Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettstedet uten stiler og JavaScript.
Porøse silikapartikler ble fremstilt ved en sol-gel-metode med noen modifikasjoner for å oppnå makroporøse partikler. Disse partiklene ble derivatisert ved reversibel addisjonsfragmenteringskjedeoverføring (RAFT)-polymerisasjon med N-fenylmaleimid-metylvinylisocyanat (PMI) og styren for å fremstille N-fenylmaleimidinterkalering av polystyren (PMP) stasjonær fase. Smalborede kolonner i rustfritt stål (100 × 1,8 mm id) ble pakket ved oppslemmingspakking. Evaluering av PMP-kolonneseparasjon av en peptidblanding bestående av fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) kromatografisk ytelse) og trypsinfordøyelse av humant serumalbumin (HAS). Under optimale elueringsforhold er det teoretiske platetallet for peptidblandingen så høyt som 280 000 plater/m². Sammenligning av separasjonsytelsen til den utviklede kolonnen med den kommersielle Ascentis Express. RP-amidkolonnen, ble det observert at separasjonsytelsen til PMP-kolonnen var bedre enn den kommersielle kolonnen når det gjelder separasjonseffektivitet og oppløsning.
I de senere årene har den biofarmasøytiske industrien blitt et voksende globalt marked med en betydelig økning i markedsandeler. Med den eksplosive veksten i den biofarmasøytiske industrien1,2,3 er analyse av peptider og proteiner svært ettertraktet. I tillegg til målpeptidet genereres flere urenheter under peptidsyntese, noe som krever kromatografisk rensing for å oppnå peptider med ønsket renhet. Analyse og karakterisering av proteiner i kroppsvæsker, vev og celler er en ekstremt utfordrende oppgave på grunn av det store antallet potensielt detekterbare arter i en enkelt prøve. Selv om massespektrometri er et effektivt verktøy for peptid- og proteinsekvensering, vil separasjonen ikke være ideell hvis slike prøver injiseres i massespektrometeret i én omgang. Dette problemet kan reduseres ved å implementere væskekromatografi (LC)-separasjoner før MS-analyse, noe som vil redusere antallet analytter som kommer inn i massespektrometeret på et gitt tidspunkt4,5,6. I tillegg kan analytter under væskefaseseparasjon fokuseres i smale områder, og dermed konsentrere disse analyttene og forbedre MS-deteksjonsfølsomheten. Væskekromatografi (LC) har utviklet seg betydelig det siste tiåret og har blitt et populært teknikk i proteomisk analyse7,8,9,10.
Reversfasevæskekromatografi (RP-LC) er mye brukt for rensing og separasjon av peptidblandinger ved bruk av oktadecylmodifisert silika (ODS) som stasjonær fase11,12,13. Imidlertid gir ikke RP stasjonære faser tilfredsstillende separasjon av peptider og proteiner på grunn av deres komplekse struktur og amfifile natur14,15. Derfor kreves spesialdesignede stasjonære faser for å analysere peptider og proteiner med polare og ikke-polare deler for å samhandle med og beholde disse analyttene16. Blandet moduskromatografi, som gir multimodale interaksjoner, kan være et alternativ til RP-LC for separasjon av peptider, proteiner og andre komplekse blandinger. Flere blandede modus stasjonære faser har blitt fremstilt, og kolonner pakket med disse fasene har blitt brukt til peptid- og proteinseparasjoner17,18,19,20,21. Blandede modus stasjonære faser (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar interkalering/RPLC) er egnet for peptid- og proteinseparasjoner på grunn av tilstedeværelsen av både polare og ikke-polare grupper22,23,24,25,26,27,28. På samme måte viser polare interkalerende stasjonære faser med kovalent bundne polare grupper god separasjonskraft og unik selektivitet for polare og ikke-polare analytter, ettersom separasjonen avhenger av samspillet mellom analytt og stasjonær fase. Multimodale interaksjoner29, 30, 31, 32. Nylig fremstilte Zhang et al.30 en dodecyl-terminert polyamin stasjonær fase og separerte hydrokarboner, antidepressiva, flavonoider, nukleosider, østrogener og flere andre analytter. Den polare interkalatoren har både polare og ikke-polare grupper, slik at den kan brukes til å separere peptider og proteiner som har både hydrofobe og hydrofile deler. Polare innebygde kolonner (f.eks. amidinnebygde C18-kolonner) er kommersielt tilgjengelige under handelsnavnet Ascentis Express RP-Amide-kolonner, men disse kolonnene brukes kun til analyse av amin 33.
I den nåværende studien ble en polar-innebygd stasjonær fase (N-fenylmaleimid-innebygd polystyren) fremstilt og evaluert for separasjon av peptider og trypsin-fordøyelser av HSA. Den stasjonære fasen ble fremstilt ved hjelp av følgende strategi. Porøse silikapartikler ble fremstilt i henhold til prosedyren gitt i vår tidligere publikasjon med noen modifikasjoner i fremstillingsprotokollen. Forholdet mellom urea, polyetylenglykol (PEG), TMOS, vann og eddiksyre ble justert for å fremstille silikapartikler med stor porestørrelse. For det andre ble en ny ligand, fenylmaleimid-metylvinylisocyanat, syntetisert og brukt til å derivatisere silikapartikler for å fremstille en polar-innebygd stasjonær fase. Den resulterende stasjonære fasen ble pakket i en kolonne av rustfritt stål (100 × 1,8 mm id) ved hjelp av det optimaliserte pakkeskjemaet. Kolonnepakkingen assisteres med mekanisk vibrasjon for å sikre at et homogent sjikt dannes i kolonnen. Evaluer pakket kolonneseparasjon av peptidblandinger bestående av fem peptider; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkefalin) og trypsinfordøyelse av humant serumalbumin (HAS). Peptidblandingen og trypsinfordøyelsen av HSA ble observert å separere med god oppløsning og effektivitet. Separasjonsytelsen til PMP-kolonnen ble sammenlignet med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen. Både peptider og proteiner ble observert å være godt oppløst og effektive på PMP-kolonnen, som var mer effektiv enn Ascentis Express RP-Amide-kolonnen.
PEG (polyetylenglykol), urea, eddiksyre, trimetoksyortosilikat (TMOS), trimetylklorsilan (TMCS), trypsin, humant serumalbumin (HSA), ammoniumklorid, urea, heksanmetyldisilazan (HMDS), metakryloylklorid (MC), styren, 4-hydroksy-TEMPO, benzoylperoksid (BPO), HPLC-kvalitet acetonitril (ACN), metanol, 2-propanol og aceton. Kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
En blanding av urea (8 g), polyetylenglykol (8 g) og 8 ml 0,01 N eddiksyre ble omrørt i 10 minutter, og deretter ble 24 ml TMOS tilsatt under iskalde forhold. Reaksjonsblandingen ble varmet opp ved 40 °C i 6 timer og deretter ved 120 °C i 8 timer i en autoklav av rustfritt stål. Vannet ble helt av, og det gjenværende materialet ble tørket ved 70 °C i 12 timer. Den tørkede myke massen ble glattmalt i en ovn og kalsinert ved 550 °C i 12 timer. Tre batcher ble fremstilt og karakterisert for å undersøke reproduserbarhet i partikkelstørrelse, porestørrelse og overflateareal.
Ved overflatemodifisering av silikapartikler med den forhåndssyntetiserte liganden fenylmaleimid-metylvinylisocyanat (PCMP) etterfulgt av radial polymerisering med styren, ble en forbindelse som inneholder polare grupper fremstilt. Stasjonær fase for aggregater og polystyrenkjeder. Fremstillingsprosessen er beskrevet nedenfor.
N-fenylmaleimid (200 mg) og metylvinylisocyanat (100 mg) ble løst opp i tørr toluen, og 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) ble tilsatt reaksjonskolben for å fremstille fenylmaleimid-metylvinylisocyanat-kopolymer (PMCP). Blandingen ble varmet opp ved 60 °C i 3 timer, filtrert og tørket i en ovn ved 40 °C i 3 timer.
Tørkede silikapartikler (2 g) ble dispergert i tørr toluen (100 ml), omrørt og sonikert i en 500 ml rundbunnet kolbe i 10 minutter. PMCP (10 mg) ble løst opp i toluen og tilsatt dråpevis til reaksjonskolben via en dryppetrakt. Blandingen ble kokt under tilbakeløp ved 100 °C i 8 timer, filtrert og vasket med aceton og tørket ved 60 °C i 3 timer. Deretter ble PMCP-bundne silikapartikler (100 g) løst opp i toluen (200 ml), og 4-hydroksy-TEMPO (2 ml) ble tilsatt i nærvær av 100 µl dibutyltinn-dilaurat som katalysator. Blandingen ble omrørt ved 50 °C i 8 timer, filtrert og tørket ved 50 °C i 3 timer.
Styren (1 ml), benzoylperoksid BPO (0,5 ml) og TEMPO-PMCP-festede silikapartikler (1,5 g) ble dispergert i toluen og renset med nitrogen. Polymerisasjonen av styren ble utført ved 100 °C i 12 timer. Det resulterende produktet ble vasket med metanol og tørket ved 60 °C over natten. Det overordnede reaksjonsskjemaet er vist i figur 1.
Prøvene ble avgasset ved 393 K i 1 time for å oppnå et resttrykk på mindre enn 10⁻³ Torr. Mengden N2 adsorbert ved et relativt trykk på P/P0 = 0,99 ble brukt til å bestemme det totale porevolumet. Morfologien til bare og ligandbundne silikapartikler ble undersøkt med skanningselektronmikroskopi (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Tørkede prøver (bare silika og ligandbundne silikapartikler) ble plassert på en aluminiumsøyle ved hjelp av selvklebende karbontape. Gull ble belagt på prøvene ved hjelp av en Q150T sputterbelegger, og et 5 nm Au-lag ble avsatt på prøvene. Dette forbedrer prosesseffektiviteten ved bruk av lave spenninger og gir finkornet, kald sputtering. En Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elementanalysator ble brukt til elementanalyse. En Malvern (Worcestershire, Storbritannia) Mastersizer 2000 partikkelstørrelsesanalysator ble brukt til å oppnå partikkelstørrelsesfordelingen. Bare silikapartikler og ligandbundne silikapartikler (5 mg av hver) ble dispergert i 5 ml isopropanol, sonikert i 10 minutter, vortexbehandlet i 5 minutter og plassert på den optiske benken til Mastersizer. Termogravimetrisk analyse ble utført med en hastighet på 5 °C per minutt over et temperaturområde på 30 til 800 °C.
Glassforede smalborede kolonner av rustfritt stål med dimensjoner (100 × 1,8 mm innvendig diameter) ble pakket ved hjelp av oppslemmingsmetoden, med samme prosedyre som brukt i Ref. 31. En kolonne i rustfritt stål (glassforet, 100 × 1,8 mm i diameter) med en utløpskobling som inneholdt en 1 µm fritte ble koblet til en slampakker (Alltech Deerfield, IL, USA). Forbered en stasjonær faseslam ved å suspendere 150 mg stasjonær fase i 1,2 ml metanol og sende den til lagringskolonnen. Metanol ble brukt som slamløsningsmiddel samt drivløsningsmiddel. Fyll kolonnen sekvensielt ved å påføre trykk på 100 MP i 10 minutter, 80 MP i 15 minutter og 60 MP i 30 minutter. Under pakkingen ble det påført mekanisk vibrasjon med to GC-kolonneristere (Alltech, Deerfield, IL, USA) for å sikre jevn pakking av kolonnen. Lukk slampakkeren og slipp trykket sakte for å forhindre skade i kolonnen. Koble kolonnen fra slampakkingsenheten og koble en annen kobling til innløpet og til LC-systemet for å kontrollere ytelsen.
En LC-pumpe (10AD Shimadzu, Japan), injektor (Valco (USA) C14 W.05) med 50 nL injeksjonssløyfe, membranavgasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillærvindu ble konstruert. Spesiell µLC-detektor (UV-2075) og glassforede mikrokolonner ble konstruert. Bruk svært smale og korte forbindelsesslanger for å minimere effekten av ekstra kolonnebåndutvidelse. Etter pakking ble kapillærer (50 μm id 365) og reduserende unionskapillærer (50 μm) installert ved 1/16″ utløpet av den reduserende unionen. Datainnsamling og kromatografisk prosessering ble utført ved hjelp av Multichro 2000-programvare. Overvåking ved 254 nm. Analytter ble testet for UV-absorbans. Kromatografiske data ble analysert av OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin fra humant serum, frysetørket pulver, ≥ 96 % (agarosegelelektroforese) 3 mg blandet med trypsin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 ml) og 0,2 M ammoniumbikarbonat (1 ml). Løsningen ble omrørt i 10 minutter og holdt i et vannbad ved 37 °C i 6 timer, deretter bråkjølt med 1 ml 0,1 % TFA. Filtrer løsningen og oppbevar den under 4 °C.
Separasjon av peptidblandinger og HSA-trypsinfordøyelser ble evaluert separat på PMP-kolonner. Kontroller separasjonen av peptidblandingen og trypsinfordøyelsen av HSA med PMP-kolonnen og sammenlign resultatene med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen. Det teoretiske platetallet beregnes som følger:
SEM-bilder av bare silikapartikler og ligandbundne silikapartikler er vist i FIG. 2. SEM-bilder av bare silikapartikler (A, B) viser at disse partiklene, i motsetning til våre tidligere studier, er sfæriske, der partiklene er forlengede eller har uregelmessig symmetri. Overflaten til de ligandbundne silikapartiklerne (C, D) er glattere enn de bare silikapartiklerne, noe som kan skyldes belegget av polystyrenkjeder på overflaten av silikapartiklerne.
Skanningselektronmikroskopbilder av bare silikapartikler (A, B) og ligandbundne silikapartikler (C, D).
Partikkelstørrelsesfordelingen av bare silikapartikler og ligandbundne silikapartikler er vist i figur 3(A). Volumbaserte partikkelstørrelsesfordelingskurver viste at størrelsen på silikapartiklene økte etter kjemisk modifisering (figur 3A). Partikkelstørrelsesfordelingsdataene for silikapartiklene fra den nåværende studien og den forrige studien er sammenlignet i tabell 1(A). Den volumbaserte partikkelstørrelsen, d(0,5), for PMP er 3,36 μm, sammenlignet med vår tidligere studie med en ad(0,5)-verdi på 3,05 μm (polystyrenbundne silikapartikler)34. Denne batchen hadde en smalere partikkelstørrelsesfordeling sammenlignet med vår tidligere studie på grunn av de varierende forholdene mellom PEG, urea, TMOS og eddiksyre i reaksjonsblandingen. Partikkelstørrelsen til PMP-fasen er litt større enn for den polystyrenbundne silikapartikkelfasen vi tidligere studerte. Dette betyr at overflatefunksjonalisering av silikapartikler med styren bare avsatte et polystyrenlag (0,97 μm) på silikaoverflaten, mens lagtykkelsen i PMP-fasen var 1,38 µm.
Partikkelstørrelsesfordeling (A) og porestørrelsesfordeling (B) av bare silikapartikler og ligandbundne silikapartikler.
Porestørrelsen, porevolumet og overflatearealet til silikapartiklene i den nåværende studien er gitt i tabell 1(B). PSD-profilene til bare silikapartikler og ligandbundne silikapartikler er vist i figur 3(B). Resultatene er sammenlignbare med vår tidligere studie. Porestørrelsene til de bare og ligandbundne silikapartiklene er henholdsvis 310 og 241, noe som indikerer at porestørrelsen minker med 69 etter kjemisk modifisering, som vist i tabell 1(B), og endringen av kurven er vist i figur 3(B). Tilsvarende minket porevolumet til silikapartiklene fra 0,67 til 0,58 cm3/g etter kjemisk modifisering. Det spesifikke overflatearealet til de nåværende studerte silikapartiklene er 116 m2/g, noe som er sammenlignbart med vår tidligere studie (124 m2/g). Som vist i tabell 1(B), minket også overflatearealet (m2/g) til silikapartiklene fra 116 m2/g til 105 m2/g etter kjemisk modifisering. modifikasjon.
Resultatene av elementanalysen av den stasjonære fasen er vist i tabell 2. Karbonmengden i den nåværende stasjonære fasen er 6,35 %, som er lavere enn karbonmengden i vår tidligere studie (polystyrenbundne silikapartikler, henholdsvis 7,93 %35 og 10,21 %)42. Karbonmengden i den nåværende stasjonære fasen er lav, fordi det i fremstillingen av den nåværende SP, i tillegg til styren, ble brukt noen polare ligander som fenylmaleimid-metylvinylisocyanat (PCMP) og 4-hydroksy-TEMPO. Nitrogenvektprosenten i den nåværende stasjonære fasen er 2,21 %, sammenlignet med henholdsvis 0,1735 og 0,85 vektprosent nitrogen i tidligere studier. Dette betyr at vektprosenten nitrogen er høyere i den nåværende stasjonære fasen på grunn av fenylmaleimid. Tilsvarende var karbonmengdene i produktene (4) og (5) henholdsvis 2,7 % og 2,9 %, mens karbonmengden i sluttproduktet (6) var 6,35 %, som vist i tabell 2. Vekttapet ble kontrollert med PMP stasjonær fase, og TGA-kurven er vist i figur 4. TGA-kurven viser et vekttap på 8,6 %, noe som stemmer godt overens med karbonmengden (6,35 %) fordi ligandene ikke bare inneholder C, men også N, O og H.
Fenylmaleimid-metylvinylisocyanatliganden ble valgt for overflatemodifisering av silikapartikler fordi den har polare fenylmaleimidgrupper og vinylisocyanatgrupper. Vinylisocyanatgrupper kan reagere videre med styren ved levende radikalpolymerisasjon. Den andre grunnen er å sette inn en gruppe som har en moderat interaksjon med analytten og ingen sterk elektrostatisk interaksjon mellom analytten og den stasjonære fasen, siden fenylmaleimiddelen ikke har noen virtuell ladning ved normal pH. Polariteten til den stasjonære fasen kan kontrolleres av den optimale mengden styren og reaksjonstiden for fri radikalpolymerisasjon. Det siste trinnet i reaksjonen (fri radikalpolymerisasjon) er kritisk og kan endre polariteten til den stasjonære fasen. Elementanalyse ble utført for å kontrollere karbonbelastningen i disse stasjonære fasene. Det ble observert at økning av mengden styren og reaksjonstiden økte karbonbelastningen i den stasjonære fasen og omvendt. SP-er fremstilt med forskjellige konsentrasjoner av styren har forskjellige karbonbelastninger. Last igjen disse stasjonære fasene i kolonner av rustfritt stål og sjekk deres kromatografiske ytelse (selektivitet, oppløsning, N2). verdi, osv.). Basert på disse eksperimentene ble en optimalisert formulering valgt for å fremstille den stasjonære PMP-fasen for å sikre kontrollert polaritet og god analyttretensjon.
Fem peptidblandinger (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) ble også evaluert ved bruk av en PMP-kolonne med en mobil fase; 60/40 (v/v) acetonitril/vann (0,1 % TFA) ved en strømningshastighet på 80 μL/min. Under optimale elueringsforhold er det teoretiske platetallet (N) per kolonne (100 × 1,8 mm id) 20 000 ± 100 (200 000 plater/m²). Tabell 3 viser N-verdiene for de tre PMP-kolonnene, og kromatogrammene er vist i figur 5A. Rask analyse på en PMP-kolonne ved høy strømningshastighet (700 μL/min). Fem peptider ble eluert i løpet av ett minutt. N-verdiene var svært gode, 13 500 ± 330 per kolonne (100 × 1,8 mm id). Tilsvarer 135 000 plater/m² (figur 5B). Tre identisk store kolonner (100 × 1,8 mm id) ble pakket med tre forskjellige partier med PMP stasjonær fase for å kontrollere reproduserbarheten. Analyttkonsentrasjonen for hver kolonne ble registrert ved bruk av optimale elueringsbetingelser og antall teoretiske plater N og retensjonstid for å separere den samme testblandingen på hver kolonne. Reproduserbarhetsdataene for PMP-kolonnene er vist i tabell 4. Reproduserbarheten til PMP-kolonnen korrelerer godt med svært lave %RSD-verdier, som vist i tabell 3.
Separasjon av peptidblandingen på PMP-kolonne (B) og Ascentis Express RP-Amid-kolonne (A); mobil fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-kolonnedimensjoner (100 × 1,8 mm id); analytisk Elueringsrekkefølgen for forbindelsene: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) og 5 (leucin) syre enkefalin)).
En PMP-kolonne (100 × 1,8 mm id) ble evaluert for separasjon av tryptiske fordøyelser av humant serumalbumin i høytrykksvæskekromatografi. Kromatogrammet i figur 6 viser at prøven er godt separert og oppløsningen er svært god. HSA-fordøyelsene ble analysert ved bruk av en strømningshastighet på 100 µL/min, mobil fase 70/30 acetonitril/vann og 0,1 % TFA. Som vist i kromatogrammet (figur 6) er HSA-fordøyelsen delt inn i 17 topper som tilsvarer 17 peptider. Separasjonseffektiviteten til hver topp i HSA-fordøyelsen ble beregnet, og verdiene er gitt i tabell 5.
En tryptisk digest av HSA (100 × 1,8 mm id) ble separert på en PMP-kolonne; strømningshastighet (100 µL/min), mobil fase 60/40 acetonitril/vann med 0,1 % TFA.
hvor L er kolonnelengden, η er viskositeten til den mobile fasen, ΔP er kolonnens mottrykk, og u er den lineære hastigheten til den mobile fasen. Permeabiliteten til PMP-kolonnen var 2,5 × 10⁻⁴ m², strømningshastigheten var 25 μL/min, og 60/40 v/v ACN/vann ble brukt. Permeabiliteten til PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) var lik den i vår tidligere studie Ref. 34. Permeabiliteten til kolonnen pakket med overfladisk porøse partikler er: 1,7 × 10⁻⁴ for 1,3 μm partikler, 3,1 × 10⁻⁴ for 1,7 μm partikler, 5,2 × 10⁻⁴ og 2,5 × 10⁻⁴ m² for 2,6 μm partikler. For 5 μm partikler 43. Derfor er permeabiliteten til PMP-fasen lik den for 5 μm kjerne-skallpartikler.
hvor Wx er vekten av kolonnen pakket med kloroform, Wy er vekten av kolonnen pakket med metanol, og ρ er tettheten til løsningsmidlet. Tetthetene av metanol (ρ = 0,7866) og kloroform (ρ = 1,484). Den totale porøsiteten til SILICA PARTICLES-C18-kolonnene (100 × 1,8 mm id) 34 og C18-Urea-kolonnene 31 som vi tidligere studerte var henholdsvis 0,63 og 0,55. Dette betyr at tilstedeværelsen av urea-ligander reduserer permeabiliteten til den stasjonære fasen. På den annen side er den totale porøsiteten til PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) 0,60. Permeabiliteten til PMP-kolonner er lavere enn for kolonner pakket med C18-bundne silikapartikler fordi C18-ligandene i stasjonære faser av C18-typen er festet til silikapartiklerne som lineære kjeder, mens det i stasjonære faser av polystyrentypen er et relativt tykt polymerlag. dannes rundt den. I et typisk eksperiment beregnes kolonneporøsiteten som:
Figur 7A og B viser PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm indre diameter) og Ascentis Express RP-Amid-kolonnen (100 × 1,8 mm indre diameter) ved bruk av de samme elueringsbetingelsene (dvs. 60/40 ACN/H2O og 0,1 % TFA) som i van Deemter-plottet. Utvalgte peptidblandinger (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkefalin) ble fremstilt i 20 µL/. Minimumsstrømningshastigheten for begge kolonnene er 800 µL/min. Minimums HETP-verdiene ved optimal strømningshastighet (80 µL/min) for PMP-kolonnen og Ascentis Express RP-Amide-kolonnen var henholdsvis 2,6 µm og 3,9 µm. HETP-verdiene indikerer at separasjonseffektiviteten til PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) er mye bedre enn den kommersielt tilgjengelige Ascentis Express RP-Amide-kolonnen (100 × 1,8 mm id). Van Deemter-plottet i figur 7(A) viser at reduksjonen i N-verdi med økende strømning ikke er signifikant sammenlignet med vår tidligere studie. Den høyere separasjonseffektiviteten til PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) sammenlignet med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen er basert på forbedringer i partikkelform, størrelse og komplekse kolonnepakkingsprosedyrer som brukes i det nåværende arbeidet34.
(A) van Deemter-plott (HETP versus lineær hastighet i mobil fase) oppnådd ved bruk av en PMP-kolonne (100 × 1,8 mm id) i 60/40 ACN/H2O med 0,1 % TFA. (B) van Deemter-plott (HETP versus lineær hastighet i mobil fase) oppnådd ved bruk av en Ascentis Express RP-Amide-kolonne (100 × 1,8 mm id) i 60/40 ACN/H2O med 0,1 % TFA.
En polarinnstøpt stasjonær fase av polystyren ble fremstilt og evaluert for separasjon av syntetiske peptidblandinger og trypsinfordøyelser av humant serumalbumin (HAS) i høytrykksvæskekromatografi. Den kromatografiske ytelsen til PMP-kolonner for peptidblandinger er utmerket når det gjelder separasjonseffektivitet og oppløsning. Den forbedrede separasjonsytelsen til PMP-kolonner skyldes en rekke årsaker, som partikkelstørrelse og porestørrelse til silikapartiklene, kontrollert syntese av den stasjonære fasen og kompleks kolonnepakking. I tillegg til høy separasjonseffektivitet er lavt kolonnemottrykk ved høye strømningshastigheter en annen fordel med denne stasjonære fasen. PMP-kolonner viser god reproduserbarhet og kan brukes til analyse av peptidblandinger og trypsinfordøyelse av forskjellige proteiner. Vi har til hensikt å bruke denne kolonnen til separasjon av naturprodukter, bioaktive forbindelser fra medisinplanter og soppekstrakter i væskekromatografi. I fremtiden vil PMP-kolonner også bli evaluert for separasjon av proteiner og monoklonale antistoffer.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Forskning på peptidseparasjonssystemer ved omvendt fasekromatografi del I: Utvikling av en kolonnekarakteriseringsprotokoll. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Forbedrede aktive peptider utviklet for behandling av infeksjonssykdommer. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. og Khrestchatisky, M. Syntetiske terapeutiske peptider: vitenskap og markedet. Legemiddeloppdagelse. 15 (1-2) i dag, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD og Shen, Y. Avansert proteomisk væskekromatografi. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Avansert væskekromatografi-massespektrometri muliggjør inkorporering av bredt målrettede metabolomikk og proteomikk. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM og Salisbury, JJ. UHPLCs rolle i legemiddelutvikling. J. Sep. Sci. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grunnleggende og praktiske aspekter ved ultrahøytrykksvæskekromatografi for raske separasjoner. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA og Tchelitcheff, P. Anvendelse av ultrahøytrykksvæskekromatografi i legemiddelutvikling. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolittiske makroporøse hydrogeler fremstilt fra olje-i-vann-emulsjoner med høy intern fase for effektiv rensing av enterovirus. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA. Væskekromatografiens rolle i proteomikk. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. og Guillarme, D. Fremvoksende trender innen reversfasevæskekromatografiseparasjoner av terapeutiske peptider og proteiner: teori og anvendelser. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE og Gebler, JC Todimensjonal separasjon av peptider ved bruk av et RP-RP-HPLC-system med forskjellige pH-verdier i den første og andre separasjonsdimensjonen. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Masseoverføringsegenskapene og den kinetiske ytelsen til høyeffektive kromatografiske kolonner pakket med C18 sub-2 μm fullstendig og overfladisk porøse partikler ble undersøkt. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nylige trender og analytiske utfordringer innen isolering, identifisering og validering av plantebaserte bioaktive peptider. anus. biological anus. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Det proteomiske landskapet i livets rike. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Nedstrømsprosessering av terapeutiske peptider ved preparativ væskekromatografi. Molecule (Basel, Sveits) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Blandet moduskromatografi og dens anvendelse på biopolymerer. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. og Sun, Y. Ligander for blandet proteinkromatografi: prinsipp, karakterisering og design. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).