Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Partikel silika berpori disiapake kanthi metode sol-gel kanthi sawetara modifikasi kanggo entuk partikel makropori. Partikel-partikel iki diderivatisasi kanthi polimerisasi transfer rantai fragmentasi tambahan sing bisa dibalik (RAFT) karo N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) lan stirena kanggo nyiapake interkalasi N-phenylmaleimide saka fase diam polistirena (PMP). Kolom baja tahan karat sempit (100 × 1,8 mm id) dikemas kanthi kemasan bubur. Pamisahan kolom PMP sing dievaluasi saka campuran peptida sing kasusun saka limang peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkephalin) kinerja kromatografi) lan pencernaan tripsin albumin serum manungsa (HAS). Ing kahanan elusi optimal, jumlah lempeng teoretis saka campuran peptida nganti 280.000 lempeng/m². Mbandhingake kinerja pamisahan kolom sing dikembangake karo Ascentis komersial Ing kolom RP-Amida Ekspres, diamati manawa kinerja pamisahan kolom PMP luwih unggul tinimbang kolom komersial ing babagan efisiensi lan resolusi pamisahan.
Ing taun-taun pungkasan, industri biofarmasi wis dadi pasar global sing saya tambah kanthi peningkatan pangsa pasar sing substansial. Kanthi pertumbuhan industri biofarmasi sing eksplosif1,2,3, analisis peptida lan protein banget dikarepake. Saliyane peptida target, sawetara pengotor diasilake sajrone sintesis peptida, saengga mbutuhake pemurnian kromatografi kanggo entuk peptida kanthi kemurnian sing dikarepake. Analisis lan karakterisasi protein ing cairan awak, jaringan, lan sel minangka tugas sing angel banget amarga akeh spesies sing bisa dideteksi ing siji sampel. Sanajan spektrometri massa minangka alat sing efektif kanggo sekuensing peptida lan protein, yen sampel kasebut disuntikake menyang spektrometer massa sekaligus, pamisahan kasebut ora bakal ideal. Masalah iki bisa dikurangi kanthi ngetrapake pamisahan kromatografi cair (LC) sadurunge analisis MS, sing bakal nyuda jumlah analit sing mlebu spektrometer massa ing wektu tartamtu4,5,6. Kajaba iku, sajrone pamisahan fase cair, analit bisa difokusake ing wilayah sing sempit, saengga ngonsentrasikan analit kasebut lan nambah sensitivitas deteksi MS. Kromatografi cair (LC) wis maju banget sajrone dasawarsa kepungkur lan wis dadi teknik populer ing analisis proteomik7,8,9,10.
Kromatografi cair fase terbalik (RP-LC) digunakake sacara wiyar kanggo pemurnian lan pamisahan campuran peptida nggunakake silika sing dimodifikasi oktadesil (ODS) minangka fase stasioner11,12,13. Nanging, fase stasioner RP ora nyedhiyakake pamisahan peptida lan protein sing marem amarga struktur kompleks lan sifat amfifilik 14,15. Mulane, fase stasioner sing dirancang khusus dibutuhake kanggo nganalisis peptida lan protein kanthi gugus polar lan non-polar kanggo sesambungan lan nahan analit kasebut16. Kromatografi mode campuran, sing nyedhiyakake interaksi multimodal, bisa dadi alternatif kanggo RP-LC kanggo pamisahan peptida, protein, lan campuran kompleks liyane. Sawetara fase stasioner mode campuran wis disiapake, lan kolom sing dikemas karo fase kasebut wis digunakake kanggo pamisahan peptida lan protein17,18,19,20,21. Fase stasioner mode campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) cocok kanggo pamisahan peptida lan protein amarga anané polar lan gugus non-polar22,23,24,25,26,27,28. Kajaba iku, fase stasioner interkalasi polar karo gugus polar sing ikatan kovalen nuduhake daya pamisahan sing apik lan selektivitas unik kanggo analit polar lan non-polar, amarga pamisahan gumantung saka interaksi antarane analit lan fase stasioner. Interaksi multimodal 29, 30, 31, 32. Bubar, Zhang et al. 30 nyiyapake fase stasioner poliamina sing diakhiri dodesil lan kasil misahake hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukleosida, estrogen, lan sawetara analit liyane. Interkalator polar duwe gugus polar lan non-polar, saengga bisa digunakake kanggo misahake peptida lan protein sing duwe gugus hidrofobik lan hidrofilik. Kolom sing dipasang polar (contone, kolom C18 sing dipasang amida) kasedhiya sacara komersial kanthi jeneng dagang kolom Ascentis Express RP-Amide, nanging kolom iki mung digunakake kanggo analisis amina 33.
Ing panliten saiki, fase stasioner sing dipasang polar (polistirena sing dipasang N-phenylmaleimide) disiapake lan dievaluasi kanggo pamisahan peptida lan dicerna tripsin saka HSA. Fase stasioner disiapake nggunakake strategi ing ngisor iki. Partikel silika berpori disiapake miturut prosedur sing diwenehake ing publikasi sadurunge kanthi sawetara modifikasi protokol persiapan. Rasio urea, polietilen glikol (PEG), TMOS, asam asetat banyu diatur kanggo nyiyapake partikel silika kanthi ukuran pori gedhe. Kapindho, ligan anyar, fenilmaleimide-metil vinil isosianat, disintesis lan digunakake kanggo derivatisasi partikel silika kanggo nyiyapake fase stasioner sing dipasang polar. Fase stasioner sing diasilake dikemas menyang kolom baja tahan karat (100 × 1,8 mm id) nggunakake skema pengepakan sing dioptimalake. Pengepakan kolom dibantu karo getaran mekanik kanggo mesthekake yen amben homogen dibentuk ing kolom. Evaluasi pamisahan kolom sing dikemas saka campuran peptida sing kasusun saka limang peptida; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) lan pencernaan Tripsin saka albumin serum manungsa (HAS). Campuran peptida lan pencernaan tripsin saka HSA diamati misah kanthi resolusi lan efisiensi sing apik. Kinerja pamisahan kolom PMP dibandhingake karo kolom Ascentis Express RP-Amide. Peptida lan protein diamati disolusi kanthi apik lan efisien ing kolom PMP, sing luwih efisien tinimbang kolom Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, Asam Asetat, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Tripsin, Human Serum Albumin (HSA), Amonium Klorida, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Metacryloyl Chloride (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Metanol, 2-Propanol, lan Aseton Dituku saka Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Campuran urea (8 g), polietilen glikol (8 g), lan 8 mL asam asetat 0,01 N diudhek suwene 10 menit, banjur 24 mL TMOS ditambahake ing kahanan adhem banget. Campuran reaksi dipanasake ing suhu 40°C suwene 6 jam lan banjur ing suhu 120°C suwene 8 jam ing autoklaf stainless steel. Banyune dibuwang lan bahan sing isih ana dikeringake ing suhu 70°C suwene 12 jam. Massa alus sing wis garing digiling alus ing oven lan dikalsinasi ing suhu 550°C suwene 12 jam. Telung batch disiapake lan dikarakterisasi kanggo mriksa reproduksibilitas ing ukuran partikel, ukuran pori, lan area permukaan.
Kanthi modifikasi permukaan partikel silika nganggo ligan pra-sintesis fenilaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) sing diterusake polimerisasi radial nganggo stirena, senyawa sing ngemot gugus polar disiapake. Fase stasioner kanggo agregat lan rantai polistirena. Proses persiapan diterangake ing ngisor iki.
N-fenilmaleimida (200 mg) lan metil vinil isosianat (100 mg) dilarutake ing toluena garing, lan 0,1 mL 2,2′-azoisobutironitrile (AIBN) ditambahake menyang labu reaksi kanggo nyiyapake kopolimer fenilmaleimida-metil vinil isosianat (PMCP). Campuran kasebut dipanasake ing suhu 60°C suwene 3 jam, disaring lan dikeringake ing oven ing suhu 40°C suwene 3 jam.
Partikel silika garing (2 g) disebar ing toluena garing (100 mL), diaduk lan disonikasi ing labu dasar bunder 500 mL suwene 10 menit. PMCP (10 mg) dilarutake ing toluena lan ditambahake tetes demi tetes menyang labu reaksi liwat corong tetes. Campuran kasebut direfluks ing suhu 100°C suwene 8 jam, disaring lan dicuci nganggo aseton lan dikeringake ing suhu 60°C suwene 3 jam. Banjur, partikel silika sing diikat PMCP (100 g) dilarutake ing toluena (200 ml) lan 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) ditambahake kanthi anané 100 µL dibutiltin dilaurat minangka katalis. Campuran kasebut diaduk ing suhu 50°C suwene 8 jam, disaring lan dikeringake ing suhu 50°C suwene 3 jam.
Stirena (1 mL), benzoil peroksida BPO (0,5 mL), lan partikel silika sing ditempelake TEMPO-PMCP (1,5 g) disebarake ing toluena lan diresiki nganggo nitrogen. Polimerisasi stirena ditindakake ing suhu 100°C sajrone 12 jam. Produk sing diasilake dicuci nganggo metanol lan dikeringake ing suhu 60°C sewengi. Skema reaksi sakabèhé dituduhake ing Gambar 1.
Sampel-sampel kasebut didegas ing suhu 393 K sajrone 1 jam kanggo entuk tekanan residual kurang saka 10-3 Torr. Jumlah N2 sing diserap ing tekanan relatif P/P0 = 0,99 digunakake kanggo nemtokake volume pori total. Morfologi partikel silika gundhul lan ikatan ligan ditliti nganggo mikroskop elektron pindai (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepang). Sampel sing wis garing (silika gundhul lan partikel silika ikatan ligan) dilebokake ing kolom aluminium nggunakake pita karbon perekat. Emas dilapisi ing sampel nggunakake coater sputter Q150T, lan lapisan Au 5 nm diendapkan ing sampel. Iki nambah efisiensi proses nggunakake voltase rendah lan nyedhiyakake butiran alus, sputtering adhem. Penganalisis elemen Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 digunakake kanggo analisis elemen. Penganalisis ukuran partikel Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 digunakake kanggo entuk distribusi ukuran partikel. Partikel silika gundhul lan silika ikatan ligan Partikel (saben 5 mg) disebar ing 5 mL isopropanol, disonikasi sajrone 10 menit, divorteks sajrone 5 menit, lan diselehake ing meja optik Mastersizer. Analisis termogravimetri ditindakake kanthi kecepatan 5 °C saben menit ing kisaran suhu 30 nganti 800 °C.
Kolom bor sempit baja tahan karat berlapis kaca kanthi dimensi (100 × 1,8 mm id) dikemas nggunakake metode pengepakan bubur, ngetrapake prosedur sing padha sing digunakake ing Ref. 31. Kolom baja tahan karat (dilapisi kaca, 100 × 1,8 mm id) kanthi fitting outlet sing ngemot frit 1 µm disambungake menyang slurry packer (Alltech Deerfield, IL, USA). Siapke slurry fase stasioner kanthi nggantungake 150 mg fase stasioner ing 1,2 mL metanol lan kirim menyang kolom panyimpenan. Metanol digunakake minangka pelarut slurry uga pelarut propeller. Isi kolom kanthi runtut kanthi menehi tekanan 100 MP sajrone 10 menit, 80 MP sajrone 15 menit, lan 60 MP sajrone 30 menit. Sajrone pengepakan, getaran mekanik ditrapake nganggo rong shaker kolom GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) kanggo njamin pengepakan kolom sing seragam. Tutup slurry packer lan lepasake tekanan alon-alon kanggo nyegah kerusakan ing kolom. Pedhot sambungan kolom saka unit pengepakan slurry lan sambungake fitting liyane menyang inlet lan menyang sistem LC kanggo mriksa kinerjane.
Pompa LC (10AD Shimadzu, Jepang), injektor (Valco (USA) C14 W.05) nganggo loop injeksi 50nL, degasser membran (Shimadzu DGU-14A), jendela kapiler UV-VIS dibangun. Detektor piranti µLC khusus (UV-2075) lan mikrokolom berlapis kaca. Gunakake tabung penghubung sing sempit banget lan cendhak kanggo nyuda efek pelebaran pita kolom ekstra. Sawise kemasan, kapiler (50 μm id 365 lan kapiler serikat reduksi (50 μm) dipasang ing outlet 1/16″ saka serikat reduksi. Pengumpulan data lan pangolahan kromatografi ditindakake nggunakake piranti lunak Multichro 2000. Pemantauan ing 254 nm Analit diuji kanggo absorbansi UV. Data kromatografi dianalisis dening OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin saka serum manungsa, bubuk liofilisasi, ≥ 96% (elektroforesis gel agarose) 3 mg dicampur karo tripsin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 mL), lan 0,2 M amonium bikarbonat (1 mL). Larutan kasebut diudhek suwene 10 menit lan disimpen ing bak banyu ing suhu 37°C suwene 6 jam, banjur didinginkan nganggo 1 mL 0,1% TFA. Saring larutan kasebut lan simpen ing ngisor 4 °C.
Pamisahan campuran peptida lan digest tripsin HSA dievaluasi kanthi kapisah ing kolom PMP. Priksa pamisahan campuran peptida lan digest tripsin HSA dening kolom PMP lan bandhingake asil karo kolom Ascentis Express RP-Amide. Nomer plat teoretis diitung kaya ing ngisor iki:
Gambar SEM partikel silika gundhul lan partikel silika sing ikatan ligan dituduhake ing Gambar 2. Gambar SEM partikel silika gundhul (A, B) nuduhake yen, beda karo panliten sadurunge, partikel kasebut awujud bunder sing partikel-partikel kasebut dawa utawa duwe simetri sing ora teratur. Permukaan partikel silika sing ikatan ligan (C, D) luwih alus tinimbang partikel silika gundhul, sing bisa uga amarga lapisan rantai polistirena ing permukaan partikel silika.
Gambar mikroskop elektron pindai saka partikel silika kosong (A, B) lan partikel silika sing kaiket ligan (C, D).
Distribusi ukuran partikel partikel silika kosong lan partikel silika sing kaiket ligan dituduhake ing Gambar 3(A). Kurva distribusi ukuran partikel adhedhasar volume nuduhake yen ukuran partikel silika mundhak sawise modifikasi kimia (Gambar 3A). Data distribusi ukuran partikel partikel silika saka panliten saiki lan panliten sadurunge dibandhingake ing Tabel 1(A). Ukuran partikel adhedhasar volume, d(0.5), saka PMP yaiku 3,36 μm, dibandhingake karo panliten sadurunge kanthi nilai ad(0.5) 3,05 μm (partikel silika sing kaiket polistirena)34. Batch iki duwe distribusi ukuran partikel sing luwih sempit dibandhingake karo panliten sadurunge amarga rasio PEG, urea, TMOS, lan asam asetat sing beda-beda ing campuran reaksi. Ukuran partikel fase PMP rada luwih gedhe tinimbang fase partikel silika sing kaiket polistirena sing wis ditliti sadurunge. Iki tegese fungsionalisasi permukaan partikel silika karo stirena mung ngendap lapisan polistirena (0,97 µm) ing permukaan silika, dene ing fase PMP kekandelan lapisan kasebut 1,38 µm.
Distribusi ukuran partikel (A) lan distribusi ukuran pori (B) partikel silika kosong lan partikel silika sing kaiket ligan.
Ukuran pori, volume pori, lan luas permukaan partikel silika saka panliten saiki diwenehake ing Tabel 1(B). Profil PSD partikel silika kosong lan partikel silika sing kaiket ligan dituduhake ing Gambar 3(B). Asil kasebut bisa dibandhingake karo panliten sadurunge. Ukuran pori partikel silika kosong lan kaiket ligan yaiku 310 lan 241, sing nuduhake yen ukuran pori mudhun 69 sawise modifikasi kimia, kaya sing dituduhake ing Tabel 1(B), lan owah-owahan kurva dituduhake ing Gambar 3(B). Kajaba iku, volume pori partikel silika mudhun saka 0,67 dadi 0,58 cm3/g sawise modifikasi kimia. Luas permukaan spesifik partikel silika sing lagi ditliti yaiku 116 m2/g, sing bisa dibandhingake karo panliten sadurunge (124 m2/g). Kaya sing dituduhake ing Tabel 1(B), luas permukaan (m2/g) partikel silika uga mudhun saka 116 m2/g dadi 105 m2/g sawise kimia. modifikasi.
Asil analisis unsur fase diam dituduhake ing Tabel 2. Beban karbon saka fase diam saiki yaiku 6,35%, sing luwih murah tinimbang beban karbon saka panliten sadurunge (partikel silika sing diikat polistirena, 7,93%35 lan 10,21%, masing-masing) 42. Beban karbon saka fase diam saiki kurang, Amarga ing persiapan SP saiki, saliyane stirena, sawetara ligan polar kayata fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) lan 4-hidroksi-TEMPO digunakake. Persen bobot nitrogen saka fase diam saiki yaiku 2,21%, dibandhingake karo 0,1735 lan 0,85% bobot nitrogen ing panliten sadurunge. Iki tegese % bobot nitrogen luwih dhuwur ing fase diam saiki amarga fenilmaleimida. Kajaba iku, beban karbon produk (4) lan (5) yaiku 2,7% lan 2,9%, masing-masing, dene beban karbon saka final Produk (6) yaiku 6,35%, kaya sing dituduhake ing Tabel 2. Penurunan bobot dicek nganggo fase stasioner PMP, lan kurva TGA dituduhake ing Gambar 4. Kurva TGA nuduhake penurunan bobot 8,6%, sing cocog karo pemuatan karbon (6,35%) amarga ligan ora mung ngandhut C nanging uga N, O, lan H.
Ligan fenilaleimida-metilvinilisosianat dipilih kanggo modifikasi permukaan partikel silika amarga nduweni gugus fenilaleimida polar lan gugus vinilisosianat. Gugus vinil isosianat bisa luwih reaksi karo stirena kanthi polimerisasi radikal urip. Alesan kapindho yaiku kanggo nglebokake gugus sing nduweni interaksi moderat karo analit lan ora ana interaksi elektrostatik sing kuwat antarane analit lan fase stasioner, amarga gugus fenilaleimida ora nduweni muatan virtual ing pH normal. Polaritas fase stasioner bisa dikontrol dening jumlah stirena sing optimal lan wektu reaksi polimerisasi radikal bebas. Langkah pungkasan saka reaksi (polimerisasi radikal bebas) penting banget lan bisa ngganti polaritas fase stasioner. Analisis unsur ditindakake kanggo mriksa pemuatan karbon saka fase stasioner iki. Diamati yen nambah jumlah stirena lan wektu reaksi nambah pemuatan karbon saka fase stasioner lan kosok balene. SP sing disiapake kanthi konsentrasi stirena sing beda duwe pemuatan karbon sing beda. Maneh, muat fase stasioner iki menyang kolom baja tahan karat lan priksa kinerja kromatografi. (selektivitas, resolusi, nilai N, lan liya-liyane). Adhedhasar eksperimen kasebut, formulasi sing dioptimalake dipilih kanggo nyiyapake fase stasioner PMP kanggo njamin polaritas sing dikontrol lan retensi analit sing apik.
Lima campuran peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkephalin) uga dievaluasi nggunakake kolom PMP nggunakake fase gerak; 60/40 (v/v) asetonitril/banyu (0,1% TFA) kanthi laju aliran 80 μL/menit. Ing kahanan elusi optimal, nomer plat teoretis (N) saben kolom (100 × 1,8 mm id) yaiku 20.000 ± 100 (200.000 plat/m²). Tabel 3 menehi nilai N kanggo telung kolom PMP lan kromatogram dituduhake ing Gambar 5A. Analisis cepet ing kolom PMP kanthi laju aliran dhuwur (700 μL/menit), limang peptida dielusi sajrone sakmenit, nilai N apik banget, 13.500 ± 330 saben kolom (100 × 1,8 mm id), Cocog karo 135.000 plat/m (Gambar 5B). Telung kolom sing ukurane padha (100 × 1,8 mm id) dikemas karo telung lot fase stasioner PMP sing beda kanggo mriksa reproduktibilitas. Konsentrasi analit kanggo saben kolom dicathet nggunakake kondisi elusi optimal lan jumlah pelat teoretis N lan wektu retensi kanggo misahake campuran uji sing padha ing saben kolom. Data reprodusibilitas kanggo kolom PMP dituduhake ing Tabel 4. Reprodusibilitas kolom PMP berkorelasi apik karo nilai %RSD sing sithik banget, kaya sing dituduhake ing Tabel 3.
Pamisahan campuran peptida ing kolom PMP (B) lan kolom Ascentis Express RP-Amide (A); fase gerak 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensi kolom PMP (100 × 1,8 mm id); analitis Urutan elusi senyawa: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) lan 5 (leusin) asam enkephalin)).
Kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dievaluasi kanggo misahake digest triptik albumin serum manungsa ing kromatografi cair kinerja dhuwur. Kromatogram ing Gambar 6 nuduhake yen sampel kasebut dipisahake kanthi apik lan resolusine apik banget. Digest HSA dianalisis nggunakake laju aliran 100 µL/menit, fase gerak 70/30 asetonitril/banyu lan 0,1% TFA. Kaya sing dituduhake ing kromatogram (Gambar 6), pencernaan HSA wis dipérang dadi 17 puncak sing cocog karo 17 peptida. Efisiensi pamisahan saben puncak ing digest HSA diitung lan nilaine diwenehake ing Tabel 5.
Digest triptik HSA (100 × 1,8 mm id) dipisahake ing kolom PMP; laju aliran (100 µL/menit), fase gerak 60/40 asetonitril/banyu karo 0,1% TFA.
ing ngendi L minangka dawa kolom, η minangka viskositas fase gerak, ΔP minangka tekanan balik kolom, lan u minangka kecepatan linier fase gerak. Permeabilitas kolom PMP yaiku 2,5 × 10-14 m2, laju aliran yaiku 25 μL/menit, lan 60/40 v/v ACN/banyu digunakake. Permeabilitas kolom PMP (100 × 1,8 mm id) padha karo panliten sadurunge Ref.34. Permeabilitas kolom sing dikemas karo partikel berpori superfisial yaiku: 1,7 × 10-15 kanggo partikel 1,3 μm, 3,1 × 10-15 kanggo partikel 1,7 μm, 5,2 × 10-15 lan 2,5 × 10-14 m2 kanggo partikel 2,6 μm Kanggo partikel 5 μm 43. Mulane, permeabilitas fase PMP padha karo partikel inti-cangkang 5 μm.
ing ngendi Wx minangka bobot kolom sing dikemas karo kloroform, Wy minangka bobot kolom sing dikemas karo metanol, lan ρ minangka kapadhetan pelarut. Kapadhetan metanol (ρ = 0,7866) lan kloroform (ρ = 1,484). Porositas total kolom SILIKA PARTIKEL-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 lan kolom C18-Urea 31 sing wis ditliti sadurunge yaiku 0,63 lan 0,55. Iki tegese anané ligan urea nyuda permeabilitas fase stasioner. Ing sisih liya, porositas total kolom PMP (100 × 1,8 mm id) yaiku 0,60. Permeabilitas kolom PMP luwih murah tinimbang kolom sing dikemas karo partikel silika sing diikat C18 amarga ing fase stasioner tipe C18, ligan C18 dipasang ing partikel silika minangka rantai linier, dene ing fase stasioner tipe polistirena, lapisan polimer sing relatif kandel dibentuk ing sekitar Ing eksperimen khas, porositas kolom diitung kaya ing ngisor iki:
Gambar 7A, B nuduhake kolom PMP (100 × 1,8 mm id) lan kolom Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) nggunakake kondisi elusi sing padha (yaiku, 60/40 ACN/H2O lan 0,1% TFA). ) saka plot van Deemter. Campuran peptida sing dipilih (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) disiapake ing 20 µL/. Laju aliran minimal kanggo kaloro kolom yaiku 800 µL/menit. Nilai HETP minimal ing laju aliran optimal (80 µL/menit) kanggo kolom PMP lan kolom Ascentis Express RP-Amide yaiku 2,6 µm lan 3,9 µm. Nilai HETP nuduhake yen efisiensi pamisahan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) luwih apik tinimbang kolom Ascentis Express RP-Amide sing kasedhiya sacara komersial (100 × 1,8 mm id). Plot van Deemter ing Gambar 7(A) nuduhake yen penurunan nilai N kanthi aliran sing saya tambah ora signifikan dibandhingake karo panliten sadurunge. Efisiensi pamisahan kolom PMP sing luwih dhuwur (100 × 1,8 mm id) dibandhingake karo kolom Ascentis Express RP-Amide adhedhasar perbaikan ing bentuk partikel, ukuran, lan prosedur pengepakan kolom kompleks sing digunakake ing karya saiki34.
(A) plot van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) sing dipikolehi nggunakake kolom PMP (100 × 1,8 mm id) ing 60/40 ACN/H2O kanthi 0,1% TFA. (B) plot van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) sing dipikolehi nggunakake kolom Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) ing 60/40 ACN/H2O kanthi 0,1% TFA.
Fase stasioner polistirena sing dipasang polar wis disiapake lan dievaluasi kanggo misahake campuran peptida sintetik lan dicerna tripsin saka albumin serum manungsa (HAS) ing kromatografi cair kinerja dhuwur. Kinerja kromatografi kolom PMP kanggo campuran peptida apik banget ing efisiensi lan resolusi pamisahan. Kinerja pamisahan kolom PMP sing luwih apik amarga macem-macem alasan, kayata ukuran partikel lan ukuran pori partikel silika, sintesis fase stasioner sing dikontrol, lan pengepakan kolom kompleks. Saliyane efisiensi pamisahan sing dhuwur, tekanan balik kolom sing kurang ing tingkat aliran sing dhuwur minangka kauntungan liyane saka fase stasioner iki. Kolom PMP nuduhake reproduksibilitas sing apik lan bisa digunakake kanggo analisis campuran peptida lan pencernaan tripsin saka macem-macem protein. Kita duwe niat kanggo nggunakake kolom iki kanggo misahake produk alami, senyawa bioaktif saka tanduran obat lan ekstrak jamur ing kromatografi cair. Ing mangsa ngarep, kolom PMP uga bakal dievaluasi kanggo misahake protein lan antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Riset babagan Sistem Pamisahan Peptida kanthi Kromatografi Fase Terbalik Bagian I: Pengembangan Protokol Karakterisasi Kolom. J. Kromatografi.1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptida aktif sing luwih apik sing dirancang kanggo perawatan penyakit infeksi. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetis: ilmu pengetahuan lan pasar. panemuan obat.15 (1-2) dina iki, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi Cair Proteomik Lanjut.J. Kromatografi.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografi cair-spektrometri massa canggih mbisakake penggabungan metabolomik lan proteomik sing ditargetkan sacara wiyar. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Perané UHPLC ing pangembangan obat. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspek dhasar lan praktis kromatografi cair tekanan ultra dhuwur kanggo pamisahan cepet. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikasi kromatografi cair kinerja ultra-tinggi ing pangembangan obat. J. Kromatografi.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogel makropori monolitik sing disiapake saka emulsi fase internal dhuwur lenga-ing-banyu kanggo pemurnian enterovirus sing efisien. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Perané kromatografi cair ing proteomik.J. Kromatografi.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Tren sing muncul ing pamisahan kromatografi cair fase terbalik saka peptida lan protein terapeutik: teori lan aplikasi. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pamisahan peptida rong dimensi nggunakake sistem RP-RP-HPLC nggunakake nilai pH sing beda ing dimensi pamisahan pisanan lan kapindho. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Karakteristik transfer massa lan kinerja kinetik kolom kromatografi efisiensi dhuwur sing dikemas karo partikel C18 sub-2 μm sing keropos kanthi lengkap lan superfisial wis diselidiki. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tren anyar lan tantangan analitis ing isolasi, identifikasi lan validasi peptida bioaktif tanduran. anus. biological anus. Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Lanskap proteomik saka kerajaan urip. Alam 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Pangolahan hilir peptida terapeutik kanthi kromatografi cair preparatif. Molekul (Basel, Swiss) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran lan aplikasine kanggo biopolimer.J. Kromatografi.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligand kanggo kromatografi protein mode campuran: prinsip, karakterisasi, lan desain. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).