Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कंपॅटिबिलिटी मोड बंद करा). यादरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय प्रदर्शित करू.
मॅक्रोपोरस कण मिळवण्यासाठी काही सुधारणांसह सोल-जेल पद्धतीने सच्छिद्र सिलिका कण तयार करण्यात आले. हे कण एन-फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलआयसोसायनेट (PMI) आणि स्टायरिनसह रिव्हर्सिबल ॲडिशन फ्रॅगमेंटेशन चेन ट्रान्सफर (RAFT) पॉलिमरायझेशनद्वारे डेरिव्हेटाइज करून एन-फेनिलमेलिमाइड इंटरकॅलेशन ऑफ पॉलिस्टायरिन (PMP) स्टेशनरी फेज तयार करण्यात आली. अरुंद-छिद्राचे स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी आयडी) स्लरी पॅकिंगद्वारे भरण्यात आले. पाच पेप्टाइड्स (ग्लाय-टायर, ग्लाय-ल्यू-टायर, ग्लाय-ग्लाय-टायर-आर्ग, टायर-आयले-ग्लाय-सेर-आर्ग, ल्युसिन एन्केफॅलिन) असलेल्या पेप्टाइड मिश्रणाचे PMP कॉलमद्वारे विलगीकरण (क्रोमॅटोग्राफिक कार्यक्षमता) आणि मानवी सीरम अल्ब्युमिनचे (HAS) ट्रायप्सिन पचन यांचे मूल्यांकन करण्यात आले. इष्टतम इल्युशन परिस्थितीत, पेप्टाइड मिश्रणाची सैद्धांतिक प्लेट संख्या 280,000 इतकी जास्त आहे. प्लेट्स/मी². विकसित कॉलमच्या विलगीकरण कामगिरीची व्यावसायिक असेन्टिस एक्सप्रेस आरपी-अमाइड कॉलमशी तुलना केल्यावर, असे दिसून आले की विलगीकरण कार्यक्षमता आणि रिझोल्यूशनच्या बाबतीत पीएमपी कॉलमची विलगीकरण कामगिरी व्यावसायिक कॉलमपेक्षा सरस होती.
अलिकडच्या वर्षांत, बायोफार्मास्युटिकल उद्योग हा बाजारपेठेतील हिश्श्यात लक्षणीय वाढीसह एक विस्तारणारी जागतिक बाजारपेठ बनला आहे. बायोफार्मास्युटिकल उद्योगाच्या प्रचंड वाढीमुळे¹,²,³, पेप्टाइड्स आणि प्रथिनांच्या विश्लेषणाला खूप महत्त्व आहे. लक्ष्यित पेप्टाइड व्यतिरिक्त, पेप्टाइड संश्लेषणादरम्यान अनेक अशुद्धी निर्माण होतात, त्यामुळे इच्छित शुद्धतेचे पेप्टाइड्स मिळवण्यासाठी क्रोमॅटोग्राफिक शुद्धीकरणाची आवश्यकता असते. शरीरातील द्रव, ऊती आणि पेशींमधील प्रथिनांचे विश्लेषण आणि वैशिष्ट्यीकरण हे एक अत्यंत आव्हानात्मक कार्य आहे, कारण एकाच नमुन्यात मोठ्या संख्येने संभाव्य शोधण्यायोग्य प्रजाती असतात. जरी मास स्पेक्ट्रोमेट्री हे पेप्टाइड आणि प्रथिनांच्या अनुक्रमणासाठी एक प्रभावी साधन असले तरी, जर असे नमुने एकाच पासमध्ये मास स्पेक्ट्रोमीटरमध्ये इंजेक्ट केले गेले, तर विलगीकरण आदर्श होणार नाही. ही समस्या एमएस विश्लेषणापूर्वी लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (एलसी) विलगीकरण लागू करून कमी केली जाऊ शकते, ज्यामुळे एका वेळी मास स्पेक्ट्रोमीटरमध्ये प्रवेश करणाऱ्या विश्लेषकांची संख्या कमी होईल⁴,⁵,⁶. याव्यतिरिक्त, द्रव अवस्थेतील विलगीकरणादरम्यान, विश्लेषकांना अरुंद प्रदेशात केंद्रित केले जाऊ शकते, ज्यामुळे हे विश्लेषक केंद्रित होतात आणि एमएस डिटेक्शन सुधारते. संवेदनशीलता. लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (LC) मध्ये गेल्या दशकात लक्षणीय प्रगती झाली आहे आणि प्रोटीओमिक विश्लेषणात हे एक लोकप्रिय तंत्र बनले आहे7,8,9,10.
रिव्हर्स्ड-फेज लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (RP-LC) ही ऑक्टाडेसिल-मॉडिफाइड सिलिका (ODS) स्थिर फेज म्हणून वापरून पेप्टाइड मिश्रणांच्या शुद्धीकरण आणि विलगिकरणासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरली जाते¹¹,¹²,¹³. तथापि, RP स्थिर फेज त्यांच्या जटिल संरचनेमुळे आणि उभयधर्मी (amphiphilic) स्वरूपामुळे पेप्टाइड्स आणि प्रथिनांचे समाधानकारक विलगिकरण करत नाहीत¹⁴,¹⁵. म्हणून, ध्रुवीय (polar) आणि अध्रुवीय (non-polar) घटकांसह पेप्टाइड्स आणि प्रथिनांचे विश्लेषण करण्यासाठी, तसेच या विश्लेष्यांशी (analytes) आंतरक्रिया करून त्यांना टिकवून ठेवण्यासाठी विशेषतः डिझाइन केलेल्या स्थिर फेजची आवश्यकता असते¹⁶. मिश्र-मोड क्रोमॅटोग्राफी, जी बहुविध आंतरक्रिया (multimodal interactions) प्रदान करते, ती पेप्टाइड्स, प्रथिने आणि इतर जटिल मिश्रणांच्या विलगिकरणासाठी RP-LC ला एक पर्याय असू शकते. अनेक मिश्र-मोड स्थिर फेज तयार केल्या गेल्या आहेत, आणि या फेजने भरलेले कॉलम पेप्टाइड आणि प्रथिनांच्या विलगिकरणासाठी वापरले गेले आहेत¹⁷,¹⁸,¹⁹,²⁰,²¹. मिश्र-मोड स्थिर फेज (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, पोलर इंटरकॅलेशन/RPLC) हे पोलर आणि नॉन-पोलर दोन्ही गटांच्या उपस्थितीमुळे पेप्टाइड आणि प्रथिने वेगळे करण्यासाठी योग्य आहेत22,23,24,25,26,27,28. त्याचप्रमाणे, सहसंयुज बंधित पोलर गटांसह पोलर इंटरकॅलेटिंग स्टेशनरी फेज पोलर आणि नॉन-पोलर विश्लेषकांसाठी चांगली विलगीकरण शक्ती आणि अद्वितीय निवडक्षमता दर्शवतात, कारण विलगीकरण हे विश्लेषक आणि स्टेशनरी फेजमधील आंतरक्रियेवर अवलंबून असते. मल्टीमोडल आंतरक्रिया 29, 30, 31, 32. अलीकडे, झांग एट अल. ३० ने डोडेसिल-टर्मिनेटेड पॉलीअमाइन स्टेशनरी फेज तयार केली आणि हायड्रोकार्बन्स, अँटीडिप्रेसंट्स, फ्लेव्होनॉइड्स, न्यूक्लियोसाइड्स, इस्ट्रोजेन्स आणि इतर अनेक विश्लेष्य यशस्वीरित्या वेगळे केले. पोलर इंटरकॅलेटरमध्ये पोलर आणि नॉन-पोलर दोन्ही गट असतात, त्यामुळे त्याचा उपयोग हायड्रोफोबिक आणि हायड्रोफिलिक दोन्ही घटक असलेल्या पेप्टाइड्स आणि प्रथिनांना वेगळे करण्यासाठी केला जाऊ शकतो. पोलर-एम्बेडेड कॉलम्स (उदा., अमाइड-एम्बेडेड C18 कॉलम्स) 'असेंटिस एक्सप्रेस आरपी-अमाइड कॉलम्स' या व्यापारी नावाने व्यावसायिकरित्या उपलब्ध आहेत, परंतु हे कॉलम्स फक्त अमाइन ३३ च्या विश्लेषणासाठी वापरले जातात.
सध्याच्या अभ्यासात, पेप्टाइड्स आणि HSA च्या ट्रायप्सिन डायजेस्टच्या विलगिकरणासाठी एक ध्रुवीय-अंतर्भूत स्थिर प्रावस्था (N-फेनिलमेलिमाइड-अंतर्भूत पॉलिस्टीरिन) तयार करून तिचे मूल्यांकन करण्यात आले. ही स्थिर प्रावस्था खालील धोरण वापरून तयार करण्यात आली. आमच्या मागील प्रकाशनात दिलेल्या प्रक्रियेनुसार, तयारीच्या प्रोटोकॉलमध्ये काही बदल करून सच्छिद्र सिलिका कण तयार करण्यात आले. मोठ्या छिद्रांच्या आकाराचे सिलिका कण तयार करण्यासाठी युरिया, पॉलिथिलीन ग्लायकोल (PEG), TMOS, पाणी आणि ऍसिटिक ऍसिड यांचे प्रमाण समायोजित करण्यात आले. दुसरे म्हणजे, एक नवीन लिगँड, फेनिलमेलिमाइड-मिथाइल विनाइल आयसोसायनेट, संश्लेषित करण्यात आला आणि ध्रुवीय अंतर्भूत स्थिर प्रावस्था तयार करण्यासाठी सिलिका कणांचे डेरिव्हेटायझेशन करण्यासाठी वापरण्यात आला. परिणामी स्थिर प्रावस्था ऑप्टिमाइझ केलेल्या पॅकिंग योजनेचा वापर करून स्टेनलेस स्टील कॉलममध्ये (100 × 1.8 मिमी आयडी) भरण्यात आली. कॉलममध्ये एकसंध थर तयार होईल याची खात्री करण्यासाठी कॉलम पॅकिंगला यांत्रिक कंपनांची मदत घेतली जाते. पाच पेप्टाइड्स असलेल्या पेप्टाइड मिश्रणांच्या पॅक्ड कॉलम विलगिकरणाचे मूल्यांकन करणे; (ग्लाय-टायर, ग्लाय-ल्यू-टायर, ग्लाय-ग्लाय-टायर-आर्ग, टायर-आयले-ग्लाय-सेर-आर्ग, ल्युसिन एन्केफॅलिन) आणि मानवी सीरम अल्ब्युमिनचे (HAS) ट्रिप्सिन डायजेस्ट. पेप्टाइड मिश्रण आणि HSA चे ट्रिप्सिन डायजेस्ट चांगल्या रिझोल्यूशन आणि कार्यक्षमतेने वेगळे झाल्याचे दिसून आले. PMP कॉलमच्या विलगीकरण कामगिरीची तुलना Ascentis Express RP-Amide कॉलमशी करण्यात आली. पेप्टाइड्स आणि प्रथिने दोन्ही PMP कॉलमवर चांगल्या प्रकारे विलगीकृत आणि कार्यक्षम असल्याचे दिसून आले, जो Ascentis Express RP-Amide कॉलमपेक्षा अधिक कार्यक्षम होता.
PEG (पॉलिथिलीन ग्लायकॉल), युरिया, ऍसिटिक ऍसिड, ट्रायमेथॉक्सी ऑर्थोसिलिकेट (TMOS), ट्रायमेथिल क्लोरोसिलेन (TMCS), ट्रिप्सिन, ह्युमन सीरम अल्ब्युमिन (HSA), अमोनियम क्लोराईड, युरिया, हेक्सेन मेथिलडायसिलाझेन (HMDS), मेथॅक्रिलॉयल क्लोराईड (MC), स्टायरीन, 4-हायड्रॉक्सी-TEMPO, बेंझॉयल पेरॉक्साइड (BPO), HPLC ग्रेड ऍसिटोनायट्रिल (ACN), मेथॅनॉल, 2-प्रोपेनॉल आणि ऍसिटोन सिग्मा-अल्ड्रिच (सेंट लुईस, MO, USA) कडून खरेदी केले.
युरिया (८ ग्रॅम), पॉलीएथिलीन ग्लायकॉल (८ ग्रॅम) आणि ०.०१ N ऍसिटिक ऍसिडचे ८ मिली यांचे मिश्रण १० मिनिटे ढवळण्यात आले, आणि नंतर बर्फासारख्या थंड परिस्थितीत त्यात २४ मिली TMOS टाकण्यात आले. अभिक्रिया मिश्रण स्टेनलेस स्टील ऑटोक्लेव्हमध्ये ४०°C वर ६ तास आणि नंतर १२०°C वर ८ तास तापवण्यात आले. पाणी ओतून टाकण्यात आले आणि उरलेला पदार्थ ७०°C वर १२ तास वाळवण्यात आला. वाळलेला मऊ गोळा ओव्हनमध्ये गुळगुळीत दळण्यात आला आणि ५५०°C वर १२ तास कॅल्साइन करण्यात आला. कणांचा आकार, छिद्रांचा आकार आणि पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ यामधील पुनरुत्पादकता तपासण्यासाठी तीन बॅच तयार करून त्यांचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यात आले.
पूर्व-संश्लेषित लिगँड फेनिलमालेइमाइड-मिथाइलविनाइलआयसोसायनेट (PCMP) वापरून सिलिका कणांच्या पृष्ठभागाचे बदल करून आणि त्यानंतर स्टायरिनसह रेडियल पॉलिमरायझेशन करून, एक ध्रुवीय गट असलेले संयुग तयार करण्यात आले. समुच्चय आणि पॉलिस्टायरिन साखळ्यांसाठी स्थिर प्रावस्था. तयारीची प्रक्रिया खाली वर्णन केली आहे.
फेनिलमेलिमाइड-मिथाइल विनाइल आयसोसायनेट कोपॉलिमर (PMCP) तयार करण्यासाठी, एन-फेनिलमेलिमाइड (२०० मिग्रॅ) आणि मिथाइल विनाइल आयसोसायनेट (१०० मिग्रॅ) कोरड्या टोल्युइनमध्ये विरघळवण्यात आले आणि अभिक्रिया पात्रात ०.१ मिली २,२′-अझोइसोब्युटिरोनायट्राइल (AIBN) टाकण्यात आले. हे मिश्रण ६०°C तापमानावर ३ तास ​​तापवण्यात आले, गाळण्यात आले आणि ओव्हनमध्ये ४०°C तापमानावर ३ तास ​​वाळवण्यात आले.
वाळलेले सिलिका कण (२ ग्रॅम) कोरड्या टोल्युइनमध्ये (१०० मिली) विखुरले गेले, ढवळले गेले आणि ५०० मिलीच्या गोल बुडाच्या फ्लास्कमध्ये १० मिनिटांसाठी सोनिकेट केले गेले. पीएमसीपी (१० मिलीग्रॅम) टोल्युइनमध्ये विरघळवून ड्रॉपिंग फनेलद्वारे प्रतिक्रिया फ्लास्कमध्ये थेंब-थेंब करून टाकले गेले. मिश्रण १००°C वर ८ तासांसाठी रिफ्लक्स केले गेले, गाळले गेले आणि ॲसिटोनने धुतले गेले व ६०°C वर ३ तासांसाठी वाळवले गेले. त्यानंतर, पीएमसीपी-बंधित सिलिका कण (१०० ग्रॅम) टोल्युइनमध्ये (२०० मिली) विरघळवले गेले आणि उत्प्रेरक म्हणून १०० µL डायब्युटिलटिन डायलॉरेटच्या उपस्थितीत ४-हायड्रॉक्सी-टेम्पो (२ मिली) टाकले गेले. मिश्रण ५०°C वर ८ तासांसाठी ढवळले गेले, गाळले गेले आणि ५०°C वर ३ तासांसाठी वाळवले गेले.
स्टायरिन (१ मिली), बेंझॉयल पेरॉक्साइड (बीपीओ) (०.५ मिली), आणि टेम्पो-पीएमसीपी-जोडलेले सिलिका कण (१.५ ग्रॅम) टोल्युइनमध्ये विखुरले गेले आणि नायट्रोजनने शुद्ध केले गेले. स्टायरिनचे बहुलकीकरण १००°C तापमानावर १२ तासांसाठी केले गेले. परिणामी उत्पादन मिथेनॉलने धुतले गेले आणि ६०°C तापमानावर रात्रभर वाळवले गेले. संपूर्ण अभिक्रियेची योजना आकृती १ मध्ये दर्शविली आहे.
१०⁻³ टॉर पेक्षा कमी अवशिष्ट दाब मिळवण्यासाठी नमुन्यांमधून ३९३ केल्विन तापमानावर १ तास वायू काढून टाकण्यात आला. एकूण छिद्रांचे आकारमान निश्चित करण्यासाठी P/P₀ = ०.९९ या सापेक्ष दाबावर शोषलेल्या नायट्रोजन (N₂) वायूच्या प्रमाणाचा वापर करण्यात आला. साध्या आणि लिगँड-बॉन्डेड सिलिका कणांच्या आकारविज्ञानाची तपासणी स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (हिताची हाय टेक्नॉलॉजीज, टोकियो, जपान) वापरून करण्यात आली. वाळवलेले नमुने (साधे सिलिका आणि लिगँड-बॉन्डेड सिलिका कण) चिकट कार्बन टेप वापरून ॲल्युमिनियम कॉलमवर ठेवण्यात आले. Q150T स्पटर कोटर वापरून नमुन्यांवर सोन्याचा मुलामा देण्यात आला आणि नमुन्यांवर ५ नॅनोमीटर सोन्याचा (Au) थर जमा करण्यात आला. यामुळे कमी व्होल्टेज वापरून प्रक्रियेची कार्यक्षमता सुधारते आणि सूक्ष्म कणांचे, कोल्ड स्पटरिंग मिळते. मूलद्रव्य विश्लेषणासाठी थर्मो इलेक्ट्रॉन (वॉल्थम, एमए, यूएसए) फ्लॅश EA1112 मूलद्रव्य विश्लेषकाचा वापर करण्यात आला. कणांच्या आकाराचे वितरण मिळवण्यासाठी माल्व्हर्न (वॉर्सेस्टरशायर, यूके) मास्टरसायझर २००० कण आकार विश्लेषकाचा वापर करण्यात आला. साधे सिलिका कण आणि लिगँड-बॉन्डेड सिलिका कण (प्रत्येकी ५ मिग्रॅ) ५ मि.ली. आयसोप्रोपेनॉलमध्ये विखुरले गेले, १० मिनिटे सोनिकेट केले गेले, ५ मिनिटे व्हॉर्टेक्स केले गेले आणि मास्टरसायझरच्या ऑप्टिकल बेंचवर ठेवले गेले. थर्मोग्रॅव्हिमेट्रिक विश्लेषण ३० ते ८०० °C तापमानाच्या श्रेणीत ५ °C प्रति मिनिट दराने केले गेले.
संदर्भ [ ] मध्ये वापरलेल्या त्याच प्रक्रियेचा वापर करून, स्लरी पॅकिंग पद्धतीने (100 × 1.8 मिमी आतील व्यास) काचेचे अस्तर असलेले स्टेनलेस स्टीलचे अरुंद-छिद्र स्तंभ भरण्यात आले. ३१. १ µm फ्रिट असलेले आउटलेट फिटिंग असलेला एक स्टेनलेस स्टील कॉलम (ग्लास-लाइन्ड, १०० × १.८ मिमी आयडी) स्लरी पॅकरला (ऑलटेक डियरफील्ड, आयएल, यूएसए) जोडण्यात आला. १५० मिग्रॅ स्टेशनरी फेज १.२ मि.ली. मिथेनॉलमध्ये निलंबित करून स्टेशनरी फेज स्लरी तयार करा आणि ती स्टोरेज कॉलममध्ये पाठवा. मिथेनॉलचा वापर स्लरी सॉल्व्हेंट तसेच प्रोपेलिंग सॉल्व्हेंट म्हणून करण्यात आला. १० मिनिटांसाठी १०० एमपी, १५ मिनिटांसाठी ८० एमपी आणि ३० मिनिटांसाठी ६० एमपी दाब देऊन कॉलम क्रमशः भरा. पॅकिंग दरम्यान, कॉलमचे एकसमान पॅकिंग सुनिश्चित करण्यासाठी दोन जीसी कॉलम शेकर्सद्वारे (ऑलटेक, डियरफील्ड, आयएल, यूएसए) यांत्रिक कंपन लागू केले गेले. स्लरी पॅकर बंद करा आणि कॉलममधील कोणतेही नुकसान टाळण्यासाठी दाब हळूहळू सोडा. कॉलम स्लरी पॅकिंग युनिटपासून डिस्कनेक्ट करा आणि इनलेटला आणि एलसी सिस्टमला दुसरे फिटिंग जोडा. त्याची कामगिरी तपासा.
एक एलसी पंप (10AD शिमात्झू, जपान), 50nL इंजेक्शन लूपसह इंजेक्टर (वाल्को (यूएसए) C14 W.05), मेंब्रेन डिगॅसर (शिमात्झू DGU-14A), UV-VIS कॅपिलरी विंडो, विशेष µLC डिव्हाइस डिटेक्टर (UV-2075) आणि ग्लास-लाइन्ड मायक्रोकॉलम्स वापरून एक विशेष उपकरण तयार करण्यात आले. एक्स्ट्रा कॉलम बँड ब्रॉडनिंगचा प्रभाव कमी करण्यासाठी अत्यंत अरुंद आणि लहान कनेक्टिंग ट्यूबिंगचा वापर करण्यात आला. पॅकेजिंगनंतर, रिड्यूसिंग युनियनच्या 1/16″ आउटलेटवर कॅपिलरीज (50 μm id 365) आणि रिड्यूसिंग युनियन कॅपिलरीज (50 μm) बसवण्यात आल्या. डेटा संकलन आणि क्रोमॅटोग्राफिक प्रक्रिया मल्टीक्रो 2000 सॉफ्टवेअर वापरून करण्यात आली. 254 nm वर मॉनिटरिंग करून, विश्लेषकांची UV शोषणासाठी चाचणी करण्यात आली. क्रोमॅटोग्राफिक डेटाचे विश्लेषण ओरिजिनप्रो8 (नॉर्थहॅम्प्टन, एमए) द्वारे करण्यात आले.
मानवी सीरममधील अल्ब्युमिन, लायोफिलाइज्ड पावडर, ≥ ९६% (ॲगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस) ३ मिग्रॅ, ट्रायप्सिन (१.५ मिग्रॅ), ४.० एम युरिया (१ मि.ली.), आणि ०.२ एम अमोनियम बायकार्बोनेट (१ मि.ली.) मध्ये मिसळले. हे द्रावण १० मिनिटे ढवळले आणि ३७°C तापमानाच्या वॉटर बाथमध्ये ६ तास ठेवले, त्यानंतर ०.१% टीएफएच्या १ मि.ली.ने अभिक्रिया थांबवली. द्रावण गाळून ४°C पेक्षा कमी तापमानात साठवा.
पेप्टाइड मिश्रणे आणि HSA ट्रायप्सिन डायजेस्ट यांचे विलगीकरण PMP कॉलमवर स्वतंत्रपणे तपासण्यात आले. PMP कॉलमद्वारे पेप्टाइड मिश्रण आणि HSA च्या ट्रायप्सिन डायजेस्टचे विलगीकरण तपासा आणि निकालांची तुलना Ascentis Express RP-Amide कॉलमशी करा. सैद्धांतिक प्लेट नंबरची गणना खालीलप्रमाणे केली जाते:
आकृती २ मध्ये साध्या सिलिका कणांच्या आणि लिगँड-बंधित सिलिका कणांच्या SEM प्रतिमा दर्शविल्या आहेत. साध्या सिलिका कणांच्या SEM प्रतिमा (A, B) दर्शवतात की, आमच्या पूर्वीच्या अभ्यासाच्या विपरीत, हे कण गोलाकार आहेत, ज्यात कण लांबट आहेत किंवा त्यांना अनियमित समरूपता आहे. लिगँड-बंधित सिलिका कणांचा पृष्ठभाग (C, D) साध्या सिलिका कणांपेक्षा अधिक गुळगुळीत आहे, जे सिलिका कणांच्या पृष्ठभागावरील पॉलिस्टीरिन साखळ्यांच्या आवरणामुळे असू शकते.
साध्या सिलिका कणांचे (A, B) आणि लिगँड-बंधित सिलिका कणांचे (C, D) स्कॅनिंग इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप प्रतिमा.
शुद्ध सिलिका कण आणि लिगँड-बंधित सिलिका कणांचे कण आकार वितरण आकृती ३(अ) मध्ये दर्शविले आहे. आकारमानावर आधारित कण आकार वितरण वक्रांनी दाखवले की रासायनिक बदलानंतर सिलिका कणांचा आकार वाढला (आकृती ३अ). सध्याच्या अभ्यासातील आणि मागील अभ्यासातील सिलिका कणांच्या कण आकार वितरणाच्या माहितीची तुलना तक्ता १(अ) मध्ये केली आहे. PMP चा आकारमानावर आधारित कण आकार, d(0.5), ३.३६ μm आहे, तर आमच्या मागील अभ्यासात ad(0.5) चे मूल्य ३.०५ μm (पॉलिस्टीरिन-बद्ध सिलिका कण)³⁴ होते. अभिक्रिया मिश्रणातील PEG, युरिया, TMOS आणि ॲसेटिक ॲसिडच्या बदलत्या प्रमाणामुळे, आमच्या मागील अभ्यासाच्या तुलनेत या बॅचमध्ये कण आकार वितरण अधिक संकुचित होते. PMP फेजचा कण आकार, आम्ही पूर्वी अभ्यासलेल्या पॉलिस्टीरिन-बद्ध सिलिका कण फेजच्या कण आकारापेक्षा किंचित मोठा आहे. याचा अर्थ असा की, स्टायरिनसह सिलिका कणांच्या पृष्ठभागाच्या कार्यात्मकीकरणामुळे केवळ पॉलिस्टीरिनचा एक थर (०.९७ µm) जमा झाला. सिलिका पृष्ठभाग, तर PMP अवस्थेमध्ये थराची जाडी 1.38 µm होती.
शुद्ध सिलिका कणांचे आणि लिगँड-बद्ध सिलिका कणांचे कण आकार वितरण (A) आणि छिद्र आकार वितरण (B).
सध्याच्या अभ्यासातील सिलिका कणांचे छिद्रांचे आकारमान, छिद्रांचे घनफळ आणि पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ तक्ता १(ब) मध्ये दिले आहे. साध्या सिलिका कणांचे आणि लिगँड-बंधित सिलिका कणांचे PSD प्रोफाइल आकृती ३(ब) मध्ये दाखवले आहेत. हे परिणाम आमच्या मागील अभ्यासाशी तुलनात्मक आहेत. साध्या आणि लिगँड-बद्ध सिलिका कणांच्या छिद्रांचे आकारमान अनुक्रमे ३१० आणि २४१ आहे, जे दर्शवते की रासायनिक बदलानंतर छिद्रांचे आकारमान ६९ ने कमी होते, जसे तक्ता १(ब) मध्ये दाखवले आहे, आणि वक्रातील बदल आकृती ३(ब) मध्ये दाखवला आहे. त्याचप्रमाणे, रासायनिक बदलानंतर सिलिका कणांचे छिद्रांचे घनफळ ०.६७ वरून ०.५८ cm³/g पर्यंत कमी झाले. सध्या अभ्यासलेल्या सिलिका कणांचे विशिष्ट पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ ११६ m²/g आहे, जे आमच्या मागील अभ्यासाशी (१२४ m²/g) तुलनात्मक आहे. तक्ता १(ब) मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, सिलिका कणांचे पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ (m²/g) देखील ११६ वरून कमी झाले. रासायनिक बदलानंतर m2/g ते 105 m2/g पर्यंत.
स्थिर अवस्थेच्या मूलद्रव्य विश्लेषणाचे परिणाम तक्ता २ मध्ये दर्शविले आहेत. सध्याच्या स्थिर अवस्थेचे कार्बन लोडिंग ६.३५% आहे, जे आमच्या मागील अभ्यासातील (पॉलिस्टायरीन-बंधित सिलिका कण, अनुक्रमे ७.९३% आणि १०.२१%) कार्बन लोडिंगपेक्षा कमी आहे. सध्याच्या स्थिर अवस्थेचे कार्बन लोडिंग कमी आहे, कारण सध्याच्या एसपीच्या (SP) निर्मितीमध्ये, स्टायरीन व्यतिरिक्त, फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलआयसोसायनेट (PCMP) आणि ४-हायड्रॉक्सी-TEMPO सारखे काही ध्रुवीय लिगँड्स वापरले गेले. सध्याच्या स्थिर अवस्थेचे नायट्रोजन वजनी टक्केवारी २.२१% आहे, तर मागील अभ्यासांमध्ये नायट्रोजनचे वजनी प्रमाण अनुक्रमे ०.१७% आणि ०.८५% होते. याचा अर्थ असा की फेनिलमेलिमाइडमुळे सध्याच्या स्थिर अवस्थेमध्ये नायट्रोजनची वजनी टक्केवारी जास्त आहे. त्याचप्रमाणे, उत्पादने (४) आणि (५) यांचे कार्बन लोडिंग अनुक्रमे २.७% आणि २.९% होते, तर टेबल 2 मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, अंतिम उत्पादनाचे (6) कार्बन लोडिंग 6.35% होते. PMP स्टेशनरी फेज वापरून वजनातील घट तपासण्यात आली आणि TGA वक्र आकृती 4 मध्ये दाखवला आहे. TGA वक्र 8.6% वजनातील घट दाखवतो, जे कार्बन लोडिंग (6.35%) शी सुसंगत आहे कारण लिगँड्समध्ये केवळ C च नाही तर N, O, आणि H देखील असतात.
सिलिका कणांच्या पृष्ठभागाच्या सुधारणेसाठी फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलआयसोसायनेट लिगँड निवडण्यात आला, कारण त्यात ध्रुवीय फेनिलमेलिमाइड गट आणि विनिलआयसोसायनेट गट असतात. विनिलआयसोसायनेट गट जिवंत रॅडिकल पॉलिमरायझेशनद्वारे स्टायरीनसोबत पुढे अभिक्रिया करू शकतात. दुसरे कारण म्हणजे असा गट समाविष्ट करणे, ज्याची विश्लेषकासोबत मध्यम आंतरक्रिया असेल आणि विश्लेषक व स्थिर प्रावस्था यांच्यात कोणतीही तीव्र इलेक्ट्रोस्टॅटिक आंतरक्रिया नसेल, कारण सामान्य pH वर फेनिलमेलिमाइड भागावर कोणताही आभासी प्रभार नसतो. स्थिर प्रावस्थेची ध्रुवीयता स्टायरीनचे इष्टतम प्रमाण आणि मुक्त रॅडिकल पॉलिमरायझेशनच्या अभिक्रियेच्या वेळेनुसार नियंत्रित केली जाऊ शकते. अभिक्रियेचा शेवटचा टप्पा (मुक्त-रॅडिकल पॉलिमरायझेशन) महत्त्वपूर्ण असतो आणि तो स्थिर प्रावस्थेची ध्रुवीयता बदलू शकतो. या स्थिर प्रावस्थांचे कार्बन लोडिंग तपासण्यासाठी मूलद्रव्यीय विश्लेषण करण्यात आले. असे दिसून आले की स्टायरीनचे प्रमाण आणि अभिक्रियेची वेळ वाढवल्याने स्थिर प्रावस्थेचे कार्बन लोडिंग वाढले आणि याउलट. स्टायरीनच्या वेगवेगळ्या सांद्रतेसह तयार केलेल्या SPs मध्ये वेगवेगळे कार्बन लोडिंग असते. पुन्हा, या स्थिर प्रावस्था स्टेनलेसमध्ये लोड करा. स्टील कॉलम वापरून त्यांच्या क्रोमॅटोग्राफिक कामगिरीची (निवडक्षमता, विभेदन, N मूल्य, इत्यादी) तपासणी केली. या प्रयोगांच्या आधारे, नियंत्रित ध्रुवीयता आणि विश्लेष्याचे चांगले धारणा सुनिश्चित करण्यासाठी PMP स्थिर प्रावस्था तयार करण्याकरिता एक अनुकूलित सूत्र निवडले गेले.
मोबाइल फेज वापरून PMP कॉलमचा वापर करून पाच पेप्टाइड मिश्रणांचे (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) देखील मूल्यांकन करण्यात आले; 80 μL/min च्या प्रवाह दराने 60/40 (v/v) ॲसिटोनायट्राइल/पाणी (0.1% TFA). इष्टतम इल्युशन परिस्थितीत, प्रति कॉलम (100 × 1.8 mm id) सैद्धांतिक प्लेट संख्या (N) 20,000 ± 100 (200,000 प्लेट्स/m²) आहे. तक्ता 3 मध्ये तीन PMP कॉलम्ससाठी N मूल्ये दिली आहेत आणि क्रोमॅटोग्राम आकृती 5A मध्ये दर्शविले आहेत. उच्च प्रवाह दराने (700 μL/min) PMP कॉलमवर जलद विश्लेषण केल्यावर, एका मिनिटात पाच पेप्टाइड्स इल्युट झाले, N मूल्ये खूप चांगली होती, प्रति कॉलम (100 × 1.8 mm id) 13,500 ± 330, जे 135,000 प्लेट्स/m² शी जुळते (आकृती 5B). तीन समान आकाराचे पुनरुत्पादकता तपासण्यासाठी, स्तंभांमध्ये (100 × 1.8 मिमी आतील व्यास) PMP स्थिर प्रावस्थेच्या तीन वेगवेगळ्या लॉट्स भरण्यात आल्या. प्रत्येक स्तंभावर तेच चाचणी मिश्रण वेगळे करण्यासाठी, इष्टतम प्रक्षालन परिस्थिती, सैद्धांतिक प्लेट्सची संख्या (N) आणि धारणा वेळ वापरून प्रत्येक स्तंभासाठी विश्लेष्याची सांद्रता नोंदवण्यात आली. PMP स्तंभांसाठी पुनरुत्पादकतेचा डेटा तक्ता ४ मध्ये दर्शविला आहे. तक्ता ३ मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, PMP स्तंभाची पुनरुत्पादकता अत्यंत कमी %RSD मूल्यांशी चांगला संबंध दर्शवते.
PMP कॉलम (B) ​​आणि एसेन्टिस एक्सप्रेस आरपी-अमाइड कॉलम (A) वर पेप्टाइड मिश्रणाचे विलगीकरण; मोबाइल फेज ६०/४० ACN/H2O (TFA ०.१%), PMP कॉलमचे आकारमान (१०० × १.८ मिमी आयडी); विश्लेषणात्मक. संयुगांचा इल्युशन क्रम: १ (ग्लाय-टायर), २ (ग्लाय-ल्यू-टायर), ३ (ग्लाय-ग्लाय-टायर-आर्ग), ४ (टायर-आयले-ग्लाय-सेर-आर्ग) आणि ५ (ल्यूसिन) ॲसिड एन्केफॅलिन).
उच्च कार्यक्षमता द्रव क्रोमॅटोग्राफीमध्ये मानवी सीरम अल्ब्युमिनच्या ट्रिप्टिक डायजेस्टच्या विलगिकरणासाठी एका PMP कॉलमचे (100 × 1.8 मिमी आयडी) मूल्यांकन करण्यात आले. आकृती 6 मधील क्रोमॅटोग्राम दर्शवितो की नमुना चांगल्या प्रकारे विलग झाला आहे आणि रिझोल्यूशन खूप चांगले आहे. HSA डायजेस्टचे विश्लेषण 100 µL/मिनिटच्या प्रवाह दराने, 70/30 ॲसिटोनाइट्राइल/पाणी या मोबाइल फेजने आणि 0.1% TFA वापरून करण्यात आले. क्रोमॅटोग्राममध्ये (आकृती 6) दर्शविल्याप्रमाणे, HSA डायजेशन 17 पेप्टाइड्सशी संबंधित 17 शिखरांमध्ये विभागले गेले आहे. HSA डायजेस्टमधील प्रत्येक शिखराच्या विलगिकरण कार्यक्षमतेची गणना करण्यात आली आणि मूल्ये तक्ता 5 मध्ये दिली आहेत.
HSA (100 × 1.8 मिमी आयडी) चा ट्रिप्टिक डायजेस्ट PMP कॉलमवर वेगळा करण्यात आला; फ्लो रेट (100 µL/मिनिट), मोबाइल फेज 60/40 ॲसिटोनाइट्राइल/पाणी 0.1% TFA सह.
येथे L ही कॉलमची लांबी आहे, η ही मोबाइल फेजची स्निग्धता आहे, ΔP हा कॉलमचा बॅक प्रेशर आहे आणि u हा मोबाइल फेजचा रेषीय वेग आहे. PMP कॉलमची पारगम्यता 2.5 × 10-14 m2 होती, प्रवाह दर 25 μL/min होता आणि 60/40 v/v ACN/पाणी वापरले गेले. PMP कॉलमची (100 × 1.8 mm id) पारगम्यता आमच्या मागील अभ्यास संदर्भ 34 प्रमाणेच होती. पृष्ठभागावर सच्छिद्र कणांनी भरलेल्या कॉलमची पारगम्यता आहे: 1.3 μm कणांसाठी 1.7 × 10-15, 1.7 μm कणांसाठी 3.1 × 10-15, 2.6 μm कणांसाठी 5.2 × 10-15 आणि 2.5 × 10-14 m2. μm कण ४३. म्हणून, PMP टप्प्याची पारगम्यता ५ μm कोर-शेल कणांच्या पारगम्यतेसारखी आहे.
येथे Wx हे क्लोरोफॉर्मने भरलेल्या कॉलमचे वजन आहे, Wy हे मिथेनॉलने भरलेल्या कॉलमचे वजन आहे आणि ρ ही द्रावकाची घनता आहे. मिथेनॉल (ρ = 0.7866) आणि क्लोरोफॉर्म (ρ = 1.484) यांची घनता. आम्ही पूर्वी अभ्यासलेल्या सिलिका पार्टिकल्स-C18 कॉलम्स (100 × 1.8 मिमी आयडी) 34 आणि C18-युरिया कॉलम्स 31 यांची एकूण सच्छिद्रता अनुक्रमे 0.63 आणि 0.55 होती. याचा अर्थ असा की युरिया लिगँड्सच्या उपस्थितीमुळे स्थिर अवस्थेची पारगम्यता कमी होते. दुसरीकडे, PMP कॉलमची (100 × 1.8 मिमी आयडी) एकूण सच्छिद्रता 0.60 आहे. PMP कॉलम्सची पारगम्यता C18-बॉन्डेड सिलिका कणांनी भरलेल्या कॉलम्सपेक्षा कमी असते कारण C18-प्रकारच्या स्थिर अवस्थांमध्ये C18 लिगँड्स सिलिकाला जोडलेले असतात. कण रेषीय साखळ्यांच्या स्वरूपात असतात, तर पॉलिस्टीरिन-प्रकारच्या स्थिर टप्प्यांमध्ये, त्याच्याभोवती एक तुलनेने जाड पॉलिमर थर तयार होतो. एका सामान्य प्रयोगात, स्तंभाची सच्छिद्रता खालीलप्रमाणे मोजली जाते:
आकृती 7A,B मध्ये PMP कॉलम (100 × 1.8 मिमी आयडी) आणि असेन्टिस एक्सप्रेस आरपी-अमाइड कॉलम (100 × 1.8 मिमी आयडी) समान इल्युशन परिस्थिती (म्हणजे, 60/40 ACN/H2O आणि 0.1% TFA) वापरून व्हॅन डीम्टर प्लॉटचे दर्शविले आहेत. निवडक पेप्टाइड मिश्रणे (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL मध्ये तयार करण्यात आली. दोन्ही कॉलमसाठी किमान प्रवाह दर 800 µL/min आहे. PMP कॉलम आणि Ascentis Express RP-Amide कॉलमसाठी इष्टतम प्रवाह दरावर (80 µL/min) किमान HETP मूल्ये अनुक्रमे 2.6 µm आणि 3.9 µm होती. HETP मूल्ये दर्शवतात की PMP कॉलमची (100 × 1.8 mm id) विलगीकरण कार्यक्षमता व्यावसायिकरित्या उपलब्ध Ascentis Express RP-Amide कॉलमपेक्षा (100 × 1.8 mm id) खूपच चांगली आहे. आकृती 7(A) मधील व्हॅन डीम्टर प्लॉट दर्शवितो की N मूल्यामध्ये घट झाली आहे. आमच्या मागील अभ्यासाच्या तुलनेत वाढत्या प्रवाहाबरोबरचा फरक लक्षणीय नाही. Ascentis Express RP-Amide कॉलमच्या तुलनेत PMP कॉलमची (100 × 1.8 mm id) उच्च विलगीकरण कार्यक्षमता ही सध्याच्या कामात वापरलेल्या कणांचा आकार, माप आणि जटिल कॉलम पॅकिंग प्रक्रियेतील सुधारणांवर आधारित आहे34.
(अ) 60/40 ACN/H2O मध्ये 0.1% TFA सह PMP कॉलम (100 × 1.8 मिमी आयडी) वापरून मिळवलेला व्हॅन डीम्टर प्लॉट (HETP विरुद्ध मोबाइल फेज लिनियर वेलॉसिटी). (ब) 60/40 ACN/H2O मध्ये 0.1% TFA सह Ascentis Express RP-Amide कॉलम (100 × 1.8 मिमी आयडी) वापरून मिळवलेला व्हॅन डीम्टर प्लॉट (HETP विरुद्ध मोबाइल फेज लिनियर वेलॉसिटी).
उच्च कार्यक्षमता द्रव क्रोमॅटोग्राफीमध्ये (high performance liquid chromatography) संश्लेषित पेप्टाइड मिश्रणे आणि मानवी सीरम अल्ब्युमिनच्या (HAS) ट्रायप्सिन पचनाच्या विलगिकरणासाठी एक ध्रुवीय-अंतर्भूत पॉलीस्टायरीन स्थिर प्रावस्था (polar-embedded polystyrene stationary phase) तयार करून तिचे मूल्यांकन करण्यात आले. पेप्टाइड मिश्रणांसाठी PMP स्तंभांची (columns) क्रोमॅटोग्राफिक कामगिरी विलगिकरण कार्यक्षमता आणि विभेदनाच्या बाबतीत उत्कृष्ट आहे. PMP स्तंभांच्या सुधारित विलगिकरण कामगिरीमागे अनेक कारणे आहेत, जसे की सिलिका कणांचा आकार आणि छिद्रांचा आकार, स्थिर प्रावस्थेचे नियंत्रित संश्लेषण आणि स्तंभांची गुंतागुंतीची रचना. उच्च विलगिकरण कार्यक्षमतेव्यतिरिक्त, उच्च प्रवाह दरांवर स्तंभाचा कमी दाब (back pressure) हा या स्थिर प्रावस्थेचा आणखी एक फायदा आहे. PMP स्तंभ चांगली पुनरुत्पादकता (reproducibility) दर्शवतात आणि त्यांचा उपयोग पेप्टाइड मिश्रणे व विविध प्रथिनांच्या ट्रायप्सिन पचनाच्या विश्लेषणासाठी केला जाऊ शकतो. द्रव क्रोमॅटोग्राफीमध्ये नैसर्गिक उत्पादने, औषधी वनस्पतींमधील जैव-सक्रिय संयुगे आणि बुरशीजन्य अर्कांच्या विलगिकरणासाठी या स्तंभाचा वापर करण्याचा आमचा मानस आहे. भविष्यात, प्रथिने आणि मोनोक्लोनल प्रतिपिंडांच्या (monoclonal antibodies) विलगिकरणासाठी देखील PMP स्तंभांचे मूल्यांकन केले जाईल.
फील्ड, जेके, युअरबी, एमआर, लाऊ, जे., थॉगरसेन, एच. आणि पीटरसन, पी. रिव्हर्स्ड फेज क्रोमॅटोग्राफीद्वारे पेप्टाइड विलगीकरण प्रणालींवरील संशोधन भाग I: कॉलम कॅरॅक्टरायझेशन प्रोटोकॉलचा विकास. जे. क्रोमॅटोग्राफी. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
गोमेझ, बी. व इतर. संसर्गजन्य रोगांच्या उपचारांसाठी डिझाइन केलेले सुधारित सक्रिय पेप्टाइड्स. बायोटेक्नॉलॉजी. ॲडव्हान्स्ड. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
व्लिएघे, पी., लिसोव्स्की, व्ही., मार्टिनेझ, जे. आणि ख्रेस्टचॅटिस्की, एम. सिंथेटिक थेरप्युटिक पेप्टाइड्स: विज्ञान आणि बाजारपेठ. ड्रग डिस्कव्हरी. 15 (1-2) टुडे, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
झी, एफ., स्मिथ, आरडी आणि शेन, वाय. प्रगत प्रोटीओमिक लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी. जे. क्रोमॅटोग्राफी. ए 1261, 78–90 (2012).
लिऊ, डब्ल्यू. आणि इतर. प्रगत लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्रीमुळे व्यापकपणे लक्ष्यित मेटाबोलॉमिक्स आणि प्रोटीओमिक्सचा समावेश करणे शक्य होते. एनस. चिम. अॅक्टा 1069, 89–97 (2019).
चेस्टनट, एसएम आणि सॅलिसबरी, जेजे औषध विकासात UHPLC ची भूमिका. जे. सेप. साय. 30(8), 1183-1190 (2007).
वू, एन. आणि क्लॉसेन, एएम. जलद विलगिकरणासाठी अल्ट्राहाय प्रेशर लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीचे मूलभूत आणि व्यावहारिक पैलू. जे. सेप. साय. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
रेन, एसए आणि चेलीचेफ, पी. औषध विकासात अल्ट्रा-हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीचा वापर. जे. क्रोमॅटोग्राफी. 1119 (1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
गु, एच. व इतर. एंटेरोव्हायरसच्या कार्यक्षम शुद्धीकरणासाठी तेल-पाणी उच्च अंतर्गत टप्प्यातील इमल्शनपासून तयार केलेले मोनोलिथिक मॅक्रोपोरोस हायड्रोजेल. केमिकल. ब्रिटन. जे. 401, 126051 (2020).
शी, वाय., झियांग, आर., होर्वाथ, सी. आणि विल्किन्स, जेए प्रोटिओमिक्समध्ये लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीची भूमिका. जे. क्रोमॅटोग्राफी. ए 1053 (1-2), 27-36 (2004).
फेकेटे, एस., व्ह्यूथे, जे.-एल. आणि गिलार्मे, डी. उपचारात्मक पेप्टाइड्स आणि प्रथिनांच्या रिव्हर्स्ड-फेज लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी विलगनातील उदयोन्मुख प्रवाह: सिद्धांत आणि अनुप्रयोग. जे. फार्मसी. बायोमेडिकल सायन्स. अनुस. 69, 9-27 (2012).
गिलार, एम., ओलिवोवा, पी., डेली, एई आणि गेबलर, जेसी पहिल्या आणि दुसऱ्या विलगीकरण आयामांमध्ये भिन्न pH मूल्ये वापरून RP-RP-HPLC प्रणाली वापरून पेप्टाइड्सचे द्विमितीय विलगीकरण. जे. सेप. साय. 28(14), 1694-1703 (2005).
फेलेटी, एस. आणि इतर. C18 सब-2 μm पूर्णपणे आणि पृष्ठभागावर सच्छिद्र कणांनी भरलेल्या उच्च-कार्यक्षम क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभांच्या वस्तुमान हस्तांतरण वैशिष्ट्ये आणि गतिज कार्यप्रदर्शनाचा अभ्यास केला गेला. जे. सेप. साय. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
पिओवेसाना, एस. व इतर. वनस्पती जैवक्रियाशील पेप्टाइड्सचे विलगीकरण, ओळख आणि प्रमाणीकरण यामधील अलीकडील ट्रेंड आणि विश्लेषणात्मक आव्हाने. गुदद्वार. जैविक गुदद्वार. केमिकल. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
म्युलर, जेबी इत्यादी. जीवनाच्या साम्राज्याचे प्रोटीओमिक लँडस्केप. नेचर 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
डेलुका, सी. व इतर. प्रिपरेटिव्ह लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीद्वारे उपचारात्मक पेप्टाइड्सची डाउनस्ट्रीम प्रक्रिया. मॉलिक्यूल (बासेल, स्वित्झर्लंड) 26(15), 4688(2021).
यांग, वाय. आणि गेंग, एक्स. मिश्र-मोड क्रोमॅटोग्राफी आणि बायोपॉलिमरसाठी त्याचा अनुप्रयोग. जे. क्रोमॅटोग्राफी. ए 1218 (49), 8813–8825 (2011).
झाओ, जी., डोंग, एक्स.-वाय. आणि सन, वाय. मिश्र-मोड प्रथिन क्रोमॅटोग्राफीसाठी लिगँड्स: तत्त्व, वैशिष्ट्यीकरण आणि रचना. जे. बायोटेक्नॉलॉजी. 144(1), 3-11 (2009).