Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat stöd för CSS. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller stänger av kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att visa webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Porösa kiseldioxidpartiklar framställdes med en sol-gel-metod med vissa modifieringar för att erhålla makroporösa partiklar. Dessa partiklar derivatiserades genom reversibel additionsfragmenteringskedjeöverföring (RAFT)-polymerisation med N-fenylmaleimid-metylvinylisocyanat (PMI) och styren för att framställa N-fenylmaleimidinterkalering av polystyren (PMP) stationär fas. Smalborrade kolonner av rostfritt stål (100 × 1,8 mm innerdiameter) packades genom uppslamningspackning. Utvärderade PMP-kolonnseparation av en peptidblandning bestående av fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucinenkefalin) kromatografisk prestanda) och trypsin-digerering av humant serumalbumin (HAS). Under optimala elueringsförhållanden är det teoretiska plattantalet för peptidblandningen så högt som 280 000 plattor/m². Jämförelse av separationsprestanda för den utvecklade kolonnen med den kommersiella Ascentis Express. RP-Amid-kolonnen observerades att separationsprestanda för PMP-kolonnen var överlägsen den kommersiella kolonnen vad gäller separationseffektivitet och upplösning.
Under senare år har den biofarmaceutiska industrin blivit en expanderande global marknad med en betydande ökning av marknadsandelar. Med den explosionsartade tillväxten inom den biofarmaceutiska industrin1,2,3 är analys av peptider och proteiner mycket eftertraktad. Förutom målpeptiden genereras flera föroreningar under peptidsyntesen, vilket kräver kromatografisk rening för att erhålla peptider med önskad renhet. Analys och karakterisering av proteiner i kroppsvätskor, vävnader och celler är en extremt utmanande uppgift på grund av det stora antalet potentiellt detekterbara arter i ett enda prov. Även om masspektrometri är ett effektivt verktyg för peptid- och proteinsekvensering, kommer separationen inte att vara idealisk om sådana prover injiceras i masspektrometern i ett svep. Detta problem kan mildras genom att implementera vätskekromatografi (LC)-separationer före MS-analys, vilket kommer att minska antalet analyter som kommer in i masspektrometern vid en given tidpunkt4,5,6. Dessutom kan analyter under vätskefasseparation fokuseras i smala områden, varigenom dessa analyter koncentreras och MS-detektionskänsligheten förbättras. Vätskekromatografi (LC) har utvecklats avsevärt under det senaste decenniet och har blivit ett populärt... teknik inom proteomisk analys7,8,9,10.
Omvändfasvätskekromatografi (RP-LC) används ofta för rening och separation av peptidblandningar med oktadecylmodifierad kiseldioxid (ODS) som stationär fas11,12,13. Emellertid ger RP-stationära faser inte tillfredsställande separation av peptider och proteiner på grund av deras komplexa struktur och amfifila natur14,15. Därför krävs specialdesignade stationära faser för att analysera peptider och proteiner med polära och opolära delar för att interagera med och behålla dessa analyter16. Blandad kromatografi, som ger multimodala interaktioner, kan vara ett alternativ till RP-LC för separation av peptider, proteiner och andra komplexa blandningar. Flera blandade stationära faser har framställts, och kolonner packade med dessa faser har använts för peptid- och proteinseparationer17,18,19,20,21. Blandade stationära faser (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polär interkalering/RPLC) är lämpliga för peptid- och proteinseparationer på grund av närvaron av både polära och opolära. grupperna22,23,24,25,26,27,28. På liknande sätt uppvisar polära interkalerande stationära faser med kovalent bundna polära grupper god separationskraft och unik selektivitet för polära och icke-polära analyter, eftersom separationen beror på interaktionen mellan analyt och stationär fas. Multimodala interaktioner29, 30, 31, 32. Nyligen framställde Zhang et al.30 en dodecylterminerad polyaminstationär fas och separerade framgångsrikt kolväten, antidepressiva medel, flavonoider, nukleosider, östrogener och flera andra analyter.Den polära interkalatorn har både polära och icke-polära grupper, så den kan användas för att separera peptider och proteiner som har både hydrofoba och hydrofila delar.Polarinbäddade kolonner (t.ex. amidinbäddade C18-kolonner) finns kommersiellt tillgängliga under handelsnamnet Ascentis Express RP-Amide-kolonner, men dessa kolonner används endast för analys av amin 33.
I den aktuella studien framställdes en polärt inbäddad stationär fas (N-fenylmaleimid-inbäddad polystyren) och utvärderades för separation av peptider och trypsin-digereringar av HSA. Den stationära fasen framställdes med följande strategi. Porösa kiseldioxidpartiklar framställdes enligt proceduren som anges i vår tidigare publikation med vissa modifieringar av framställningsprotokollet. Förhållandet urea, polyetylenglykol (PEG), TMOS, vatten och ättiksyra justerades för att framställa kiseldioxidpartiklar med stor porstorlek. För det andra syntetiserades en ny ligand, fenylmaleimid-metylvinylisocyanat, och användes för att derivatisera kiseldioxidpartiklar för att framställa en polärt inbäddad stationär fas. Den resulterande stationära fasen packades i en kolonn av rostfritt stål (100 × 1,8 mm i diameter) med hjälp av det optimerade packningsschemat. Kolonnpackningen assisteras med mekanisk vibration för att säkerställa att en homogen bädd bildas i kolonnen. Utvärdera packad kolonnseparation av peptidblandningar bestående av fem peptider; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkefalin) och trypsin-digestion av humant serumalbumin (HAS). Peptidblandningen och trypsin-digestionen av HSA observerades separera med god upplösning och effektivitet. Separationsprestandan för PMP-kolonnen jämfördes med den för Ascentis Express RP-Amide-kolonnen. Både peptider och proteiner observerades vara väl upplösta och effektiva på PMP-kolonnen, som var mer effektiv än Ascentis Express RP-Amide-kolonnen.
PEG (polyetylenglykol), urea, ättiksyra, trimetoxiortosilikat (TMOS), trimetylklorsilan (TMCS), trypsin, humant serumalbumin (HSA), ammoniumklorid, urea, hexanmetyldisilazan (HMDS), metakryloylklorid (MC), styren, 4-hydroxi-TEMPO, bensoylperoxid (BPO), HPLC-kvalitet acetonitril (ACN), metanol, 2-propanol och aceton. Inköpt från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
En blandning av urea (8 g), polyetylenglykol (8 g) och 8 ml 0,01 N ättiksyra omrördes i 10 minuter, och sedan tillsattes 24 ml TMOS under iskalla förhållanden. Reaktionsblandningen upphettades vid 40 °C i 6 timmar och sedan vid 120 °C i 8 timmar i en autoklav av rostfritt stål. Vattnet hälldes av och det återstående materialet torkades vid 70 °C i 12 timmar. Den torkade mjuka massan maldes slät i en ugn och kalcinerades vid 550 °C i 12 timmar. Tre satser framställdes och karakteriserades för att undersöka reproducerbarhet i partikelstorlek, porstorlek och ytarea.
Genom ytmodifiering av kiseldioxidpartiklar med den försyntetiserade liganden fenylmaleimid-metylvinylisocyanat (PCMP) följt av radiell polymerisation med styren framställdes en förening innehållande polära grupper. Stationär fas för aggregat och polystyrenkedjor. Framställningsprocessen beskrivs nedan.
N-fenylmaleimid (200 mg) och metylvinylisocyanat (100 mg) löstes i torr toluen, och 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) tillsattes till reaktionskolven för att framställa fenylmaleimid-metylvinylisocyanat-sampolymer (PMCP). Blandningen upphettades vid 60 °C i 3 timmar, filtrerades och torkades i en ugn vid 40 °C i 3 timmar.
Torkade kiseldioxidpartiklar (2 g) dispergerades i torr toluen (100 ml), omrördes och sonikerades i en 500 ml rundbottnad kolv i 10 minuter. PMCP (10 mg) löstes i toluen och tillsattes droppvis till reaktionskolven via en dropptratt. Blandningen återloppskokades vid 100 °C i 8 timmar, filtrerades och tvättades med aceton och torkades vid 60 °C i 3 timmar. Därefter löstes PMCP-bundna kiseldioxidpartiklar (100 g) i toluen (200 ml) och 4-hydroxi-TEMPO (2 ml) tillsattes i närvaro av 100 µl dibutyltenndilaurat som katalysator. Blandningen omrördes vid 50 °C i 8 timmar, filtrerades och torkades vid 50 °C i 3 timmar.
Styren (1 ml), bensoylperoxid BPO (0,5 ml) och TEMPO-PMCP-bundna kiseldioxidpartiklar (1,5 g) dispergerades i toluen och spolades med kväve. Polymerisationen av styren utfördes vid 100 °C i 12 timmar. Den resulterande produkten tvättades med metanol och torkades vid 60 °C över natten. Det övergripande reaktionsschemat visas i figur 1.
Proverna avgasades vid 393 K i 1 timme för att erhålla ett resttryck på mindre än 10⁻³ Torr. Mängden N2 som adsorberades vid ett relativt tryck på P/P0 = 0,99 användes för att bestämma den totala porvolymen. Morfologin hos bara och ligandbundna kiseldioxidpartiklar undersöktes med svepelektronmikroskopi (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Torkade prover (bar kiseldioxid och ligandbundna kiseldioxidpartiklar) placerades på en aluminiumkolonn med hjälp av självhäftande koltejp. Guldpläterades på proverna med hjälp av en Q150T-sputterbeläggare och ett 5 nm Au-lager deponerades på proverna. Detta förbättrar processeffektiviteten vid användning av låga spänningar och ger finkornig kallsputtring. En Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elementanalysator användes för elementanalys. En Malvern (Worcestershire, Storbritannien) Mastersizer 2000 partikelstorleksanalysator användes för att erhålla partikelstorleksfördelningen. Nakna kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar (5 mg vardera) dispergerades i 5 ml isopropanol, sonikerades i 10 minuter, vortexbehandlades i 5 minuter och placerades på Mastersizerns optiska bänk. Termogravimetrisk analys utfördes med en hastighet av 5 °C per minut över ett temperaturintervall på 30 till 800 °C.
Glasfodrade kolonner av rostfritt stål med smal borrning med dimensionerna (100 × 1,8 mm innerdiameter) packades med hjälp av uppslamningsmetoden, med tillämpning av samma procedur som användes i Ref. 31. En kolonn av rostfritt stål (glasfodrad, 100 × 1,8 mm innerdiameter) med en utloppskoppling innehållande en 1 µm fritta anslöts till en slampackare (Alltech Deerfield, IL, USA). Framställ en stationär fas-slam genom att suspendera 150 mg stationär fas i 1,2 ml metanol och skicka den till lagringskolonnen. Metanol användes som slamlösningsmedel såväl som drivlösningsmedel. Fyll kolonnen sekventiellt genom att applicera tryck på 100 MP i 10 minuter, 80 MP i 15 minuter och 60 MP i 30 minuter. Under packning applicerades mekanisk vibration med två GC-kolonnskakare (Alltech, Deerfield, IL, USA) för att säkerställa jämn packning av kolonnen. Stäng slampackaren och släpp trycket långsamt för att förhindra skador i kolonnen. Koppla bort kolonnen från slampackningsenheten och anslut en annan koppling till inloppet och till LC-systemet för att kontrollera dess prestanda.
En LC-pump (10AD Shimadzu, Japan), injektor (Valco (USA) C14 W.05) med 50 nL injektionsslinga, membranavgasare (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS-kapillärfönster konstruerades. Speciell µLC-detektor (UV-2075) och glasfodrade mikrokolonner konstruerades. Mycket smala och korta anslutningsslangar användes för att minimera effekten av extra kolumnbandsbreddning. Efter paketering installerades kapillärer (50 μm id 365) och reducerande unionskapillärer (50 μm) vid 1/16″-utloppet från den reducerande unionen. Datainsamling och kromatografisk bearbetning utfördes med hjälp av Multichro 2000-programvara. Övervakning vid 254 nm. Analyter testades med avseende på UV-absorbans. Kromatografiska data analyserades med OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin från humant serum, frystorkat pulver, ≥ 96 % (agarosgelelektrofores) 3 mg blandat med trypsin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 ml) och 0,2 M ammoniumbikarbonat (1 ml). Lösningen omrördes i 10 minuter och hölls i ett vattenbad vid 37 °C i 6 timmar, sedan släcktes lösningen med 1 ml 0,1 % TFA. Filtrera lösningen och förvara vid högst 4 °C.
Separation av peptidblandningar och HSA-trypsin-digereringar utvärderades separat på PMP-kolonner. Kontrollera separationen av peptidblandningen och trypsin-digereringen av HSA med PMP-kolonnen och jämför resultaten med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen. Det teoretiska plattantalet beräknas enligt följande:
SEM-bilder av bara kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar visas i FIG. 2. SEM-bilder av bara kiseldioxidpartiklar (A, B) visar att dessa partiklar, till skillnad från våra tidigare studier, är sfäriska, vilket innebär att partiklarna är förlängda eller har oregelbunden symmetri. Ytan på de ligandbundna kiseldioxidpartiklarna (C, D) är jämnare än den på de bara kiseldioxidpartiklarna, vilket kan bero på beläggningen av polystyrenkedjor på ytan av kiseldioxidpartiklarna.
Svepelektronmikroskopbilder av bara kiseldioxidpartiklar (A, B) och ligandbundna kiseldioxidpartiklar (C, D).
Partikelstorleksfördelningarna för bara kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar visas i figur 3(A). Volymbaserade partikelstorleksfördelningskurvor visade att storleken på kiseldioxidpartiklarna ökade efter kemisk modifiering (figur 3A). Partikelstorleksfördelningsdata för kiseldioxidpartiklarna från den aktuella studien och den tidigare studien jämförs i tabell 1(A). Den volymbaserade partikelstorleken, d(0,5), för PMP är 3,36 μm, jämfört med vår tidigare studie med ett ad(0,5)-värde på 3,05 μm (polystyrenbundna kiseldioxidpartiklar)34. Denna sats hade en smalare partikelstorleksfördelning jämfört med vår tidigare studie på grund av de varierande förhållandena mellan PEG, urea, TMOS och ättiksyra i reaktionsblandningen. Partikelstorleken för PMP-fasen är något större än för den polystyrenbundna kiseldioxidpartikelfasen som vi tidigare studerat. Detta innebär att ytfunktionalisering av kiseldioxidpartiklar med styren endast avsatte ett polystyrenlager (0,97 μm) på kiseldioxidytan, medan lagertjockleken i PMP-fasen var 1,38 µm.
Partikelstorleksfördelning (A) och porstorleksfördelning (B) för bara kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar.
Porstorleken, porvolymen och ytan för kiseldioxidpartiklarna i den aktuella studien anges i tabell 1(B). PSD-profilerna för bara kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar visas i figur 3(B). Resultaten är jämförbara med vår tidigare studie. Porstorlekarna för de bara och ligandbundna kiseldioxidpartiklarna är 310 respektive 241, vilket indikerar att porstorleken minskar med 69 efter kemisk modifiering, såsom visas i tabell 1(B), och förändringen av kurvan visas i figur 3(B). På liknande sätt minskade porvolymen för kiseldioxidpartiklarna från 0,67 till 0,58 cm3/g efter kemisk modifiering. Den specifika ytan för de för närvarande studerade kiseldioxidpartiklarna är 116 m2/g, vilket är jämförbart med vår tidigare studie (124 m2/g). Som visas i tabell 1(B) minskade även kiseldioxidpartiklarnas yta (m2/g) från 116 m2/g till 105 m2/g efter kemisk modifiering. modifiering.
Resultaten av elementaranalysen av den stationära fasen visas i tabell 2. Kolhalten i den nuvarande stationära fasen är 6,35 %, vilket är lägre än kolhalten i vår tidigare studie (polystyrenbundna kiseldioxidpartiklar, 7,93 %35 respektive 10,21 %)42. Kolhalten i den nuvarande stationära fasen är låg, eftersom vid framställningen av den nuvarande SP, förutom styren, användes vissa polära ligander såsom fenylmaleimid-metylvinylisocyanat (PCMP) och 4-hydroxi-TEMPO. Kvävehalten i viktprocenten i den nuvarande stationära fasen är 2,21 %, jämfört med 0,1735 respektive 0,85 viktprocent kväve i tidigare studier. Detta innebär att viktprocenten kväve är högre i den nuvarande stationära fasen på grund av fenylmaleimid. På liknande sätt var kolhalten i produkterna (4) och (5) 2,7 % respektive 2,9 %, medan kolhalten i slutprodukten (6) var 6,35 %, såsom visas i tabell 2. Viktförlusten kontrollerades med PMP i stationär fas, och TGA-kurvan visas i figur 4. TGA-kurvan visar en viktförlust på 8,6 %, vilket stämmer väl överens med kolmängden (6,35 %) eftersom liganderna inte bara innehåller C utan även N, O och H.
Fenylmaleimid-metylvinylisocyanatliganden valdes för ytmodifiering av kiseldioxidpartiklar eftersom den har polära fenylmaleimidgrupper och vinylisocyanatgrupper. Vinylisocyanatgrupper kan reagera vidare med styren genom levande radikalpolymerisation. Det andra skälet är att infoga en grupp som har en måttlig interaktion med analyten och ingen stark elektrostatisk interaktion mellan analyten och den stationära fasen, eftersom fenylmaleimiddelen inte har någon virtuell laddning vid normalt pH. Polariteten hos den stationära fasen kan kontrolleras av den optimala mängden styren och reaktionstiden för fri radikalpolymerisation. Det sista steget i reaktionen (fri radikalpolymerisation) är kritiskt och kan ändra polariteten hos den stationära fasen. Elementaranalys utfördes för att kontrollera kolmängden i dessa stationära faser. Det observerades att ökad mängd styren och reaktionstiden ökade kolmängden i den stationära fasen och vice versa. SP:er framställda med olika koncentrationer av styren har olika kolmängder. Ladda återigen dessa stationära faser i kolonner av rostfritt stål och kontrollera deras kromatografiska prestanda (selektivitet, upplösning, N2). värde, etc.). Baserat på dessa experiment valdes en optimerad formulering för att framställa den stationära PMP-fasen för att säkerställa kontrollerad polaritet och god analytretention.
Fem peptidblandningar (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucinenkefalin) utvärderades också med användning av en PMP-kolonn med en mobil fas; 60/40 (v/v) acetonitril/vatten (0,1 % TFA) vid en flödeshastighet på 80 μL/min. Under optimala elueringsförhållanden är det teoretiska plattantalet (N) per kolonn (100 × 1,8 mm id) 20 000 ± 100 (200 000 plattor/m²). Tabell 3 visar N-värdena för de tre PMP-kolonnerna och kromatogrammen visas i figur 5A. Snabb analys på en PMP-kolonn vid hög flödeshastighet (700 μL/min), fem peptider eluerades inom en minut, N-värdena var mycket bra, 13 500 ± 330 per kolonn (100 × 1,8 mm id), motsvarande 135 000 plattor/m² (figur 5B). Tre identiskt stora kolonner (100 × 1,8 mm id) packades med tre olika partier av PMP stationär fas för att kontrollera reproducerbarheten. Analytkoncentrationen för varje kolonn registrerades med optimala elueringsförhållanden och antalet teoretiska plattor N och retentionstid för att separera samma testblandning på varje kolonn. Reproducerbarhetsdata för PMP-kolonnerna visas i tabell 4. Reproducerbarheten för PMP-kolonnen korrelerar väl med mycket låga %RSD-värden, såsom visas i tabell 3.
Separation av peptidblandningen på PMP-kolonn (B) och Ascentis Express RP-Amid-kolonn (A); mobil fas 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-kolonnens dimensioner (100 × 1,8 mm innerdiameter); analytisk Elueringsordning för föreningarna: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) och 5 (leucin) syraenkefalin)).
En PMP-kolonn (100 × 1,8 mm i diameter) utvärderades för separation av tryptiska digestioner av humant serumalbumin i högpresterande vätskekromatografi. Kromatogrammet i figur 6 visar att provet är väl separerat och upplösningen är mycket god. HSA-digestioner analyserades med en flödeshastighet på 100 µL/min, mobil fas 70/30 acetonitril/vatten och 0,1 % TFA. Som visas i kromatogrammet (figur 6) har HSA-digereringen delats upp i 17 toppar motsvarande 17 peptider. Separationseffektiviteten för varje topp i HSA-digereringen beräknades och värdena anges i tabell 5.
En tryptisk digest av HSA (100 × 1,8 mm id) separerades på en PMP-kolonn; flödeshastighet (100 µL/min), mobil fas 60/40 acetonitril/vatten med 0,1 % TFA.
där L är kolonnlängden, η är viskositeten hos den mobila fasen, ΔP är kolonnens mottryck och u är den linjära hastigheten hos den mobila fasen. PMP-kolonnens permeabilitet var 2,5 × 10⁻⁴ m², flödeshastigheten var 25 μL/min och 60/40 v/v ACN/vatten användes. PMP-kolonnens permeabilitet (100 × 1,8 mm innerdiameter) var lik den i vår tidigare studie Ref. 34. Kolonnens permeabilitet packad med ytligt porösa partiklar är: 1,7 × 10⁻⁴ för 1,3 μm partiklar, 3,1 × 10⁻⁴ för 1,7 μm partiklar, 5,2 × 10⁻⁴ och 2,5 × 10⁻⁴ m² för 2,6 μm partiklar. För 5 μm partiklar 43 är därför PMP-fasens permeabilitet lik den för 5 μm kärna-skalpartiklar.
där Wx är vikten av kolonnen packad med kloroform, Wy är vikten av kolonnen packad med metanol och ρ är lösningsmedlets densitet. Densiteterna för metanol (ρ = 0,7866) och kloroform (ρ = 1,484). Den totala porositeten för SILICA PARTICLES-C18-kolonnerna (100 × 1,8 mm id) 34 och C18-Urea-kolonnerna 31 som vi tidigare studerat var 0,63 respektive 0,55. Detta innebär att närvaron av ureeligander minskar permeabiliteten för den stationära fasen. Å andra sidan är den totala porositeten för PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) 0,60. Permeabiliteten för PMP-kolonner är lägre än för kolonner packade med C18-bundna kiseldioxidpartiklar eftersom C18-liganderna i stationära faser av C18-typ är bundna till kiseldioxidpartiklarna som linjära kedjor, medan det i stationära faser av polystyrentyp är ett relativt tjockt polymerlager. bildas runt den. I ett typiskt experiment beräknas kolonnens porositet som:
Figur 7A, B visar PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm innerdiameter) och Ascentis Express RP-Amid-kolonnen (100 × 1,8 mm innerdiameter) med samma elueringsförhållanden (dvs. 60/40 ACN/H2O och 0,1 % TFA) som i van Deemter-diagrammet. Utvalda peptidblandningar (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkefalin) framställdes i 20 µL/. Minsta flödeshastighet för båda kolonnerna är 800 µL/min. Minsta HETP-värden vid optimal flödeshastighet (80 µL/min) för PMP-kolonnen och Ascentis Express RP-Amide-kolonnen var 2,6 µm respektive 3,9 µm. HETP-värdena indikerar att separationseffektiviteten för PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm innerdiameter) är mycket bättre än den kommersiellt tillgängliga Ascentis Express RP-Amide-kolonnen (100 × 1,8 mm innerdiameter). Van Deemter-diagrammet i figur 7(A) visar att minskningen av N-värdet med ökande flöde inte är signifikant jämfört med vår tidigare studie. Den högre separationseffektiviteten för PMP-kolonnen (100 × 1,8 mm id) jämfört med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen är baserad på förbättringar i partikelform, storlek och komplexa kolonnpackningsprocedurer som används i det aktuella arbetet34.
(A) van Deemter-diagram (HETP kontra linjär hastighet i mobil fas) erhållet med en PMP-kolonn (100 × 1,8 mm innerdiameter) i 60/40 ACN/H2O med 0,1 % TFA. (B) van Deemter-diagram (HETP kontra linjär hastighet i mobil fas) erhållet med en Ascentis Express RP-Amide-kolonn (100 × 1,8 mm innerdiameter) i 60/40 ACN/H2O med 0,1 % TFA.
En polärt inbäddad stationär polystyrenfas framställdes och utvärderades för separation av syntetiska peptidblandningar och trypsin-digereringar av humant serumalbumin (HAS) i högpresterande vätskekromatografi. Den kromatografiska prestandan hos PMP-kolonner för peptidblandningar är utmärkt vad gäller separationseffektivitet och upplösning. Den förbättrade separationsprestandan hos PMP-kolonner beror på en mängd olika orsaker, såsom partikelstorlek och porstorlek hos kiseldioxidpartiklarna, kontrollerad syntes av den stationära fasen och komplex kolonnpackning. Förutom hög separationseffektivitet är lågt kolonnmottryck vid höga flödeshastigheter en annan fördel med denna stationära fas. PMP-kolonner uppvisar god reproducerbarhet och kan användas för analys av peptidblandningar och trypsin-digerering av olika proteiner. Vi avser att använda denna kolonn för separation av naturprodukter, bioaktiva föreningar från medicinalväxter och svampextrakt i vätskekromatografi. I framtiden kommer PMP-kolonner också att utvärderas för separation av proteiner och monoklonala antikroppar.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Forskning om peptidseparationssystem med omvänd faskromatografi Del I: Utveckling av ett kolonnkarakteriseringsprotokoll. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Förbättrade aktiva peptider utformade för behandling av infektionssjukdomar. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetiska terapeutiska peptider: vetenskap och marknaden. läkemedelsutveckling. 15 (1-2) idag, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avancerad proteomisk vätskekromatografi. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Avancerad vätskekromatografi-masspektrometri möjliggör införlivande av brett riktade metabolomik och proteomik. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC:s roll i läkemedelsutveckling. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grundläggande och praktiska aspekter av ultrahögtrycksvätskekromatografi för snabba separationer. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Tillämpning av ultrahögpresterande vätskekromatografi vid läkemedelsutveckling. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolitiska makroporösa hydrogeler framställda från olja-i-vatten-emulsioner med hög intern fashalt för effektiv rening av enterovirus. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vätskekromatografins roll i proteomik. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Framväxande trender inom omvänd fas vätskekromatografiseparationer av terapeutiska peptider och proteiner: teori och tillämpningar. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tvådimensionell separation av peptider med hjälp av ett RP-RP-HPLC-system med olika pH-värden i den första och andra separationsdimensionen. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al.Massöverföringsegenskaperna och den kinetiska prestandan hos högeffektiva kromatografiska kolonner packade med C18 sub-2 μm helt och ytligt porösa partiklar undersöktes. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Senaste trender och analytiska utmaningar inom isolering, identifiering och validering av växtbioaktiva peptider. anus. biological anus. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Det proteomiska landskapet i livets rike. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Nedströmsbearbetning av terapeutiska peptider genom preparativ vätskekromatografi. Molecule (Basel, Schweiz) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode kromatografi och dess tillämpning på biopolymerer. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligander för blandad proteinkromatografi: princip, karakterisering och design. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).