Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta para sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga estilo at JavaScript.
Ang mga porous silica particle ay inihanda gamit ang sol-gel method na may ilang mga pagbabago upang makakuha ng mga macroporous particle. Ang mga particle na ito ay hinango sa pamamagitan ng reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization na may N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) at styrene upang ihanda ang N-phenylmaleimide intercalation ng polystyrene (PMP) stationary phase. Ang mga narrow-bore stainless steel column (100 × 1.8 mm id) ay ini-pack sa pamamagitan ng slurry packing. Sinuri ang PMP column separation ng isang peptide mixture na binubuo ng limang peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) chromatographic performance) at trypsin digestion ng human serum albumin (HAS). Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng elution, ang theoretical plate count ng peptide mixture ay kasing taas ng 280,000 plates/m². Paghahambing sa separation performance ng nabuong column sa komersyal na Ascentis Sa Express RP-Amide column, naobserbahan na ang performance ng paghihiwalay ng PMP column ay mas mahusay kaysa sa commercial column sa mga tuntunin ng kahusayan at resolusyon sa paghihiwalay.
Sa mga nakaraang taon, ang industriya ng biopharmaceutical ay naging isang lumalawak na pandaigdigang merkado na may malaking pagtaas sa bahagi ng merkado. Dahil sa mabilis na paglago ng industriya ng biopharmaceutical1,2,3, ang pagsusuri ng mga peptide at protina ay lubos na ninanais. Bilang karagdagan sa target na peptide, maraming mga dumi ang nalilikha sa panahon ng synthesis ng peptide, kaya nangangailangan ng chromatographic purification upang makakuha ng mga peptide na may nais na kadalisayan. Ang pagsusuri at paglalarawan ng mga protina sa mga likido sa katawan, mga tisyu at mga selula ay isang lubhang mahirap na gawain dahil sa malaking bilang ng mga potensyal na matukoy na species sa isang sample. Bagama't ang mass spectrometry ay isang epektibong kasangkapan para sa peptide at protein sequencing, kung ang mga naturang sample ay iturok sa mass spectrometer nang isang beses, ang paghihiwalay ay hindi magiging perpekto. Ang problemang ito ay maaaring mabawasan sa pamamagitan ng pagpapatupad ng mga paghihiwalay ng liquid chromatography (LC) bago ang pagsusuri ng MS, na magbabawas sa bilang ng mga analyte na pumapasok sa mass spectrometer sa isang takdang oras4,5,6. Bilang karagdagan, sa panahon ng paghihiwalay ng liquid phase, ang mga analyte ay maaaring ituon sa makikitid na rehiyon, sa gayon ay kino-concentrate ang mga analyte na ito at pinapabuti ang sensitivity ng MS detection. Ang Liquid chromatography (LC) ay ay umunlad nang malaki sa nakalipas na dekada at naging isang popular na pamamaraan sa proteomic analysis7,8,9,10.
Ang reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) ay malawakang ginagamit para sa paglilinis at paghihiwalay ng mga peptide mixture gamit ang octadecyl-modified silica (ODS) bilang stationary phase11,12,13. Gayunpaman, ang mga RP stationary phase ay hindi nagbibigay ng kasiya-siyang paghihiwalay ng mga peptide at protina dahil sa kanilang kumplikadong istraktura at amphiphilic na katangian14,15. Samakatuwid, kinakailangan ang mga espesyal na idinisenyong stationary phase upang masuri ang mga peptide at protina na may polar at non-polar moieties upang makipag-ugnayan at mapanatili ang mga analyte na ito16. Ang mixed-mode chromatography, na nagbibigay ng multimodal interactions, ay maaaring maging alternatibo sa RP-LC para sa paghihiwalay ng mga peptide, protina, at iba pang kumplikadong mixture. Maraming mixed-mode stationary phase ang inihanda, at ang mga column na puno ng mga phase na ito ay ginamit para sa paghihiwalay ng peptide at protina17,18,19,20,21. Ang mga mixed-mode stationary phase (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) ay angkop para sa paghihiwalay ng peptide at protina dahil sa pagkakaroon ng parehong polar at mga non-polar group22,23,24,25,26,27,28. Katulad nito, ang mga polar intercalating stationary phase na may mga covalently bonded polar group ay nagpapakita ng mahusay na kapangyarihan sa paghihiwalay at natatanging selectivity para sa polar at non-polar analytes, dahil ang paghihiwalay ay nakasalalay sa interaksyon sa pagitan ng analyte at stationary phase. Mga multimodal interaction 29, 30, 31, 32. Kamakailan lamang, si Zhang et al. 30 ay naghanda ng isang dodecyl-terminated polyamine stationary phase at matagumpay na naghiwalay ng mga hydrocarbon, antidepressants, flavonoids, nucleosides, estrogens, at ilang iba pang analytes. Ang polar intercalator ay may parehong polar at non-polar groups, kaya maaari itong gamitin upang paghiwalayin ang mga peptide at protina na may parehong hydrophobic at hydrophilic moieties. Ang mga polar-embedded column (hal., amide-embedded C18 column) ay komersyal na makukuha sa ilalim ng trade name na Ascentis Express RP-Amide columns, ngunit ang mga column na ito ay ginagamit lamang para sa pagsusuri ng amine 33.
Sa kasalukuyang pag-aaral, isang polar-embedded stationary phase (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) ang inihanda at sinuri para sa paghihiwalay ng mga peptide at trypsin digest ng HSA. Ang stationary phase ay inihanda gamit ang sumusunod na estratehiya. Ang mga porous silica particle ay inihanda ayon sa pamamaraang ibinigay sa aming nakaraang publikasyon na may ilang mga pagbabago sa protocol ng paghahanda. Ang ratio ng urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS, water acetic acid ay inayos upang ihanda ang mga silica particle na may malaking pore size. Pangalawa, isang bagong ligand, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, ang na-synthesize at ginamit upang i-derivatize ang mga silica particle upang maghanda ng isang polar embedded stationary phase. Ang nagresultang stationary phase ay inimpake sa isang stainless steel column (100 × 1.8 mm id) gamit ang optimized packing scheme. Ang column packing ay tinutulungan ng mechanical vibration upang matiyak na isang homogenous bed ang nabuo sa loob ng column. Suriin ang paghihiwalay ng packed column ng mga peptide mixture na binubuo ng limang peptide; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) at Trypsin digest ng human serum albumin (HAS). Ang peptide mixture at trypsin digest ng HSA ay naobserbahang naghiwalay nang may mahusay na resolusyon at kahusayan. Ang performance ng paghihiwalay ng PMP column ay inihambing sa Ascentis Express RP-Amide column. Ang parehong peptide at protina ay naobserbahang mahusay na nalutas at mahusay sa PMP column, na mas mahusay kaysa sa Ascentis Express RP-Amide column.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, Acetic Acid, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Human Serum Albumin (HSA), Ammonium Chloride, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Methanol, 2-Propanol, at Acetone na Binili mula sa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Isang pinaghalong urea (8 g), polyethylene glycol (8 g), at 8 mL ng 0.01 N acetic acid ang hinalo sa loob ng 10 minuto, at pagkatapos ay 24 mL ng TMOS ang idinagdag dito sa ilalim ng malamig na kondisyon. Ang pinaghalong reaksyon ay pinainit sa 40°C sa loob ng 6 na oras at pagkatapos ay sa 120°C sa loob ng 8 oras sa isang stainless steel autoclave. Ang tubig ay ibinuhos at ang natitirang materyal ay pinatuyo sa 70°C sa loob ng 12 oras. Ang pinatuyong malambot na masa ay makinis na giniling sa isang oven at kinalsina sa 550°C sa loob ng 12 oras. Tatlong batch ang inihanda at kinilala upang suriin ang reproducibility sa laki ng particle, laki ng butas at lawak ng ibabaw.
Sa pamamagitan ng pagbabago sa ibabaw ng mga partikulo ng silica gamit ang pre-synthesized ligand na phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) na sinundan ng radial polymerization gamit ang styrene, isang polar group-containing compound ang naihanda. Nakatigil na yugto para sa mga aggregate at polystyrene chain. Ang proseso ng paghahanda ay inilalarawan sa ibaba.
Ang N-phenylmaleimide (200 mg) at methyl vinyl isocyanate (100 mg) ay tinunaw sa tuyong toluene, at 0.1 mL ng 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) ay idinagdag sa reaction flask upang ihanda ang phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate copolymer (PMCP). Ang timpla ay pinainit sa 60°C sa loob ng 3 oras, sinala, at pinatuyo sa oven sa 40°C sa loob ng 3 oras.
Ang mga pinatuyong partikulo ng silica (2 g) ay ipinakalat sa tuyong toluene (100 mL), hinalo, at nilagyan ng sonikasyon sa isang 500 mL na bilog na prasko sa loob ng 10 minuto. Ang PMCP (10 mg) ay tinunaw sa toluene at idinagdag nang patak-patak sa prasko ng reaksyon sa pamamagitan ng isang dropping funnel. Ang timpla ay pinainit sa 100°C sa loob ng 8 oras, sinala, hinugasan gamit ang acetone, at pinatuyo sa 60°C sa loob ng 3 oras. Pagkatapos, ang mga partikulo ng silica na nakadikit sa PMCP (100 g) ay tinunaw sa toluene (200 ml) at ang 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) ay idinagdag sa presensya ng 100 µL ng dibutyltin dilaurate bilang katalista. Ang timpla ay hinalo sa 50°C sa loob ng 8 oras, sinala, at pinatuyo sa 50°C sa loob ng 3 oras.
Ang Styrene (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0.5 mL), at TEMPO-PMCP-attached silica particles (1.5 g) ay ikinalat sa toluene at nilinis gamit ang nitrogen. Ang polimerisasyon ng styrene ay isinagawa sa 100°C sa loob ng 12 oras. Ang nagresultang produkto ay hinugasan gamit ang methanol at pinatuyo sa 60°C magdamag. Ang pangkalahatang iskema ng reaksyon ay ipinapakita sa Figure 1.
Ang mga sample ay tinanggalan ng gas sa 393 K sa loob ng 1 oras upang makakuha ng natitirang presyon na mas mababa sa 10-3 Torr. Ang dami ng N2 na na-adsorb sa relatibong presyon na P/P0 = 0.99 ay ginamit upang matukoy ang kabuuang volume ng pore. Ang morpolohiya ng mga bare at ligand-bonded silica particle ay sinuri gamit ang scanning electron microscopy (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Ang mga pinatuyong sample (bare silica at ligand-bonded silica particle) ay inilagay sa isang aluminum column gamit ang adhesive carbon tape. Ang ginto ay kinalupkop sa mga sample gamit ang isang Q150T sputter coater, at isang 5 nm Au layer ang idineposito sa mga sample. Pinapabuti nito ang kahusayan ng proseso gamit ang mababang boltahe at nagbibigay ng pinong butil, malamig na sputtering. Isang Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elemental analyzer ang ginamit para sa elemental analysis. Isang Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 particle size analyzer ang ginamit upang makuha ang distribusyon ng laki ng particle. Mga naked silica particle at ligand-bonded silica Ang mga partikulo (5 mg bawat isa) ay ipinakalat sa 5 mL ng isopropanol, nilagyan ng sonication sa loob ng 10 minuto, ini-vortex sa loob ng 5 minuto, at inilagay sa optical bench ng Mastersizer. Ang thermogravimetric analysis ay isinagawa sa bilis na 5 °C kada minuto sa hanay ng temperatura na 30 hanggang 800 °C.
Ang mga makikipot na butas na haligi na gawa sa hindi kinakalawang na asero na may lining na salamin na may sukat (100 × 1.8 mm id) ay inimpake gamit ang paraan ng pag-iimpake ng slurry, na ginagamit ang parehong pamamaraan na ginamit sa Ref. 31. Isang haligi na gawa sa hindi kinakalawang na asero (may lining na salamin, 100 × 1.8 mm id) na may outlet fitting na naglalaman ng 1 µm frit ang ikinonekta sa isang slurry packer (Alltech Deerfield, IL, USA). Maghanda ng stationary phase slurry sa pamamagitan ng paglalagay ng 150 mg ng stationary phase sa 1.2 mL ng methanol at ipadala ito sa storage column. Ginamit ang methanol bilang slurry solvent pati na rin ang propelling solvent. Punuin ang haligi nang sunud-sunod sa pamamagitan ng paglalapat ng pressure na 100 MP sa loob ng 10 minuto, 80 MP sa loob ng 15 minuto, at 60 MP sa loob ng 30 minuto. Habang nag-iimpake, inilapat ang mechanical vibration gamit ang dalawang GC column shaker (Alltech, Deerfield, IL, USA) upang matiyak ang pantay na pag-iimpake ng haligi. Isara ang slurry packer at dahan-dahang bitawan ang pressure upang maiwasan ang anumang pinsala sa loob ng haligi. Idiskonekta ang haligi mula sa slurry packing unit at ikonekta ang isa pang fitting sa inlet at sa LC system upang suriin ang performance nito.
Isang LC pump (10AD Shimadzu, Japan), injector (Valco (USA) C14 W.05) na may 50nL injection loop, membrane degasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS capillary window ang ginawa gamit ang espesyal na µLC device detector (UV-2075) at mga microcolumn na may glass line. Gumamit ng napakakitid at maiikling connecting tubing upang mabawasan ang epekto ng karagdagang pagpapalapad ng column band. Pagkatapos ng packaging, ang mga capillary (50 μm id 365 at mga reducing union capillary (50 μm) ay inilagay sa 1/16″ outlet ng reducing union. Ang pagkolekta ng datos at pagproseso ng chromatographic ay isinagawa gamit ang Multichro 2000 software. Ang pagsubaybay sa 254 nm Analytes ay sinubukan para sa UV absorbance. Ang mga chromatographic data ay sinuri gamit ang OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin mula sa serum ng tao, lyophilized na pulbos, ≥ 96% (agarose gel electrophoresis) 3 mg na hinaluan ng trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), at 0.2 M ammonium bicarbonate (1 mL). Ang solusyon ay hinalo sa loob ng 10 minuto at pinanatili sa isang paliguan ng tubig sa 37°C sa loob ng 6 na oras, pagkatapos ay pinalamig gamit ang 1 mL ng 0.1% TFA. Salain ang solusyon at iimbak sa temperaturang mababa sa 4 °C.
Ang paghihiwalay ng mga peptide mixture at HSA trypsin digest ay sinuri nang hiwalay sa mga PMP column. Suriin ang paghihiwalay ng peptide mixture at trypsin digest ng HSA sa pamamagitan ng PMP column at ihambing ang mga resulta sa Ascentis Express RP-Amide column. Ang theoretical plate number ay kinakalkula tulad ng sumusunod:
Ang mga imahe ng SEM ng mga bare silica particle at ligand-bonded silica particle ay ipinapakita sa FIG. 2. Ang mga imahe ng SEM ng mga bare silica particle (A, B) ay nagpapakita na, kabaligtaran sa aming mga nakaraang pag-aaral, ang mga particle na ito ay spherical kung saan ang mga particle ay pahaba o may irregular na simetriya. Ang ibabaw ng mga ligand-bonded silica particle (C, D) ay mas makinis kaysa sa mga bare silica particle, na maaaring dahil sa patong ng mga polystyrene chain sa ibabaw ng mga silica particle.
Mga imahe ng scanning electron microscope ng mga bare silica particle (A, B) at mga ligand-bonded silica particle (C, D).
Ang mga distribusyon ng laki ng particle ng mga bare silica particle at ligand-bonded silica particle ay ipinapakita sa Figure 3(A). Ang mga volume-based particle size distribution curve ay nagpakita na ang laki ng mga silica particle ay tumaas pagkatapos ng chemical modification (Fig. 3A). Ang datos ng distribusyon ng laki ng particle ng mga silica particle mula sa kasalukuyang pag-aaral at sa nakaraang pag-aaral ay inihambing sa Table 1(A). Ang volume-based particle size, d(0.5), ng PMP ay 3.36 μm, kumpara sa aming nakaraang pag-aaral na may ad(0.5) value na 3.05 μm (polystyrene-bound silica particles)34. Ang batch na ito ay may mas makitid na distribusyon ng laki ng particle kumpara sa aming nakaraang pag-aaral dahil sa iba't ibang ratio ng PEG, urea, TMOS, at acetic acid sa reaction mixture. Ang laki ng particle ng PMP phase ay bahagyang mas malaki kaysa sa polystyrene-bound silica particle phase na aming napag-aralan noon. Nangangahulugan ito na ang surface functionalization ng mga silica particle na may styrene ay nagdeposito lamang ng polystyrene layer (0.97 µm) sa silica surface, samantalang sa PMP phase ang kapal ng layer ay 1.38 µm.
Distribusyon ng laki ng partikulo (A) at distribusyon ng laki ng butas (B) ng mga partikulo ng hubad na silica at mga partikulo ng silica na nakagapos sa ligand.
Ang laki ng butas, dami ng butas, at lawak ng ibabaw ng mga particle ng silica sa kasalukuyang pag-aaral ay ibinibigay sa Talahanayan 1(B). Ang mga PSD profile ng mga bare silica particle at ligand-bonded silica particle ay ipinapakita sa Larawan 3(B). Ang mga resulta ay maihahambing sa aming nakaraang pag-aaral. Ang laki ng butas ng mga bare at ligand-bound silica particle ay 310 at 241, ayon sa pagkakabanggit, na nagpapahiwatig na ang laki ng butas ay bumababa ng 69 pagkatapos ng pagbabagong kemikal, tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 1(B), at ang pagbabago ng kurba ay ipinapakita sa Larawan 3(B). Katulad nito, ang dami ng butas ng mga particle ng silica ay bumaba mula 0.67 hanggang 0.58 cm3/g pagkatapos ng pagbabagong kemikal. Ang tiyak na lawak ng ibabaw ng mga kasalukuyang pinag-aaralang particle ng silica ay 116 m2/g, na maihahambing sa aming nakaraang pag-aaral (124 m2/g). Tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 1(B), ang lawak ng ibabaw (m2/g) ng mga particle ng silica ay bumaba rin mula 116 m2/g hanggang 105 m2/g pagkatapos ng pagbabagong kemikal. pagbabago.
Ang mga resulta ng elemental analysis ng stationary phase ay ipinapakita sa Table 2. Ang carbon loading ng kasalukuyang stationary phase ay 6.35%, na mas mababa kaysa sa carbon loading ng aming nakaraang pag-aaral (polystyrene bonded silica particles, 7.93%35 at 10.21%, ayon sa pagkakabanggit) 42. Ang carbon loading ng kasalukuyang stationary phase ay mababa, dahil sa paghahanda ng kasalukuyang SP, bilang karagdagan sa styrene, ilang polar ligands tulad ng phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) at 4-hydroxy-TEMPO ang ginamit. Ang nitrogen weight percent ng kasalukuyang stationary phase ay 2.21%, kumpara sa 0.1735 at 0.85% by weight ng nitrogen sa mga nakaraang pag-aaral, ayon sa pagkakabanggit. Nangangahulugan ito na ang wt % ng nitrogen ay mas mataas sa kasalukuyang stationary phase dahil sa phenylmaleimide. Katulad nito, ang carbon loadings ng mga produkto (4) at (5) ay 2.7% at 2.9%, ayon sa pagkakabanggit, habang ang carbon loading ng pangwakas na Ang produkto (6) ay 6.35%, gaya ng ipinapakita sa Talahanayan 2. Ang pagbaba ng timbang ay sinuri gamit ang PMP stationary phase, at ang TGA curve ay ipinapakita sa Figure 4. Ang TGA curve ay nagpapakita ng pagbaba ng timbang na 8.6%, na naaayon sa carbon loading (6.35%) dahil ang mga ligand ay naglalaman hindi lamang ng C kundi pati na rin ng N, O, at H.
Ang phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ligand ay pinili para sa surface modification ng mga silica particle dahil mayroon itong polar phenylmaleimide groups at vinylisocyanate groups. Ang vinyl isocyanate groups ay maaaring higit pang mag-react sa styrene sa pamamagitan ng living radical polymerization. Ang pangalawang dahilan ay upang magsingit ng isang grupo na may katamtamang interaksyon sa analyte at walang malakas na electrostatic interaction sa pagitan ng analyte at ng stationary phase, dahil ang phenylmaleimide moiety ay walang virtual charge sa normal na pH. Ang polarity ng stationary phase ay maaaring kontrolin ng pinakamainam na dami ng styrene at ng reaction time ng free radical polymerization. Ang huling hakbang ng reaksyon (free-radical polymerization) ay kritikal at maaaring magbago ng polarity ng stationary phase. Isinagawa ang elemental analysis upang suriin ang carbon loading ng mga stationary phase na ito. Naobserbahan na ang pagtaas ng dami ng styrene at ang reaction time ay nagpataas ng carbon loading ng stationary phase at vice versa. Ang mga SP na inihanda na may iba't ibang konsentrasyon ng styrene ay may iba't ibang carbon loading. Muli, i-load ang mga stationary phase na ito sa mga stainless steel column at suriin ang kanilang chromatographic performance. (selektibidad, resolusyon, halaga ng N, atbp.). Batay sa mga eksperimentong ito, isang na-optimize na pormulasyon ang napili upang ihanda ang PMP stationary phase upang matiyak ang kontroladong polarity at mahusay na analyte retention.
Limang peptide mixtures (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ang sinuri rin gamit ang isang PMP column gamit ang isang mobile phase; 60/40 (v/v) acetonitrile/tubig (0.1% TFA) sa flow rate na 80 μL/min. Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng elution, ang theoretical plate number (N) bawat column (100 × 1.8 mm id) ay 20,000 ± 100 (200,000 plates/m²). Ang Table 3 ay nagbibigay ng mga halagang N para sa tatlong column ng PMP at ang mga chromatogram ay ipinapakita sa Figure 5A. Mabilis na pagsusuri sa isang column ng PMP sa mataas na flow rate (700 μL/min), limang peptide ang na-elute sa loob ng isang minuto, napakaganda ng mga halagang N, 13,500 ± 330 bawat column (100 × 1.8 mm id), Katumbas ng 135,000 plates/m (Figure 5B). Tatlong column na magkapareho ang laki (100 × 1.8 mm id) ang nilagyan ng tatlong magkakaibang lots ng PMP stationary phase upang suriin ang reproducibility. Ang Ang konsentrasyon ng analyte para sa bawat kolum ay naitala gamit ang pinakamainam na mga kondisyon ng elusyon at ang bilang ng mga theoretical plate na N at oras ng pagpapanatili upang paghiwalayin ang parehong pinaghalong pagsubok sa bawat kolum. Ang datos ng reproducibility para sa mga kolum ng PMP ay ipinapakita sa Talahanayan 4. Ang reproducibility ng kolum ng PMP ay may mahusay na kaugnayan sa napakababang halaga ng %RSD, tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 3.
Paghihiwalay ng pinaghalong peptide sa hanay ng PMP (B) at hanay ng Ascentis Express RP-Amide (A); mobile phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), mga sukat ng hanay ng PMP (100 × 1.8 mm id); analitikal Ang pagkakasunud-sunod ng elusyon ng mga compound: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) at 5 (leucine) acid enkephalin)).
Isang PMP column (100 × 1.8 mm id) ang sinuri para sa paghihiwalay ng mga tryptic digest ng human serum albumin sa pamamagitan ng high performance liquid chromatography. Ipinapakita ng chromatogram sa Figure 6 na ang sample ay mahusay na nakahiwalay at ang resolution ay napakaganda. Sinuri ang mga HSA digest gamit ang flow rate na 100 µL/min, mobile phase 70/30 acetonitrile/tubig at 0.1% TFA. Gaya ng ipinapakita sa chromatogram (Figure 6), ang HSA digestion ay hinati sa 17 peak na katumbas ng 17 peptides. Ang separation efficiency ng bawat peak sa HSA digest ay kinalkula at ang mga value ay ibinigay sa Table 5.
Isang tryptic digest ng HSA (100 × 1.8 mm id) ang pinaghiwalay sa isang PMP column; flow rate (100 µL/min), mobile phase 60/40 acetonitrile/tubig na may 0.1% TFA.
kung saan ang L ay ang haba ng haligi, ang η ay ang lagkit ng mobile phase, ang ΔP ay ang back pressure ng haligi, at ang u ay ang linear velocity ng mobile phase. Ang permeability ng haligi ng PMP ay 2.5 × 10-14 m2, ang flow rate ay 25 μL/min, at 60/40 v/v ACN/tubig ang ginamit. Ang permeability ng haligi ng PMP (100 × 1.8 mm id) ay katulad ng sa aming nakaraang pag-aaral Ref.34. Ang permeability ng haligi na puno ng mababaw na porous na mga particle ay: 1.7 × 10-15 para sa 1.3 μm na mga particle, 3.1 × 10-15 para sa 1.7 μm na mga particle, 5.2 × 10-15 at 2.5 × 10-14 m2 para sa 2.6 μm na mga particle. Para sa 5 μm na mga particle 43. Samakatuwid, ang permeability ng PMP phase ay katulad ng sa 5 μm na mga core-shell na mga particle.
kung saan ang Wx ay ang bigat ng haligi na puno ng chloroform, ang Wy ay ang bigat ng haligi na puno ng methanol, at ang ρ ay ang densidad ng solvent. Ang mga densidad ng methanol (ρ = 0.7866) at chloroform (ρ = 1.484). Ang kabuuang porosity ng mga haligi ng SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 at mga haligi ng C18-Urea 31 na aming naunang pinag-aralan ay 0.63 at 0.55, ayon sa pagkakabanggit. Nangangahulugan ito na ang presensya ng mga urea ligand ay binabawasan ang permeability ng stationary phase. Sa kabilang banda, ang kabuuang porosity ng haligi ng PMP (100 × 1.8 mm id) ay 0.60. Ang permeability ng mga haligi ng PMP ay mas mababa kaysa sa mga haligi na puno ng mga particle ng silica na may bonded na C18 dahil sa mga stationary phase na uri ng C18, ang mga ligand ng C18 ay nakakabit sa mga particle ng silica bilang mga linear chain, habang sa mga stationary phase na uri ng polystyrene, ang isang medyo makapal na layer ng polymer ay nabubuo sa paligid ng Sa isang tipikal na eksperimento, ang porosity ng haligi ay kinakalkula bilang:
Ipinapakita ng Figure 7A, B ang PMP column (100 × 1.8 mm id) at Ascentis Express RP-Amide column (100 × 1.8 mm id) gamit ang parehong mga kondisyon ng elusyon (ibig sabihin, 60/40 ACN/H2O at 0.1% TFA). ) ng van Deemter plot. Ang mga piling peptide mixtures (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ay inihanda sa 20 µL/. Ang minimum flow rate para sa parehong column ay 800 µL/min. Ang minimum HETP values ​​​​sa optimal flow rate (80 µL/min) para sa PMP column at Ascentis Express RP-Amide column ay 2.6 µm at 3.9 µm, ayon sa pagkakabanggit. Ang HETP values ​​​​ay nagpapahiwatig na ang separation efficiency ng PMP column (100 × 1.8 mm id) ay mas mahusay kaysa sa komersyal na available na Ascentis Express RP-Amide column (100 × 1.8 mm id). Ang van Deemter plot sa Fig. 7(A) ay nagpapakita na ang pagbaba sa N value kasabay ng pagtaas ng daloy ay hindi makabuluhan kumpara sa aming nakaraang pag-aaral. Ang mas mataas na separation efficiency ng PMP column (100 × 1.8 mm id) kumpara sa Ascentis Express RP-Amide column ay batay sa mga pagpapabuti sa hugis, laki, at mga kumplikadong pamamaraan sa pag-iimpake ng column na ginamit sa kasalukuyang gawain34.
(A) van Deemter plot (HETP laban sa mobile phase linear velocity) na nakuha gamit ang isang PMP column (100 × 1.8 mm id) sa 60/40 ACN/H2O na may 0.1% TFA.(B) van Deemter plot (HETP laban sa mobile phase linear velocity) na nakuha gamit ang isang Ascentis Express RP-Amide column (100 × 1.8 mm id) sa 60/40 ACN/H2O na may 0.1% TFA.
Isang polar-embedded polystyrene stationary phase ang inihanda at sinuri para sa paghihiwalay ng mga synthetic peptide mixtures at trypsin digests ng human serum albumin (HAS) sa high performance liquid chromatography. Ang chromatographic performance ng mga PMP column para sa mga peptide mixtures ay mahusay sa kahusayan at resolusyon ng paghihiwalay. Ang pinahusay na pagganap ng paghihiwalay ng mga PMP column ay dahil sa iba't ibang dahilan, tulad ng laki ng particle at pore size ng mga silica particle, kontroladong synthesis ng stationary phase, at complex column packing. Bukod sa mataas na kahusayan sa paghihiwalay, ang mababang column back pressure sa mataas na flow rate ay isa pang bentahe ng stationary phase na ito. Ang mga PMP column ay nagpapakita ng mahusay na reproducibility at maaaring gamitin para sa pagsusuri ng mga peptide mixtures at trypsin digestion ng iba't ibang protina. Layunin naming gamitin ang column na ito para sa paghihiwalay ng mga natural na produkto, bioactive compounds mula sa mga halamang gamot at fungal extracts sa liquid chromatography. Sa hinaharap, susuriin din ang mga PMP column para sa paghihiwalay ng mga protina at monoclonal antibodies.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Pananaliksik sa mga Sistema ng Paghihiwalay ng Peptide sa pamamagitan ng Reversed Phase Chromatography Bahagi I: Pagbuo ng isang Column Characterization Protocol. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Mga pinahusay na aktibong peptide na idinisenyo para sa paggamot ng mga nakakahawang sakit. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Mga sintetikong therapeutic peptide: agham at merkado. pagtuklas ng gamot.15 (1-2) ngayon, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD at Shen, Y. Mas Maunlad na Proteomic Liquid Chromatography.J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Ang advanced liquid chromatography-mass spectrometry ay nagbibigay-daan sa pagsasama ng malawakang naka-target na metabolomics at proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM at Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagbuo ng gamot. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Mga Pangunahing at Praktikal na Aspeto ng Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography para sa Mabilis na Paghihiwalay. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikasyon ng ultra-high performance liquid chromatography sa pagbuo ng gamot. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Mga monolithic macroporous hydrogel na inihanda mula sa mga high internal phase emulsion na may mataas na internal phase na langis-sa-tubig para sa mahusay na paglilinis ng mga enterovirus. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ang papel ng liquid chromatography sa proteomics.J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. at Guillarme, D. Mga umuusbong na uso sa mga paghihiwalay ng mga therapeutic peptide at protina gamit ang reversed-phase liquid chromatography: teorya at mga aplikasyon. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dalawang-dimensyonal na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang isang sistemang RP-RP-HPLC gamit ang iba't ibang halaga ng pH sa una at pangalawang dimensyon ng paghihiwalay. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Sinuri ang mga katangian ng paglilipat ng masa at kinetic performance ng mga high-efficiency chromatographic column na puno ng C18 sub-2 μm na ganap at mababaw na porous na mga particle. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Mga kamakailang uso at mga hamon sa pagsusuri sa paghihiwalay, pagkilala at pagpapatunay ng mga bioactive peptide ng halaman. anus. biological anus. Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Ang proteomic na tanawin ng kaharian ng buhay. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Pagproseso sa ibaba ng agos ng mga therapeutic peptide sa pamamagitan ng preparative liquid chromatography. Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography at ang aplikasyon nito sa mga biopolymer.J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. at Sun, Y. Mga Ligand para sa mixed-mode protein chromatography: prinsipyo, paglalarawan, at disenyo. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).