Cảm ơn bạn đã truy cập Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ hạn chế cho CSS. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Các hạt silica xốp được chế tạo bằng phương pháp sol-gel với một số sửa đổi để thu được các hạt xốp lớn. Các hạt này được dẫn xuất hóa bằng phản ứng trùng hợp chuyển chuỗi phân mảnh bổ sung thuận nghịch (RAFT) với N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) và styrene để chế tạo pha tĩnh xen kẽ N-phenylmaleimide của polystyrene (PMP). Các cột thép không gỉ có lỗ hẹp (đường kính trong 100 × 1,8 mm) được nhồi bằng phương pháp nhồi bùn. Đánh giá hiệu suất sắc ký của cột PMP đối với hỗn hợp peptide gồm năm peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) và tiêu hóa trypsin albumin huyết thanh người (HAS). Trong điều kiện rửa giải tối ưu, số lượng đĩa lý thuyết của hỗn hợp peptide lên tới 280.000 đĩa/m². So sánh quá trình tách hiệu suất của cột được phát triển với cột Ascentis Express RP-Amide thương mại, người ta quan sát thấy hiệu suất tách của cột PMP vượt trội hơn cột thương mại về hiệu suất tách và độ phân giải.
Trong những năm gần đây, ngành công nghiệp dược phẩm sinh học đã trở thành một thị trường toàn cầu đang mở rộng với sự gia tăng đáng kể về thị phần. Với sự phát triển bùng nổ của ngành công nghiệp dược phẩm sinh học1,2,3, việc phân tích các peptide và protein rất được mong muốn. Ngoài peptide mục tiêu, một số tạp chất được tạo ra trong quá trình tổng hợp peptide, do đó cần phải tinh chế sắc ký để thu được các peptide có độ tinh khiết mong muốn. Việc phân tích và mô tả đặc tính của protein trong dịch cơ thể, mô và tế bào là một nhiệm vụ cực kỳ khó khăn do số lượng lớn các loài có khả năng phát hiện được trong một mẫu duy nhất. Mặc dù phổ khối là một công cụ hiệu quả để giải trình tự peptide và protein, nhưng nếu các mẫu như vậy được tiêm vào máy quang phổ khối trong một lần, thì quá trình phân tách sẽ không lý tưởng. Vấn đề này có thể được giảm thiểu bằng cách triển khai phân tách sắc ký lỏng (LC) trước khi phân tích MS, điều này sẽ làm giảm số lượng chất phân tích đi vào máy quang phổ khối tại một thời điểm nhất định4,5,6. Ngoài ra, trong quá trình tách pha lỏng, các chất phân tích có thể được tập trung vào các vùng hẹp, do đó cô đặc các chất phân tích này và cải thiện độ nhạy phát hiện MS. Sắc ký lỏng (LC) đã đã tiến bộ đáng kể trong thập kỷ qua và đã trở thành một kỹ thuật phổ biến trong phân tích protein7,8,9,10.
Sắc ký lỏng pha đảo (RP-LC) được sử dụng rộng rãi để tinh chế và tách hỗn hợp peptide bằng cách sử dụng silica biến tính octadecyl (ODS) làm pha tĩnh11,12,13. Tuy nhiên, pha tĩnh RP không cung cấp khả năng tách peptide và protein thỏa đáng do cấu trúc phức tạp và bản chất lưỡng tính của chúng 14,15 . Do đó, cần có các pha tĩnh được thiết kế đặc biệt để phân tích peptide và protein có các phần phân cực và không phân cực để tương tác và giữ lại các chất phân tích này16. Sắc ký chế độ hỗn hợp, cung cấp các tương tác đa phương thức, có thể là một giải pháp thay thế cho RP-LC để tách peptide, protein và các hỗn hợp phức tạp khác. Một số pha tĩnh chế độ hỗn hợp đã được chuẩn bị và các cột chứa các pha này đã được sử dụng để tách peptide và protein17,18,19,20,21. Pha tĩnh chế độ hỗn hợp (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, xen kẽ phân cực/RPLC) phù hợp để tách peptide và protein do sự hiện diện của cả nhóm phân cực và không phân cực22,23,24,25,26,27,28 .Tương tự như vậy, các pha tĩnh xen kẽ phân cực với các nhóm phân cực liên kết cộng hóa trị cho thấy khả năng tách tốt và tính chọn lọc duy nhất đối với các chất phân tích phân cực và không phân cực, vì sự tách phụ thuộc vào tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh. Tương tác đa phương thức 29, 30, 31, 32.Gần đây, Zhang và cộng sự 30 đã chuẩn bị một pha tĩnh polyamine kết thúc bằng dodecyl và tách thành công các hydrocarbon, thuốc chống trầm cảm, flavonoid, nucleoside, estrogen và một số chất phân tích khác.Chất xen kẽ phân cực có cả nhóm phân cực và không phân cực, do đó nó có thể được sử dụng để tách các peptide và protein có cả phần kỵ nước và phần ưa nước.Các cột nhúng phân cực (ví dụ: cột C18 nhúng amide) có sẵn trên thị trường dưới tên thương mại là cột Ascentis Express RP-Amide, nhưng các cột này chỉ được sử dụng để phân tích amin 33.
Trong nghiên cứu hiện tại, một pha tĩnh nhúng phân cực (polystyrene nhúng N-phenylmaleimide) đã được chuẩn bị và đánh giá để tách peptide và dịch tiêu hóa trypsin của HSA. Pha tĩnh được chuẩn bị bằng chiến lược sau. Các hạt silica xốp được chuẩn bị theo quy trình được đưa ra trong ấn phẩm trước đây của chúng tôi với một số sửa đổi đối với giao thức chuẩn bị. Tỷ lệ urê, polyethylene glycol (PEG), TMOS, axit axetic nước được điều chỉnh để chuẩn bị các hạt silica có kích thước lỗ lớn. Thứ hai, một phối tử mới, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, đã được tổng hợp và sử dụng để dẫn xuất các hạt silica để chuẩn bị pha tĩnh nhúng phân cực. Pha tĩnh thu được được đóng gói vào cột thép không gỉ (100 × 1,8 mm id) bằng cách sử dụng sơ đồ đóng gói tối ưu. Việc đóng gói cột được hỗ trợ bằng rung động cơ học để đảm bảo hình thành một lớp đồng nhất bên trong cột. Đánh giá quá trình tách cột được đóng gói của hỗn hợp peptide bao gồm năm peptide; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) và dịch tiêu hóa Trypsin của albumin huyết thanh người (HAS). Hỗn hợp peptide và dịch tiêu hóa trypsin của HSA được quan sát thấy có khả năng phân tách với độ phân giải và hiệu quả tốt. Hiệu suất phân tách của cột PMP được so sánh với cột Ascentis Express RP-Amide. Cả peptide và protein đều được quan sát thấy có khả năng phân tách tốt và hiệu quả trên cột PMP, hiệu quả hơn cột Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Urê, Axit axetic, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Albumin huyết thanh người (HSA), Amoni clorua, Urê, Hexan Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), Acetonitrile cấp HPLC (ACN), Methanol, 2-Propanol và Acetone Mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ).
Hỗn hợp urê (8 g), polyethylene glycol (8 g) và 8 mL axit axetic 0,01 N được khuấy trong 10 phút, sau đó thêm 24 mL TMOS vào đó trong điều kiện lạnh như băng. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng ở 40°C trong 6 giờ và sau đó ở 120°C trong 8 giờ trong nồi hấp bằng thép không gỉ. Nước được đổ ra và vật liệu còn lại được sấy khô ở 70°C trong 12 giờ. Khối mềm khô được nghiền mịn trong lò và nung ở 550°C trong 12 giờ. Ba mẻ đã được chuẩn bị và đặc trưng để kiểm tra khả năng tái tạo về kích thước hạt, kích thước lỗ rỗng và diện tích bề mặt.
Bằng cách biến tính bề mặt các hạt silica với phối tử phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) được tổng hợp trước, sau đó là quá trình trùng hợp xuyên tâm với styrene, một hợp chất chứa nhóm phân cực đã được tạo ra. Pha tĩnh cho các chất kết tụ và chuỗi polystyrene. Quá trình tạo ra được mô tả dưới đây.
N-phenylmaleimide (200 mg) và methyl vinyl isocyanat (100 mg) được hòa tan trong toluen khô, và 0,1 mL 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) được thêm vào bình phản ứng để chuẩn bị đồng trùng hợp phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanat (PMCP). Hỗn hợp được đun nóng ở 60°C trong 3 giờ, lọc và sấy khô trong lò ở 40°C trong 3 giờ.
Các hạt silica khô (2 g) được phân tán trong toluen khô (100 mL), khuấy và siêu âm trong bình tròn đáy 500 mL trong 10 phút. PMCP (10 mg) được hòa tan trong toluen và nhỏ từng giọt vào bình phản ứng qua phễu nhỏ giọt. Hỗn hợp được đun sôi ở 100°C trong 8 giờ, lọc và rửa bằng axeton và sấy khô ở 60°C trong 3 giờ. Sau đó, các hạt silica liên kết PMCP (100 g) được hòa tan trong toluen (200 ml) và 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) được thêm vào với sự có mặt của 100 µL dibutyltin dilaurate làm chất xúc tác. Hỗn hợp được khuấy ở 50°C trong 8 giờ, lọc và sấy khô ở 50°C trong 3 giờ.
Styrene (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0,5 mL) và các hạt silica gắn TEMPO-PMCP (1,5 g) được phân tán trong toluene và được thanh lọc bằng nitơ. Quá trình trùng hợp styrene được thực hiện ở 100°C trong 12 giờ. Sản phẩm thu được được rửa bằng methanol và sấy khô ở 60°C qua đêm. Sơ đồ phản ứng tổng thể được thể hiện trong Hình 1.
Các mẫu được khử khí ở 393 K trong 1 giờ để thu được áp suất dư nhỏ hơn 10-3 Torr. Lượng N2 hấp phụ ở áp suất tương đối P/P0 = 0,99 được sử dụng để xác định tổng thể tích lỗ rỗng. Hình thái của các hạt silica trần và liên kết với phối tử được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét (Hitachi High Technologies, Tokyo, Nhật Bản). Các mẫu khô (các hạt silica trần và các hạt silica liên kết với phối tử) được đặt trên cột nhôm bằng băng dính carbon. Vàng được mạ trên các mẫu bằng máy phủ phun Q150T và một lớp Au 5 nm được lắng đọng trên các mẫu. Điều này cải thiện hiệu quả quy trình bằng cách sử dụng điện áp thấp và cung cấp quá trình phun lạnh, hạt mịn. Máy phân tích nguyên tố Flash EA1112 của Thermo Electron (Waltham, MA, Hoa Kỳ) được sử dụng để phân tích nguyên tố. Máy phân tích kích thước hạt Mastersizer 2000 của Malvern (Worcestershire, Vương quốc Anh) được sử dụng để thu được phân bố kích thước hạt. Naked các hạt silica và các hạt silica liên kết với phối tử (mỗi hạt 5 mg) được phân tán trong 5 mL isopropanol, siêu âm trong 10 phút, tạo xoáy trong 5 phút và đặt trên băng ghế quang học của Mastersizer. Phân tích nhiệt trọng lượng được thực hiện với tốc độ 5 °C mỗi phút trong phạm vi nhiệt độ từ 30 đến 800 °C.
Các cột thép không gỉ có lỗ hẹp được lót kính có kích thước (đường kính trong 100 × 1,8 mm) được đóng gói bằng phương pháp đóng gói bùn, áp dụng quy trình tương tự như trong Tài liệu tham khảo. 31. Một cột thép không gỉ (có lớp lót thủy tinh, đường kính trong 100 × 1,8 mm) có đầu nối đầu ra chứa frit 1 µm được kết nối với bộ đóng gói bùn (Alltech Deerfield, IL, Hoa Kỳ). Chuẩn bị bùn pha tĩnh bằng cách treo 150 mg pha tĩnh trong 1,2 mL methanol và đưa vào cột lưu trữ. Methanol được sử dụng làm dung môi bùn cũng như dung môi đẩy. Làm đầy cột theo trình tự bằng cách tạo áp suất 100 MP trong 10 phút, 80 MP trong 15 phút và 60 MP trong 30 phút. Trong quá trình đóng gói, rung động cơ học được áp dụng với hai máy lắc cột GC (Alltech, Deerfield, IL, Hoa Kỳ) để đảm bảo đóng gói cột đồng đều. Đóng bộ đóng gói bùn và giải phóng áp suất từ ​​từ để tránh bất kỳ hư hỏng nào bên trong cột. Ngắt kết nối cột khỏi bộ đóng gói bùn và kết nối một đầu nối khác với đầu vào và hệ thống LC để kiểm tra hiệu suất của nó.
Bơm LC (10AD Shimadzu, Nhật Bản), bộ phận tiêm (Valco (Hoa Kỳ) C14 W.05) với vòng tiêm 50nL, bộ tách khí màng (Shimadzu DGU-14A), cửa sổ mao quản UV-VIS được chế tạo. Đầu dò thiết bị µLC đặc biệt (UV-2075) và các cột vi mô lót kính. Sử dụng ống kết nối rất hẹp và ngắn để giảm thiểu tác động của việc mở rộng dải cột bổ sung. Sau khi đóng gói, các mao quản (50 μm id 365 và các mao quản liên kết khử (50 μm) được lắp đặt tại đầu ra 1/16″ của liên kết khử. Thu thập dữ liệu và xử lý sắc ký được thực hiện bằng phần mềm Multichro 2000. Giám sát ở 254 nm Các chất phân tích được thử nghiệm về khả năng hấp thụ tia UV. Dữ liệu sắc ký được phân tích bằng OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin từ huyết thanh người, bột đông khô, ≥ 96% (điện di gel agarose) 3 mg trộn với trypsin (1,5 mg), urê 4,0 M (1 mL) và amoni bicarbonate 0,2 M (1 mL). Khuấy dung dịch trong 10 phút và giữ trong bồn nước ở 37°C trong 6 giờ, sau đó làm nguội bằng 1 mL TFA 0,1%. Lọc dung dịch và bảo quản dưới 4°C.
Sự phân tách hỗn hợp peptide và dịch tiêu hóa trypsin HSA được đánh giá riêng biệt trên các cột PMP. Kiểm tra sự phân tách hỗn hợp peptide và dịch tiêu hóa trypsin của HSA bằng cột PMP và so sánh kết quả với cột Ascentis Express RP-Amide. Số đĩa lý thuyết được tính như sau:
Hình ảnh SEM của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết với phối tử được thể hiện trong HÌNH 2. Hình ảnh SEM của các hạt silica trần (A, B) cho thấy, trái ngược với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, các hạt này có hình cầu trong đó các hạt bị kéo dài hoặc có tính đối xứng không đều. Bề mặt của các hạt silica liên kết với phối tử (C, D) mịn hơn bề mặt của các hạt silica trần, điều này có thể là do lớp phủ của các chuỗi polystyrene trên bề mặt của các hạt silica.
Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét của các hạt silica trần (A, B) và các hạt silica liên kết với phối tử (C, D).
Phân bố kích thước hạt của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết với phối tử được thể hiện trong Hình 3(A). Đường cong phân bố kích thước hạt theo thể tích cho thấy kích thước của các hạt silica tăng lên sau khi biến tính hóa học (Hình 3A). Dữ liệu phân bố kích thước hạt của các hạt silica từ nghiên cứu hiện tại và nghiên cứu trước đây được so sánh trong Bảng 1(A). Kích thước hạt theo thể tích, d(0,5), của PMP là 3,36 μm, so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi với giá trị ad(0,5) là 3,05 μm (các hạt silica liên kết với polystyrene)34. Mẻ này có phân bố kích thước hạt hẹp hơn so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi do tỷ lệ PEG, urê, TMOS và axit axetic khác nhau trong hỗn hợp phản ứng. Kích thước hạt của pha PMP lớn hơn một chút so với pha hạt silica liên kết với polystyrene mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đây. Điều này có nghĩa là chức năng hóa bề mặt của các hạt silica với styrene chỉ lắng đọng một lớp polystyrene (0,97 µm) trên bề mặt silica, trong khi ở pha PMP, độ dày lớp là 1,38 µm.
Phân bố kích thước hạt (A) và phân bố kích thước lỗ rỗng (B) của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết với phối tử.
Kích thước lỗ rỗng, thể tích lỗ rỗng và diện tích bề mặt của các hạt silica trong nghiên cứu hiện tại được đưa ra trong Bảng 1(B). Hồ sơ PSD của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử được thể hiện trong Hình 3(B). Các kết quả tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Kích thước lỗ rỗng của các hạt silica trần và liên kết phối tử lần lượt là 310 và 241, điều này cho thấy kích thước lỗ rỗng giảm 69 sau khi biến đổi hóa học, như thể hiện trong Bảng 1(B) và sự thay đổi của đường cong được thể hiện trong Hình 3(B). Tương tự như vậy, thể tích lỗ rỗng của các hạt silica giảm từ 0,67 xuống 0,58 cm3/g sau khi biến đổi hóa học. Diện tích bề mặt riêng của các hạt silica hiện đang nghiên cứu là 116 m2/g, tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (124 m2/g). Như thể hiện trong Bảng 1(B), diện tích bề mặt (m2/g) của các hạt silica cũng giảm từ 116 m2/g xuống 105 m2/g sau khi biến đổi hóa học.
Kết quả phân tích thành phần pha tĩnh được thể hiện ở Bảng 2. Tải lượng cacbon của pha tĩnh hiện tại là 6,35%, thấp hơn tải lượng cacbon trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi (các hạt silica liên kết polystyrene, lần lượt là 7,93%35 và 10,21%) 42. Tải lượng cacbon của pha tĩnh hiện tại thấp, Bởi vì trong quá trình chuẩn bị SP hiện tại, ngoài styrene, một số phối tử phân cực như phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) và 4-hydroxy-TEMPO đã được sử dụng. Phần trăm khối lượng nitơ của pha tĩnh hiện tại là 2,21%, so với 0,1735 và 0,85% theo khối lượng nitơ trong các nghiên cứu trước đây. Điều này có nghĩa là phần trăm khối lượng nitơ cao hơn trong pha tĩnh hiện tại do phenylmaleimide. Tương tự như vậy, tải lượng cacbon của sản phẩm (4) và (5) lần lượt là 2,7% và 2,9%, trong khi tải lượng cacbon của sản phẩm cuối cùng (6) là 6,35%, như thể hiện trong Bảng 2. Sự mất mát trọng lượng đã được kiểm tra bằng pha tĩnh PMP và đường cong TGA được thể hiện trong Hình 4. Đường cong TGA cho thấy sự mất mát trọng lượng là 8,6%, phù hợp với tải lượng carbon (6,35%) vì các phối tử không chỉ chứa C mà còn chứa N, O và H.
Phối tử phenylmaleimide-methylvinylisocyanate được chọn để biến tính bề mặt các hạt silica vì nó có nhóm phenylmaleimide phân cực và nhóm vinylisocyanate. Nhóm vinyl isocyanate có thể phản ứng thêm với styrene bằng phản ứng trùng hợp gốc sống. Lý do thứ hai là chèn một nhóm có tương tác vừa phải với chất phân tích và không có tương tác tĩnh điện mạnh giữa chất phân tích và pha tĩnh, vì phần phenylmaleimide không có điện tích ảo ở pH bình thường. Độ phân cực của pha tĩnh có thể được kiểm soát bằng lượng styrene tối ưu và thời gian phản ứng trùng hợp gốc tự do. Bước cuối cùng của phản ứng (trùng hợp gốc tự do) rất quan trọng và có thể thay đổi độ phân cực của pha tĩnh. Phân tích nguyên tố được thực hiện để kiểm tra lượng cacbon của các pha tĩnh này. Người ta quan sát thấy rằng việc tăng lượng styrene và thời gian phản ứng làm tăng lượng cacbon của pha tĩnh và ngược lại. SP được chuẩn bị với các nồng độ styrene khác nhau có lượng cacbon khác nhau. Một lần nữa, nạp các pha tĩnh này vào các cột thép không gỉ và kiểm tra chúng hiệu suất sắc ký (độ chọn lọc, độ phân giải, giá trị N, v.v.). Dựa trên các thí nghiệm này, một công thức tối ưu đã được chọn để chuẩn bị pha tĩnh PMP nhằm đảm bảo độ phân cực được kiểm soát và khả năng giữ lại chất phân tích tốt.
Năm hỗn hợp peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) cũng được đánh giá bằng cách sử dụng cột PMP với pha động; 60/40 (v/v) acetonitrile/nước (0,1% TFA) ở tốc độ dòng chảy 80 μL/phút. Trong điều kiện rửa giải tối ưu, số đĩa lý thuyết (N) trên mỗi cột (100 × 1,8 mm id) là 20.000 ± 100 (200.000 đĩa/m²). Bảng 3 đưa ra các giá trị N cho ba cột PMP và sắc ký đồ được hiển thị trong Hình 5A. Phân tích nhanh trên cột PMP ở tốc độ dòng chảy cao (700 μL/phút), năm peptide đã được rửa giải trong vòng một phút, giá trị N rất tốt, 13.500 ± 330 trên mỗi cột (100 × 1,8 mm id), Tương ứng với 135.000 đĩa/m (Hình 5B). Ba cột có kích thước giống hệt nhau (100 × 1,8 mm id) được nhồi ba loại khác nhau nhiều pha tĩnh PMP để kiểm tra khả năng tái tạo. Nồng độ chất phân tích cho mỗi cột được ghi lại bằng cách sử dụng các điều kiện rửa giải tối ưu và số lượng đĩa lý thuyết N và thời gian lưu để tách cùng một hỗn hợp thử nghiệm trên mỗi cột. Dữ liệu tái tạo cho các cột PMP được thể hiện trong Bảng 4. Khả năng tái tạo của cột PMP tương quan tốt với các giá trị %RSD rất thấp, như thể hiện trong Bảng 3.
Phân tách hỗn hợp peptide trên cột PMP (B) và cột Ascentis Express RP-Amide (A); pha động 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), kích thước cột PMP (100 × 1,8 mm id); phân tích Thứ tự rửa giải của các hợp chất: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) và 5 (leucine) acid enkephalin)).
Cột PMP (100 × 1,8 mm id) đã được đánh giá để tách các sản phẩm tiêu hóa trypsin của albumin huyết thanh người trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. Sắc ký đồ trong Hình 6 cho thấy mẫu được tách tốt và độ phân giải rất tốt. Các sản phẩm tiêu hóa HSA được phân tích bằng cách sử dụng tốc độ dòng chảy 100 µL/phút, pha động 70/30 acetonitril/nước và 0,1% TFA. Như thể hiện trong sắc ký đồ (Hình 6), sản phẩm tiêu hóa HSA đã được chia thành 17 đỉnh tương ứng với 17 peptide. Hiệu suất tách của từng đỉnh trong sản phẩm tiêu hóa HSA đã được tính toán và các giá trị được đưa ra trong Bảng 5.
Dịch tiêu hóa trypsin của HSA (đường kính trong 100 × 1,8 mm) được tách trên cột PMP; tốc độ dòng chảy (100 µL/phút), pha động 60/40 acetonitril/nước với 0,1% TFA.
trong đó L là chiều dài cột, η là độ nhớt của pha động, ΔP là áp suất ngược của cột và u là vận tốc tuyến tính của pha động. Độ thấm của cột PMP là 2,5 × 10-14 m2, lưu lượng là 25 μL/phút và sử dụng 60/40 v/v ACN/nước. Độ thấm của cột PMP (100 × 1,8 mm id) tương tự như nghiên cứu trước đây của chúng tôi Ref.34. Độ thấm của cột chứa các hạt có bề mặt xốp là: 1,7 × 10-15 đối với các hạt 1,3 μm, 3,1 × 10-15 đối với các hạt 1,7 μm, 5,2 × 10-15 và 2,5 × 10-14 m2 đối với các hạt 2,6 μm Đối với các hạt 5 μm 43. Do đó, độ thấm của pha PMP tương tự như độ thấm của các hạt lõi-vỏ 5 μm.
trong đó Wx là trọng lượng của cột được nhồi bằng clorofom, Wy là trọng lượng của cột được nhồi bằng metanol và ρ là khối lượng riêng của dung môi. Khối lượng riêng của metanol (ρ = 0,7866) và clorofom (ρ = 1,484). Tổng độ xốp của các cột SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 và các cột C18-Urea 31 mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đây lần lượt là 0,63 và 0,55. Điều này có nghĩa là sự hiện diện của các phối tử urê làm giảm độ thấm của pha tĩnh. Mặt khác, tổng độ xốp của cột PMP (100 × 1,8 mm id) là 0,60. Độ thấm của các cột PMP thấp hơn độ thấm của các cột được nhồi bằng các hạt silica liên kết C18 vì trong các pha tĩnh loại C18, các phối tử C18 được gắn vào các hạt silica dưới dạng chuỗi tuyến tính, trong khi trong loại polystyrene pha tĩnh, một lớp polyme tương đối dày được hình thành xung quanh nó. Trong một thí nghiệm điển hình, độ xốp của cột được tính như sau:
Hình 7A, B cho thấy cột PMP (đường kính trong 100 × 1,8 mm) và cột Ascentis Express RP-Amide (đường kính trong 100 × 1,8 mm) sử dụng cùng điều kiện rửa giải (tức là 60/40 ACN/H2O và 0,1% TFA). ) của biểu đồ van Deemter. Các hỗn hợp peptide được chọn (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) được chuẩn bị trong 20 µL/Tốc độ dòng chảy tối thiểu cho cả hai cột là 800 µL/phút. Các giá trị HETP tối thiểu ở tốc độ dòng chảy tối ưu (80 µL/phút) cho cột PMP và cột Ascentis Express RP-Amide lần lượt là 2,6 µm và 3,9 µm. Các giá trị HETP chỉ ra rằng hiệu suất tách của cột PMP (100 × 1,8 mm id) tốt hơn nhiều so với cột Ascentis Express RP-Amide có bán trên thị trường (100 × 1,8 mm id). Biểu đồ van Deemter trong Hình 7(A) cho thấy sự giảm giá trị N khi dòng chảy tăng không đáng kể so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Hiệu suất tách cao hơn của cột PMP (đường kính trong 100 × 1,8 mm) so với cột Ascentis Express RP-Amide dựa trên những cải tiến về hình dạng, kích thước hạt và quy trình đóng gói cột phức tạp được sử dụng trong công trình hiện tại34.
(A) Biểu đồ van Deemter (HETP so với vận tốc tuyến tính của pha động) thu được bằng cách sử dụng cột PMP (đường kính trong 100 × 1,8 mm) trong 60/40 ACN/H2O với 0,1% TFA. (B) Biểu đồ van Deemter (HETP so với vận tốc tuyến tính của pha động) thu được bằng cách sử dụng cột Ascentis Express RP-Amide (đường kính trong 100 × 1,8 mm) trong 60/40 ACN/H2O với 0,1% TFA.
Pha tĩnh polystyrene nhúng phân cực đã được chuẩn bị và đánh giá để tách hỗn hợp peptide tổng hợp và dịch tiêu hóa trypsin của albumin huyết thanh người (HAS) trong sắc ký lỏng hiệu suất cao. Hiệu suất sắc ký của cột PMP cho hỗn hợp peptide là tuyệt vời về hiệu quả tách và độ phân giải. Hiệu suất tách được cải thiện của cột PMP là do nhiều lý do, chẳng hạn như kích thước hạt và kích thước lỗ rỗng của các hạt silica, tổng hợp pha tĩnh được kiểm soát và đóng gói cột phức tạp. Ngoài hiệu quả tách cao, áp suất ngược cột thấp ở tốc độ dòng chảy cao là một ưu điểm khác của pha tĩnh này. Cột PMP thể hiện khả năng tái tạo tốt và có thể được sử dụng để phân tích hỗn hợp peptide và dịch tiêu hóa trypsin của nhiều loại protein khác nhau. Chúng tôi dự định sử dụng cột này để tách các sản phẩm tự nhiên, hợp chất hoạt tính sinh học từ cây thuốc và chiết xuất nấm trong sắc ký lỏng. Trong tương lai, cột PMP cũng sẽ được đánh giá để tách protein và kháng thể đơn dòng.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha đảo ngược Phần I: Phát triển giao thức đặc tính cột.J. Sắc ký.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Cải tiến các peptide hoạt tính được thiết kế để điều trị các bệnh truyền nhiễm. Công nghệ sinh học. Nâng cao. 36 (2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptide trị liệu tổng hợp: khoa học và thị trường. khám phá thuốc. 15 (1-2) ngày nay, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Sắc ký lỏng nâng cao.J. Sắc ký.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Sắc ký lỏng tiên tiến-phổ khối cho phép kết hợp các nghiên cứu về chuyển hóa và protein có mục tiêu rộng. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Vai trò của UHPLC trong phát triển thuốc.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Các khía cạnh cơ bản và thực tế của sắc ký lỏng áp suất cực cao để tách nhanh. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu suất cực cao trong phát triển thuốc.J. Sắc ký.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hydrogel xốp đơn khối được chế tạo từ nhũ tương pha bên trong dầu trong nước để làm sạch hiệu quả enterovirus. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu về protein.J. Sắc ký.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Xu hướng mới nổi trong việc tách sắc ký lỏng pha đảo ngược của các peptit và protein điều trị: lý thuyết và ứng dụng.J. Dược học.Khoa học Y sinh.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Phân tách hai chiều của peptide bằng hệ thống RP-RP-HPLC sử dụng các giá trị pH khác nhau ở chiều phân tách thứ nhất và thứ hai.J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Đặc tính truyền khối và hiệu suất động học của các cột sắc ký hiệu suất cao chứa các hạt C18 dưới 2 μm có độ xốp hoàn toàn và bề mặt đã được nghiên cứu.J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Xu hướng gần đây và những thách thức phân tích trong việc phân lập, xác định và xác nhận các peptide hoạt tính sinh học thực vật.anus.anus sinh học.Hóa học.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB và cộng sự.Bối cảnh proteomic của vương quốc sự sống.Thiên nhiên 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Xử lý hạ nguồn các peptide điều trị bằng sắc ký lỏng điều chế.Phân tử (Basel, Thụy Sĩ) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký chế độ hỗn hợp và ứng dụng của nó vào các polyme sinh học.J. Sắc ký.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Các phối tử cho sắc ký protein chế độ hỗn hợp: nguyên lý, đặc điểm và thiết kế.J. Công nghệ sinh học.144(1), 3-11 (2009).