Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiks attēlota bez stiliem un JavaScript.
Poraini silīcija dioksīda daļiņas tika sagatavotas ar sol-gēla metodi ar dažām modifikācijām, lai iegūtu makroporainas daļiņas. Šīs daļiņas tika atvasinātas ar atgriezeniskas pievienošanas fragmentācijas ķēdes pārneses (RAFT) polimerizāciju ar N-fenilmaleimīda-metilvinilizocianātu (PMI) un stirolu, lai sagatavotu polistirola (PMP) stacionārās fāzes N-fenilmaleimīda interkalāciju. Šaurcauruma nerūsējošā tērauda kolonnas (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) tika pildītas ar suspensijas pildījumu. Novērtēta peptīdu maisījuma, kas sastāv no pieciem peptīdiem (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leicīna enkefalīns), atdalīšana PMP kolonnā (hromatogrāfiskā veiktspēja) un cilvēka seruma albumīna (HAS) šķelšana ar tripsīnu. Optimālos eluēšanas apstākļos peptīdu maisījuma teorētiskais plākšņu skaits ir pat 280 000 plāksnītes/m². Salīdzinot izstrādātās kolonnas atdalīšanas veiktspēju ar komerciālo Ascentis Express RP-Amide kolonnu, tika iegūts... novēroja, ka PMP kolonnas atdalīšanas veiktspēja bija pārāka par komerciālo kolonnu atdalīšanas efektivitātes un izšķirtspējas ziņā.
Pēdējos gados biofarmaceitiskā nozare ir kļuvusi par augošu globālu tirgu ar ievērojamu tirgus daļas pieaugumu. Līdz ar biofarmaceitiskās nozares straujo izaugsmi1,2,3 ļoti pieprasīta ir peptīdu un olbaltumvielu analīze. Papildus mērķa peptīdam peptīdu sintēzes laikā rodas vairāki piemaisījumi, tāpēc ir nepieciešama hromatogrāfiska attīrīšana, lai iegūtu vēlamās tīrības peptīdus. Olbaltumvielu analīze un raksturošana ķermeņa šķidrumos, audos un šūnās ir ārkārtīgi sarežģīts uzdevums, jo vienā paraugā ir liels skaits potenciāli nosakāmu sugu. Lai gan masas spektrometrija ir efektīvs instruments peptīdu un olbaltumvielu sekvencēšanai, ja šādi paraugi tiek ievadīti masas spektrometrā vienā piegājienā, atdalīšana nebūs ideāla. Šo problēmu var mazināt, pirms MS analīzes ieviešot šķidruma hromatogrāfijas (LC) atdalīšanu, kas samazinās analītu skaitu, kas nonāk masas spektrometrā noteiktā laikā4,5,6. Turklāt šķidrās fāzes atdalīšanas laikā analītus var koncentrēt šauros reģionos, tādējādi koncentrējot šos analītus un uzlabojot MS noteikšanas jutību. Šķidruma hromatogrāfija (LC) pēdējās desmitgades laikā ir ievērojami attīstījusies un ir kļuvusi par populāru metodi proteomikā. analīze7,8,9,10.
Apgrieztās fāzes šķidruma hromatogrāfija (RP-LC) tiek plaši izmantota peptīdu maisījumu attīrīšanai un atdalīšanai, izmantojot oktadecilmodificētu silīcija dioksīdu (ODS) kā stacionāro fāzi11,12,13. Tomēr RP stacionārās fāzes nenodrošina apmierinošu peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanu to sarežģītās struktūras un amfifilā rakstura dēļ14,15. Tāpēc ir nepieciešamas speciāli izstrādātas stacionārās fāzes, lai analizētu peptīdus un olbaltumvielas ar polāriem un nepolāriem fragmentiem, kas mijiedarbojas ar šiem analītiem un saglabā tos16. Jaukta režīma hromatogrāfija, kas nodrošina multimodālu mijiedarbību, var būt alternatīva RP-LC peptīdu, olbaltumvielu un citu sarežģītu maisījumu atdalīšanai. Ir sagatavotas vairākas jaukta režīma stacionārās fāzes, un peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanai ir izmantotas kolonnas, kas pildītas ar šīm fāzēm17,18,19,20,21. Jaukta režīma stacionārās fāzes (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polārā interkalācija/RPLC) ir piemērotas peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanai gan polāro, gan nepolāro daļiņu klātbūtnes dēļ. grupas22,23,24,25,26,27,28. Līdzīgi, polārās interkalējošās stacionārās fāzes ar kovalenti saistītām polārām grupām uzrāda labu atdalīšanas spēju un unikālu selektivitāti polāriem un nepolāriem analītiem, jo ​​atdalīšana ir atkarīga no analīta un stacionārās fāzes mijiedarbības. Multimodālas mijiedarbības 29, 30, 31, 32. Nesen Zhang et al. 30 sagatavoja dodecilgrupu terminētu poliamīna stacionāro fāzi un veiksmīgi atdalīja ogļūdeņražus, antidepresantus, flavonoīdus, nukleozīdus, estrogēnus un vairākus citus analītus. Polārajam interkalatoram ir gan polāras, gan nepolāras grupas, tāpēc to var izmantot, lai atdalītu peptīdus un olbaltumvielas, kurām ir gan hidrofobas, gan hidrofilas daļas. Polāri iegultās kolonnas (piemēram, amīdā iegultās C18 kolonnas) ir komerciāli pieejamas ar tirdzniecības nosaukumu Ascentis Express RP-Amide kolonnas, taču šīs kolonnas tiek izmantotas tikai amīna 33 analīzei.
Pašreizējā pētījumā tika sagatavota un novērtēta polāri iegulta stacionārā fāze (N-fenilmaleimīdā iegults polistirols) peptīdu un HSA tripsīna digestu atdalīšanai. Stacionārā fāze tika sagatavota, izmantojot šādu stratēģiju. Porainas silīcija dioksīda daļiņas tika sagatavotas saskaņā ar mūsu iepriekšējā publikācijā aprakstīto procedūru ar dažām modifikācijām sagatavošanas protokolā. Urīnvielas, polietilēnglikola (PEG), TMOS, ūdens etiķskābes attiecība tika pielāgota, lai sagatavotu silīcija dioksīda daļiņas ar lielu poru izmēru. Otrkārt, tika sintezēts jauns ligands, fenilmaleimīda-metilvinilizocianāts, un izmantots silīcija dioksīda daļiņu derivatizēšanai, lai sagatavotu polāri iegultu stacionāro fāzi. Iegūtā stacionārā fāze tika iepakota nerūsējošā tērauda kolonnā (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs), izmantojot optimizētu iepakošanas shēmu. Kolonnas iepakošanu veicina mehāniskā vibrācija, lai nodrošinātu homogēna slāņa veidošanos kolonnā. Novērtējiet piecu peptīdu peptīdu maisījumu iepakotās kolonnas atdalīšanu; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leicīna enkefalīns) un ar tripsīnu sagremots cilvēka seruma albumīns (HAS). Tika novērots, ka peptīdu maisījums un ar tripsīnu sagremotais HSA atdalās ar labu izšķirtspēju un efektivitāti. PMP kolonnas atdalīšanas veiktspēja tika salīdzināta ar Ascentis Express RP-Amide kolonnas atdalīšanas veiktspēju. Gan peptīdi, gan proteīni PMP kolonnā, kas bija efektīvāka nekā Ascentis Express RP-Amide kolonna, bija labi izšķirti un efektīvi.
PEG (polietilēnglikols), urīnviela, etiķskābe, trimetoksiortosilikāts (TMOS), trimetilhlorosilāns (TMCS), tripsīns, cilvēka seruma albumīns (HSA), amonija hlorīds, urīnviela, heksāna metildisilazāns (HMDS), metakriloilhlorīds (MC), stirols, 4-hidroksi-TEMPO, benzoilperoksīds (BPO), HPLC kvalitātes acetonitrils (ACN), metanols, 2-propanols un acetons. Iegādāts no Sigma-Aldrich (Sentluisa, Misūri, ASV).
Urīnvielas (8 g), polietilēnglikola (8 g) un 8 ml 0,01 N etiķskābes maisījumu maisīja 10 minūtes, un pēc tam ledusaukstā vidē pievienoja 24 ml TMOS. Reakcijas maisījumu karsēja 40 °C temperatūrā 6 stundas un pēc tam 120 °C temperatūrā 8 stundas nerūsējošā tērauda autoklāvā. Ūdens tika nolēts, un atlikušo materiālu žāvēja 70 °C temperatūrā 12 stundas. Žāvēto mīksto masu gludi samala krāsnī un kalcinēja 550 °C temperatūrā 12 stundas. Tika sagatavotas un raksturotas trīs partijas, lai pārbaudītu daļiņu izmēra, poru izmēra un virsmas laukuma atkārtojamību.
Modificējot silīcija dioksīda daļiņu virsmu ar iepriekš sintezētu ligandu fenilmaleimīda-metilvinilizocianātu (PCMP) un pēc tam veicot radiālu polimerizāciju ar stirolu, tika sagatavots polāro grupu saturošs savienojums. Stacionārā fāze agregātiem un polistirola ķēdēm. Sagatavošanas process ir aprakstīts turpmāk.
N-fenilmaleimīds (200 mg) un metilvinilizocianāts (100 mg) tika izšķīdināti sausā toluolā, un reakcijas kolbā tika pievienots 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitrila (AIBN), lai pagatavotu fenilmaleimīda-metilvinilizocianāta kopolimēru (PMCP). Maisījumu 3 stundas karsēja 60 °C temperatūrā, filtrēja un žāvēja cepeškrāsnī 40 °C temperatūrā 3 stundas.
Žāvētas silīcija dioksīda daļiņas (2 g) tika disperģētas sausā toluolā (100 ml), maisītas un apstrādātas ar ultraskaņu 500 ml apaļkolbā 10 minūtes. PMCP (10 mg) tika izšķīdināts toluolā un pilināmā piltuvē pievienots reakcijas kolbai. Maisījumu 8 stundas vārīja ar atplūdi 100 °C temperatūrā, filtrēja, mazgāja ar acetonu un žāvēja 60 °C temperatūrā 3 stundas. Pēc tam ar PMCP saistītas silīcija dioksīda daļiņas (100 g) tika izšķīdinātas toluolā (200 ml) un pievienots 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) 100 µl dibutilalvas dilaurāta klātbūtnē kā katalizators. Maisījumu 8 stundas maisīja 50 °C temperatūrā, filtrēja un žāvēja 50 °C temperatūrā 3 stundas.
Stirolu (1 ml), benzoilperoksīdu BPO (0,5 ml) un ar TEMPO-PMCP piesaistītas silīcija dioksīda daļiņas (1,5 g) disperģēja toluolā un attīrīja ar slāpekli. Stirola polimerizāciju veica 100 °C temperatūrā 12 stundas. Iegūto produktu mazgāja ar metanolu un žāvēja 60 °C temperatūrā nakti. Kopējā reakcijas shēma parādīta 1. attēlā.
Paraugi tika degazēti 393 K temperatūrā 1 stundu, lai iegūtu atlikušo spiedienu, kas mazāks par 10⁻³ Torr. Kopējā poru tilpuma noteikšanai tika izmantots N2 daudzums, kas adsorbēts pie relatīvā spiediena P/P0 = 0,99. Kailo un ar ligandu saistīto silīcija dioksīda daļiņu morfoloģija tika pārbaudīta ar skenējošo elektronu mikroskopiju (Hitachi High Technologies, Tokija, Japāna). Žāvēti paraugi (kailais silīcija dioksīds un ar ligandu saistītās silīcija dioksīda daļiņas) tika novietoti uz alumīnija kolonnas, izmantojot līmlenti. Zelts tika uzklāts uz paraugiem, izmantojot Q150T izsmidzināšanas pārklāšanas ierīci, un uz paraugiem tika uzklāts 5 nm Au slānis. Tas uzlabo procesa efektivitāti, izmantojot zemu spriegumu, un nodrošina smalkgraudainu, aukstu izsmidzināšanu. Elementu analīzei tika izmantots Thermo Electron (Waltham, MA, ASV) Flash EA1112 elementu analizators. Daļiņu izmēra sadalījuma iegūšanai tika izmantots Malvern (Worcestershire, Apvienotā Karaliste) Mastersizer 2000 daļiņu izmēra analizators. Kailas silīcija dioksīda daļiņas un ar ligandu saistītās silīcija dioksīda daļiņas. (5 mg katrs) tika disperģēti 5 ml izopropanolā, apstrādāti ar ultraskaņu 10 minūtes, vorteksēti 5 minūtes un novietoti uz Mastersizer optiskā galda. Termogravimetriskā analīze tika veikta ar ātrumu 5 °C minūtē temperatūras diapazonā no 30 līdz 800 °C.
Ar stiklu izklātas nerūsējošā tērauda šaurcauruma kolonnas ar izmēriem (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) tika pildītas, izmantojot suspensijas pildīšanas metodi, piemērojot to pašu procedūru, kas izmantota atsaucē. 31. Nerūsējošā tērauda kolonna (ar stikla pārklājumu, 100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) ar izejas savienojumu, kurā bija 1 µm frites, tika pievienota suspensijas iepakotāja (Alltech Deerfield, IL, ASV) ierīcei. Sagatavojiet stacionārās fāzes suspensiju, suspendējot 150 mg stacionārās fāzes 1,2 ml metanola, un nosūtiet to uz uzglabāšanas kolonnu. Metanols tika izmantots kā suspensijas šķīdinātājs, kā arī kā virzošais šķīdinātājs. Kolonnu secīgi piepildiet, pielietojot spiedienu 100 MP 10 minūtes, 80 MP 15 minūtes un 60 MP 30 minūtes. Pildīšanas laikā ar diviem GC kolonnas kratītājiem (Alltech, Deerfield, IL, ASV) tika pielietota mehāniskā vibrācija, lai nodrošinātu kolonnas vienmērīgu pildīšanu. Aizveriet suspensijas iepakotāju un lēnām atbrīvojiet spiedienu, lai novērstu bojājumus kolonnā. Atvienojiet kolonnu no suspensijas iepakošanas ierīces un pievienojiet citu savienojumu ieplūdei un LC sistēmai, lai pārbaudītu tās darbību.
Tika konstruēts LC sūknis (10AD Shimadzu, Japāna), injektors (Valco (ASV) C14 W.05) ar 50 nL injekcijas cilpu, membrānas degazētājs (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilārais logs, speciāls µLC ierīces detektors (UV-2075) un ar stiklu izklātas mikrokolonnas. Izmantotas ļoti šauras un īsas savienojošās caurules, lai samazinātu kolonnas joslas papildu paplašināšanās efektu. Pēc iepakošanas kapilāri (50 μm, iekšējais diametrs 365) un reducējošā savienojuma kapilāri (50 μm) tika uzstādīti reducējošā savienojuma 1/16″ izejā. Datu vākšana un hromatogrāfiskā apstrāde tika veikta, izmantojot Multichro 2000 programmatūru. Monitorings pie 254 nm. Analītiem tika pārbaudīta UV absorbcija. Hromatogrāfiskie dati tika analizēti ar OriginPro8 (Northampton, MA).
Cilvēka seruma albumīns, liofilizēts pulveris, ≥ 96% (agarozes gela elektroforēze) 3 mg sajaukts ar tripsīnu (1,5 mg), 4,0 M urīnvielu (1 ml) un 0,2 M amonija bikarbonātu (1 ml). Šķīdumu maisīja 10 minūtes un turēja ūdens vannā 37°C temperatūrā 6 stundas, pēc tam pievienoja 1 ml 0,1% TFA. Šķīdumu filtrēja un uzglabāja temperatūrā zem 4°C.
Peptīdu maisījumu un HSA tripsīna digestu atdalīšana tika novērtēta atsevišķi PMP kolonnās. Pārbaudiet peptīdu maisījuma un HSA tripsīna digesta atdalīšanu ar PMP kolonnu un salīdziniet rezultātus ar Ascentis Express RP-Amide kolonnu. Teorētisko plākšņu skaitu aprēķina šādi:
2. attēlā parādīti kailu silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu SEM attēli. Kailu silīcija dioksīda daļiņu (A, B) SEM attēli rāda, ka atšķirībā no mūsu iepriekšējiem pētījumiem šīs daļiņas ir sfēriskas, iegarenas vai tām ir neregulāra simetrija. Ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu (C, D) virsma ir gludāka nekā kailu silīcija dioksīda daļiņu virsma, kas var būt saistīts ar polistirola ķēžu pārklājumu uz silīcija dioksīda daļiņu virsmas.
Skenējošā elektronmikroskopa attēli ar tīrām silīcija dioksīda daļiņām (A, B) un ar ligandu saistītām silīcija dioksīda daļiņām (C, D).
Kailu silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu daļiņu izmēru sadalījums ir parādīts 3. attēlā (A). Tilpuma daļiņu izmēru sadalījuma līknes parādīja, ka silīcija dioksīda daļiņu izmērs palielinājās pēc ķīmiskās modifikācijas (3. att. A). Pašreizējā pētījuma un iepriekšējā pētījuma silīcija dioksīda daļiņu izmēru sadalījuma dati ir salīdzināti 1. tabulā (A). PMP daļiņu izmērs d(0,5), kas balstīts uz tilpumu, ir 3,36 μm, salīdzinot ar mūsu iepriekšējo pētījumu ar ad(0,5) vērtību 3,05 μm (ar polistirolu saistītas silīcija dioksīda daļiņas)34. Šai partijai bija šaurāks daļiņu izmēru sadalījums salīdzinājumā ar mūsu iepriekšējo pētījumu, jo reakcijas maisījumā mainījās PEG, urīnvielas, TMOS un etiķskābes attiecības. PMP fāzes daļiņu izmērs ir nedaudz lielāks nekā iepriekš pētītās ar polistirolu saistītās silīcija dioksīda daļiņu fāzes daļiņu izmērs. Tas nozīmē, ka silīcija dioksīda daļiņu virsmas funkcionalizācija ar stirolu uz silīcija dioksīda virsmas nogulsnēja tikai polistirola slāni (0,97 µm), savukārt PMP fāzē slāņa biezums bija 1,38 µm.
Kailu silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistītu silīcija dioksīda daļiņu daļiņu izmēru sadalījums (A) un poru izmēru sadalījums (B).
Pašreizējā pētījuma silīcija dioksīda daļiņu poru izmērs, poru tilpums un virsmas laukums ir norādīts 1. tabulā (B). Kailo silīcija dioksīda daļiņu un ar ligandu saistīto silīcija dioksīda daļiņu PSD profili ir parādīti 3. attēlā (B). Rezultāti ir salīdzināmi ar mūsu iepriekšējo pētījumu. Kailo un ar ligandu saistīto silīcija dioksīda daļiņu poru izmēri ir attiecīgi 310 un 241, kas norāda, ka poru izmērs pēc ķīmiskās modifikācijas samazinās par 69 cm, kā parādīts 1. tabulā (B), un līknes izmaiņas ir parādītas 3. attēlā (B). Līdzīgi silīcija dioksīda daļiņu poru tilpums pēc ķīmiskās modifikācijas samazinājās no 0,67 līdz 0,58 cm3/g. Pašreiz pētīto silīcija dioksīda daļiņu īpatnējā virsma ir 116 m2/g, kas ir salīdzināma ar mūsu iepriekšējo pētījumu (124 m2/g). Kā parādīts 1. tabulā (B), silīcija dioksīda daļiņu virsmas laukums (m2/g) arī samazinājās no 116 m2/g līdz 105 m2/g pēc... ķīmiskā modifikācija.
Stacionārās fāzes elementanalīzes rezultāti ir parādīti 2. tabulā. Pašreizējās stacionārās fāzes oglekļa saturs ir 6,35 %, kas ir mazāks nekā mūsu iepriekšējā pētījuma oglekļa saturs (ar polistirolu saistītas silīcija dioksīda daļiņas, attiecīgi 7,93 %35 un 10,21 %)42. Pašreizējās stacionārās fāzes oglekļa saturs ir zems, jo pašreizējās SP sagatavošanā papildus stirolam tika izmantoti daži polāri ligandi, piemēram, fenilmaleimīda-metilvinilizocianāts (PCMP) un 4-hidroksi-TEMPO. Pašreizējās stacionārās fāzes slāpekļa saturs svara procentos ir 2,21 %, salīdzinot ar 0,1735 un 0,85 % slāpekļa svara iepriekšējos pētījumos. Tas nozīmē, ka slāpekļa saturs svara procentos pašreizējā stacionārajā fāzē ir lielāks fenilmaleimīda dēļ. Līdzīgi produktu (4) un (5) oglekļa saturs bija attiecīgi 2,7 % un 2,9 %, savukārt gala produkta (6) oglekļa saturs bija 6,35 %, kā parādīts 2. tabulā. Svara zudums tika pārbaudīts ar PMP stacionāro fāzi, un TGA līkne ir parādīta 4. attēlā. TGA līkne uzrāda 8,6 % svara zudumu, kas labi atbilst oglekļa saturam (6,35 %), jo ligandi satur ne tikai C, bet arī N, O un H.
Fenilmaleimīda-metilvinilizocianāta ligands tika izvēlēts silīcija dioksīda daļiņu virsmas modifikācijai, jo tam ir polāras fenilmaleimīda grupas un vinilizocianāta grupas. Vinilizocianāta grupas var tālāk reaģēt ar stirolu, izmantojot dzīvo radikāļu polimerizāciju. Otrais iemesls ir ievietot grupu, kurai ir mērena mijiedarbība ar analītu un nav spēcīgas elektrostatiskas mijiedarbības starp analītu un stacionāro fāzi, jo fenilmaleimīda daļai nav virtuāla lādiņa normālā pH līmenī. Stacionārās fāzes polaritāti var kontrolēt ar optimālu stirola daudzumu un brīvo radikāļu polimerizācijas reakcijas laiku. Reakcijas pēdējais solis (brīvo radikāļu polimerizācija) ir kritisks un var mainīt stacionārās fāzes polaritāti. Lai pārbaudītu šo stacionāro fāžu oglekļa slodzi, tika veikta elementu analīze. Tika novērots, ka, palielinot stirola daudzumu un reakcijas laiku, palielinājās stacionārās fāzes oglekļa slodze un otrādi. Ar dažādām stirola koncentrācijām sagatavotiem SP ir atšķirīga oglekļa slodze. Atkal ievietojiet šīs stacionārās fāzes nerūsējošā tērauda kolonnās un pārbaudiet to hromatogrāfisko veiktspēju (selektivitāte, izšķirtspēja, N vērtība utt.). Pamatojoties uz šiem eksperimentiem, tika izveidots Lai nodrošinātu kontrolētu polaritāti un labu analīta aizturi, PMP stacionārās fāzes sagatavošanai tika izvēlēta optimizēta formula.
Izmantojot PMP kolonnu ar mobilo fāzi, tika novērtēti arī pieci peptīdu maisījumi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leicīna enkefalīns); 60/40 (v/v) acetonitrila/ūdens (0,1% TFA) šķīdums ar plūsmas ātrumu 80 μL/min. Optimālos eluēšanas apstākļos teorētiskais plākšņu skaits (N) uz kolonnu (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) ir 20 000 ± 100 (200 000 plāksnītes/m²). 3. tabulā ir norādītas N vērtības trim PMP kolonnām, un hromatogrammas ir parādītas 5.A attēlā. Ātrā analīze PMP kolonnā ar lielu plūsmas ātrumu (700 μL/min) pieci peptīdi tika eluēti vienas minūtes laikā, N vērtības bija ļoti labas, 13 500 ± 330 uz kolonnu (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs), kas atbilst 135 000 plāksnītēm/m (5.B attēls). Trīs identiska izmēra kolonnas (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) tika pildītas ar trim dažādām PMP stacionārās fāzes partijām, lai pārbaudītu reproducējamību. Analīts Katras kolonnas koncentrācija tika reģistrēta, izmantojot optimālos eluēšanas apstākļus un teorētisko plākšņu skaitu N un aiztures laiku, lai atdalītu vienu un to pašu testa maisījumu katrā kolonnā. PMP kolonnu reproducējamības dati ir parādīti 4. tabulā. PMP kolonnas reproducējamība labi korelē ar ļoti zemām %RSD vērtībām, kā parādīts 3. tabulā.
Peptīdu maisījuma atdalīšana PMP kolonnā (B) un Ascentis Express RP-Amide kolonnā (A); mobilā fāze 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP kolonnas izmēri (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs); analītiskā. Savienojumu eluēšanas secība: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) un 5 (leicīns) (skābes enkefalīns).
Augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijā tika novērtēta PMP kolonna (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) cilvēka seruma albumīna triptisko digestu atdalīšanai. 6. attēlā redzamā hromatogramma parāda, ka paraugs ir labi atdalīts un izšķirtspēja ir ļoti laba. HSA digesti tika analizēti, izmantojot plūsmas ātrumu 100 µL/min, mobilo fāzi 70/30 acetonitrila/ūdens un 0,1% TFA. Kā parādīts hromatogrammā (6. attēls), HSA digests ir sadalīts 17 pīķos, kas atbilst 17 peptīdiem. Tika aprēķināta katra pīķa atdalīšanas efektivitāte HSA digestā, un vērtības ir norādītas 5. tabulā.
HSA (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) triptiskā digesta metode tika atdalīta PMP kolonnā; plūsmas ātrums (100 µL/min), kustīgā fāze 60/40 acetonitrila/ūdens maisījums ar 0,1% TFA.
kur L ir kolonnas garums, η ir mobilās fāzes viskozitāte, ΔP ir kolonnas pretspiediens un u ir mobilās fāzes lineārais ātrums. PMP kolonnas caurlaidība bija 2,5 × 10-14 m2, plūsmas ātrums bija 25 μL/min, un tika izmantots 60/40 v/v ACN/ūdens. PMP kolonnas (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) caurlaidība bija līdzīga mūsu iepriekšējā pētījuma (Ref. 34) caurlaidībai. Ar virspusēji porainām daļiņām pildītas kolonnas caurlaidība ir: 1,7 × 10-15 1,3 μm daļiņām, 3,1 × 10-15 1,7 μm daļiņām, 5,2 × 10-15 un 2,5 × 10-14 m2 2,6 μm daļiņām 5 μm daļiņām 43. Tāpēc PMP fāzes caurlaidība ir līdzīga 5 μm kodola-apvalka daļiņu caurlaidībai.
kur Wx ir ar hloroformu pildītās kolonnas svars, Wy ir ar metanolu pildītās kolonnas svars un ρ ir šķīdinātāja blīvums. Metanola (ρ = 0,7866) un hloroforma (ρ = 1,484) blīvumi. Iepriekš pētīto SILICA PARTICLES-C18 kolonnu (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) 34 un C18-urīnvielas kolonnu 31 kopējā porainība bija attiecīgi 0,63 un 0,55. Tas nozīmē, ka urīnvielas ligandu klātbūtne samazina stacionārās fāzes caurlaidību. Savukārt PMP kolonnas (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) kopējā porainība ir 0,60. PMP kolonnu caurlaidība ir zemāka nekā kolonnām, kas pildītas ar C18 saistītām silīcija dioksīda daļiņām, jo ​​C18 tipa stacionārajās fāzēs C18 ligandi ir piesaistīti silīcija dioksīda daļiņām kā lineāras ķēdes, savukārt polistirola tipa stacionārajās fāzēs ap to veidojas relatīvi biezs polimēra slānis. tipiskā eksperimentā kolonnas porainību aprēķina šādi:
7A. un 7B. attēlā redzama PMP kolonna (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) un Ascentis Express RP-Amide kolonna (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs), izmantojot vienādus eluēšanas apstākļus (t. i., 60/40 ACN/H2O un 0,1 % TFA). van Dēmtera diagrammā. Atlasītie peptīdu maisījumi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leicīna enkefalīns) tika sagatavoti 20 µL/min tilpumā. Minimālais plūsmas ātrums abām kolonnām ir 800 µL/min. Minimālās HETP vērtības pie optimālā plūsmas ātruma (80 µL/min) PMP kolonnai un Ascentis Express RP-Amide kolonnai bija attiecīgi 2,6 µm un 3,9 µm. HETP vērtības norāda, ka PMP kolonnas (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) atdalīšanas efektivitāte ir daudz labāka nekā komerciāli pieejamajai Ascentis Express RP-Amide kolonnai (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs). Van Dēmtera diagramma 7. attēlā (A) parāda, ka N vērtības samazināšanās, palielinoties plūsmai, nav būtiska, salīdzinot ar mūsu iepriekšējo pētījumu. PMP kolonnas (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) augstākā atdalīšanas efektivitāte salīdzinājumā ar Ascentis Express RP-Amide kolonnas ieviešana ir balstīta uz daļiņu formas, izmēra un sarežģīto kolonnu iepakošanas procedūru uzlabojumiem, ko izmanto pašreizējā darbā34.
(A) van Dēmtera grafiks (HETP pret mobilās fāzes lineāro ātrumu), kas iegūts, izmantojot PMP kolonnu (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) 60/40 ACN/H2O ar 0,1% TFA. (B) van Dēmtera grafiks (HETP pret mobilās fāzes lineāro ātrumu), kas iegūts, izmantojot Ascentis Express RP-Amide kolonnu (100 × 1,8 mm iekšējais diametrs) 60/40 ACN/H2O ar 0,1% TFA.
Augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijā tika sagatavota un novērtēta polāri iegulta polistirola stacionārā fāze sintētisko peptīdu maisījumu un cilvēka seruma albumīna (HAS) tripsīna digestu atdalīšanai. PMP kolonnu hromatogrāfiskā veiktspēja peptīdu maisījumiem ir lieliska atdalīšanas efektivitātes un izšķirtspējas ziņā. PMP kolonnu uzlabotā atdalīšanas veiktspēja ir saistīta ar dažādiem iemesliem, piemēram, silīcija dioksīda daļiņu izmēru un poru izmēru, kontrolētu stacionārās fāzes sintēzi un sarežģītu kolonnas pildījumu. Papildus augstajai atdalīšanas efektivitātei, vēl viena šīs stacionārās fāzes priekšrocība ir zems kolonnas pretspiediens pie lieliem plūsmas ātrumiem. PMP kolonnām ir laba reproducējamība un tās var izmantot peptīdu maisījumu analīzei un dažādu olbaltumvielu tripsīna digestācijai. Mēs plānojam izmantot šo kolonnu dabisko produktu, ārstniecības augu bioaktīvo savienojumu un sēnīšu ekstraktu atdalīšanai šķidruma hromatogrāfijā. Nākotnē PMP kolonnas tiks novērtētas arī olbaltumvielu un monoklonālo antivielu atdalīšanai.
Fīlds, Dž. K., Eierbijs, M. R., Lau, Dž., Tēgersens, H. un Pētersons, P. Peptīdu atdalīšanas sistēmu izpēte, izmantojot apgrieztās fāzes hromatogrāfiju, I daļa: kolonnas raksturošanas protokola izstrāde. J. Chromatography.1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Uzlaboti aktīvi peptīdi, kas paredzēti infekcijas slimību ārstēšanai. Biotechnology.Advanced.36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. un Khrestchatisky, M. Sintētiskie terapeitiskie peptīdi: zinātne un tirgus. Zāļu atklāšana. 15 (1–2) šodien, 40.–56. lpp. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Sje, F., Smits, R. D. un Šens, J. Uzlabotā proteomiskā šķidruma hromatogrāfija. J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Uzlabotā šķidruma hromatogrāfijas-masas spektrometrija ļauj iekļaut plaši mērķtiecīgus metabolomiku un proteomiku.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM un Salisbury, JJ UHPLC loma zāļu izstrādē. J. Sep. Sci.30(8), 1183–1190 (2007).
Vu, N. un Klausens, AM. Īpaši augsta spiediena šķidruma hromatogrāfijas fundamentālie un praktiskie aspekti ātrai atdalīšanai. J. Sep. Sci. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Rens, SA un Čeličefs, P. Ultraaugstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas pielietojums zāļu izstrādē. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolīti makroporaini hidrogēli, kas sagatavoti no eļļas-ūdenī augstas iekšējās fāzes emulsijām enterovīrusu efektīvai attīrīšanai. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Ši, J., Sjans, R., Horvāts, C. un Vilkinss, Dž.A. Šķidrumhromatogrāfijas loma proteomikā. J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. un Guillarme, D. Jaunās tendences terapeitisko peptīdu un olbaltumvielu atdalīšanā ar apgrieztās fāzes šķidruma hromatogrāfiju: teorija un pielietojums. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE un Gebler, JC Divdimensiju peptīdu atdalīšana, izmantojot RP-RP-HPLC sistēmu, izmantojot dažādas pH vērtības pirmajā un otrajā atdalīšanas dimensijā. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Tika pētītas augstas efektivitātes hromatogrāfijas kolonnu, kas pildītas ar C18 zem 2 μm pilnībā un virspusēji porainām daļiņām, masas pārneses raksturlielumi un kinētiskā veiktspēja. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Jaunākās tendences un analītiskie izaicinājumi augu bioaktīvo peptīdu izolēšanā, identificēšanā un validācijā.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Dzīvības valstības proteomikas ainava. Nature 582(7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Terapeitisko peptīdu apstrāde ar preparatīvo šķidruma hromatogrāfiju. Molecule (Bāzele, Šveice) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Jauktā režīma hromatogrāfija un tās pielietojums biopolimēriem. J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Džao, G., Duns, S.-J. un Suns, J. Ligandas jaukta režīma olbaltumvielu hromatogrāfijai: princips, raksturojums un dizains. J. Biotechnology.144(1), 3.–11. lpp. (2009).