhúng amide) được bán trên thị trường với tên thương mại là cột Ascentis Express RP-Amide, nhưng các cột này chỉ được sử dụng để phân tích amin 33.
Trong nghiên cứu hiện tại, một pha tĩnh phân cực (polystyrene nhúng N-phenylmaleimide) đã được chuẩn bị và đánh giá khả năng tách các peptide và sản phẩm thủy phân trypsin của HSA. Pha tĩnh được chuẩn bị bằng chiến lược sau: Các hạt silica xốp được chuẩn bị theo quy trình đã nêu trong ấn phẩm trước đây của chúng tôi với một số sửa đổi đối với quy trình chuẩn bị. Tỷ lệ urê, polyetylen glycol (PEG), TMOS, nước và axit axetic được điều chỉnh để chuẩn bị các hạt silica có kích thước lỗ xốp lớn. Thứ hai, một phối tử mới, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, đã được tổng hợp và sử dụng để dẫn xuất các hạt silica nhằm chuẩn bị một pha tĩnh phân cực. Pha tĩnh thu được được đóng gói vào một cột thép không gỉ (100 × 1,8 mm đường kính trong) bằng cách sử dụng sơ đồ đóng gói tối ưu. Việc đóng gói cột được hỗ trợ bằng rung cơ học để đảm bảo tạo thành một lớp đồng nhất bên trong cột. Đánh giá khả năng tách hỗn hợp peptide gồm năm peptide trong cột đóng gói; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) và sản phẩm thủy phân trypsin của albumin huyết thanh người (HAS). Hỗn hợp peptide và sản phẩm thủy phân trypsin của HSA được quan sát thấy tách biệt với độ phân giải và hiệu quả tốt. Hiệu suất tách của cột PMP được so sánh với cột Ascentis Express RP-Amide. Cả peptide và protein đều được quan sát thấy tách biệt tốt và hiệu quả trên cột PMP, hiệu quả hơn so với cột Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Urê, Axit axetic, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Albumin huyết thanh người (HSA), Amoni clorua, Urê, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), Acetonitrile (ACN) loại HPLC, Methanol, 2-Propanol và Acetone được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Hỗn hợp gồm urê (8 g), polyetylen glycol (8 g) và 8 mL axit axetic 0,01 N được khuấy trong 10 phút, sau đó thêm 24 mL TMOS vào trong điều kiện lạnh. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng ở 40°C trong 6 giờ và sau đó ở 120°C trong 8 giờ trong nồi hấp bằng thép không gỉ. Nước được đổ bỏ và phần vật liệu còn lại được sấy khô ở 70°C trong 12 giờ. Khối lượng mềm đã sấy khô được nghiền mịn trong lò và nung ở 550°C trong 12 giờ. Ba mẻ được chuẩn bị và phân tích để kiểm tra tính khả reproducible về kích thước hạt, kích thước lỗ xốp và diện tích bề mặt.
Bằng cách biến đổi bề mặt các hạt silica với phối tử phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) được tổng hợp trước, tiếp theo là trùng hợp xuyên tâm với styren, một hợp chất chứa nhóm phân cực đã được điều chế. Pha tĩnh cho các cụm và chuỗi polystyren. Quy trình điều chế được mô tả dưới đây.
N-phenylmaleimide (200 mg) và methyl vinyl isocyanate (100 mg) được hòa tan trong toluene khô, và 0,1 mL 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) được thêm vào bình phản ứng để điều chế copolymer phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate (PMCP). Hỗn hợp được đun nóng ở 60°C trong 3 giờ, lọc và sấy khô trong lò ở 40°C trong 3 giờ.
Các hạt silica khô (2 g) được phân tán trong toluen khô (100 mL), khuấy đều và siêu âm trong bình đáy tròn 500 mL trong 10 phút. PMCP (10 mg) được hòa tan trong toluen và thêm nhỏ giọt vào bình phản ứng bằng phễu nhỏ giọt. Hỗn hợp được đun hồi lưu ở 100°C trong 8 giờ, lọc, rửa bằng acetone và sấy khô ở 60°C trong 3 giờ. Sau đó, các hạt silica liên kết PMCP (100 g) được hòa tan trong toluen (200 ml) và 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) được thêm vào với sự có mặt của 100 µL dibutyltin dilaurate làm chất xúc tác. Hỗn hợp được khuấy ở 50°C trong 8 giờ, lọc và sấy khô ở 50°C trong 3 giờ.
Styren (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0,5 mL) và các hạt silica gắn TEMPO-PMCP (1,5 g) được phân tán trong toluen và được sục khí nitơ. Quá trình trùng hợp styren được thực hiện ở 100°C trong 12 giờ. Sản phẩm thu được được rửa bằng metanol và sấy khô ở 60°C qua đêm. Sơ đồ phản ứng tổng thể được thể hiện trong Hình 1.
Các mẫu được khử khí ở 393 K trong 1 giờ để thu được áp suất dư nhỏ hơn 10-3 Torr. Lượng N2 hấp phụ ở áp suất tương đối P/P0 = 0,99 được sử dụng để xác định tổng thể tích lỗ rỗng. Hình thái của các hạt silica trần và silica liên kết phối tử được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét (Hitachi High Technologies, Tokyo, Nhật Bản). Các mẫu khô (hạt silica trần và hạt silica liên kết phối tử) được đặt trên cột nhôm bằng băng dính carbon. Vàng được mạ lên các mẫu bằng máy mạ chân không Q150T, và một lớp Au dày 5 nm được lắng đọng trên các mẫu. Điều này cải thiện hiệu quả quy trình bằng cách sử dụng điện áp thấp và cung cấp hạt mịn, mạ chân không lạnh. Máy phân tích nguyên tố Thermo Electron (Waltham, MA, Hoa Kỳ) Flash EA1112 được sử dụng để phân tích nguyên tố. Máy phân tích kích thước hạt Malvern (Worcestershire, Anh) Mastersizer 2000 được sử dụng để thu được phân bố kích thước hạt. Các hạt silica trần và Các hạt silica liên kết phối tử (mỗi hạt 5 mg) được phân tán trong 5 mL isopropanol, siêu âm trong 10 phút, khuấy đều trong 5 phút và đặt trên bàn quang học của máy Mastersizer. Phân tích nhiệt trọng lượng được thực hiện với tốc độ 5 °C mỗi phút trong phạm vi nhiệt độ từ 30 đến 800 °C.
Các cột thép không gỉ tráng men có đường kính nhỏ kích thước (100 × 1,8 mm id) được đóng gói bằng phương pháp đóng gói dạng huyền phù, áp dụng quy trình tương tự như trong tài liệu tham khảo. 31. Một cột thép không gỉ (tráng men thủy tinh, 100 × 1,8 mm đường kính trong) với đầu nối có chứa màng lọc 1 µm được nối với bộ đóng gói huyền phù (Alltech Deerfield, IL, USA). Chuẩn bị huyền phù pha tĩnh bằng cách hòa tan 150 mg pha tĩnh trong 1,2 mL metanol và đưa vào cột chứa. Metanol được sử dụng làm dung môi huyền phù cũng như dung môi đẩy. Nạp cột tuần tự bằng cách áp dụng áp suất 100 MPa trong 10 phút, 80 MPa trong 15 phút và 60 MPa trong 30 phút. Trong quá trình đóng gói, rung cơ học được áp dụng bằng hai máy lắc cột GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) để đảm bảo đóng gói đồng đều cột. Đóng bộ đóng gói huyền phù và xả áp suất từ ​​từ để tránh bất kỳ hư hỏng nào bên trong cột. Ngắt kết nối cột khỏi bộ đóng gói huyền phù và kết nối một đầu nối khác vào đầu vào và hệ thống LC để kiểm tra. hiệu suất.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (LC) bao gồm bơm LC (10AD Shimadzu, Nhật Bản), bộ phận bơm mẫu (Valco (Mỹ) C14 W.05) với vòng bơm 50nL, bộ khử khí màng (Shimadzu DGU-14A), cửa sổ mao dẫn UV-VIS, đầu dò thiết bị µLC đặc biệt (UV-2075) và các cột vi mô tráng thủy tinh. Sử dụng ống nối rất nhỏ và ngắn để giảm thiểu ảnh hưởng của sự mở rộng dải ngoài cột. Sau khi đóng gói, các mao dẫn (đường kính trong 50 μm, 365) và các mao dẫn nối giảm (50 μm) được lắp đặt tại đầu ra 1/16″ của khớp nối giảm. Việc thu thập dữ liệu và xử lý sắc ký được thực hiện bằng phần mềm Multichro 2000. Giám sát ở bước sóng 254 nm. Các chất phân tích được kiểm tra độ hấp thụ UV. Dữ liệu sắc ký được phân tích bằng phần mềm OriginPro8 (Northampton, MA).
3 mg albumin từ huyết thanh người, dạng bột đông khô, độ tinh khiết ≥ 96% (điện di trên gel agarose), trộn với 1,5 mg trypsin, 1 mL urê 4,0 M và 1 mL amoni bicacbonat 0,2 M. Khuấy dung dịch trong 10 phút và giữ trong bể nước ở 37°C trong 6 giờ, sau đó làm nguội nhanh bằng 1 mL dung dịch TFA 0,1%. Lọc dung dịch và bảo quản ở nhiệt độ dưới 4°C.
Quá trình tách hỗn hợp peptide và sản phẩm thủy phân trypsin của HSA được đánh giá riêng biệt trên cột PMP. Kiểm tra sự tách hỗn hợp peptide và sản phẩm thủy phân trypsin của HSA bằng cột PMP và so sánh kết quả với cột Ascentis Express RP-Amide. Số đĩa lý thuyết được tính như sau:
Hình ảnh SEM của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử được thể hiện trong Hình 2. Hình ảnh SEM của các hạt silica trần (A, B) cho thấy, trái ngược với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, các hạt này có hình cầu, trong đó các hạt bị kéo dài hoặc có đối xứng không đều. Bề mặt của các hạt silica liên kết phối tử (C, D) mịn hơn so với các hạt silica trần, điều này có thể là do lớp phủ chuỗi polystyrene trên bề mặt của các hạt silica.
Hình ảnh hiển vi điện tử quét của các hạt silica trần (A, B) và các hạt silica liên kết phối tử (C, D).
Hình 3(A) thể hiện sự phân bố kích thước hạt của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử. Các đường cong phân bố kích thước hạt dựa trên thể tích cho thấy kích thước của các hạt silica tăng lên sau khi biến đổi hóa học (Hình 3A). Bảng 1(A) so sánh dữ liệu phân bố kích thước hạt của các hạt silica từ nghiên cứu hiện tại và nghiên cứu trước đó. Kích thước hạt dựa trên thể tích, d(0,5), của PMP là 3,36 μm, so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi với giá trị ad(0,5) là 3,05 μm (các hạt silica liên kết polystyrene)34. Lô này có sự phân bố kích thước hạt hẹp hơn so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi do tỷ lệ PEG, urê, TMOS và axit axetic khác nhau trong hỗn hợp phản ứng. Kích thước hạt của pha PMP lớn hơn một chút so với pha hạt silica liên kết polystyrene mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đây. Điều này có nghĩa là việc chức năng hóa bề mặt các hạt silica bằng styren chỉ tạo ra một lớp polystyrene (0,97 µm) trên bề mặt silica. Trong khi đó, ở pha PMP, độ dày lớp là 1,38 µm.
Phân bố kích thước hạt (A) và phân bố kích thước lỗ xốp (B) của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử.
Kích thước lỗ xốp, thể tích lỗ xốp và diện tích bề mặt của các hạt silica trong nghiên cứu hiện tại được trình bày trong Bảng 1(B). Hồ sơ PSD của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử được thể hiện trong Hình 3(B). Kết quả tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Kích thước lỗ xốp của các hạt silica trần và liên kết phối tử lần lượt là 310 và 241, cho thấy kích thước lỗ xốp giảm 69 sau khi biến đổi hóa học, như thể hiện trong Bảng 1(B), và sự thay đổi của đường cong được thể hiện trong Hình 3(B). Tương tự, thể tích lỗ xốp của các hạt silica giảm từ 0,67 xuống 0,58 cm3/g sau khi biến đổi hóa học. Diện tích bề mặt riêng của các hạt silica được nghiên cứu hiện tại là 116 m2/g, tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (124 m2/g). Như thể hiện trong Bảng 1(B), diện tích bề mặt (m2/g) của các hạt silica cũng giảm từ 116 m2/g xuống 105 m2/g. m2/g sau khi biến đổi hóa học.
Kết quả phân tích nguyên tố của pha tĩnh được thể hiện trong Bảng 2. Hàm lượng carbon của pha tĩnh hiện tại là 6,35%, thấp hơn hàm lượng carbon trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi (các hạt silica liên kết polystyrene, lần lượt là 7,93%35 và 10,21%) 42. Hàm lượng carbon của pha tĩnh hiện tại thấp là do trong quá trình điều chế SP hiện tại, ngoài styrene, một số phối tử phân cực như phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) và 4-hydroxy-TEMPO đã được sử dụng. Phần trăm khối lượng nitơ của pha tĩnh hiện tại là 2,21%, so với 0,1735 và 0,85% theo khối lượng nitơ trong các nghiên cứu trước đây. Điều này có nghĩa là phần trăm khối lượng nitơ cao hơn trong pha tĩnh hiện tại do phenylmaleimide. Tương tự, hàm lượng carbon của sản phẩm (4) và (5) lần lượt là 2,7% và 2,9%, trong khi hàm lượng carbon của sản phẩm cuối cùng sản phẩm (6) là 6,35%, như thể hiện trong Bảng 2. Sự giảm khối lượng được kiểm tra với pha tĩnh PMP và đường cong TGA được thể hiện trong Hình 4. Đường cong TGA cho thấy sự giảm khối lượng là 8,6%, phù hợp với tải trọng carbon (6,35%) vì các phối tử không chỉ chứa C mà còn chứa N, O và H.
Ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate được chọn để biến đổi bề mặt các hạt silica vì nó có các nhóm phenylmaleimide và vinylisocyanate phân cực. Các nhóm vinylisocyanate có thể tiếp tục phản ứng với styren bằng phản ứng trùng hợp gốc tự do sống. Lý do thứ hai là để đưa vào một nhóm có tương tác vừa phải với chất phân tích và không có tương tác tĩnh điện mạnh giữa chất phân tích và pha tĩnh, vì nhóm phenylmaleimide không có điện tích ảo ở pH bình thường. Độ phân cực của pha tĩnh có thể được kiểm soát bằng lượng styren tối ưu và thời gian phản ứng trùng hợp gốc tự do. Bước cuối cùng của phản ứng (trùng hợp gốc tự do) rất quan trọng và có thể thay đổi độ phân cực của pha tĩnh. Phân tích nguyên tố được thực hiện để kiểm tra hàm lượng carbon của các pha tĩnh này. Quan sát thấy rằng việc tăng lượng styren và thời gian phản ứng làm tăng hàm lượng carbon của pha tĩnh và ngược lại. Các pha tĩnh được điều chế với nồng độ styren khác nhau có hàm lượng carbon khác nhau. Một lần nữa, nạp các pha tĩnh này vào cột thép không gỉ và kiểm tra đặc tính sắc ký của chúng. hiệu suất (độ chọn lọc, độ phân giải, giá trị N, v.v.). Dựa trên các thí nghiệm này, một công thức tối ưu đã được lựa chọn để chuẩn bị pha tĩnh PMP nhằm đảm bảo độ phân cực được kiểm soát và khả năng giữ lại chất phân tích tốt.
Năm hỗn hợp peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) cũng được đánh giá bằng cột PMP sử dụng pha động; Dung dịch acetonitrile/nước (0,1% TFA) tỷ lệ 60/40 (v/v) với tốc độ dòng chảy 80 μL/min. Trong điều kiện rửa giải tối ưu, số đĩa lý thuyết (N) trên mỗi cột (100 × 1,8 mm id) là 20.000 ± 100 (200.000 đĩa/m²). Bảng 3 đưa ra các giá trị N cho ba cột PMP và sắc ký đồ được thể hiện trong Hình 5A. Phân tích nhanh trên cột PMP ở tốc độ dòng chảy cao (700 μL/min), năm peptide được rửa giải trong vòng một phút, giá trị N rất tốt, 13.500 ± 330 trên mỗi cột (100 × 1,8 mm id), tương ứng với 135.000 đĩa/m (Hình 5B). Ba cột có kích thước giống hệt nhau (100 × 1,8 mm id) được đóng gói với ba lô khác nhau của Pha tĩnh PMP được sử dụng để kiểm tra khả năng tái lập. Nồng độ chất phân tích cho mỗi cột được ghi lại bằng cách sử dụng các điều kiện rửa giải tối ưu và số đĩa lý thuyết N cũng như thời gian lưu để tách cùng một hỗn hợp thử nghiệm trên mỗi cột. Dữ liệu về khả năng tái lập của các cột PMP được thể hiện trong Bảng 4. Khả năng tái lập của cột PMP tương quan tốt với các giá trị %RSD rất thấp, như được thể hiện trong Bảng 3.
Tách hỗn hợp peptide trên cột PMP (B) và cột Ascentis Express RP-Amide (A); pha động 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), kích thước cột PMP (100 × 1,8 mm id); thứ tự rửa giải của các hợp chất: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) và 5 (leucine) acid enkephalin)).
Cột PMP (100 × 1,8 mm id) được đánh giá để tách các sản phẩm thủy phân trypsin của albumin huyết thanh người trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. Sắc ký đồ trong Hình 6 cho thấy mẫu được tách tốt và độ phân giải rất cao. Các sản phẩm thủy phân HSA được phân tích bằng tốc độ dòng 100 µL/min, pha động 70/30 acetonitrile/nước và 0,1% TFA. Như thể hiện trong sắc ký đồ (Hình 6), sản phẩm thủy phân HSA đã được tách thành 17 đỉnh tương ứng với 17 peptide. Hiệu suất tách của mỗi đỉnh trong sản phẩm thủy phân HSA đã được tính toán và các giá trị được đưa ra trong Bảng 5.
Sản phẩm thủy phân trypsin của HSA (100 × 1,8 mm id) được tách trên cột PMP; tốc độ dòng chảy (100 µL/min), pha động 60/40 acetonitrile/nước với 0,1% TFA.
trong đó L là chiều dài cột, η là độ nhớt của pha động, ΔP là áp suất ngược của cột và u là vận tốc tuyến tính của pha động. Độ thấm của cột PMP là 2,5 × 10-14 m2, tốc độ dòng chảy là 25 μL/min và sử dụng hỗn hợp ACN/nước 60/40 v/v. Độ thấm của cột PMP (100 × 1,8 mm id) tương tự như nghiên cứu trước đây của chúng tôi (Tài liệu tham khảo 34). Độ thấm của cột được đóng gói bằng các hạt xốp bề mặt là: 1,7 × 10-15 đối với hạt 1,3 μm, 3,1 × 10-15 đối với hạt 1,7 μm, 5,2 × 10-15 và 2,5 × 10-14 m2 đối với hạt 2,6 μm. Đối với hạt 5 μm là 43. Do đó, độ thấm Đặc tính của pha PMP tương tự như đặc tính của các hạt lõi-vỏ 5 μm.
trong đó Wx là trọng lượng của cột được đóng gói bằng cloroform, Wy là trọng lượng của cột được đóng gói bằng metanol, và ρ là mật độ của dung môi. Mật độ của metanol (ρ = 0,7866) và cloroform (ρ = 1,484). Tổng độ xốp của các cột SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 và các cột C18-Urea 31 mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đây lần lượt là 0,63 và 0,55. Điều này có nghĩa là sự hiện diện của các phối tử urê làm giảm độ thấm của pha tĩnh. Mặt khác, tổng độ xốp của cột PMP (100 × 1,8 mm id) là 0,60. Độ thấm của các cột PMP thấp hơn so với các cột được đóng gói bằng các hạt silica liên kết C18 vì trong các pha tĩnh loại C18, các phối tử C18 được gắn vào các hạt silica dưới dạng chuỗi tuyến tính, trong khi trong các pha tĩnh loại polystyrene, Một lớp polymer tương đối dày được hình thành xung quanh nó. Trong một thí nghiệm điển hình, độ xốp của cột được tính như sau:
Hình 7A,B thể hiện cột PMP (100 × 1,8 mm id) và cột Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) sử dụng cùng điều kiện rửa giải (tức là 60/40 ACN/H2O và 0,1% TFA). ) của biểu đồ van Deemter. Các hỗn hợp peptide được chọn (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) được chuẩn bị trong 20 µL/phút. Tốc độ dòng chảy tối thiểu cho cả hai cột là 800 µL/phút. Giá trị HETP tối thiểu ở tốc độ dòng chảy tối ưu (80 µL/phút) đối với cột PMP và cột Ascentis Express RP-Amide lần lượt là 2,6 µm và 3,9 µm. Các giá trị HETP cho thấy hiệu quả tách của cột PMP (100 × 1,8 mm id) tốt hơn nhiều so với cột Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) có bán trên thị trường. Biểu đồ van Deemter trong Hình 7(A) cho thấy sự giảm giá trị N khi tăng tốc độ dòng chảy không đáng kể so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Hiệu quả tách cao hơn của... Cột PMP (100 × 1,8 mm id) so với cột Ascentis Express RP-Amide dựa trên những cải tiến về hình dạng, kích thước hạt và quy trình đóng gói cột phức tạp được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại34.
(A) Đồ thị van Deemter (HETP so với vận tốc tuyến tính của pha động) thu được bằng cách sử dụng cột PMP (100 × 1,8 mm id) trong dung môi 60/40 ACN/H2O với 0,1% TFA. (B) Đồ thị van Deemter (HETP so với vận tốc tuyến tính của pha động) thu được bằng cách sử dụng cột Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) trong dung môi 60/40 ACN/H2O với 0,1% TFA.
Một pha tĩnh polystyrene nhúng phân cực đã được chuẩn bị và đánh giá để tách hỗn hợp peptide tổng hợp và sản phẩm phân giải trypsin của albumin huyết thanh người (HAS) trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. Hiệu suất sắc ký của cột PMP đối với hỗn hợp peptide rất tốt về hiệu quả tách và độ phân giải. Hiệu suất tách được cải thiện của cột PMP là do nhiều lý do, chẳng hạn như kích thước hạt và kích thước lỗ xốp của các hạt silica, quá trình tổng hợp pha tĩnh được kiểm soát và cấu trúc đóng gói cột phức tạp. Ngoài hiệu quả tách cao, áp suất ngược cột thấp ở tốc độ dòng chảy cao là một ưu điểm khác của pha tĩnh này. Cột PMP thể hiện khả năng tái lập tốt và có thể được sử dụng để phân tích hỗn hợp peptide và sản phẩm phân giải trypsin của nhiều loại protein khác nhau. Chúng tôi dự định sử dụng cột này để tách các sản phẩm tự nhiên, các hợp chất hoạt tính sinh học từ cây thuốc và chiết xuất nấm trong sắc ký lỏng. Trong tương lai, cột PMP cũng sẽ được đánh giá để tách protein và kháng thể đơn dòng.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha đảo Phần I: Phát triển quy trình đặc trưng cột. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Các peptide hoạt tính được cải tiến được thiết kế để điều trị các bệnh truyền nhiễm. Công nghệ sinh học. Nâng cao. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptide trị liệu tổng hợp: khoa học và thị trường. khám phá thuốc. 15 (1-2) hôm nay, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Sắc ký lỏng proteomics nâng cao. Tạp chí Sắc ký. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Sắc ký lỏng-khối phổ tiên tiến cho phép kết hợp chuyển hóa học và protein học nhắm mục tiêu rộng rãi.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Vai trò của UHPLC trong phát triển thuốc. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng siêu cao áp để tách nhanh. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cực cao trong phát triển thuốc. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hydrogel xốp nguyên khối được điều chế từ nhũ tương pha nội cao dầu trong nước để thanh lọc hiệu quả enterovirus. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vai trò của sắc ký lỏng trong proteomics. J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Các xu hướng mới nổi trong tách sắc ký lỏng pha đảo ngược các peptide và protein trị liệu: lý thuyết và ứng dụng. Tạp chí Dược học. Khoa học Y sinh. Anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tách peptit hai chiều bằng hệ thống RP-RP-HPLC sử dụng các giá trị pH khác nhau trong chiều tách thứ nhất và thứ hai. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Đặc tính truyền khối và hiệu suất động học của các cột sắc ký hiệu suất cao được đóng gói bằng các hạt C18 dưới 2 μm có độ xốp hoàn toàn và bề mặt đã được nghiên cứu. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Các xu hướng gần đây và những thách thức phân tích trong việc phân lập, xác định và xác nhận các peptit hoạt tính sinh học thực vật.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Bức tranh proteomic của vương quốc sự sống. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Xử lý hạ nguồn các peptide trị liệu bằng sắc ký lỏng chuẩn bị. Molecule (Basel, Thụy Sĩ) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký hỗn hợp và ứng dụng của nó đối với các polyme sinh học. J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligand cho sắc ký protein hỗn hợp: nguyên lý, đặc điểm và thiết kế.J. Công nghệ sinh học.144(1), 3-11 (2009).