תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או לכבות את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
חלקיקי סיליקה נקבוביים הוכנו בשיטת סול-ג'ל עם מספר שינויים כדי להשיג חלקיקים מקרו-נקבוביים. חלקיקים אלה עברו נגזר על ידי פולימריזציה הפיכה של שרשרת העברת פרגמנטציה (RAFT) עם N-פנילמלאימיד-מתילוויניליזוציאנאט (PMI) וסטירן כדי להכין אינטרקלציה של N-פנילמלאימיד של פאזה נייחת פוליסטירן (PMP). עמודות נירוסטה צרות (100 × 1.8 מ"מ פנימי) נארזו באריזת תערובת. הערכת ביצועי כרומטוגרפיה של הפרדת תערובת פפטידים בעמודת PMP המורכבת מחמישה פפטידים (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ועיכול טריפסין של אלבומין בסרום אנושי (HAS). בתנאי שחרור אופטימליים, ספירת הצלחות התאורטית של תערובת הפפטידים גבוהה עד 280,000 צלחות/מ"ר. השוואת ביצועי ההפרדה של העמודה שפותחה עם ה-Ascentis Express המסחרי. בעמודת RP-Amide, נצפה כי ביצועי ההפרדה של עמודת PMP היו טובים יותר מאשר העמודה המסחרית מבחינת יעילות ההפרדה והרזולוציה.
בשנים האחרונות, תעשיית הביו-פרמצבטיקה הפכה לשוק עולמי הולך וגדל עם עלייה משמעותית בנתח השוק. עם הצמיחה המתפרצת של תעשיית הביו-פרמצבטיקה1,2,3, ניתוח פפטידים וחלבונים הוא מבוקש מאוד. בנוסף לפפטיד המטרה, נוצרים מספר זיהומים במהלך סינתזת פפטידים, ולכן נדרש טיהור כרומטוגרפי כדי להשיג פפטידים בטוהר הרצוי. ניתוח ואפיון חלבונים בנוזלי גוף, רקמות ותאים הם משימה מאתגרת ביותר בשל המספר הרב של מינים הניתנים לזיהוי פוטנציאלי בדגימה אחת. למרות שספקטרומטריית מסה היא כלי יעיל לריצוף פפטידים וחלבונים, אם דגימות כאלה מוזרקות לספקטרומטר מסה במעבר אחד, ההפרדה לא תהיה אידיאלית. ניתן למתן בעיה זו על ידי יישום הפרדות כרומטוגרפיה נוזלית (LC) לפני ניתוח MS, אשר יפחית את מספר האנליטים הנכנסים לספקטרומטר המסה בזמן נתון4,5,6. בנוסף, במהלך הפרדת פאזות נוזליות, ניתן למקד אנליטים באזורים צרים, ובכך לרכז אנליטים אלה ולשפר את רגישות גילוי MS. כרומטוגרפיית נוזלים (LC) התקדמה משמעותית בעשור האחרון והפכה לפופולרית... טכניקה בניתוח פרוטאומי7,8,9,10.
כרומטוגרפיית נוזלים בפאזה הפוכה (RP-LC) נמצאת בשימוש נרחב לטיהור והפרדה של תערובות פפטידים באמצעות סיליקה שעברה שינוי אוקטדציל (ODS) כפאזה נייחת11,12,13. עם זאת, פאזות נייחות RP אינן מספקות הפרדה מספקת של פפטידים וחלבונים בשל המבנה המורכב שלהם ואופיין האמפיפילי14,15. לכן, נדרשות פאזות נייחות שתוכננו במיוחד כדי לנתח פפטידים וחלבונים עם קבוצות פולריות ולא פולריות כדי לתקשר עם אנליטים אלה ולשמור אותם16. כרומטוגרפיה במצב מעורב, המספקת אינטראקציות רב-מודאליות, יכולה להיות אלטרנטיבה ל-RP-LC להפרדת פפטידים, חלבונים ותערובות מורכבות אחרות. הוכנו מספר פאזות נייחות במצב מעורב, ועמודות ארוזות בפאזות אלה שימשו להפרדות פפטידים וחלבונים17,18,19,20,21. פאזות נייחות במצב מעורב (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation פולארי/RPLC) מתאימות להפרדות פפטידים וחלבונים בשל נוכחותם של קבוצות פולריות ולא פולריות כאחד. קבוצות22,23,24,25,26,27,28. באופן דומה, פאזות נייחות intercalating קוטביות עם קבוצות פולריות הקשורות קוולנטית מראות כוח הפרדה טוב וסלקטיביות ייחודית עבור אנליטים פולריים ולא פולריים, מכיוון שההפרדה תלויה באינטראקציה בין האנליט לפאזה הנייחת. אינטראקציות רב-מודאליות29, 30, 31, 32. לאחרונה, ג'אנג ועמיתיו30 הכינו פאזה נייחת פוליאמין עם סיום דודציל והפרידו בהצלחה פחמימנים, תרופות נוגדות דיכאון, פלבנואידים, נוקלאוזידים, אסטרוגנים ומספר אנליטים אחרים. לאינטרקלטור הקוטבי יש קבוצות פולריות ולא פולריות, כך שניתן להשתמש בו להפרדת פפטידים וחלבונים בעלי קבוצות הידרופוביות והידרופיליות כאחד. עמודות משובצות פולריות (למשל, עמודות C18 משובצות באמיד) זמינות מסחרית תחת השם המסחרי עמודות Ascentis Express RP-Amide, אך עמודות אלו משמשות לניתוח של אמין 33 בלבד.
במחקר הנוכחי, הוכנה פאזה נייחת משובצת פולאר (פוליסטירן משובץ N-פנילמלימיד) והוערכה להפרדת פפטידים ועיכול טריפסין של HSA. הפאזה הנייחת הוכנה באמצעות האסטרטגיה הבאה. חלקיקי סיליקה נקבוביים הוכנו לפי הנוהל שניתן בפרסום הקודם שלנו עם כמה שינויים בפרוטוקול ההכנה. היחס בין אוריאה, פוליאתילן גליקול (PEG), TMOS, מים וחומצה אצטית הותאם להכנת חלקיקי סיליקה בעלי גודל נקבוביות גדול. שנית, ליגנד חדש, פנילמלימיד-מתיל ויניל איזוציאנט, סונתז ושימש ליצירת חלקיקי סיליקה להכנת פאזה נייחת משובצת פולאר. הפאזה הנייחת שנוצרה נדחסה בעמודה מפלדת אל-חלד (100 × 1.8 מ"מ פנימי) באמצעות סכמת אריזה אופטימלית. אריזת העמודה נעזרת ברטט מכני כדי להבטיח שנוצרת מצע הומוגני בתוך העמודה. הערכת הפרדת עמודה דחוסה של תערובות פפטידים המורכבות מחמישה פפטידים; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ועיכול טריפסין של אלבומין בסרום אנושי (HAS). תערובת הפפטידים ועיכול הטריפסין של HSA נצפו כהפרדה ברזולוציה ויעילות טובות. ביצועי ההפרדה של עמודת PMP הושוו לאלו של עמודת Ascentis Express RP-Amide. פפטידים וחלבונים נצפו כהפרדה טובה ויעילה בעמודת PMP, שהייתה יעילה יותר מעמודת Ascentis Express RP-Amide.
PEG (פוליאתילן גליקול), אוריאה, חומצה אצטית, טרימתוקסי אורטוסיליקט (TMOS), טרימתיל כלורוסילאן (TMCS), טריפסין, אלבומין בסרום אנושי (HSA), אמוניום כלוריד, אוריאה, הקסאן מתילדיסילאזאן (HMDS), מתאקרילויל כלוריד (MC), סטירן, 4-הידרוקסי-TEMPO, בנזואיל פראוקסיד (BPO), אצטוניטריל (ACN) ברמת HPLC, מתנול, 2-פרופנול ואצטון. נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב).
תערובת של אוריאה (8 גרם), פוליאתילן גליקול (8 גרם) ו-8 מ"ל של חומצה אצטית 0.01 N עורבבה במשך 10 דקות, ולאחר מכן נוספו אליה 24 מ"ל של TMOS בתנאים קרים כקרח. תערובת התגובה חוממה ב-40 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות ולאחר מכן ב-120 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות באוטוקלב מפלדת אל-חלד. המים נשפכו והחומר הנותר יובש ב-70 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. המסה הרכה היבשה נטחנה בצורה חלקה בתנור ועברו קלצינציה ב-550 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. שלוש מנות הוכנו ואופיינו לבחינת שחזור בגודל החלקיקים, גודל הנקבוביות ושטח הפנים.
על ידי שינוי פני השטח של חלקיקי סיליקה עם ליגנד פנילמלאימיד-מתילוויניליזוציאנאט (PCMP) שסונתז מראש, ולאחר מכן פולימריזציה רדיאלית עם סטירן, הוכנה תרכובת המכילה קבוצה פולרית. פאזה נייחת עבור אגרגטים ושרשראות פוליסטירן. תהליך ההכנה מתואר להלן.
N-פנילמלימיד (200 מ"ג) ומתיל ויניל איזוציאנט (100 מ"ג) הומסו בטולואן יבש, ו-0.1 מ"ל של 2,2'-אזואיזובוטירוניטריל (AIBN) נוספו לבקבוק התגובה כדי להכין קופולימר פנילמלימיד-מתיל ויניל איזוציאנט (PMCP). התערובת חוממה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות, סוננה ויובשה בתנור ב-40 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
חלקיקי סיליקה יבשים (2 גרם) פוזרו בטולואן יבש (100 מ"ל), עורבבו ועברו סוניקציה בבקבוק עגול של 500 מ"ל למשך 10 דקות. PMCP (10 מ"ג) הומס בטולואן והוסף טיפה אחר טיפה לבקבוק התגובה דרך משפך טפטוף. התערובת חוממה ברפלוקס ב-100 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות, סוננה, נשטפה באצטון ויובשה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. לאחר מכן, חלקיקי סיליקה הקשורים ל-PMCP (100 גרם) הומסו בטולואן (200 מ"ל) ו-4-הידרוקסי-TEMPO (2 מ"ל) נוסף בנוכחות 100 מיקרוליטר של דיבוטילטין דילאוראט כזרז. התערובת עורבבה ב-50 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות, סוננה ויובשה ב-50 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
סטירן (1 מ"ל), בנזואיל פרוקסיד BPO (0.5 מ"ל) וחלקיקי סיליקה המחוברים ל-TEMPO-PMCP (1.5 גרם) פוזרו בטולואן וטוהרו בחנקן. הפולימריזציה של הסטירן בוצעה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. התוצר שנוצר נשטף עם מתנול ויובש ב-60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. סכמת התגובה הכוללת מוצגת באיור 1.
הדגימות נוקו מגזים ב-393 קלווין למשך שעה אחת כדי להשיג לחץ שיורי של פחות מ-10-3 טור. כמות ה-N2 שנספחה בלחץ יחסי של P/P0 = 0.99 שימשה לקביעת נפח הנקבוביות הכולל. המורפולוגיה של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (Hitachi High Technologies, טוקיו, יפן). דגימות מיובשות (סיליקה חשופה וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד) הונחו על עמוד אלומיניום באמצעות סרט דביק פחמן. זהב צופה על הדגימות באמצעות ציפוי התזה Q150T, ושכבת Au בעובי 5 ננומטר הופקדה על הדגימות. זה משפר את יעילות התהליך באמצעות מתחים נמוכים ומספק התזה קרה עדינה. מנתח אלמנטים Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 שימש לניתוח אלמנטים. מנתח גודל חלקיקים Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 שימש כדי לקבל את התפלגות גודל החלקיקים. חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד. (5 מ"ג כל אחד) פוזרו ב-5 מ"ל של איזופרופנול, עברו סוניקציה במשך 10 דקות, עורבבו בוורטקס במשך 5 דקות והונחו על ספסל האופטי של מכשיר המאסטרסייזר. ניתוח תרמוגרבימטרי בוצע בקצב של 5 מעלות צלזיוס לדקה בטווח טמפרטורות של 30 עד 800 מעלות צלזיוס.
עמודות נירוסטה צרות מצופות זכוכית במידות (100 × 1.8 מ"מ פנימי) נארזו בשיטת אריזת slurry, תוך יישום אותו הליך המשמש במקור. 31. עמודה מפלדת אל-חלד (מצופה זכוכית, קוטר פנימי של 100 × 1.8 מ"מ) עם מחבר יציאה המכיל פריט של 1 מיקרומטר חוברה לאריזת תרחיף (Alltech Deerfield, IL, USA). הכינו תרחיף פאזה נייחת על ידי השעיית 150 מ"ג של פאזה נייחת ב-1.2 מ"ל של מתנול ושליחתו לעמודת האחסון. מתנול שימש כממס תרחיף וכן כממס מניע. מלאו את העמודה ברצף על ידי הפעלת לחצים של 100 מגה-בייט למשך 10 דקות, 80 מגה-בייט למשך 15 דקות ו-60 מגה-בייט למשך 30 דקות. במהלך האריזה, הופעלה רטט מכני באמצעות שני ניעורי עמודות GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) כדי להבטיח אריזה אחידה של העמודה. סגרו את אריזת התרחיף ושחררו את הלחץ באיטיות כדי למנוע נזק בתוך העמודה. נתקו את העמודה מיחידת אריזת התרחיף וחברו מחבר נוסף לכניסה ולמערכת LC כדי לבדוק את ביצועיה.
נבנו משאבת LC (10AD Shimadzu, יפן), מזרק (Valco (ארה"ב) C14 W.05) עם לולאת הזרקה של 50nL, מסיר גזים בממברנה (Shimadzu DGU-14A), חלון נימי UV-VIS. גלאי μLC מיוחד (UV-2075) ומיקרו-עמודות מרופדות זכוכית. השתמשו בצינורות חיבור צרים וקצרים מאוד כדי למזער את ההשפעה של הרחבת פס העמודה הנוספת. לאחר האריזה, הותקנו נימים (50 מיקרומטר בקוטר 365) ונימים של איחוד מחזר (50 מיקרומטר) ביציאה של 1/16 אינץ' של האיחוד המחזר. איסוף הנתונים ועיבוד הכרומטוגרפי בוצעו באמצעות תוכנת Multichro 2000. ניטור ב-254 ננומטר. האנליטים נבדקו לספיגת UV. הנתונים הכרומטוגרפיים נותחו על ידי OriginPro8 (נורת'המפטון, מסצ'וסטס).
אלבומין מסרום אנושי, אבקה שעברה ליופיליזציה, ≥ 96% (אלקטרופורזה בג'ל אגרוז) 3 מ"ג מעורבב עם טריפסין (1.5 מ"ג), 4.0 M אוריאה (1 מ"ל) ו-0.2 M אמוניום ביקרבונט (1 מ"ל). התמיסה עורבבה במשך 10 דקות ונשמרה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות, ולאחר מכן דוממה עם 1 מ"ל של 0.1% TFA. סננו את התמיסה ואחסנו מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
הפרדת תערובות פפטידים ועיכול טריפסין של HSA הוערכה בנפרד על עמודות PMP. בדקו את הפרדת תערובת הפפטידים ועיכול הטריפסין של HSA על ידי עמודת ה-PMP והשוו את התוצאות לעמודת Ascentis Express RP-Amide. מספר הלוחות התאורטי מחושב באופן הבא:
תמונות SEM של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצגות באיור 2. תמונות SEM של חלקיקי סיליקה חשופים (A, B) מראות שבניגוד למחקרים קודמים שלנו, חלקיקים אלה הם כדוריים שבהם החלקיקים מוארכים או בעלי סימטריה לא סדירה. פני השטח של חלקיקי הסיליקה הקשורים לליגנד (C, D) חלקים יותר מאלה של חלקיקי הסיליקה החשופים, דבר שעשוי להיות בגלל ציפוי שרשראות פוליסטירן על פני חלקיקי הסיליקה.
תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של חלקיקי סיליקה חשופים (A, B) וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד (C, D).
התפלגות גודל החלקיקים של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצגת באיור 3(א). עקומות התפלגות גודל החלקיקים המבוססות על נפח הראו שגודל חלקיקי הסיליקה גדל לאחר שינוי כימי (איור 3א). נתוני התפלגות גודל החלקיקים של חלקיקי הסיליקה מהמחקר הנוכחי והמחקר הקודם מושווים בטבלה 1(א). גודל החלקיקים המבוסס על נפח, d(0.5), של PMP הוא 3.36 מיקרומטר, בהשוואה למחקר הקודם שלנו עם ערך ad(0.5) של 3.05 מיקרומטר (חלקיקי סיליקה הקשורים לפוליסטירן)34. לאצווה זו הייתה התפלגות גודל חלקיקים צר יותר בהשוואה למחקר הקודם שלנו עקב היחסים המשתנים של PEG, אוריאה, TMOS וחומצה אצטית בתערובת התגובה. גודל החלקיקים של פאזת ה-PMP גדול מעט מזה של פאזת חלקיקי הסיליקה הקשורים לפוליסטירן שחקרנו בעבר. משמעות הדבר היא שפונקציונליזציה של חלקיקי סיליקה על פני השטח עם סטירן רק השקיעה שכבת פוליסטירן (0.97 מיקרומטר) על פני הסיליקה, ואילו בשלב ה-PMP עובי השכבה היה... 1.38 מיקרומטר.
התפלגות גודל החלקיקים (A) והתפלגות גודל הנקבוביות (B) של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד.
גודל הנקבוביות, נפח הנקבוביות ושטח הפנים של חלקיקי הסיליקה של המחקר הנוכחי ניתנים בטבלה 1(B). פרופילי ה-PSD של חלקיקי סיליקה חשופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצגים באיור 3(B). התוצאות דומות למחקר הקודם שלנו. גודל הנקבוביות של חלקיקי הסיליקה החשופים והקשורים לליגנד הוא 310 ו-241, בהתאמה, דבר המצביע על כך שגודל הנקבוביות יורד ב-69 לאחר שינוי כימי, כפי שמוצג בטבלה 1(B), והשינוי בעקומה מוצג באיור 3(B). באופן דומה, נפח הנקבוביות של חלקיקי הסיליקה ירד מ-0.67 ל-0.58 סמ"ק/גרם לאחר שינוי כימי. שטח הפנים הסגולי של חלקיקי הסיליקה הנחקרים כעת הוא 116 מ"ר/גרם, נתון דומה למחקר הקודם שלנו (124 מ"ר/גרם). כפי שמוצג בטבלה 1(B), שטח הפנים (מ"ר/גרם) של חלקיקי הסיליקה ירד גם הוא מ-116 מ"ר/גרם ל-105 מ"ר/גרם לאחר שינוי כימי. שינוי.
תוצאות הניתוח האלמנטרי של הפאזה הנייחת מוצגות בטבלה 2. טעינת הפחמן של הפאזה הנייחת הנוכחית היא 6.35%, שהיא נמוכה יותר מעומס הפחמן של המחקר הקודם שלנו (חלקיקי סיליקה מקושרים לפוליסטירן, 7.93%35 ו-10.21%, בהתאמה)42. טעינת הפחמן של הפאזה הנייחת הנוכחית נמוכה, מכיוון שבהכנת ה-SP הנוכחי, בנוסף לסטירן, נעשה שימוש בכמה ליגנדים פולריים כגון פנילמלאימיד-מתילוויניליזוציאנאט (PCMP) ו-4-הידרוקסי-TEMPO. אחוז משקל החנקן של הפאזה הנייחת הנוכחית הוא 2.21%, בהשוואה ל-0.1735 ו-0.85% משקל חנקן במחקרים קודמים, בהתאמה. משמעות הדבר היא שאחוז משקל החנקן גבוה יותר בפאזה הנייחת הנוכחית עקב פנילמלאימיד. באופן דומה, טעינות הפחמן של התוצרים (4) ו-(5) היו 2.7% ו-2.9%, בהתאמה, בעוד שעומס הפחמן של התוצר הסופי (6) היה 6.35%, כפי שמוצג בטבלה 2. ירידה במשקל נבדקה באמצעות פאזה נייחת של PMP, ועקומת ה-TGA מוצגת באיור 4. עקומת ה-TGA מראה ירידה במשקל של 8.6%, התואמת היטב את עומס הפחמן (6.35%) מכיוון שהליגנדים מכילים לא רק C אלא גם N, O ו-H.
הליגנד פנילמלאימיד-מתילוויניליזוציאנאט נבחר לשינוי פני השטח של חלקיקי סיליקה מכיוון שיש לו קבוצות פנילמלאימיד קוטביות וקבוצות ויניליזוציאנאט. קבוצות ויניל איזוציאנט יכולות להגיב עוד יותר עם סטירן על ידי פולימריזציה רדיקלית חיה. הסיבה השנייה היא להכניס קבוצה שיש לה אינטראקציה מתונה עם האנליט ואין אינטראקציה אלקטרוסטטית חזקה בין האנליט לפאזה הנייחת, מכיוון שלחלק הפנילמלאימיד אין מטען וירטואלי ב-pH רגיל. ניתן לשלוט בקוטביות של הפאזה הנייחת על ידי כמות הסטירן האופטימלית וזמן התגובה של פולימריזציה רדיקלית חופשית. השלב האחרון של התגובה (פולימריזציה רדיקלית חופשית) הוא קריטי ויכול לשנות את הקוטביות של הפאזה הנייחת. בוצע ניתוח אלמנטרי כדי לבדוק את עומס הפחמן של פאזות נייחות אלו. נצפה כי הגדלת כמות הסטירן וזמן התגובה הגדילה את עומס הפחמן של הפאזה הנייחת ולהיפך. ל-SPs שהוכנו עם ריכוזים שונים של סטירן יש עומסי פחמן שונים. שוב, טען את הפאזות הנייחות הללו לתוך עמודות נירוסטה ובדק את הביצועים הכרומטוגרפיים שלהן (סלקטיביות, רזולוציה, N2). ערך וכו'). בהתבסס על ניסויים אלה, נבחרה פורמולציה אופטימלית להכנת הפאזה הנייחת של PMP כדי להבטיח קוטביות מבוקרת ושימור אנליטים טוב.
חמש תערובות פפטידים (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, לאוצין אנקפלין) הוערכו גם הן באמצעות עמודת PMP המשתמשת בפאזה ניידת; 60/40 (v/v) אצטוניטריל/מים (0.1% TFA) בקצב זרימה של 80 מיקרוליטר/דקה. בתנאי אלואציה אופטימליים, מספר הלוחות התאורטי (N) לכל עמודה (100 × 1.8 מ"מ פנימי) הוא 20,000 ± 100 (200,000 לוחות/מ"ר). טבלה 3 מציגה את ערכי ה-N עבור שלוש עמודות ה-PMP והכרומטוגרמות מוצגות באיור 5A. ניתוח מהיר על עמודת PMP בקצב זרימה גבוה (700 מיקרוליטר/דקה), חמישה פפטידים עברו אלואציה תוך דקה אחת, ערכי ה-N היו טובים מאוד, 13,500 ± 330 לכל עמודה (100 × 1.8 מ"מ פנימי), מתאים ל-135,000 לוחות/מ"ר (איור 5B). שלוש עמודות בגודל זהה (100 × 1.8 מ"מ פנימי) נארזו בשלוש מנות שונות של פאזה נייחת PMP כדי לבדוק את יכולת השחזור. ריכוז האנליט עבור כל עמודה נרשם תוך שימוש בתנאי אלוציה אופטימליים ומספר הלוחות התאורטיים N וזמן החזקה להפרדת אותה תערובת בדיקה בכל עמודה. נתוני השחזור עבור עמודות ה-PMP מוצגים בטבלה 4. השחזור של עמודת ה-PMP מתואם היטב עם ערכי %RSD נמוכים מאוד, כפי שמוצג בטבלה 3.
הפרדת תערובת הפפטידים על עמודת PMP (B) ועמודת Ascentis Express RP-Amide (A); פאזה ניידת 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), מידות עמודת PMP (100 × 1.8 מ"מ פנימי); אנליטי. סדר האלוציה של התרכובות: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ו-5 (לאוצין) חומצה אנקפלין)).
עמודת PMP (100 × 1.8 מ"מ פנימי) הוערכה לצורך הפרדת עיכולים טריפטיים של אלבומין בסרום אנושי בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים. הכרומטוגרמה באיור 6 מראה שהדגימה מופרדת היטב והרזולוציה טובה מאוד. עיכולי HSA נותחו באמצעות קצב זרימה של 100 מיקרוליטר/דקה, פאזה ניידת 70/30 אצטוניטריל/מים ו-0.1% TFA. כפי שמוצג בכרומטוגרמה (איור 6), עיכול ה-HSA חולק ל-17 פיקים התואמים ל-17 פפטידים. יעילות ההפרדה של כל שיא בעיכול HSA חושבה והערכים ניתנים בטבלה 5.
עיכול טריפטי של HSA (100 × 1.8 מ"מ פנימי) הופרד על עמודת PMP; קצב זרימה (100 מיקרוליטר/דקה), פאזה ניידת 60/40 אצטוניטריל/מים עם 0.1% TFA.
כאשר L הוא אורך העמודה, η היא צמיגות הפאזה הניידת, ΔP הוא לחץ הגב של העמודה, ו-u היא המהירות הליניארית של הפאזה הניידת. חדירות עמודת ה-PMP הייתה 2.5 × 10-14 מ"ר, קצב הזרימה היה 25 מיקרוליטר/דקה, ונעשה שימוש ב-60/40 v/v ACN/מים. חדירות עמודת ה-PMP (100 × 1.8 מ"מ קוטר פנימי) הייתה דומה לזו של המחקר הקודם שלנו Ref.34. חדירות העמודה הארוזה בחלקיקים נקבוביים שטחית היא: 1.7 × 10-15 עבור חלקיקים של 1.3 מיקרומטר, 3.1 × 10-15 עבור חלקיקים של 1.7 מיקרומטר, 5.2 × 10-15 ו-2.5 × 10-14 מ"ר עבור חלקיקים של 2.6 מיקרומטר עבור חלקיקים של 5 מיקרומטר 43. לכן, חדירות פאזת ה-PMP דומה לזו של חלקיקי ליבה-קליפה של 5 מיקרומטר.
כאשר Wx הוא משקל העמודה הארוזה בכלורופורם, Wy הוא משקל העמודה הארוזה במתנול, ו-ρ הוא צפיפות הממס. צפיפויות המתנול (ρ = 0.7866) והכלורופורם (ρ = 1.484). הנקבוביות הכוללת של עמודות חלקיקי סיליקה-C18 (100 × 1.8 מ"מ קוטר פנימי) 34 ועמודות C18-אוריאה 31 שחקרנו בעבר הייתה 0.63 ו-0.55, בהתאמה. משמעות הדבר היא שנוכחות ליגנדים של אוריאה מפחיתה את החדירות של הפאזה הנייחת. מצד שני, הנקבוביות הכוללת של עמודת PMP (100 × 1.8 מ"מ קוטר פנימי) היא 0.60. החדירות של עמודות PMP נמוכה מזו של עמודות ארוזות בחלקיקי סיליקה הקשורים ל-C18 מכיוון שבפאזות נייחות מסוג C18 ליגנדים של C18 מחוברים לחלקיקי הסיליקה כשרשראות ליניאריות, בעוד שבפאזות נייחות מסוג פוליסטירן, שכבת הפולימר העבה יחסית... נוצר סביבו. בניסוי טיפוסי, נקבוביות העמודה מחושבת כך:
איור 7א', ב' מציגים את עמודת ה-PMP (קוטר פנימי של 100 × 1.8 מ"מ) ואת עמודת ה-Ascentis Express RP-Amide (קוטר פנימי של 100 × 1.8 מ"מ) תוך שימוש באותם תנאי שחרור (כלומר, 60/40 ACN/H2O ו-0.1% TFA) של גרף ואן דמטר. תערובות פפטידים נבחרות (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) הוכנו ב-20 מיקרוליטר/ קצב הזרימה המינימלי עבור שתי העמודות הוא 800 מיקרוליטר/דקה. ערכי ה-HETP המינימליים בקצב הזרימה האופטימלי (80 מיקרוליטר/דקה) עבור עמודת ה-PMP ועמודת ה-Ascentis Express RP-Amide היו 2.6 מיקרומטר ו-3.9 מיקרומטר, בהתאמה. ערכי ה-HETP מצביעים על כך שייעילות ההפרדה של עמודת ה-PMP (100 × 1.8 מ"מ פנימי) טובה בהרבה מעמודת ה-Ascentis Express RP-Amide הזמינה מסחרית (100 × 1.8 מ"מ פנימי). דיאגרמת ואן דמטר באיור 7(A) מראה שהירידה בערך N עם הזרימה הגוברת אינה משמעותית בהשוואה למחקר הקודם שלנו. יעילות ההפרדה הגבוהה יותר של עמודת ה-PMP (100 × 1.8 מ"מ פנימי) id) בהשוואה לעמודת Ascentis Express RP-Amide מבוססת על שיפורים בצורת החלקיקים, בגודלם ובהליכי אריזה מורכבים של העמודה המשמשים בעבודה הנוכחית34.
(א) דיאגרמת ואן דמטר (HETP לעומת מהירות ליניארית של פאזה ניידת) שהתקבלה באמצעות עמודת PMP (100 × 1.8 מ"מ פנימי) ב-60/40 ACN/H2O עם 0.1% TFA. (ב) דיאגרמת ואן דמטר (HETP לעומת מהירות ליניארית של פאזה ניידת) שהתקבלה באמצעות עמודת Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 מ"מ פנימי) ב-60/40 ACN/H2O עם 0.1% TFA.
פאזה נייחת מפוליסטירן משובצת פוליר הוכנה והוערכה להפרדת תערובות פפטידים סינתטיות ועיכול טריפסין של אלבומין בסרום אנושי (HAS) בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים. ביצועי הכרומטוגרפיה של עמודות PMP לתערובות פפטידים מצוינים ביעילות ההפרדה וברזולוציה. ביצועי ההפרדה המשופרים של עמודות PMP נובעים ממגוון סיבות, כגון גודל החלקיקים וגודל הנקבוביות של חלקיקי הסיליקה, סינתזה מבוקרת של הפאזה הנייחת ואריזה מורכבת של העמודה. בנוסף ליעילות ההפרדה הגבוהה, לחץ גב נמוך בעמודה בקצבי זרימה גבוהים הוא יתרון נוסף של פאזה נייחת זו. עמודות PMP מציגות שחזור טוב וניתן להשתמש בהן לניתוח תערובות פפטידים ועיכול טריפסין של חלבונים שונים. אנו מתכוונים להשתמש בעמודה זו להפרדת מוצרים טבעיים, תרכובות ביו-אקטיביות מצמחי מרפא ותמציות פטרייתיות בכרומטוגרפיית נוזלים. בעתיד, עמודות PMP יוערכו גם להפרדת חלבונים ונוגדנים חד שבטיים.
פילד, ג'יי.קיי., יוארבי, מ.ר., לאו, ג'., תוגרסן, ה'. ופטרסון, פ. מחקר על מערכות הפרדת פפטידים על ידי כרומטוגרפיה פאזה הפוכה חלק א': פיתוח פרוטוקול אפיון עמודה. י'. כרומטוגרפיה. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
גומז, ב' ואחרים. פפטידים פעילים משופרים המיועדים לטיפול במחלות זיהומיות. ביוטכנולוגיה. מתקדמת. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. פפטידים טיפוליים סינתטיים: מדע ושוק. גילוי תרופות. 15 (1-2) היום, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. כרומטוגרפיה נוזלית פרוטאומית מתקדמת. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. כרומטוגרפיית נוזלים-ספקטרומטריית מסות מתקדמת מאפשרת שילוב של מטבולומיקה ופרוטאומיקה בעלי מגוון רחב של תוצאות. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ תפקידו של UHPLC בפיתוח תרופות. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
וו, נ. וקלאוזן, א.מ. היבטים יסודיים ומעשיים של כרומטוגרפיית נוזלים בלחץ גבוה במיוחד להפרדות מהירות. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
רן, ס.א. וצ'ליטשף, פ. יישום כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בפיתוח תרופות. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. הידרוג'לים מקרופורוסים מונוליטיים שהוכנו מאמולסיות שמן-במים בעלות פאזה פנימית גבוהה לטיהור יעיל של אנטרווירוסים. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
שי, י., שיאנג, ר., הורבט, ק. ווילקינס, ג'.א. תפקיד הכרומטוגרפיה הנוזלית בפרוטאומיקס. J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
פקטה, ש., וות'י, י.-ל. וגילרמה, ד. מגמות מתפתחות בהפרדות כרומטוגרפיית נוזלים בפאזה הפוכה של פפטידים וחלבונים טיפוליים: תיאוריה ויישומים. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
גילאר, מ., אוליבובה, פ., דיילי, א.א. וגבר, ג'.סי. הפרדה דו-ממדית של פפטידים באמצעות מערכת RP-RP-HPLC תוך שימוש בערכי pH שונים בממד ההפרדה הראשון והשני. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. נחקרו מאפייני העברת המסה והביצועים הקינטיים של עמודות כרומטוגרפיות יעילות גבוהה ארוזות בחלקיקים נקבוביים מלאים ושטחיים של C18 בגודל תת-2 מיקרומטר. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. מגמות אחרונות ואתגרים אנליטיים בבידוד, זיהוי ותיקוף של פפטידים ביו-אקטיביים צמחיים. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB ואחרים. הנוף הפרוטאומי של ממלכת החיים. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. עיבוד במורד הזרם של פפטידים טיפוליים על ידי כרומטוגרפיית נוזלים פרפרטיבית. Molecule (באזל, שוויץ) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. כרומטוגרפיה במצב מעורב ויישומה בביופולימרים. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. ליגנדים לכרומטוגרפיית חלבונים במצב מעורב: עיקרון, אפיון ותכנון. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).