Spas ji bo serdana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî moda lihevhatinê di Internet Explorer-ê de vemirînin). Di vê navberê de, ji bo ku piştgiriya berdewam misoger bikin, em ê malperê bêyî şêwaz û JavaScript-ê nîşan bidin.
Perçeyên silîkaya poroz bi rêbaza sol-jel bi hin guhertinan hatin amadekirin da ku perçeyên makroporoz werin bidestxistin. Ev perçe bi polîmerîzasyona veguhestina zincîra parçekirina lêzêdekirinê ya berevajîkirî (RAFT) bi N-fenîlmaleîmîd-metîlvînîlîsosîyanat (PMI) û stîrenê hatin derivatîzekirin da ku interkalasyona N-fenîlmaleîmîd a qonaxa sabît a polîstîren (PMP) were amadekirin. Stûnên pola yên zengarnegir ên teng-qulikî (100 × 1.8 mm id) bi pakkirina şilavê hatin pakkirin. Performansa kromatografiyê ya performansa kromatografiyê ya PMP ya tevliheviya peptîdê ya ji pênc peptîdan (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) û hilweşandina trîpsînê ya albumîna seruma mirovan (HAS) hat nirxandin. Di bin şert û mercên elûsyonê yên çêtirîn de, jimara teorîk a plakaya tevliheviya peptîdê bi qasî 280,000 plaka/m² ye. Berawirdkirina performansa veqetandinê ya stûna pêşkeftî bi Ascentis-a bazirganî re Di stûna Express RP-Amîdê de, hate dîtin ku performansa veqetandinê ya stûna PMP ji hêla karîgeriya veqetandinê û çareseriyê ve ji stûna bazirganî çêtir bû.
Di salên dawî de, pîşesaziya biyofarmasûtîk bi zêdebûnek berbiçav a para bazarê ve bûye bazarek gerdûnî ya berfireh. Bi mezinbûna teqîner a pîşesaziya biyofarmasûtîk1,2,3, analîza peptîd û proteînan pir tê xwestin. Ji bilî peptîda hedef, di dema senteza peptîdê de gelek qirêjî çêdibin, ji ber vê yekê ji bo bidestxistina peptîdên bi paqijiya xwestî paqijkirina kromatografîk hewce dike. Analîz û taybetmendiya proteînan di şilavên laş, tevn û hucreyan de karekî pir dijwar e ji ber hejmareke mezin a cureyên potansiyel ên tespîtkirinê di yek nimûneyê de. Her çend spektrometriya girseyî amûrek bi bandor e ji bo rêzkirina peptîd û proteînê, heke nimûneyên weha di yek derbasbûnê de di spektrometreya girseyî de werin derzîkirin, veqetandin dê ne îdeal be. Ev pirsgirêk dikare bi pêkanîna veqetandinên kromatografiya şile (LC) berî analîza MS were sivik kirin, ku dê hejmara analîtên ku di demek diyarkirî de dikevin spektrometreya girseyî kêm bike4,5,6. Wekî din, di dema veqetandina qonaxa şile de, analît dikarin li herêmên teng werin balkişandin, bi vî rengî van analîtan kom dikin û hesasiyeta tespîtkirina MS baştir dikin. Kromatografiya şile (LC) bi girîngî pêşketiye. di deh salên dawî de û di analîza proteomîk de bûye teknîkek populer7,8,9,10.
Kromatografiya şileya qonaxa berevajî (RP-LC) bi berfirehî ji bo paqijkirin û veqetandina tevliheviyên peptîdê bi karanîna silîkaya oktadesîlî ya guherandî (ODS) wekî qonaxa sabît tê bikar anîn11,12,13. Lêbelê, qonaxên sabît ên RP ji ber avahiya wan a tevlihev û xwezaya wan a amfîfîlîk veqetandina têrker a peptîd û proteînan peyda nakin14,15. Ji ber vê yekê, qonaxên sabît ên bi taybetî hatine sêwirandin hewce ne ku peptîd û proteînan bi beşên polar û ne-polar analîz bikin da ku bi van analîtan re têkilî daynin û biparêzin16. Kromatografiya moda tevlihev, ku têkiliyên pirmodal peyda dike, dikare ji bo veqetandina peptîd, proteîn û tevliheviyên din ên tevlihev alternatîfek ji bo RP-LC be. Çend qonaxên sabît ên moda tevlihev hatine amadekirin, û stûnên ku bi van qonaxan hatine dagirtin ji bo veqetandina peptîd û proteînan hatine bikar anîn17,18,19,20,21. Fazên sabît ên moda tevlihev (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, navberdana polar/RPLC) ji bo veqetandina peptîd û proteînan ji ber hebûna hem polar û hem jî ne-polar guncan in. kom22,23,24,25,26,27,28. Bi heman awayî, qonaxên stasyonar ên navberkirî yên polar bi komên polar ên bi girêdana kovalentî hêza veqetandinê ya baş û hilbijartina bêhempa ji bo analîtên polar û ne-polar nîşan didin, ji ber ku veqetandin bi têkiliya di navbera analît û qonaxa stasyonêr de ve girêdayî ye. Têkiliyên pirmodal 29, 30, 31, 32. Di demên dawî de, Zhang û hevkarên wî 30 qonaxek stasyonar a polîamîn a bi dodecyl-dawîkirî amade kirin û bi serkeftî hîdrokarbon, antîdepresan, flavonoîd, nukleozîd, estrogen û çend analîtên din ji hev veqetandin. Navberkera polar hem komên polar û hem jî yên ne-polar hene, ji ber vê yekê ew dikare were bikar anîn da ku peptîd û proteînên ku hem beşên hîdrofobîk û hem jî hîdrofîlîk hene ji hev veqetîne. Stûnên polar-çandî (mînak, stûnên C18 yên bi amîd-çandî) bi navê bazirganî stûnên Ascentis Express RP-Amîd bi bazirganî hene, lê ev stûn tenê ji bo analîza amîn 33 têne bikar anîn.
Di vê lêkolînê de, qonaxek stasyonar a polar-çandî (polîstîren a N-fenîlmaleîmîd-çandî) ji bo veqetandina peptîd û helandinên trîpsînê yên HSA hate amadekirin û nirxandin. Qonaxa stasyonar bi karanîna stratejiya jêrîn hate amadekirin. Perçeyên silîkaya poroz li gorî prosedûra ku di weşana me ya berê de hatî dayîn bi hin guhertinên li ser protokola amadekirinê hatin amadekirin. Rêjeya urea, polîetîlen glîkol (PEG), TMOS, asîda asetîk a avê hate sererast kirin da ku perçeyên silîkayê bi mezinahiya porên mezin werin amadekirin. Ya duyemîn, lîgandek nû, fenîlmaleîmîd-metîl vînîl îzosîyanat, hate sentez kirin û ji bo derivatîzekirina perçeyên silîkayê hate bikar anîn da ku qonaxek stasyonar a polar-çandî were amadekirin. Qonaxa stasyonar a encam bi karanîna nexşeya pakkirinê ya çêtirkirî di stûnek pola zengarnegir de (100 × 1.8 mm id) hate pak kirin. Pakkirina stûnê bi lerizîna mekanîkî tê alîkar kirin da ku piştrast bike ku di nav stûnê de nivînek homojen çêdibe. Veqetandina stûna pakkirî ya tevliheviyên peptîdê yên ji pênc peptîdan pêk tên binirxînin; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) û heriskirina trîpsînê ya albûmîna seruma mirovan (HAS). Têkeliya peptîd û heriskirina trîpsînê ya HSA bi çareserî û karîgeriyeke baş ji hev veqetiyan. Performansa veqetandinê ya stûna PMP bi ya stûna Ascentis Express RP-Amîdê re hate berhev kirin. Hem peptîd û hem jî proteîn li ser stûna PMP baş çareserî û karîger bûn, ku ji stûna Ascentis Express RP-Amîdê karîgertir bû.
PEG (Polîetîlen Glîkol), Urea, Asîda Asetîk, Trîmetoksî Ortosîlîkat (TMOS), Trîmetîl Klorosîlan (TMCS), Trîpsîn, Albûmîna Seruma Mirovan (HSA), Klorîda Amonyûmê, Urea, Heksan Metîldîsîlazan (HMDS), Klorîda Metakrîloîl (MC), Stîren, 4-Hîdroksî-TEMPO, Peroksîda Benzoîl (BPO), Asetonîtrîla Pola HPLC (ACN), Metanol, 2-Propanol, û Aseton Ji Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, DYA) hatine kirîn.
Têkelêk ji urea (8 g), polîetîlen glîkol (8 g), û 8 mL ji asîda asetîk a 0.01 N 10 deqîqeyan hate tevlihevkirin, û dû re 24 mL TMOS di bin şert û mercên sar-qeşayî de lê hate zêdekirin. Têkelê reaksiyonê di 40°C de 6 saetan û dû re di 120°C de 8 saetan di otoklaveke pola zengarnegir de hate germkirin. Av hate rijandin û madeya mayî di 70°C de 12 saetan hate hişkkirin. Girseya nerm a hişkkirî di firinekê de hate hûrkirin û 12 saetan di 550°C de hate kalsînkirin. Sê kom hatin amadekirin û taybetmendîkirin da ku dubarekirina mezinahiya perçeyan, mezinahiya kunan û rûbera wê were lêkolînkirin.
Bi guhertina rûyê perçeyên silîkayê bi lîgandê pêş-sentezkirî fenîlmaleîmîd-metîlvînîlîsosîyanat (PCMP) û dû re jî polîmerîzasyona radyal bi stîrenê, terkîbek ku koma polar dihewîne hate amadekirin. Qonaxa sabît ji bo agregat û zincîrên polîstîrenê. Pêvajoya amadekirinê li jêr tê vegotin.
N-fenîlmaleîmîd (200 mg) û metîl vînîl îzosîyanat (100 mg) di toluenê hişk de hatin çareserkirin, û 0.1 mL ji 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) li şûşeya reaksiyonê hat zêdekirin da ku kopolimera fenîlmaleîmîd-metîl vînîl îzosîyanat (PMCP) were amadekirin. Têkel 3 saetan di 60°C de hat germkirin, hat fîltrekirin û di firinekê de 3 saetan di 40°C de hat zuwakirin.
Perçeyên silîkaya hişkkirî (2 g) di toluenê hişk (100 mL) de hatin belavkirin, hatin tevdan û di firaxeke binî gilover a 500 mL de 10 deqîqeyan hatin sonîzekirin. PMCP (10 mg) di toluenê de hat çareserkirin û bi rêya hûnikeke daketinê bi dilop bi dilop li firaxeya reaksiyonê hat zêdekirin. Têkel 8 saetan di 100°C de hat germkirin, bi asetonê hat fîltrekirin û şuştin û 3 saetan di 60°C de hat zuwakirin. Piştre, perçeyên silîkaya bi PMCP ve girêdayî (100 g) di toluenê (200 ml) de hatin çareserkirin û 4-hîdroksî-TEMPO (2 mL) di hebûna 100 µL dîbutîltîn dîlaurat de wekî katalîzator hat zêdekirin. Têkel 8 saetan di 50°C de hat tevdan, 3 saetan di 50°C de hat fîltrekirin û zuwakirin.
Stîren (1 mL), benzoîl peroksît BPO (0.5 mL), û perçeyên silîka yên bi TEMPO-PMCP ve girêdayî (1.5 g) di toluenê de hatin belavkirin û bi nîtrojenê hatin paqijkirin. Polîmerîzasyona stîrenê di 100°C de ji bo 12 saetan hate kirin. Berhema encam bi metanolê hate şuştin û di 60°C de tevahiya şevê hate hişk kirin. Nexşeya reaksiyonê ya giştî di Wêne 1 de tê nîşandan.
Nimûne di 393 K de ji bo 1 saetê hatin paqijkirin da ku zexta mayî ji 10-3 Torr kêmtir be. Mîqdara N2 ya ku di zexta nisbî ya P/P0 = 0.99 de hatiye adsorbekirin ji bo destnîşankirina qebareya giştî ya poran hate bikar anîn. Morfolojiya perçeyên silîkaya tazî û yên bi lîgand ve girêdayî bi mîkroskopiya elektronê ya şopandinê (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japonya) hate lêkolîn kirin. Nimûneyên hişkkirî (silîkaya tazî û perçeyên silîkaya bi lîgand ve girêdayî) bi karanîna kaseta karbonê ya pêvekirî li ser stûnek aluminiumê hatin danîn. Bi karanîna pêçandina sputter a Q150T, zêr li ser nimûneyan hate danîn, û qatek Au ya 5 nm li ser nimûneyan hate danîn. Ev yek bi karanîna voltaja nizm karîgeriya pêvajoyê baştir dike û sputterkirina sar û genimê nazik peyda dike. Analîzkerek hêmanî ya Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 ji bo analîza hêmanî hate bikar anîn. Analîzkerek mezinahiya perçeyan a Malvern (Worcestershire, Keyaniya Yekbûyî) Mastersizer 2000 ji bo bidestxistina belavkirina mezinahiya perçeyan hate bikar anîn. Perçeyên silîkaya tazî û silîkaya bi lîgand ve girêdayî perçe (her yek 5 mg) di 5 mL îzopropanolê de hatin belavkirin, 10 deqîqe bi sonîkkirinê hatin kirin, 5 deqîqe bi vortexkirinê hatin tevlihevkirin û li ser kursiya optîkî ya Mastersizer hatin danîn. Analîza termogravimetrîkî bi rêjeya 5 °C di deqîqeyê de li ser rêjeya germahiyê ya 30 heta 800 °C hate kirin.
Stûnên pola zengarnegir ên bi qulika teng ên bi cam hatine pêçandin û pîvanên (100 × 1.8 mm id) bi rêbaza pakkirina şilavê hatin pakkirin, bi sepandina heman prosedurê ku di Ref. de hatî bikar anîn. 31. Stûnek ji pola zengarnegir (bi cam hatiye pêçandin, 100 × 1.8 mm id) bi pêvekek derketinê ku 1 µm frît tê de heye, bi pakkerek şilavê (Alltech Deerfield, IL, USA) ve hate girêdan. Şilavek qonaxa sabît bi 150 mg qonaxa sabît di 1.2 mL metanolê de were amadekirin û were şandin stûna hilanînê. Metanol wekî çareserkera şilavê û her weha wekî çareserkera pêşvebirinê hate bikar anîn. Stûnê bi rêzê bi sepandina zextên 100 MP ji bo 10 deqîqeyan, 80 MP ji bo 15 deqîqeyan, û 60 MP ji bo 30 deqîqeyan were tijî kirin. Di dema pakkirinê de, lerizîna mekanîkî bi du hejkerên stûna GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) hate sepandin da ku pakkirina yekreng a stûnê were misoger kirin. Pakkera şilavê bigirin û zextê hêdî hêdî berdin da ku pêşî li zirarê di nav stûnê de bigirin. Stûnê ji yekîneya pakkirina şilavê veqetînin û pêvekek din bi ketinê û bi pergala LC ve girêdin da ku performansa wê kontrol bikin.
Pompeyek LC (10AD Shimadzu, Japonya), enjeksiyoner (Valco (USA) C14 W.05) bi xeleka enjeksiyonê ya 50nL, degasera parzûnê (Shimadzu DGU-14A), pencereya kapîlar a UV-VIS hate çêkirin. Detektora cîhaza µLC ya taybet (UV-2075) û mîkrostûnên bi cam hatine pêçandin. Ji bo kêmkirina bandora firehbûna benda stûna zêde, lûleyên girêdanê yên pir teng û kurt bikar bînin. Piştî pakkirinê, kapîler (50 μm id 365 û kapîlerên yekîtiyê yên kêmker (50 μm) li dergeha 1/16″ ya yekîtîya kêmker hatin sazkirin. Berhevkirina daneyan û pêvajoya kromatografîk bi karanîna nermalava Multichro 2000 hate kirin. Çavdêrîkirin li 254 nm Analît ji bo vegirtina UV hatin ceribandin. Daneyên kromatografîk ji hêla OriginPro8 (Northampton, MA) ve hatin analîz kirin.
Albumîn ji seruma mirovî, toza lîyofîlîzekirî, ≥ 96% (elektroforeza jela agarozê) 3 mg bi trîpsîn (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), û 0.2 M bîkarbonata amonyûm (1 mL) re tevlihevkirî. Çareserî 10 deqîqeyan hate tevlihevkirin û 6 saetan di serşokek avê de li 37°C hate hiştin, paşê bi 1 mL ji 0.1% TFA hate vemirandin. Çareserî parzûn bikin û li jêr 4°C hilînin.
Veqetandina tevliheviyên peptîd û herisên trîpsînê yên HSA li ser stûnên PMP cuda cuda hatin nirxandin. Veqetandina tevliheviya peptîd û herisên trîpsînê yên HSA ji hêla stûna PMP ve kontrol bikin û encaman bi stûna Ascentis Express RP-Amîdê re bidin ber hev. Hejmara plakaya teorîk wiha tê hesibandin:
Wêneyên SEM ên perçeyên silîkaya tazî û perçeyên silîkaya bi girêdana lîgand ve di Şekil 2 de têne nîşandan. Wêneyên SEM ên perçeyên silîkaya tazî (A, B) nîşan didin ku, berevajî lêkolînên me yên berê, ev perçe gilover in ku tê de perçe dirêj dibin an jî sîmetrîya wan ne rêkûpêk e. Rûyê perçeyên silîkaya bi girêdana lîgand ve (C, D) ji ya perçeyên silîkaya tazî nermtir e, ku dibe ku ji ber pêçandina zincîrên polîstîrenê li ser rûyê perçeyên silîkayê be.
Wêneyên mîkroskopa elektronî ya skankirinê ya perçeyên silîka yên tazî (A, B) û perçeyên silîka yên bi lîgand ve girêdayî (C, D).
Belavkirinên mezinahiya perçeyên perçeyên silîkaya tazî û perçeyên silîkaya bi girêdana lîgand ve di Şekil 3(A) de têne nîşandan. Xêzên belavkirina mezinahiya perçeyên li ser bingeha qebareyê nîşan dan ku mezinahiya perçeyên silîkayê piştî guhertina kîmyewî zêde bûye (Şekil 3A). Daneyên belavkirina mezinahiya perçeyên perçeyên silîkayê ji lêkolîna heyî û lêkolîna berê di Tabloya 1(A) de têne berhev kirin. Mezinahiya perçeyên li ser bingeha qebareyê, d(0.5), ya PMP 3.36 μm e, li gorî lêkolîna me ya berê bi nirxa ad(0.5) ya 3.05 μm (perçeyên silîkaya bi polîstîrenê ve girêdayî)34. Ev kom li gorî lêkolîna me ya berê belavbûnek mezinahiya perçeyan a tengtir hebû ji ber rêjeyên cûda yên PEG, urea, TMOS, û asîda asetîk di tevliheviya reaksiyonê de. Mezinahiya perçeyên qonaxa PMP ji ya qonaxa perçeyên silîkaya bi polîstîrenê ve girêdayî ku me berê lêkolîn kiriye hinekî mezintir e. Ev tê vê wateyê ku fonksiyonalîzasyona rûyê perçeyên silîkayê bi stîrenê tenê qatek polîstîren (0.97 µm) li ser rûyê silîkayê danî, lê di qonaxa PMP de qalindahiya qatê 1.38 bû. µm.
Belavbûna mezinahiya perçeyan (A) û belavbûna mezinahiya poran (B) ya perçeyên silîkaya tazî û perçeyên silîkaya bi lîgand ve girêdayî.
Mezinahiya kunan, qebareya kunan û rûbera rûyê perçeyên silîka yên vê lêkolînê di Tabloya 1(B) de hatine dayîn. Profîlên PSD yên perçeyên silîka yên tazî û perçeyên silîka yên bi lîgand ve girêdayî di Şekil 3(B) de têne nîşandan. Encam bi lêkolîna me ya berê re berawirdî ne. Mezinahiya kunan a perçeyên silîka yên tazî û yên bi lîgand ve girêdayî bi rêzê ve 310 û 241 in, ku nîşan dide ku mezinahiya kunan piştî guhertina kîmyewî bi 69 kêm dibe, wekî ku di Tabloya 1(B) de tê nîşandan, û guhertina xêzê di Şekil 3(B) de tê nîşandan. Bi heman awayî, qebareya kunan a perçeyên silîka piştî guhertina kîmyewî ji 0.67 daket 0.58 cm3/g. Rûbera taybetî ya perçeyên silîka yên ku niha têne lêkolîn kirin 116 m2/g e, ku bi lêkolîna me ya berê (124 m2/g) re berawirdî ye. Wekî ku di Tabloya 1(B) de tê nîşandan, rûbera rûyê (m2/g) ya perçeyên silîka jî ji 116 m2/g daket 105 m2/g piştî... guhertina kîmyayî.
Encamên analîza hêmanî ya qonaxa sabît di Tabloya 2-an de têne nîşandan. Barkirina karbonê ya qonaxa sabît a niha %6.35 e, ku ji barkirina karbonê ya lêkolîna me ya berê kêmtir e (perçeyên silîkaya girêdayî polîstîrenê, bi rêzê ve %7.9335 û %10.21)42. Barkirina karbonê ya qonaxa sabît a niha kêm e, Ji ber ku di amadekirina SP-ya niha de, ji bilî stîrenê, hin lîgandên polar ên wekî fenîlmaleîmîd-metîlvînîlîsosîyanat (PCMP) û 4-hîdroksî-TEMPO hatine bikar anîn. Rêjeya giraniya nîtrojenê ya qonaxa sabît a niha %2.21 e, li gorî %0.1735 û %0.85 bi giraniya nîtrojenê di lêkolînên berê de. Ev tê vê wateyê ku % wt ya nîtrojenê di qonaxa sabît a niha de ji ber fenîlmaleîmîdê bilindtir e. Bi heman rengî, barkirina karbonê ya berhemên (4) û (5) bi rêzê ve %2.7 û %2.9 bû, dema ku barkirina karbonê ya berhema dawîn (6) %6.35 bû, wekî ku di Tabloya 2-an de tê nîşandan. Windakirina giraniyê bi qonaxa sabît a PMP-ê hate kontrol kirin, û xêza TGA di Şekil 4-an de tê nîşandan. Xêza TGA windakirina giraniyê ya %8.6 nîşan dide, ku bi barkirina karbonê (%6.35) re lihevhatî ye ji ber ku lîgand ne tenê C lê di heman demê de N, O, û H jî dihewînin.
Lîganda fenîlmaleîmîd-metîlvînîlîsosîyanat ji bo guherandina rûyê perçeyên silîka hat hilbijartin ji ber ku ew komên fenîlmaleîmîd ên polar û komên vînîlîzosîyanat hene. Komên vînîl îzosîyanat dikarin bi polîmerîzasyona radîkal a zindî bi stîrenê re reaksiyonê zêdetir bikin. Sedema duyemîn ew e ku komek were danîn ku têkiliyek nerm bi analît re heye û têkiliyek elektrostatîk a bihêz di navbera analît û qonaxa sabît de tune ye, ji ber ku beşa fenîlmaleîmîd di pH-ya normal de barek virtual tune. Polarîteya qonaxa sabît dikare bi mîqdara çêtirîn a stîrenê û dema reaksiyonê ya polîmerîzasyona radîkal a azad were kontrol kirin. Gava dawîn a reaksiyonê (polîmerîzasyona radîkal a azad) krîtîk e û dikare polarîteya qonaxa sabît biguhezîne. Analîza hêmanî hat kirin da ku barkirina karbonê ya van qonaxên sabît were kontrol kirin. Hat dîtin ku zêdekirina mîqdara stîrenê û dema reaksiyonê barkirina karbonê ya qonaxa sabît zêde dike û berevajî vê. SP-yên ku bi konsantrasyonên cûda yên stîrenê hatine amadekirin barkirinên karbonê yên cûda hene. Dîsa, van qonaxên sabît bar bikin nav stûnên pola yên zengarnegir û kromatografiya wan kontrol bikin. performans (bijarte, çareserî, nirxa N, hwd.). Li ser bingeha van ceribandinan, formulasyonek çêtirînkirî hate hilbijartin da ku qonaxa sabît a PMP amade bike da ku polarîteya kontrolkirî û ragirtina baş a analîtê were misoger kirin.
Pênc tevlihevên peptîdê (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) jî bi karanîna stûnek PMP bi karanîna qonaxa mobîl hatin nirxandin; 60/40 (v/v) asetonîtrîl/av (0.1% TFA) bi rêjeya herikîna 80 μL/min. Di bin şert û mercên elûsyonê yên çêtirîn de, hejmara plakaya teorîk (N) ji bo her stûnekê (100 × 1.8 mm id) 20,000 ± 100 (200,000 plaka/m²) ye. Tabloya 3 nirxên N ji bo sê stûnên PMP dide û kromatogram di Wêne 5A de têne nîşandan. Analîza bilez li ser stûnek PMP bi rêjeya herikîna bilind (700 μL/min), pênc peptîd di nav deqîqeyekê de hatin elûs kirin, nirxên N pir baş bûn, 13,500 ± 330 ji bo her stûnekê (100 × 1.8 mm id), Li gorî 135,000 plaka/m2 ye (Wêne 5B). Sê stûnên bi mezinahiya wekhev (100 × 1.8 mm id) bi sê lotên cûda yên qonaxa stasyonêr a PMP hatin pak kirin da ku dubarekirinê were kontrol kirin. Têkeliya analîtê ji bo her stûnê bi karanîna şert û mercên rijandina çêtirîn û jimara plakayên teorîk N û dema ragirtinê ji bo veqetandina heman tevliheviya ceribandinê li ser her stûnê hate tomar kirin. Daneyên dubarekirinê ji bo stûnên PMP di Tabloya 4-an de têne nîşandan. Dubarekirina stûna PMP bi nirxên pir kêm ên %RSD re baş têkildar e, wekî ku di Tabloya 3-an de tê nîşandan.
Veqetandina tevliheviya peptîdê li ser stûna PMP (B) û stûna Ascentis Express RP-Amîdê (A); qonaxa mobîl 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), pîvanên stûna PMP (100 × 1.8 mm id); analîtîk Rêza derxistina pêkhateyan: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) û 5 (leucine) asîd enkefalîn)).
Stûnek PMP (100 × 1.8 mm id) ji bo veqetandina dahûrên trîptîk ên albûmîna seruma mirovan di kromatografiya şilek a performansa bilind de hate nirxandin. Kromatografiya di Wêne 6 de nîşan dide ku nimûne baş hatiye veqetandin û çareserî pir baş e. Dahûrên HSA bi karanîna rêjeya herikîna 100 µL/min, qonaxa mobîl 70/30 asetonîtrîl/av û 0.1% TFA hatin analîzkirin. Wekî ku di kromatografiyê de (Wêne 6) tê xuyang kirin, dahûrîna HSA li 17 lûtkeyên ku bi 17 peptîdan re têkildar in hatiye dabeş kirin. Karîgeriya veqetandina her lûtkeyê di dahûrîna HSA de hate hesab kirin û nirx di Tabloya 5 de têne dayîn.
Heriskirineke trîptîk a HSA (100 × 1.8 mm id) li ser stûneke PMP hate veqetandin; rêjeya herikînê (100 µL/min), qonaxa mobîl 60/40 asetonîtrîl/av bi 0.1% TFA.
ku L dirêjahiya stûnê ye, η vîskozîteya qonaxa mobîl e, ΔP zexta paşveger a stûnê ye, û u leza xêzikî ya qonaxa mobîl e. Permeabilîteya stûna PMP 2.5 × 10-14 m2 bû, rêjeya herikînê 25 μL/min bû, û 60/40 v/v ACN/av hate bikar anîn. Permeabilîteya stûna PMP (100 × 1.8 mm id) dişibiya ya lêkolîna me ya berê Ref.34. Permeabilîteya stûna ku bi perçeyên rûberî poroz tije ye ev e: 1.7 × 10-15 ji bo perçeyên 1.3 μm, 3.1 × 10-15 ji bo perçeyên 1.7 μm, 5.2 × 10-15 û 2.5 × 10-14 m2 ji bo perçeyên 2.6 μm Ji bo perçeyên 5 μm 43. Ji ber vê yekê, permeabilîteya qonaxa PMP dişibihe ya perçeyên core-shell ên 5 μm.
ku Wx giraniya stûna bi kloroformê tije ye, Wy giraniya stûna bi metanolê tije ye, û ρ dendika çareserkerê ye. Dendika metanolê (ρ = 0.7866) û kloroformê (ρ = 1.484). Porozîteya giştî ya stûnên SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 û stûnên C18-Urea 31 ku me berê lêkolîn kiribûn, bi rêzê ve 0.63 û 0.55 bûn. Ev tê vê wateyê ku hebûna lîgandên urea permeabilîteya qonaxa sabît kêm dike. Ji hêla din ve, porozîteya giştî ya stûna PMP (100 × 1.8 mm id) 0.60 e. Permeabilîteya stûnên PMP ji ya stûnên bi perçeyên silîkayê yên bi C18 ve girêdayî tije kêmtir e ji ber ku di qonaxên sabît ên celebê C18 de lîgandên C18 wekî zincîrên xêzikî bi perçeyên silîkayê ve girêdayî ne, lê di qonaxên sabît ên celebê polîstîren de, qata polîmer a nisbeten stûr çêdibe. li dora wê. Di ceribandinek tîpîk de, porozîteya stûnê wiha tê hesibandin:
Wêne 7A,B stûna PMP (100 × 1.8 mm id) û stûna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) bi karanîna heman şert û mercên rijandinê (ango, 60/40 ACN/H2O û 0.1% TFA). ) yên nexşeya van Deemter nîşan dide. Têkelên peptîdên bijartî (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) di 20 µL de hatin amadekirin. Rêjeya herikîna herî kêm ji bo her du stûnan 800 µL/min e. Nirxên herî kêm ên HETP di rêjeya herikîna çêtirîn (80 µL/min) de ji bo stûna PMP û stûna Ascentis Express RP-Amide bi rêzê ve 2.6 µm û 3.9 µm bûn. Nirxên HETP nîşan didin ku karîgeriya veqetandina stûna PMP (100 × 1.8 mm id) ji stûna Ascentis Express RP-Amide ya bazirganî (100 × 1.8 mm id) pir çêtir e. Nexşeya van Deemter di Şekil 7(A) de nîşan dide ku kêmbûna nirxa N bi zêdebûna herikînê re li gorî lêkolîna me ya berê ne girîng e. Karîgeriya veqetandina bilindtir a stûna PMP (100 × 1.8 mm id) li gorî stûna Ascentis Express RP-Amide li ser bingeha başbûnên di şekil, mezinahî û prosedurên pakkirina stûnê yên tevlihev de ye ku di xebata heyî de têne bikar anîn34.
(A) nexşeya van Deemter (LEZA HETP li hember LEZA LINEAR a QONAXA MOBÎL) bi karanîna stûneke PMP (100 × 1.8 mm ID) di 60/40 ACN/H2O de bi 0.1% TFA hatiye bidestxistin. (B) nexşeya van Deemter (LEZA HETP li hember LEZA LINEAR a QONAXA MOBÎL) bi karanîna stûneke Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm ID) di 60/40 ACN/H2O de bi 0.1% TFA hatiye bidestxistin.
Qonaxeke stasyonar a polîstîren a polar-çekirî ji bo veqetandina tevliheviyên peptîdên sentetîk û helandina trîpsînê ya albûmîna seruma mirovan (HAS) di kromatografiya şile ya performansa bilind de hate amadekirin û nirxandin. Performansa kromatografîk a stûnên PMP ji bo tevliheviyên peptîd di karîgeriya veqetandinê û çareseriyê de pir baş e. Performansa veqetandina başkirî ya stûnên PMP ji ber gelek sedeman e, wekî mezinahiya perçeyan û mezinahiya porên perçeyên silîka, senteza kontrolkirî ya qonaxa stasyonar, û pakkirina stûna tevlihev. Ji bilî karîgeriya veqetandina bilind, zexta paşveger a stûna nizm di rêjeyên herikîna bilind de avantajek din a vê qonaxa stasyonar e. Stûnên PMP dubarebûnek baş nîşan didin û dikarin ji bo analîza tevliheviyên peptîd û helandina trîpsînê ya proteînên cûrbecûr werin bikar anîn. Em niyeta me heye ku vê stûnê ji bo veqetandina hilberên xwezayî, pêkhateyên biyoaktîf ji nebatan derman û ekstraktên fungî di kromatografiya şile de bikar bînin. Di pêşerojê de, stûnên PMP dê ji bo veqetandina proteîn û antîkorên monoklonal jî werin nirxandin.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Lêkolîna li ser Sîstemên Veqetandina Peptîdan bi Kromatografiya Qonaxa Berevajî Beşa I: Pêşxistina Protokola Taybetmendiya Stûnê. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. û yên din. Peptîdên çalak ên baştirkirî yên ji bo dermankirina nexweşiyên vegirtî hatine sêwirandin. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptîdên dermanî yên sentetîk: zanist û bazar. keşifkirina dermanan. 15 (1-2) îro, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografiya Şileya Proteomîk a Pêşketî. J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografiya şile ya pêşketî-spektrometriya girseyî dihêle ku metabolomîk û proteomîkên bi berfirehî hedefgirtî werin bikar anîn.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Rola UHPLC di pêşveçûna dermanan de. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Alîyên bingehîn û pratîkî yên kromatografiya şileya zexta ultrabilind ji bo veqetandinên bilez. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Bikaranîna kromatografiya şileya performansa ultra bilind di pêşvebirina dermanan de. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hîdrojelên makropor ên monolîtîk ên ji emulsiyonên qonaxa navxweyî ya bilind a rûn-di-avê de ji bo paqijkirina bi bandor a enterovîrusan hatine amadekirin. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Rola kromatografiya şile di proteomîkê de. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Trendên derketî di veqetandina kromatografiya şilek a qonaxa berevajî ya peptîd û proteînên dermankirinê de: teorî û serîlêdan. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Veqetandina peptîdan a du-alî bi karanîna pergala RP-RP-HPLC bi karanîna nirxên pH-ê yên cûda di pîvanên veqetandina yekem û duyem de. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. û yên din. Taybetmendiyên veguhastina girseyî û performansa kînetîk a stûnên kromatografiyê yên bi karîgeriya bilind ên ku bi perçeyên C18 sub-2 μm bi tevahî û bi porozên rûberî hatine pak kirin, hatin lêkolîn kirin. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. û yên din. Trendên dawî û zehmetiyên analîtîk di veqetandin, destnîşankirin û pejirandina peptîdên biyoaktîf ên nebatan de. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB û yên din. Peyzaja proteomîk a padîşahiya jiyanê. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Pêvajoya daketî ya peptîdên dermankirinê bi kromatografiya şileya amadekar. Molecule (Basel, Swîsre) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografiya moda tevlihev û sepandina wê li ser biyopolîmeran. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Lîgand ji bo kromatografiya proteîna moda tevlihev: prensîb, taybetmendîkirin û sêwirandin. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).