Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Huokoisia piidioksidihiukkasia valmistettiin sol-geelimenetelmällä, johon tehtiin joitakin muutoksia makrohuokoisten hiukkasten saamiseksi. Nämä hiukkaset derivatisoitiin reversiibelillä additiofragmentaatioketjunsiirtopolymeroinnilla (RAFT) N-fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatin (PMI) ja styreenin kanssa polystyreenin (PMP) stationäärifaasin N-fenyylimaleimidi-interkalaation valmistamiseksi. Kapeareikäiset ruostumattomasta teräksestä valmistetut kolonnit (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) pakattiin lietepakkauksella. Arvioitiin viiden peptidin (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusiinienkefaliini) peptidiseoksen PMP-kolonnierotusta (kromatografinen suorituskyky) ja ihmisen seerumin albumiinin (HAS) trypsiinidigestiota. Optimaalisissa eluointiolosuhteissa peptidiseoksen teoreettinen levymäärä on jopa 280 000 levyä/m². Verrattaessa kehitetyn kolonnin erotuskykyä kaupalliseen Ascentis Express RP-Amide -kolonniin, havaittiin havaitsi, että PMP-kolonnin erotuskyky oli kaupallista kolonnia parempi erotustehokkuuden ja resoluution suhteen.
Viime vuosina biolääketeollisuudesta on tullut laajeneva maailmanlaajuinen markkina-alue, jonka markkinaosuus on kasvanut huomattavasti. Biolääketeollisuuden räjähdysmäisen kasvun myötä1,2,3 peptidien ja proteiinien analysointi on erittäin haluttua. Kohdepeptidin lisäksi peptidisynteesissä syntyy useita epäpuhtauksia, jotka vaativat kromatografista puhdistusta halutun puhtauden omaavien peptidien saamiseksi. Proteiinien analysointi ja karakterisointi kehon nesteissä, kudoksissa ja soluissa on erittäin haastava tehtävä, koska yhdessä näytteessä on suuri määrä potentiaalisesti havaittavia lajeja. Vaikka massaspektrometria on tehokas työkalu peptidien ja proteiinien sekvensointiin, jos tällaiset näytteet injektoidaan massaspektrometriin yhdellä ajolla, erotus ei ole ihanteellinen. Tätä ongelmaa voidaan lieventää ottamalla käyttöön nestekromatografia (LC) -erottelut ennen MS-analyysiä, mikä vähentää massaspektrometriin tiettynä ajankohtana tulevien analyyttien määrää4,5,6. Lisäksi nestefaasierottelun aikana analyytit voidaan kohdistaa kapeille alueille, jolloin ne voidaan tiivistää ja parantaa MS-detektion herkkyyttä. Nestekromatografia (LC) on kehittynyt merkittävästi viimeisen vuosikymmenen aikana ja siitä on tullut suosittu tekniikka proteomiikassa. analyysi7,8,9,10.
Käänteisfaasinestekromatografiaa (RP-LC) käytetään laajalti peptidiseosten puhdistukseen ja erotteluun käyttäen stationäärisenä faasina oktadekyylimodifioitua piidioksidia (ODS)11,12,13. RP-stationäärifaasit eivät kuitenkaan tarjoa tyydyttävää peptidien ja proteiinien erottelua niiden monimutkaisen rakenteen ja amfifiilisen luonteen vuoksi14,15. Siksi tarvitaan erityisesti suunniteltuja stationäärifaaseja peptidien ja proteiinien analysoimiseksi polaaristen ja ei-polaaristen osien kanssa, jotta ne voivat olla vuorovaikutuksessa näiden analyyttien kanssa ja pidättää ne16. Sekamuotoinen kromatografia, joka tarjoaa multimodaalisia vuorovaikutuksia, voi olla vaihtoehto RP-LC:lle peptidien, proteiinien ja muiden monimutkaisten seosten erottelussa. Useita sekamuotoisia stationäärifaaseja on valmistettu, ja näillä faaseilla pakattuja kolonneja on käytetty peptidien ja proteiinien erotteluun17,18,19,20,21. Sekamuotoiset stationäärifaasit (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaarinen interkalaatio/RPLC) soveltuvat peptidien ja proteiinien erotteluun sekä polaaristen että ei-polaaristen osien läsnäolon vuoksi. ryhmät22,23,24,25,26,27,28. Vastaavasti polaariset interkaloituvat stationäärifaasit, joissa on kovalenttisesti sitoutuneita polaarisia ryhmiä, osoittavat hyvää erotuskykyä ja ainutlaatuista selektiivisyyttä polaarisille ja ei-polaarisille analyyteille, koska erotus riippuu analyytin ja stationäärifaasin välisestä vuorovaikutuksesta. Multimodaaliset vuorovaikutukset 29, 30, 31, 32. Äskettäin Zhang et al. 30 valmistivat dodekyylipäätteisen polyamiinistationäärifaasin ja erottivat onnistuneesti hiilivetyjä, masennuslääkkeitä, flavonoideja, nukleosideja, estrogeenejä ja useita muita analyyttejä. Polaarisessa interkalaattorissa on sekä polaarisia että ei-polaarisia ryhmiä, joten sitä voidaan käyttää peptidien ja proteiinien erottamiseen, joissa on sekä hydrofobisia että hydrofiilisiä osia. Polaarisesti upotetut kolonnit (esim. amidipohjaiset C18-kolonnit) ovat kaupallisesti saatavilla kauppanimellä Ascentis Express RP-Amide -kolonnit, mutta näitä kolonneja käytetään vain amiinin 33 analysointiin.
Tässä tutkimuksessa valmistettiin polaarisesti upotettu stationäärifaasi (N-fenyylimaleimidi-upotettu polystyreeni) ja arvioitiin sen käyttöä peptidien ja HSA:n trypsiinidigestion erottamiseksi. Stationäärifaasi valmistettiin seuraavaa strategiaa käyttäen. Huokoiset piidioksidihiukkaset valmistettiin edellisessä julkaisussamme kuvatun menetelmän mukaisesti, ja valmistusprotokollaan tehtiin joitakin muutoksia. Urean, polyetyleeniglykolin (PEG), TMOS:n, veden ja etikkahapon suhdetta säädettiin suurten huokoskokoisten piidioksidihiukkasten valmistamiseksi. Toiseksi syntetisoitiin uusi ligandi, fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatti, ja sitä käytettiin piidioksidihiukkasten derivatisointiin polaarisesti upotetun stationäärifaasin valmistamiseksi. Tuloksena oleva stationäärifaasi pakattiin ruostumattomasta teräksestä valmistettuun kolonniin (sisähalkaisija 100 × 1,8 mm) optimoitua pakkausmenetelmää käyttäen. Kolonnin pakkausta autetaan mekaanisella tärinällä, jotta kolonniin muodostuu homogeeninen kerros. Arvioi viidestä peptidistä koostuvien peptidiseosten pakatun kolonnin erottelua. (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leusiini-enkefaliini) ja trypsiinillä pilkottu ihmisen seerumialbumiini (HAS). Peptidiseoksen ja trypsiinillä pilkotun HSA:n havaittiin erottuvan hyvällä erotuskyvyllä ja tehokkuudella. PMP-kolonnin erotuskykyä verrattiin Ascentis Express RP-Amide -kolonniin. Sekä peptidien että proteiinien havaittiin erottuvan hyvin ja olevan tehokkaita PMP-kolonnissa, joka oli tehokkaampi kuin Ascentis Express RP-Amide -kolonni.
PEG (polyetyleeniglykoli), urea, etikkahappo, trimetoksiortosilikaatti (TMOS), trimetyylikloorisilaani (TMCS), trypsiini, ihmisen seerumin albumiini (HSA), ammoniumkloridi, urea, heksaanimetyylidisilatsaani (HMDS), metakryloyylikloridi (MC), styreeni, 4-hydroksi-TEMPO, bentsoyyliperoksidi (BPO), HPLC-laatuinen asetonitriili (ACN), metanoli, 2-propanoli ja asetoni. Ostettu Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA).
Urean (8 g), polyetyleeniglykolin (8 g) ja 8 ml:n 0,01 N etikkahapon seosta sekoitettiin 10 minuuttia, ja sitten siihen lisättiin 24 ml TMOS:ia jääkylmässä vedessä. Reaktioseosta kuumennettiin 40 °C:ssa 6 tuntia ja sitten 120 °C:ssa 8 tuntia ruostumattomasta teräksestä valmistetussa autoklaavissa. Vesi kaadettiin pois ja jäännösmateriaali kuivattiin 70 °C:ssa 12 tuntia. Kuivattu pehmeä massa jauhettiin tasaiseksi uunissa ja kalsinoitiin 550 °C:ssa 12 tuntia. Valmistettiin kolme erää ja karakterisoitiin niiden toistettavuuden tutkimiseksi hiukkaskoon, huokoskoon ja pinta-alan suhteen.
Polaarisia ryhmiä sisältävä yhdiste valmistettiin modifioimalla piidioksidihiukkasia pintaa esisyntetisoidulla ligandilla fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaatilla (PCMP) ja sen jälkeen radiaalisella polymeroinnilla styreenin kanssa. Kiinteä faasi aggregaateille ja polystyreeniketjuille. Valmistusprosessi kuvataan alla.
N-fenyylimaleimidi (200 mg) ja metyylivinyyli-isosyanaatti (100 mg) liuotettiin kuivaan tolueeniin, ja reaktiokolviin lisättiin 0,1 ml 2,2′-atsoisobutyronitriiliä (AIBN) fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaattikopolymeerin (PMCP) valmistamiseksi. Seosta kuumennettiin 60 °C:ssa 3 tuntia, suodatettiin ja kuivattiin uunissa 40 °C:ssa 3 tuntia.
Kuivattuja piidioksidihiukkasia (2 g) dispergoitiin kuivaan tolueeniin (100 ml), sekoitettiin ja sonikoitiin 500 ml:n pyöreäpohjaisessa pullossa 10 minuutin ajan. PMCP (10 mg) liuotettiin tolueeniin ja lisättiin tipoittain reaktiopulloon tiputussuppilon kautta. Seosta refluksoitiin 100 °C:ssa 8 tuntia, suodatettiin ja pestiin asetonilla ja kuivattiin 60 °C:ssa 3 tuntia. Sitten PMCP:hen sitoutuneet piidioksidihiukkaset (100 g) liuotettiin tolueeniin (200 ml) ja lisättiin 4-hydroksi-TEMPO:a (2 ml) 100 µl:n dibutyylitinadilauraattia katalysaattorina. Seosta sekoitettiin 50 °C:ssa 8 tuntia, suodatettiin ja kuivattiin 50 °C:ssa 3 tuntia.
Styreeni (1 ml), bentsoyyliperoksidi BPO (0,5 ml) ja TEMPO-PMCP:hen kiinnittyneet piidioksidihiukkaset (1,5 g) dispergoitiin tolueeniin ja huuhdeltiin typellä. Styreenin polymerointi suoritettiin 100 °C:ssa 12 tunnin ajan. Tuloksena oleva tuote pestiin metanolilla ja kuivattiin 60 °C:ssa yön yli. Kokonaisreaktiokaavio on esitetty kuvassa 1.
Näytteistä poistettiin kaasua 393 K:ssa tunnin ajan, jotta jäännöspaineeksi saatiin alle 10⁻³ Torria. Kokonaishuokostilavuuden määrittämiseen käytettiin suhteellisessa paineessa P/P0 = 0,99 adsorboitunutta N2-määrää. Paljaiden ja ligandilla sitoutuneiden piidioksidihiukkasten morfologiaa tutkittiin pyyhkäisyelektronimikroskopialla (Hitachi High Technologies, Tokio, Japani). Kuivatut näytteet (paljas piidioksidi ja ligandilla sitoutuneet piidioksidihiukkaset) asetettiin alumiinipylvääseen hiiliteipillä. Näytteet kullattiin Q150T-sputter-pinnoittimella, ja näytteiden päälle kerrostettiin 5 nm:n Au-kerros. Tämä parantaa prosessin tehokkuutta matalilla jännitteillä ja mahdollistaa hienorakeisen kylmäsputteroinnin. Alkuaineanalyysiin käytettiin Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 -alkuaineanalysaattoria. Hiukkaskokojakauman määrittämiseen käytettiin Malvern (Worcestershire, Iso-Britannia) Mastersizer 2000 -hiukkaskokoanalysaattoria. Paljaat piidioksidihiukkaset ja ligandilla sitoutuneet piidioksidihiukkaset (5 mg kutakin) dispergoitiin 5 ml:aan isopropanolia, sonikoitiin 10 minuuttia, vorteksoitiin 5 minuuttia ja asetettiin Mastersizer-laitteen optiselle pöydälle. Termogravimetrinen analyysi suoritettiin nopeudella 5 °C minuutissa lämpötila-alueella 30–800 °C.
Lasivuoratut, ruostumattomasta teräksestä valmistetut kapeareikäiset kolonnit, joiden mitat olivat 100 × 1,8 mm, pakattiin lietepakkausmenetelmällä käyttäen samaa menettelyä kuin viitteessä nro. 31. Ruostumattomasta teräksestä valmistettu kolonni (lasivuorattu, sisähalkaisija 100 × 1,8 mm), jonka ulostuloliittimessä oli 1 µm:n fritti, liitettiin lietepakkaajaan (Alltech Deerfield, IL, USA). Valmistele stationäärifaasisuspensio suspendoimalla 150 mg stationäärifaasia 1,2 ml:aan metanolia ja lähetä se varastokolonniin. Metanolia käytettiin lieteliuottimena sekä ponneaineena. Täytä kolonni peräkkäin käyttämällä 100 MP:n paineita 10 minuutin ajan, 80 MP:n paineita 15 minuutin ajan ja 60 MP:n paineita 30 minuutin ajan. Pakkauksen aikana kohdistettiin mekaanista tärytystä kahdella kaasukromatografiakolonnin ravistimella (Alltech, Deerfield, IL, USA) kolonnin tasaisen pakkautumisen varmistamiseksi. Sulje lietepakkaaja ja vapauta paine hitaasti, jotta kolonni ei vaurioidu. Irrota kolonni lietepakkausyksiköstä ja liitä toinen liitin tuloliittimeen ja nestekromatografiajärjestelmään sen suorituskyvyn tarkistamiseksi.
LC-pumppu (10AD Shimadzu, Japani), injektori (Valco (USA) C14 W.05) 50 nL:n injektiosilmukalla, kalvokaasutin (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS-kapillaari-ikkuna, erityinen µLC-laitedetektori (UV-2075) ja lasilla vuoratut mikrokolonnit. Käytettiin hyvin kapeita ja lyhyitä liitosputkia kolonnin kaistanlevennysten minimoimiseksi. Pakkaamisen jälkeen kapillaarit (50 μm sisähalkaisija 365) ja pelkistävät liitoskapillaarit (50 μm) asennettiin pelkistävän liitososan 1/16 tuuman ulostuloon. Tiedonkeruu ja kromatografinen käsittely tehtiin Multichro 2000 -ohjelmistolla. Seuranta 254 nm:ssä. Analyyteistä testattiin UV-absorbanssi. Kromatografiset tiedot analysoitiin OriginPro8:lla (Northampton, MA).
Ihmisen seerumista peräisin oleva albumiini, kylmäkuivattu jauhe, ≥ 96 % (agaroosigeelielektroforeesi) 3 mg sekoitettuna trypsiiniin (1,5 mg), 4,0 M ureaan (1 ml) ja 0,2 M ammoniumbikarbonaattiin (1 ml). Liuosta sekoitettiin 10 minuuttia ja pidettiin vesihauteessa 37 °C:ssa 6 tuntia, minkä jälkeen se sammutettiin 1 ml:lla 0,1 % TFA:ta. Suodata liuos ja säilytä alle 4 °C:ssa.
Peptidiseosten ja HSA:n trypsiinipilkkomisten erottumista arvioitiin erikseen PMP-kolonneilla. Tarkista peptidiseoksen ja HSA:n trypsiinipilkkomisten erottuminen PMP-kolonnilla ja vertaa tuloksia Ascentis Express RP-Amide -kolonniin. Teoreettinen levymäärä lasketaan seuraavasti:
Kuvassa 2 on esitetty paljaiden piidioksidihiukkasten ja ligandilla sitoutuneiden piidioksidihiukkasten SEM-kuvat. Paljaiden piidioksidihiukkasten (A, B) SEM-kuvat osoittavat, että aiemmista tutkimuksistamme poiketen nämä hiukkaset ovat pallomaisia, pitkänomaisia ​​tai epäsäännöllisen symmetrisia. Ligandilla sitoutuneiden piidioksidihiukkasten (C, D) pinta on sileämpi kuin paljaiden piidioksidihiukkasten, mikä voi johtua piidioksidihiukkasten pinnalla olevista polystyreeniketjuista.
Paljaiden piidioksidihiukkasten (A, B) ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten (C, D) pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvat.
Paljaiden piidioksidihiukkasten ja ligandilla sidottujen piidioksidihiukkasten hiukkaskokojakaumat on esitetty kuvassa 3(A). Tilavuuspohjaiset hiukkaskokojakaumakäyrät osoittivat, että piidioksidihiukkasten koko kasvoi kemiallisen modifioinnin jälkeen (kuva 3A). Nykyisen tutkimuksen ja aiemman tutkimuksen piidioksidihiukkasten hiukkaskokojakaumatietoja on verrattu taulukossa 1(A). PMP:n tilavuuspohjainen hiukkaskoko, d(0,5), on 3,36 μm, verrattuna aiempaan tutkimukseemme, jossa ad(0,5)-arvo oli 3,05 μm (polystyreenillä sidotut piidioksidihiukkaset)34. Tämän erän hiukkaskokojakauma oli kapeampi kuin aiemmassa tutkimuksessamme johtuen PEG:n, urean, TMOS:n ja etikkahapon vaihtelevista suhteista reaktioseoksessa. PMP-faasin hiukkaskoko on hieman suurempi kuin aiemmin tutkimamme polystyreenillä sidotun piidioksidihiukkasfaasin. Tämä tarkoittaa, että piidioksidihiukkasten pintafunktionalisointi styreenillä kerrosti piidioksidin pinnalle vain polystyreenikerroksen (0,97 µm), kun taas PMP-faasissa kerroksen paksuus oli 1,38 µm.
Paljaiden piidioksidihiukkasten ja ligandiin sitoutuneiden piidioksidihiukkasten hiukkaskokojakauma (A) ja huokoskokojakauma (B).
Nykyisen tutkimuksen piidioksidihiukkasten huokoskoko, huokostilavuus ja pinta-ala on esitetty taulukossa 1(B). Paljaiden piidioksidihiukkasten ja ligandilla sitoutuneiden piidioksidihiukkasten PSD-profiilit on esitetty kuvassa 3(B). Tulokset ovat verrattavissa aiempaan tutkimukseemme. Paljaiden ja ligandilla sitoutuneiden piidioksidihiukkasten huokoskoot ovat vastaavasti 310 ja 241, mikä osoittaa, että huokoskoko pienenee 69 µm kemiallisen modifioinnin jälkeen, kuten taulukosta 1(B) käyrän muutos on esitetty kuvassa 3(B). Vastaavasti piidioksidihiukkasten huokostilavuus pieneni 0,67:stä 0,58 cm3/g:iin kemiallisen modifioinnin jälkeen. Nykyisten tutkittujen piidioksidihiukkasten ominaispinta-ala on 116 m2/g, mikä on verrattavissa aiempaan tutkimukseemme (124 m2/g). Kuten taulukosta 1(B) käy ilmi, piidioksidihiukkasten pinta-ala (m2/g) pieneni myös 116 m2/g:stä 105 m2/g:iin modifioinnin jälkeen. kemiallinen modifikaatio.
Stationäärifaasin alkuaineanalyysin tulokset on esitetty taulukossa 2. Nykyisen stationäärifaasin hiilipitoisuus on 6,35 %, mikä on pienempi kuin aiemman tutkimuksemme hiilipitoisuus (polystyreenillä sidotut piidioksidihiukkaset, 7,93 %35 ja 10,21 %)42. Nykyisen stationäärifaasin hiilipitoisuus on pieni, koska nykyisen SP:n valmistuksessa käytettiin styreenin lisäksi joitakin polaarisia ligandeja, kuten fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaattia (PCMP) ja 4-hydroksi-TEMPO:a. Nykyisen stationäärifaasin typpipitoisuus on 2,21 %, kun aiemmissa tutkimuksissa typpipitoisuus oli 0,1735 ja 0,85 painoprosenttia. Tämä tarkoittaa, että typen painoprosentti on korkeampi nykyisessä stationäärifaasissa fenyylimaleimidin vuoksi. Vastaavasti tuotteiden (4) ja (5) hiilipitoisuudet olivat 2,7 % ja 2,9 %, kun taas lopputuotteen (6) hiilipitoisuus oli 6,35 %, kuten taulukosta 2 käy ilmi. Painonpudotus tarkistettiin PMP-stationäärifaasilla, ja TGA-käyrä on esitetty kuvassa 4. TGA-käyrä osoittaa 8,6 %:n painonpudotuksen, mikä on hyvässä yhteensopivuudessa hiilipitoisuuden (6,35 %) kanssa, koska ligandit sisältävät paitsi C:tä myös N:ää, O:ta ja H:ta.
Fenyylimaleimidi-metyylivinyyli-isosyanaattiligandi valittiin piidioksidihiukkasten pinnan modifiointiin, koska siinä on polaarisia fenyylimaleimidiryhmiä ja vinyyli-isosyanaattiryhmiä. Vinyyli-isosyanaattiryhmät voivat reagoida edelleen styreenin kanssa elävän radikaalin polymeroinnin avulla. Toinen syy on lisätä ryhmä, jolla on kohtalainen vuorovaikutus analyytin kanssa eikä voimakasta sähköstaattista vuorovaikutusta analyytin ja stationäärifaasin välillä, koska fenyylimaleimidiryhmällä ei ole virtuaalista varausta normaalissa pH:ssa. Stationäärifaasin polaarisuutta voidaan kontrolloida optimaalisella styreenin määrällä ja vapaiden radikaalien polymeroinnin reaktioajalla. Reaktion viimeinen vaihe (vapaiden radikaalien polymerointi) on kriittinen ja voi muuttaa stationäärifaasin polaarisuutta. Alkuaineanalyysi suoritettiin näiden stationäärifaasien hiilipitoisuuden tarkistamiseksi. Havaittiin, että styreenin määrän ja reaktioajan lisääminen lisäsi stationäärifaasin hiilipitoisuutta ja päinvastoin. Eri styreenipitoisuuksilla valmistetuilla SP-polymeroinneilla on erilaiset hiilipitoisuudet. Nämä stationäärifaasit ladataan jälleen ruostumattomasta teräksestä valmistettuihin kolonneihin ja tarkistetaan niiden kromatografinen suorituskyky (selektiivisyys, resoluutio, N-arvo jne.). Näiden kokeiden perusteella... PMP:n stationäärifaasin valmistukseen valittiin optimoitu formulaatio, jotta varmistettiin kontrolloitu polaarisuus ja hyvä analyytin retentio.
Viisi peptidiseosta (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusiinienkefaliini) arvioitiin myös käyttämällä PMP-kolonnia ja liikkuvaa faasia; 60/40 (v/v) asetonitriili/vesi (0,1 % TFA) virtausnopeudella 80 μl/min. Optimaalisissa eluointiolosuhteissa teoreettinen levymäärä (N) kolonnia (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) kohden on 20 000 ± 100 (200 000 levyä/m²). Taulukossa 3 on esitetty N-arvot kolmelle PMP-kolonnitille ja kromatogrammit on esitetty kuvassa 5A. Nopea analyysi PMP-kolonnissa suurella virtausnopeudella (700 μl/min), viisi peptidiä eluoitui minuutin sisällä, N-arvot olivat erittäin hyvät, 13 500 ± 330 kolonnia (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) kohden, vastaa 135 000 levyä/m² (kuva 5B). Kolme identtisen kokoista kolonnia (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) pakattiin kolmella eri erällä PMP-stationäärifaasia toistettavuuden tarkistamiseksi. Analyytti Kunkin kolonnin konsentraatio rekisteröitiin käyttämällä optimaalisia eluointiolosuhteita ja teoreettisten pohjalevyjen lukumäärää N ja retentioaikaa saman testiseoksen erottamiseksi kussakin kolonnissa. PMP-kolonnien toistettavuustiedot on esitetty taulukossa 4. PMP-kolonnin toistettavuus korreloi hyvin erittäin matalien %RSD-arvojen kanssa, kuten taulukosta 3 käy ilmi.
Peptidiseoksen erotus PMP-kolonnilla (B) ja Ascentis Express RP-Amide -kolonnilla (A); liikkuva faasi 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-kolonnin mitat (100 × 1,8 mm sisähalkaisija); analyyttinen. Yhdisteiden eluutiojärjestys: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ja 5 (leusiini) (happoenkefaliini).
PMP-kolonnia (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) arvioitiin ihmisen seerumialbumiinin tryptisten pilkkomistuotteiden erottelun suhteen korkean erotuskyvyn nestekromatografialla. Kuvassa 6 esitetty kromatogrammi osoittaa, että näyte on hyvin erotettu ja erotuskyky on erittäin hyvä. HSA-pilkkomistuotteet analysoitiin käyttämällä virtausnopeutta 100 µl/min, liikkuvana faasina 70/30 asetonitriili/vesi ja 0,1 % TFA:ta. Kuten kromatogrammista (kuva 6) käy ilmi, HSA-pilkkominen on jaettu 17 piikkiin, jotka vastaavat 17 peptidiä. Kunkin piikin erotustehokkuus HSA-pilkkomisessa laskettiin, ja arvot on esitetty taulukossa 5.
HSA:n (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) tryptisellä liuoksella valmistettu osa erotettiin PMP-kolonnilla; virtausnopeus (100 µl/min), liikkuva faasi 60/40 asetonitriili/vesi, jossa 0,1 % TFA:ta.
jossa L on kolonnin pituus, η on liikkuvan faasin viskositeetti, ΔP on kolonnin vastapaine ja u on liikkuvan faasin lineaarinopeus. PMP-kolonnin permeabiliteetti oli 2,5 × 10-14 m2, virtausnopeus oli 25 μl/min ja käytettiin 60/40 v/v ACN/vesi-seosta. PMP-kolonnin (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) permeabiliteetti oli samanlainen kuin edellisessä tutkimuksessamme Ref.34. Pinnallisesti huokoisilla hiukkasilla täytetyn kolonnin permeabiliteetti on: 1,7 × 10-15 1,3 μm:n hiukkasille, 3,1 × 10-15 1,7 μm:n hiukkasille, 5,2 × 10-15 ja 2,5 × 10-14 m2 2,6 μm:n hiukkasille. 5 μm:n hiukkasille 43. Siksi PMP-faasin permeabiliteetti on samanlainen kuin 5 μm:n ydin-kuorirakenteisten hiukkasten.
jossa Wx on kloroformilla täytetyn kolonnin paino, Wy on metanolilla täytetyn kolonnin paino ja ρ on liuottimen tiheys. Metanolin (ρ = 0,7866) ja kloroformin (ρ = 1,484) tiheydet. Aiemmin tutkimiemme SILICA PARTICLES-C18-kolonnien (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) 34 ja C18-urea-kolonnien 31 kokonaishuokoisuus oli vastaavasti 0,63 ja 0,55. Tämä tarkoittaa, että urealigandien läsnäolo vähentää stationäärifaasin läpäisevyyttä. Toisaalta PMP-kolonnin (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) kokonaishuokoisuus on 0,60. PMP-kolonnien läpäisevyys on pienempi kuin C18-sidoksella sitoutuneilla piidioksidihiukkasilla täytetyillä kolonneilla, koska C18-tyyppisissä stationäärifaaseissa C18-ligandit ovat kiinnittyneet piidioksidihiukkasiin lineaarisina ketjuina, kun taas polystyreenityyppisissä stationäärifaaseissa sen ympärille muodostuu suhteellisen paksu polymeerikerros. Tyypillisessä kokeessa kolonnin huokoisuus lasketaan seuraavasti:
Kuvioissa 7A ja 7B on esitetty van Deemterin käyrän PMP-kolonni (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) ja Ascentis Express RP-Amide -kolonni (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) samoissa eluointiolosuhteissa (eli 60/40 ACN/H2O ja 0,1 % TFA). Valittuja peptidiseoksia (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leusiini-enkefaliini) valmistettiin 20 µl/min. Molempien kolonnien minimivirtausnopeus on 800 µl/min. PMP-kolonnin ja Ascentis Express RP-Amide -kolonnin optimaalisella virtausnopeudella (80 µl/min) mitatut HETP-minimiarvot olivat 2,6 µm ja 3,9 µm. HETP-arvot osoittavat, että PMP-kolonnin (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) erotustehokkuus on paljon parempi kuin kaupallisesti saatavilla olevan Ascentis Express RP-Amide -kolonnin (100 × 1,8 mm sisähalkaisija). Kuvan 7(A) van Deemterin käyrä osoittaa, että N-arvon lasku virtauksen kasvaessa ei ole merkittävää verrattuna aiempaan tutkimukseemme. PMP-kolonnin (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) korkeampi erotustehokkuus verrattuna... Ascentis Express RP-Amide -kolonniin siirtyminen perustuu tässä työssä käytettyjen hiukkasten muodon, koon ja monimutkaisten kolonnin pakkausmenetelmien parannuksiin34.
(A) van Deemterin käyrä (HETP vs. liikkuvan faasin lineaarinopeus), joka on saatu käyttämällä PMP-kolonnia (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) 60/40 ACN/H2O-seoksessa, jossa on 0,1 % TFA:ta. (B) van Deemterin käyrä (HETP vs. liikkuvan faasin lineaarinopeus), joka on saatu käyttämällä Ascentis Express RP-Amide -kolonnia (100 × 1,8 mm sisähalkaisija) 60/40 ACN/H2O-seoksessa, jossa on 0,1 % TFA:ta.
Polaarisesti upotettu polystyreeni-stationäärifaasi valmistettiin ja arvioitiin synteettisten peptidiseosten ja ihmisen seerumialbumiinin (HAS) trypsiinidigestion erottelua varten korkean erotuskyvyn nestekromatografiassa. PMP-kolonnien kromatografinen suorituskyky peptidiseoksille on erinomainen erotustehokkuuden ja resoluution suhteen. PMP-kolonnien parantunut erotuskyky johtuu useista syistä, kuten piidioksidihiukkasten hiukkaskoosta ja huokoskoosta, stationäärifaasin hallitusta synteesistä ja monimutkaisesta kolonnin täytöstä. Korkean erotustehokkuuden lisäksi alhainen kolonnin vastapaine suurilla virtausnopeuksilla on tämän stationäärifaasin toinen etu. PMP-kolonneilla on hyvä toistettavuus ja niitä voidaan käyttää peptidiseosten analysointiin ja erilaisten proteiinien trypsiinidigestion suorittamiseen. Aiomme käyttää tätä kolonnia luonnontuotteiden, lääkekasvien bioaktiivisten yhdisteiden ja sieniuutteiden erottamiseen nestekromatografiassa. Tulevaisuudessa PMP-kolonneja arvioidaan myös proteiinien ja monoklonaalisten vasta-aineiden erotteluun.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Tutkimus peptidien erotusjärjestelmistä käänteisfaasikromatografialla, osa I: kolonnin karakterisointiprotokollan kehittäminen. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. ym. Parannetut aktiiviset peptidit tartuntatautien hoitoon. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synteettiset terapeuttiset peptidit: tiede ja markkinat. Lääkekehitys. 15 (1-2) tänään, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Edistynyt proteomiikkanestekromatografia. J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ym. Edistynyt nestekromatografia-massaspektrometria mahdollistaa laajasti kohdennettujen metabolomiikan ja proteomiikan menetelmien sisällyttämisen. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC:n rooli lääkekehityksessä. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM. Ultrakorkean paineen nestekromatografian perus- ja käytännön näkökohdat nopeissa erotteluissa. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ultra-korkean suorituskyvyn nestekromatografian käyttö lääkekehityksessä. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. ym. Monoliittisia makrohuokoisia hydrogeelejä, jotka on valmistettu öljy-vedessä-pitoisista korkean sisäisen faasin emulsioista enterovirusten tehokkaaseen puhdistukseen. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Nestekromatografian rooli proteomiikassa. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Nousevat trendit terapeuttisten peptidien ja proteiinien käänteisfaasinestekromatografiassa: teoria ja sovellukset. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Peptidien kaksiulotteinen erottelu RP-RP-HPLC-järjestelmällä käyttäen eri pH-arvoja ensimmäisessä ja toisessa erotusdimensiossa. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. ym. Tutkittiin täysin ja pinnallisesti huokoisilla alle 2 μm:n C18-hiukkasilla täytettyjen tehokkaiden kromatografiakolonnien massansiirto-ominaisuuksia ja kineettistä suorituskykyä. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. ym. Viimeaikaiset trendit ja analyyttiset haasteet kasvien bioaktiivisten peptidien eristämisessä, tunnistamisessa ja validoinnissa.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB ym. Elämän valtakunnan proteomiikkamaisema. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. ym. Terapeuttisten peptidien jatkokäsittely preparatiivisella nestekromatografialla. Molecule (Basel, Sveitsi) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Sekamuotoinen kromatografia ja sen soveltaminen biopolymeereihin. J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligandit sekamuotoiseen proteiinikromatografiaan: periaate, karakterisointi ja suunnittelu. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).