Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSSకు పరిమిత మద్దతు ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్‌డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను ఆఫ్ చేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, మద్దతు కొనసాగేలా చూసేందుకు, మేము ఈ సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా ప్రదర్శిస్తాము.
స్థూలరంధ్రాల కణాలను పొందడానికి, కొన్ని మార్పులతో సోల్-జెల్ పద్ధతి ద్వారా రంధ్రయుత సిలికా కణాలను తయారు చేశారు. ఈ కణాలను, పాలీస్టైరీన్ యొక్క N-ఫినైల్‌మాలిమైడ్ ఇంటర్‌కలేషన్ (PMP) స్థిర దశను తయారు చేయడానికి, N-ఫినైల్‌మాలిమైడ్-మిథైల్‌వినైల్‌ఐసోసైనెట్ (PMI) మరియు స్టైరీన్‌తో రివర్సిబుల్ అడిషన్ ఫ్రాగ్మెంటేషన్ చైన్ ట్రాన్స్‌ఫర్ (RAFT) పాలిమరైజేషన్ ద్వారా డెరివటైజ్ చేశారు. సన్నని-బోర్ స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాలమ్‌లను (100 × 1.8 మిమీ id) స్లర్రీ ప్యాకింగ్ ద్వారా నింపారు. ఐదు పెప్టైడ్‌లతో (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ల్యూసిన్ ఎన్‌కెఫాలిన్) కూడిన పెప్టైడ్ మిశ్రమం యొక్క PMP కాలమ్ విభజనను (క్రోమాటోగ్రాఫిక్ పనితీరు) మరియు హ్యూమన్ సీరం అల్బుమిన్ (HAS) యొక్క ట్రిప్సిన్ జీర్ణక్రియను మూల్యాంకనం చేశారు. సరైన ఎల్యూషన్ పరిస్థితులలో, పెప్టైడ్ మిశ్రమం యొక్క సైద్ధాంతిక ప్లేట్ కౌంట్ ఇంత ఎక్కువగా ఉంటుంది. 280,000 ప్లేట్లు/మీ². అభివృద్ధి చేయబడిన కాలమ్ యొక్క విభజన పనితీరును వాణిజ్యపరమైన అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్‌తో పోల్చినప్పుడు, విభజన సామర్థ్యం మరియు రిజల్యూషన్ పరంగా PMP కాలమ్ యొక్క విభజన పనితీరు వాణిజ్యపరమైన కాలమ్ కంటే ఉన్నతంగా ఉన్నట్లు గమనించబడింది.
ఇటీవలి సంవత్సరాలలో, బయోఫార్మాస్యూటికల్ పరిశ్రమ మార్కెట్ వాటాలో గణనీయమైన పెరుగుదలతో విస్తరిస్తున్న ప్రపంచ మార్కెట్‌గా మారింది. బయోఫార్మాస్యూటికల్ పరిశ్రమ యొక్క విపరీతమైన వృద్ధితో¹,²,³, పెప్టైడ్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌ల విశ్లేషణకు అధిక ప్రాధాన్యత ఏర్పడింది. లక్షిత పెప్టైడ్‌తో పాటు, పెప్టైడ్ సంశ్లేషణ సమయంలో అనేక మలినాలు ఉత్పత్తి అవుతాయి, అందువల్ల కావలసిన స్వచ్ఛత గల పెప్టైడ్‌లను పొందడానికి క్రోమాటోగ్రాఫిక్ శుద్ధీకరణ అవసరం. ఒకే నమూనాలో గుర్తించదగిన జాతులు అధిక సంఖ్యలో ఉండటం వలన, శరీర ద్రవాలు, కణజాలాలు మరియు కణాలలో ప్రోటీన్‌ల విశ్లేషణ మరియు లక్షణీకరణ అత్యంత సవాలుతో కూడుకున్న పని. పెప్టైడ్ మరియు ప్రోటీన్ సీక్వెన్సింగ్ కోసం మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ఒక సమర్థవంతమైన సాధనం అయినప్పటికీ, అటువంటి నమూనాలను ఒకేసారి మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌లోకి పంపితే, విభజన ఆదర్శవంతంగా ఉండదు. MS విశ్లేషణకు ముందు లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (LC) విభజనలను అమలు చేయడం ద్వారా ఈ సమస్యను తగ్గించవచ్చు, ఇది ఒక నిర్దిష్ట సమయంలో మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌లోకి ప్రవేశించే విశ్లేష్యాల సంఖ్యను తగ్గిస్తుంది⁴,⁵,⁶. అదనంగా, ద్రవ దశ విభజన సమయంలో, విశ్లేష్యాలను ఇరుకైన ప్రాంతాలలో కేంద్రీకరించవచ్చు, తద్వారా ఈ విశ్లేష్యాలను గాఢతరం చేసి MS గుర్తింపు సున్నితత్వాన్ని మెరుగుపరచవచ్చు. గత దశాబ్దంలో క్రోమాటోగ్రఫీ (LC) గణనీయంగా అభివృద్ధి చెందింది మరియు ప్రోటీయోమిక్ విశ్లేషణలో ఒక ప్రముఖ సాంకేతికతగా మారింది7,8,9,10.
రివర్స్డ్-ఫేజ్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (RP-LC) అనేది ఆక్టాడెసిల్-మాడిఫైడ్ సిలికా (ODS)ను స్థిర దశగా ఉపయోగించి పెప్టైడ్ మిశ్రమాల శుద్ధీకరణ మరియు విభజన కోసం విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది11,12,13.అయితే, RP స్థిర దశలు వాటి సంక్లిష్ట నిర్మాణం మరియు ఆంఫిఫిలిక్ స్వభావం కారణంగా పెప్టైడ్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌లను సంతృప్తికరంగా వేరు చేయవు14,15.అందువల్ల, ఈ విశ్లేష్యాలతో సంకర్షణ చెందడానికి మరియు వాటిని నిలుపుకోవడానికి ధ్రువ మరియు అధ్రువ భాగాలతో కూడిన పెప్టైడ్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌లను విశ్లేషించడానికి ప్రత్యేకంగా రూపొందించిన స్థిర దశలు అవసరం16.మల్టీమోడల్ పరస్పర చర్యలను అందించే మిక్స్‌డ్-మోడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ, పెప్టైడ్‌లు, ప్రోటీన్‌లు మరియు ఇతర సంక్లిష్ట మిశ్రమాల విభజన కోసం RP-LCకి ప్రత్యామ్నాయంగా ఉంటుంది.అనేక మిక్స్‌డ్-మోడ్ స్థిర దశలు తయారు చేయబడ్డాయి, మరియు ఈ దశలతో నింపబడిన కాలమ్‌లు పెప్టైడ్ మరియు ప్రోటీన్ విభజనల కోసం ఉపయోగించబడ్డాయి17,18,19,20,21.మిక్స్‌డ్-మోడ్ స్థిర దశలు (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, పోలార్ ఇంటర్‌కలేషన్/RPLC) అనేవి పోలార్ మరియు నాన్-పోలార్ గ్రూపులు రెండూ ఉండటం వల్ల పెప్టైడ్ మరియు ప్రోటీన్ వేర్పాటుకు అనుకూలంగా ఉంటాయి22,23,24,25,26,27,28. అదేవిధంగా, సమయోజనీయ బంధం గల పోలార్ గ్రూపులతో కూడిన పోలార్ ఇంటర్‌కలేటింగ్ స్టేషనరీ ఫేజ్‌లు పోలార్ మరియు నాన్-పోలార్ ఎనలైట్‌ల కోసం మంచి వేర్పాటు శక్తిని మరియు ప్రత్యేకమైన సెలెక్టివిటీని చూపుతాయి, ఎందుకంటే వేర్పాటు అనేది ఎనలైట్ మరియు స్టేషనరీ ఫేజ్ మధ్య పరస్పర చర్యపై ఆధారపడి ఉంటుంది. మల్టీమోడల్ ఇంటరాక్షన్స్ 29, 30, 31, 32. ఇటీవల, జాంగ్ మరియు ఇతరులు. 30 ఒక డోడెసిల్-టెర్మినేటెడ్ పాలిఅమైన్ స్థిర దశను తయారుచేసి, హైడ్రోకార్బన్‌లు, యాంటీడిప్రెసెంట్లు, ఫ్లేవనాయిడ్లు, న్యూక్లియోసైడ్‌లు, ఈస్ట్రోజెన్‌లు మరియు అనేక ఇతర విశ్లేష్యాలను విజయవంతంగా వేరు చేసింది. పోలార్ ఇంటర్‌కలేటర్‌లో పోలార్ మరియు నాన్-పోలార్ గ్రూపులు రెండూ ఉంటాయి, కాబట్టి దీనిని హైడ్రోఫోబిక్ మరియు హైడ్రోఫిలిక్ భాగాలను కలిగి ఉన్న పెప్టైడ్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌లను వేరు చేయడానికి ఉపయోగించవచ్చు. పోలార్-ఎంబెడెడ్ కాలమ్‌లు (ఉదాహరణకు, అమైడ్-ఎంబెడెడ్ C18 కాలమ్‌లు) అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్‌లు అనే వాణిజ్య నామంతో వాణిజ్యపరంగా అందుబాటులో ఉన్నాయి, కానీ ఈ కాలమ్‌లను అమైన్ 33 విశ్లేషణకు మాత్రమే ఉపయోగిస్తారు.
ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, HSA యొక్క పెప్టైడ్‌లు మరియు ట్రిప్సిన్ డైజెస్ట్‌లను వేరు చేయడానికి ఒక పోలార్-ఎంబెడెడ్ స్టేషనరీ ఫేజ్ (N-ఫినైల్‌మేలిమైడ్-ఎంబెడెడ్ పాలీస్టైరిన్) తయారు చేయబడింది మరియు మూల్యాంకనం చేయబడింది. ఈ స్టేషనరీ ఫేజ్‌ను ఈ క్రింది వ్యూహాన్ని ఉపయోగించి తయారు చేశారు. మా మునుపటి ప్రచురణలో ఇచ్చిన విధానం ప్రకారం, తయారీ ప్రోటోకాల్‌కు కొన్ని మార్పులతో పోరస్ సిలికా కణాలను తయారు చేశారు. పెద్ద రంధ్రాల పరిమాణం గల సిలికా కణాలను తయారు చేయడానికి యూరియా, పాలిఇథిలీన్ గ్లైకాల్ (PEG), TMOS, నీరు మరియు ఎసిటిక్ యాసిడ్ నిష్పత్తిని సర్దుబాటు చేశారు. రెండవది, ఒక కొత్త లిగాండ్, ఫినైల్‌మేలిమైడ్-మిథైల్ వినైల్ ఐసోసైనెట్‌ను సంశ్లేషణ చేసి, పోలార్ ఎంబెడెడ్ స్టేషనరీ ఫేజ్‌ను తయారు చేయడానికి సిలికా కణాలను డెరివటైజ్ చేయడానికి ఉపయోగించారు. ఫలితంగా వచ్చిన స్టేషనరీ ఫేజ్‌ను ఆప్టిమైజ్ చేసిన ప్యాకింగ్ స్కీమ్‌ను ఉపయోగించి ఒక స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) లో ప్యాక్ చేశారు. కాలమ్ లోపల ఒక సజాతీయ బెడ్ ఏర్పడేలా చూసుకోవడానికి కాలమ్ ప్యాకింగ్‌కు యాంత్రిక కంపనం సహాయపడుతుంది. ఐదు పెప్టైడ్‌లతో కూడిన పెప్టైడ్ మిశ్రమాల ప్యాక్డ్ కాలమ్ విభజనను మూల్యాంకనం చేయండి; (గ్లై-టైర్, గ్లై-ల్యూ-టైర్, గ్లై-గ్లై-టైర్-ఆర్గ్, టైర్-ఐల్-గ్లై-సెర్-ఆర్గ్, ల్యూసిన్ ఎంకెఫాలిన్) మరియు హ్యూమన్ సీరం ఆల్బుమిన్ (HAS) యొక్క ట్రిప్సిన్ డైజెస్ట్. పెప్టైడ్ మిశ్రమం మరియు HSA యొక్క ట్రిప్సిన్ డైజెస్ట్ మంచి రిజల్యూషన్ మరియు సామర్థ్యంతో వేరుపడటం గమనించబడింది. PMP కాలమ్ యొక్క వేరుచేసే పనితీరును అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్‌తో పోల్చారు. పెప్టైడ్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌లు రెండూ PMP కాలమ్‌పై బాగా వేరు చేయబడి, సమర్థవంతంగా ఉన్నట్లు గమనించబడింది, ఇది అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్ కంటే ఎక్కువ సమర్థవంతంగా ఉంది.
PEG (పాలిఇథిలీన్ గ్లైకాల్), యూరియా, ఎసిటిక్ యాసిడ్, ట్రైమెథాక్సీ ఆర్థోసిలికేట్ (TMOS), ట్రైమిథైల్ క్లోరోసిలేన్ (TMCS), ట్రిప్సిన్, హ్యూమన్ సీరం ఆల్బుమిన్ (HSA), అమ్మోనియం క్లోరైడ్, యూరియా, హెక్సేన్ మిథైల్ డైసిలాజేన్ (HMDS), మెథాక్రైలోయిల్ క్లోరైడ్ (MC), స్టైరీన్, 4-హైడ్రాక్సీ-టెంపో, బెంజాయిల్ పెరాక్సైడ్ (BPO), HPLC గ్రేడ్ ఎసిటోనైట్రైల్ (ACN), మిథనాల్, 2-ప్రొపనాల్, మరియు ఎసిటోన్ లను సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ (సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) నుండి కొనుగోలు చేయడం జరిగింది.
యూరియా (8 గ్రా), పాలిఇథిలీన్ గ్లైకాల్ (8 గ్రా), మరియు 8 మి.లీ 0.01 N ఎసిటిక్ ఆమ్లం మిశ్రమాన్ని 10 నిమిషాల పాటు కలిపి, ఆ తర్వాత అతి శీతల పరిస్థితులలో దానికి 24 మి.లీ TMOSను జోడించారు. ఈ చర్య మిశ్రమాన్ని ఒక స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ ఆటోక్లేవ్‌లో 40°C వద్ద 6 గంటలు, ఆ తర్వాత 120°C వద్ద 8 గంటలు వేడి చేశారు. నీటిని వంపేసి, మిగిలిన పదార్థాన్ని 70°C వద్ద 12 గంటల పాటు ఆరబెట్టారు. ఆరబెట్టిన మెత్తని ద్రవ్యరాశిని ఒక ఓవెన్‌లో నునుపుగా రుబ్బి, 550°C వద్ద 12 గంటల పాటు కాల్చారు. కణ పరిమాణం, రంధ్రాల పరిమాణం మరియు ఉపరితల వైశాల్యంలో పునరుత్పత్తిని పరిశీలించడానికి మూడు బ్యాచ్‌లను తయారు చేసి, వాటి లక్షణాలను నిర్ధారించారు.
ముందుగా సంశ్లేషణ చేయబడిన లిగాండ్ ఫినైల్‌మేలిమైడ్-మిథైల్‌వినైల్‌ఐసోసయనేట్ (PCMP)తో సిలికా కణాల ఉపరితల మార్పు చేసి, ఆ తర్వాత స్టైరీన్‌తో రేడియల్ పాలిమరైజేషన్ చేయడం ద్వారా, ధ్రువ సమూహాన్ని కలిగి ఉన్న ఒక సమ్మేళనం తయారు చేయబడింది. సముదాయాలు మరియు పాలీస్టైరీన్ గొలుసుల కోసం స్థిర దశ. తయారీ ప్రక్రియ క్రింద వివరించబడింది.
N-ఫినైల్‌మలేమైడ్ (200 mg) మరియు మిథైల్ వినైల్ ఐసోసైనెట్ (100 mg) లను పొడి టోలుయీన్‌లో కరిగించి, ఫినైల్‌మలేమైడ్-మిథైల్ వినైల్ ఐసోసైనెట్ కోపాలిమర్ (PMCP) ను తయారు చేయడానికి రియాక్షన్ ఫ్లాస్క్‌కు 0.1 mL 2,2′-అజోఐసోబ్యూటిరోనైట్రైల్ (AIBN) ను కలిపారు. ఈ మిశ్రమాన్ని 60°C వద్ద 3 గంటల పాటు వేడి చేసి, వడపోసి, ఓవెన్‌లో 40°C వద్ద 3 గంటల పాటు ఆరబెట్టారు.
ఎండబెట్టిన సిలికా కణాలను (2 గ్రా) పొడి టోలుయీన్ (100 మి.లీ)లో కలిపి, 500 మి.లీ గుండ్రని అడుగు ఉన్న ఫ్లాస్క్‌లో 10 నిమిషాల పాటు కలియబెట్టి, సోనికేట్ చేశారు. PMCP (10 మి.గ్రా)ను టోలుయీన్‌లో కరిగించి, డ్రాపింగ్ ఫన్నల్ ద్వారా చుక్కల చుక్కలుగా రియాక్షన్ ఫ్లాస్క్‌కు చేర్చారు. ఈ మిశ్రమాన్ని 100°C వద్ద 8 గంటల పాటు రిఫ్లక్స్ చేసి, వడపోసి, అసిటోన్‌తో కడిగి, 60°C వద్ద 3 గంటల పాటు ఆరబెట్టారు. ఆ తర్వాత, PMCP-బంధిత సిలికా కణాలను (100 గ్రా) టోలుయీన్ (200 మి.లీ)లో కరిగించి, ఉత్ప్రేరకంగా 100 µL డైబ్యూటిల్టిన్ డైలారేట్ సమక్షంలో 4-హైడ్రాక్సీ-టెంపో (2 మి.లీ)ను చేర్చారు. ఈ మిశ్రమాన్ని 50°C వద్ద 8 గంటల పాటు కలియబెట్టి, వడపోసి, 50°C వద్ద 3 గంటల పాటు ఆరబెట్టారు.
స్టైరీన్ (1 mL), బెంజోయిల్ పెరాక్సైడ్ BPO (0.5 mL), మరియు TEMPO-PMCP-జతపరచిన సిలికా కణాలను (1.5 g) టోలుయీన్‌లో కలిపి, నైట్రోజన్‌తో శుద్ధి చేశారు. స్టైరీన్ పాలిమరైజేషన్‌ను 100°C వద్ద 12 గంటల పాటు నిర్వహించారు. ఫలితంగా వచ్చిన ఉత్పత్తిని మెథనాల్‌తో కడిగి, 60°C వద్ద రాత్రంతా ఆరబెట్టారు. మొత్తం చర్య పథకాన్ని పటం 1లో చూపించారు.
10-3 టార్ కంటే తక్కువ అవశేష పీడనాన్ని పొందడానికి నమూనాలను 393 K వద్ద 1 గంట పాటు డీగ్యాస్ చేశారు. మొత్తం రంధ్రాల ఘనపరిమాణాన్ని నిర్ధారించడానికి P/P0 = 0.99 సాపేక్ష పీడనం వద్ద శోషించబడిన N2 పరిమాణాన్ని ఉపయోగించారు. బేర్ మరియు లిగాండ్-బాండెడ్ సిలికా కణాల స్వరూపాన్ని స్కానింగ్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (హిటాచీ హై టెక్నాలజీస్, టోక్యో, జపాన్)తో పరిశీలించారు. ఎండిన నమూనాలను (బేర్ సిలికా మరియు లిగాండ్-బాండెడ్ సిలికా కణాలు) అంటుకునే కార్బన్ టేప్‌ను ఉపయోగించి ఒక అల్యూమినియం కాలమ్‌పై ఉంచారు. Q150T స్పుటర్ కోటర్‌ను ఉపయోగించి నమూనాలపై బంగారాన్ని పూత పూశారు, మరియు నమూనాలపై 5 nm Au పొరను నిక్షేపించారు. ఇది తక్కువ వోల్టేజ్‌లను ఉపయోగించి ప్రక్రియ సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరుస్తుంది మరియు సూక్ష్మ కణాలతో కూడిన కోల్డ్ స్పుటరింగ్‌ను అందిస్తుంది. మూలకాల విశ్లేషణ కోసం థర్మో ఎలక్ట్రాన్ (వాల్తామ్, MA, USA) ఫ్లాష్ EA1112 ఎలిమెంటల్ ఎనలైజర్‌ను ఉపయోగించారు. కణ పరిమాణ పంపిణీని పొందడానికి మాల్వెర్న్ (వోర్సెస్టర్‌షైర్, UK) మాస్టర్‌సైజర్ 2000 పార్టికల్ సైజ్ ఎనలైజర్‌ను ఉపయోగించారు. నగ్న సిలికా కణాలు మరియు లిగాండ్-బంధిత సిలికా కణాలను (ఒక్కొక్కటి 5 mg) 5 mL ఐసోప్రొపనాల్‌లో విక్షేపించి, 10 నిమిషాల పాటు సోనికేట్ చేసి, 5 నిమిషాల పాటు వోర్టెక్స్ చేసి, మాస్టర్‌సైజర్ యొక్క ఆప్టికల్ బెంచ్‌పై ఉంచారు. 30 నుండి 800 °C ఉష్ణోగ్రత పరిధిలో నిమిషానికి 5 °C చొప్పున థర్మోగ్రావిమెట్రిక్ విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది.
రిఫరెన్స్‌లో ఉపయోగించిన అదే విధానాన్ని అనుసరించి, (100 × 1.8 మిమీ ఐడి) కొలతలు గల గ్లాస్-లైన్డ్ స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ నారో-బోర్ కాలమ్‌లను స్లర్రీ ప్యాకింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి ప్యాక్ చేశారు. 31. 1 µm ఫ్రిట్ కలిగిన అవుట్‌లెట్ ఫిట్టింగ్‌తో ఉన్న ఒక స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాలమ్ (గ్లాస్-లైన్డ్, 100 × 1.8 mm id) ఒక స్లర్రీ ప్యాకర్‌కు (ఆల్‌టెక్ డీర్‌ఫీల్డ్, IL, USA) అనుసంధానించబడింది. 1.2 mL మెథనాల్‌లో 150 mg స్టేషనరీ ఫేజ్‌ను సస్పెండ్ చేయడం ద్వారా ఒక స్టేషనరీ ఫేజ్ స్లర్రీని తయారు చేసి, దానిని స్టోరేజ్ కాలమ్‌కు పంపండి. మెథనాల్‌ను స్లర్రీ ద్రావణిగా మరియు ప్రొపెల్లింగ్ ద్రావణిగా కూడా ఉపయోగించారు. 10 నిమిషాల పాటు 100 MP, 15 నిమిషాల పాటు 80 MP, మరియు 30 నిమిషాల పాటు 60 MP పీడనాలను వర్తింపజేస్తూ కాలమ్‌ను వరుసగా నింపండి. ప్యాకింగ్ సమయంలో, కాలమ్ ఏకరీతిగా ప్యాక్ అయ్యేలా చూసుకోవడానికి రెండు GC కాలమ్ షేకర్లతో (ఆల్‌టెక్, డీర్‌ఫీల్డ్, IL, USA) యాంత్రిక కంపనాన్ని వర్తింపజేశారు. కాలమ్ లోపల ఎటువంటి నష్టం జరగకుండా నిరోధించడానికి స్లర్రీ ప్యాకర్‌ను మూసివేసి, పీడనాన్ని నెమ్మదిగా విడుదల చేయండి. స్లర్రీ ప్యాకింగ్ యూనిట్ నుండి కాలమ్‌ను డిస్‌కనెక్ట్ చేసి, కనెక్ట్ చేయండి. దాని పనితీరును తనిఖీ చేయడానికి ఇన్లెట్‌కు మరియు LC సిస్టమ్‌కు మరొక ఫిట్టింగ్.
ఒక LC పంప్ (10AD షిమాడ్జు, జపాన్), 50nL ఇంజెక్షన్ లూప్‌తో కూడిన ఇంజెక్టర్ (వాల్కో (USA) C14 W.05), మెంబ్రేన్ డీగ్యాసర్ (షిమాడ్జు DGU-14A), UV-VIS కేశనాళిక విండో, ప్రత్యేక µLC పరికర డిటెక్టర్ (UV-2075) మరియు గ్లాస్-లైన్డ్ మైక్రోకాలమ్‌లను ఉపయోగించి నిర్మించబడింది. అదనపు కాలమ్ బ్యాండ్ విస్తరణ ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి చాలా సన్నని మరియు పొట్టి కనెక్టింగ్ ట్యూబింగ్‌ను ఉపయోగించారు. ప్యాకేజింగ్ తర్వాత, కేశనాళికలు (50 μm id 365) మరియు రెడ్యూసింగ్ యూనియన్ కేశనాళికలు (50 μm) రెడ్యూసింగ్ యూనియన్ యొక్క 1/16″ అవుట్‌లెట్ వద్ద అమర్చబడ్డాయి. మల్టీక్రో 2000 సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి డేటా సేకరణ మరియు క్రోమాటోగ్రాఫిక్ ప్రాసెసింగ్ చేయబడ్డాయి. 254 nm వద్ద పర్యవేక్షణ జరిగింది. విశ్లేష్యకాలను UV శోషణ కోసం పరీక్షించారు. క్రోమాటోగ్రాఫిక్ డేటాను ఆరిజిన్‌ప్రో8 (నార్తాంప్టన్, MA) ద్వారా విశ్లేషించారు.
మానవ సీరం నుండి తీసిన అల్బుమిన్, ఘనీభవించి శుద్ధి చేసిన పొడి, ≥ 96% (అగరోస్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్) 3 mg ను ట్రిప్సిన్ (1.5 mg), 4.0 M యూరియా (1 mL), మరియు 0.2 M అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్ (1 mL) తో కలిపారు. ఈ ద్రావణాన్ని 10 నిమిషాల పాటు కలిపి, 37°C వద్ద వాటర్ బాత్‌లో 6 గంటల పాటు ఉంచారు, ఆ తర్వాత 1 mL 0.1% TFA తో చర్యను ఆపారు. ద్రావణాన్ని వడపోసి, 4 °C కంటే తక్కువ ఉష్ణోగ్రతలో నిల్వ చేయండి.
పెప్టైడ్ మిశ్రమాలు మరియు HSA ట్రిప్సిన్ డైజెస్ట్‌ల విభజనను PMP కాలమ్‌లపై విడివిడిగా మూల్యాంకనం చేశారు. PMP కాలమ్ ద్వారా పెప్టైడ్ మిశ్రమం మరియు HSA ట్రిప్సిన్ డైజెస్ట్ యొక్క విభజనను తనిఖీ చేసి, ఫలితాలను అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్‌తో పోల్చండి. సైద్ధాంతిక ప్లేట్ సంఖ్యను ఈ క్రింది విధంగా లెక్కిస్తారు:
కేవలం సిలికా కణాల మరియు లిగాండ్-బంధిత సిలికా కణాల SEM చిత్రాలు పటం 2లో చూపబడ్డాయి. కేవలం సిలికా కణాల (A, B) SEM చిత్రాలు, మా మునుపటి అధ్యయనాలకు విరుద్ధంగా, ఈ కణాలు గోళాకారంలో ఉన్నాయని, వాటిలో కణాలు పొడవుగా లేదా క్రమరహిత సౌష్టవాన్ని కలిగి ఉన్నాయని చూపిస్తున్నాయి. లిగాండ్-బంధిత సిలికా కణాల (C, D) ఉపరితలం కేవలం సిలికా కణాల ఉపరితలం కంటే నునుపుగా ఉంది, దీనికి కారణం సిలికా కణాల ఉపరితలంపై పాలీస్టైరిన్ గొలుసుల పూత ఉండవచ్చు.
కేవలం సిలికా కణాల (A, B) మరియు లిగాండ్-బంధిత సిలికా కణాల (C, D) స్కానింగ్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ చిత్రాలు.
కేవలం సిలికా కణాల మరియు లిగాండ్-బంధిత సిలికా కణాల కణ పరిమాణ పంపిణీలు పటం 3(A)లో చూపబడ్డాయి. ఘనపరిమాణం-ఆధారిత కణ పరిమాణ పంపిణీ వక్రతలు రసాయన మార్పు తర్వాత సిలికా కణాల పరిమాణం పెరిగిందని చూపించాయి (పటం 3A). ప్రస్తుత అధ్యయనం మరియు మునుపటి అధ్యయనం నుండి వచ్చిన సిలికా కణాల కణ పరిమాణ పంపిణీ డేటా పట్టిక 1(A)లో పోల్చబడింది. PMP యొక్క ఘనపరిమాణం-ఆధారిత కణ పరిమాణం, d(0.5), 3.36 μm, దీనిని మా మునుపటి అధ్యయనంలోని ad(0.5) విలువ 3.05 μm (పాలీస్టైరీన్-బంధిత సిలికా కణాలు)34తో పోల్చగా. చర్య మిశ్రమంలో PEG, యూరియా, TMOS, మరియు ఎసిటిక్ ఆమ్లం యొక్క విభిన్న నిష్పత్తుల కారణంగా, మా మునుపటి అధ్యయనంతో పోలిస్తే ఈ బ్యాచ్ ఇరుకైన కణ పరిమాణ పంపిణీని కలిగి ఉంది. PMP దశ యొక్క కణ పరిమాణం, మేము గతంలో అధ్యయనం చేసిన పాలీస్టైరీన్-బంధిత సిలికా కణ దశ కంటే కొద్దిగా పెద్దదిగా ఉంది. దీని అర్థం, స్టైరీన్‌తో సిలికా కణాల ఉపరితల ఫంక్షనలైజేషన్ కేవలం ఒక పాలీస్టైరీన్ పొరను (0.97 µm) మాత్రమే నిక్షేపించింది. సిలికా ఉపరితలంపై, అయితే PMP దశలో పొర మందం 1.38 µm గా ఉంది.
బేర్ సిలికా కణాల మరియు లిగాండ్-బౌండ్ సిలికా కణాల కణ పరిమాణ పంపిణీ (A) మరియు రంధ్ర పరిమాణ పంపిణీ (B).
ప్రస్తుత అధ్యయనంలోని సిలికా కణాల రంధ్ర పరిమాణం, రంధ్ర ఘనపరిమాణం మరియు ఉపరితల వైశాల్యం పట్టిక 1(B)లో ఇవ్వబడ్డాయి. సాధారణ సిలికా కణాలు మరియు లిగాండ్-బంధిత సిలికా కణాల PSD ప్రొఫైల్‌లు చిత్రం 3(B)లో చూపబడ్డాయి. ఫలితాలు మా మునుపటి అధ్యయనంతో పోల్చదగినవి. సాధారణ మరియు లిగాండ్-బంధిత సిలికా కణాల రంధ్ర పరిమాణాలు వరుసగా 310 మరియు 241, ఇది రసాయన మార్పు తర్వాత రంధ్ర పరిమాణం 69 తగ్గుతుందని సూచిస్తుంది, ఇది పట్టిక 1(B)లో చూపబడింది, మరియు వక్రరేఖ యొక్క మార్పు చిత్రం 3(B)లో చూపబడింది. అదేవిధంగా, రసాయన మార్పు తర్వాత సిలికా కణాల రంధ్ర ఘనపరిమాణం 0.67 నుండి 0.58 cm³/gకి తగ్గింది. ప్రస్తుతం అధ్యయనం చేయబడిన సిలికా కణాల నిర్దిష్ట ఉపరితల వైశాల్యం 116 m²/g, ఇది మా మునుపటి అధ్యయనం (124 m²/g)తో పోల్చదగినది. పట్టిక 1(B)లో చూపిన విధంగా, సిలికా కణాల ఉపరితల వైశాల్యం (m²/g) కూడా 116 నుండి తగ్గింది. రసాయన మార్పు తర్వాత m2/g నుండి 105 m2/g వరకు.
స్థిర దశ యొక్క మూలక విశ్లేషణ ఫలితాలు పట్టిక 2లో చూపబడ్డాయి. ప్రస్తుత స్థిర దశ యొక్క కార్బన్ లోడింగ్ 6.35%, ఇది మా మునుపటి అధ్యయనం (పాలీస్టైరీన్ బంధిత సిలికా కణాలు, వరుసగా 7.93%35 మరియు 10.21%) 42 యొక్క కార్బన్ లోడింగ్ కంటే తక్కువ. ప్రస్తుత స్థిర దశ యొక్క కార్బన్ లోడింగ్ తక్కువగా ఉంది, ఎందుకంటే ప్రస్తుత SP తయారీలో, స్టైరీన్‌తో పాటు, ఫినైల్‌మాలిమైడ్-మిథైల్‌వినైల్‌ఐసోసైనెట్ (PCMP) మరియు 4-హైడ్రాక్సీ-టెంపో వంటి కొన్ని ధ్రువ లిగాండ్‌లను ఉపయోగించారు. ప్రస్తుత స్థిర దశ యొక్క నత్రజని బరువు శాతం 2.21%, మునుపటి అధ్యయనాలలో వరుసగా 0.1735 మరియు 0.85% బరువు గల నత్రజనితో పోలిస్తే. దీని అర్థం ఫినైల్‌మాలిమైడ్ కారణంగా ప్రస్తుత స్థిర దశలో నత్రజని బరువు శాతం ఎక్కువగా ఉంది. అదేవిధంగా, ఉత్పత్తులు (4) మరియు (5) యొక్క కార్బన్ లోడింగ్‌లు 2.7% మరియు 2.9%గా ఉన్నాయి. వరుసగా, తుది ఉత్పత్తి (6) యొక్క కార్బన్ లోడింగ్ 6.35%గా ఉంది, ఇది పట్టిక 2లో చూపబడింది. బరువు నష్టాన్ని PMP స్థిర దశతో తనిఖీ చేయబడింది మరియు TGA వక్రరేఖ చిత్రం 4లో చూపబడింది. TGA వక్రరేఖ 8.6% బరువు నష్టాన్ని చూపిస్తుంది, ఇది కార్బన్ లోడింగ్ (6.35%)తో బాగా సరిపోలుతుంది ఎందుకంటే లిగాండ్‌లలో C మాత్రమే కాకుండా N, O మరియు H కూడా ఉంటాయి.
సిలికా కణాల ఉపరితల మార్పు కోసం ఫినైల్‌మాలిమైడ్-మిథైల్‌వినైల్‌ఐసోసయనేట్ లిగాండ్‌ను ఎంచుకున్నారు, ఎందుకంటే దీనిలో ధ్రువ ఫినైల్‌మాలిమైడ్ సమూహాలు మరియు వినైల్‌ఐసోసయనేట్ సమూహాలు ఉన్నాయి. వినైల్ ఐసోసయనేట్ సమూహాలు లివింగ్ రాడికల్ పాలిమరైజేషన్ ద్వారా స్టైరీన్‌తో మరింతగా చర్య జరపగలవు. రెండవ కారణం, విశ్లేష్యంతో మితమైన పరస్పర చర్యను కలిగి ఉండి, విశ్లేష్యానికి మరియు స్థిర దశకు మధ్య బలమైన స్థిర విద్యుత్ పరస్పర చర్య లేని సమూహాన్ని చేర్చడం. ఎందుకంటే సాధారణ pH వద్ద ఫినైల్‌మాలిమైడ్ భాగానికి వర్చువల్ చార్జ్ ఉండదు. స్థిర దశ యొక్క ధ్రువణతను స్టైరీన్ యొక్క సరైన పరిమాణం మరియు ఫ్రీ రాడికల్ పాలిమరైజేషన్ చర్య సమయం ద్వారా నియంత్రించవచ్చు. చర్య యొక్క చివరి దశ (ఫ్రీ-రాడికల్ పాలిమరైజేషన్) చాలా కీలకమైనది మరియు ఇది స్థిర దశ యొక్క ధ్రువణతను మార్చగలదు. ఈ స్థిర దశల యొక్క కార్బన్ లోడింగ్‌ను తనిఖీ చేయడానికి మూలక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. స్టైరీన్ పరిమాణం మరియు చర్య సమయాన్ని పెంచడం వల్ల స్థిర దశ యొక్క కార్బన్ లోడింగ్ పెరుగుతుందని మరియు దీనికి విరుద్ధంగా జరుగుతుందని గమనించబడింది. వివిధ స్టైరీన్ గాఢతలతో తయారు చేయబడిన SPలు వేర్వేరు కార్బన్‌ను కలిగి ఉంటాయి. లోడింగ్‌లు. మళ్ళీ, ఈ స్థిర దశలను స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాలమ్‌లలోకి లోడ్ చేసి, వాటి క్రోమాటోగ్రాఫిక్ పనితీరును (ఎంపిక, రిజల్యూషన్, N విలువ, మొదలైనవి) తనిఖీ చేయండి. ఈ ప్రయోగాల ఆధారంగా, నియంత్రిత ధ్రువణత మరియు మంచి విశ్లేష్య నిలుపుదలని నిర్ధారించడానికి PMP స్థిర దశను తయారు చేయడానికి ఒక ఆప్టిమైజ్డ్ ఫార్ములేషన్‌ను ఎంపిక చేశారు.
ఐదు పెప్టైడ్ మిశ్రమాలను (గ్లై-టైర్, గ్లై-ల్యూ-టైర్, గ్లై-గ్లై-టైర్-ఆర్గ్, టైర్-ఐల్-గ్లై-సెర్-ఆర్గ్, ల్యూసిన్ ఎన్‌కెఫాలిన్) కూడా మొబైల్ ఫేజ్‌ను ఉపయోగించి PMP కాలమ్ ద్వారా మూల్యాంకనం చేశారు; 80 μL/min ప్రవాహ రేటు వద్ద 60/40 (v/v) ఎసిటోనైట్రిల్/నీరు (0.1% TFA). సరైన ఎల్యూషన్ పరిస్థితులలో, ప్రతి కాలమ్‌కు (100 × 1.8 mm id) సిద్ధాంతపరమైన ప్లేట్ సంఖ్య (N) 20,000 ± 100 (200,000 ప్లేట్లు/m²) ఉంటుంది. పట్టిక 3 మూడు PMP కాలమ్‌ల కోసం N విలువలను ఇస్తుంది మరియు క్రోమాటోగ్రామ్‌లు చిత్రం 5Aలో చూపబడ్డాయి. అధిక ప్రవాహ రేటు (700 μL/min) వద్ద PMP కాలమ్‌పై వేగవంతమైన విశ్లేషణలో, ఐదు పెప్టైడ్‌లు ఒక నిమిషంలోపు ఎల్యూట్ చేయబడ్డాయి, N విలువలు చాలా బాగున్నాయి, ప్రతి కాలమ్‌కు (100 × 1.8 mm id) 13,500 ± 330, ఇది 135,000 ప్లేట్లు/m²కు అనుగుణంగా ఉంటుంది (చిత్రం 5B). ఒకే పరిమాణంలో ఉన్న మూడు పునరుత్పత్తిని తనిఖీ చేయడానికి, కాలమ్‌లను (100 × 1.8 మిమీ id) మూడు వేర్వేరు లాట్‌ల PMP స్థిర దశతో నింపారు. ప్రతి కాలమ్‌పై ఒకే పరీక్ష మిశ్రమాన్ని వేరు చేయడానికి, సరైన ఎల్యూషన్ పరిస్థితులు, సిద్ధాంతపరమైన ప్లేట్ల సంఖ్య (N) మరియు నిలుపుదల సమయాన్ని ఉపయోగించి ప్రతి కాలమ్‌కు విశ్లేష్య గాఢతను నమోదు చేశారు. PMP కాలమ్‌ల పునరుత్పత్తి డేటా పట్టిక 4లో చూపబడింది. పట్టిక 3లో చూపిన విధంగా, PMP కాలమ్ యొక్క పునరుత్పత్తి చాలా తక్కువ %RSD విలువలతో బాగా సంబంధం కలిగి ఉంది.
PMP కాలమ్ (B) మరియు అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్ (A) పై పెప్టైడ్ మిశ్రమం యొక్క విభజన; మొబైల్ ఫేజ్ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP కాలమ్ కొలతలు (100 × 1.8 mm id); సమ్మేళనాల ఎల్యూషన్ క్రమం: 1 (గ్లై-టైర్), 2 (గ్లై-ల్యూ-టైర్), 3 (గ్లై-గ్లై-టైర్-ఆర్గ్), 4 (టైర్-ఐల్-గ్లై-సెర్-ఆర్గ్) మరియు 5 (ల్యూసిన్) యాసిడ్ ఎన్‌కెఫాలిన్).
హై పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీలో హ్యూమన్ సీరం ఆల్బుమిన్ యొక్క ట్రిప్టిక్ డైజెస్ట్‌లను వేరు చేయడానికి ఒక PMP కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) మూల్యాంకనం చేయబడింది. చిత్రం 6లోని క్రోమాటోగ్రామ్, నమూనా బాగా వేరు చేయబడిందని మరియు రిజల్యూషన్ చాలా బాగుందని చూపిస్తుంది. HSA డైజెస్ట్‌లను 100 µL/min ప్రవాహ రేటు, 70/30 ఎసిటోనైట్రిల్/నీరు మొబైల్ ఫేజ్ మరియు 0.1% TFA ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. క్రోమాటోగ్రామ్‌లో (చిత్రం 6) చూపిన విధంగా, HSA డైజెషన్ 17 పెప్టైడ్‌లకు అనుగుణంగా 17 పీక్‌లుగా విభజించబడింది. HSA డైజెస్ట్‌లోని ప్రతి పీక్ యొక్క వేరుచేసే సామర్థ్యం లెక్కించబడింది మరియు ఆ విలువలు పట్టిక 5లో ఇవ్వబడ్డాయి.
HSA (100 × 1.8 mm id) యొక్క ట్రిప్టిక్ డైజెస్ట్‌ను PMP కాలమ్‌పై వేరు చేశారు; ప్రవాహ రేటు (100 µL/min), మొబైల్ ఫేజ్ 60/40 అసిటోనైట్రిల్/నీరు 0.1% TFAతో.
ఇక్కడ L అనేది కాలమ్ పొడవు, η అనేది మొబైల్ ఫేజ్ యొక్క స్నిగ్ధత, ΔP అనేది కాలమ్ బ్యాక్ ప్రెజర్, మరియు u అనేది మొబైల్ ఫేజ్ యొక్క రేఖీయ వేగం. PMP కాలమ్ యొక్క పారగమ్యత 2.5 × 10-14 m2, ప్రవాహ రేటు 25 μL/min, మరియు 60/40 v/v ACN/నీరు ఉపయోగించబడింది. PMP కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) యొక్క పారగమ్యత మా మునుపటి అధ్యయనం Ref.34 మాదిరిగానే ఉంది. ఉపరితలంగా రంధ్రాలు గల కణాలతో నింపబడిన కాలమ్ యొక్క పారగమ్యత: 1.3 μm కణాలకు 1.7 × 10-15, 1.7 μm కణాలకు 3.1 × 10-15, 2.6 μm కణాలకు 5.2 × 10-15 మరియు 2.5 × 10-14 m2. μm కణాలు 43. అందువల్ల, PMP దశ యొక్క పారగమ్యత 5 μm కోర్-షెల్ కణాల పారగమ్యతను పోలి ఉంటుంది.
ఇక్కడ Wx అనేది క్లోరోఫామ్‌తో నింపబడిన కాలమ్ యొక్క బరువు, Wy అనేది మెథనాల్‌తో నింపబడిన కాలమ్ యొక్క బరువు, మరియు ρ అనేది ద్రావణి యొక్క సాంద్రత. మెథనాల్ (ρ = 0.7866) మరియు క్లోరోఫామ్ (ρ = 1.484) ల సాంద్రతలు. మేము గతంలో అధ్యయనం చేసిన సిలికా పార్టికల్స్-C18 కాలమ్‌లు (100 × 1.8 mm id) 34 మరియు C18-యూరియా కాలమ్‌లు 31 యొక్క మొత్తం పోరోసిటీ వరుసగా 0.63 మరియు 0.55. దీని అర్థం యూరియా లిగాండ్‌ల ఉనికి స్థిర దశ యొక్క పారగమ్యతను తగ్గిస్తుంది. మరోవైపు, PMP కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) యొక్క మొత్తం పోరోసిటీ 0.60. C18-రకం స్థిర దశలలో C18 లిగాండ్‌లు జతచేయబడి ఉంటాయి కాబట్టి, C18-బంధిత సిలికా కణాలతో నింపబడిన కాలమ్‌ల కంటే PMP కాలమ్‌ల పారగమ్యత తక్కువగా ఉంటుంది. సిలికా కణాలు సరళ గొలుసులుగా ఉంటాయి, అయితే పాలీస్టైరిన్-రకం స్థిర దశలలో, దాని చుట్టూ సాపేక్షంగా మందపాటి పాలిమర్ పొర ఏర్పడుతుంది. ఒక సాధారణ ప్రయోగంలో, కాలమ్ పోరోసిటీని ఈ విధంగా లెక్కిస్తారు:
పటం 7A,B లు వాన్ డీమ్టర్ ప్లాట్ యొక్క ఒకే రకమైన ఎల్యూషన్ పరిస్థితులను (అనగా, 60/40 ACN/H2O మరియు 0.1% TFA) ఉపయోగించి PMP కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) మరియు అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) లను చూపుతాయి. ఎంపిక చేసిన పెప్టైడ్ మిశ్రమాలను (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL/లో తయారు చేశారు. రెండు కాలమ్‌లకు కనీస ప్రవాహ రేటు 800 µL/min. PMP కాలమ్ మరియు అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్ కోసం సరైన ప్రవాహ రేటు (80 µL/min) వద్ద కనీస HETP విలువలు వరుసగా 2.6 µm మరియు 3.9 µm. HETP విలువలు వాణిజ్యపరంగా లభించే అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) కంటే PMP కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) యొక్క విభజన సామర్థ్యం చాలా మెరుగ్గా ఉందని సూచిస్తున్నాయి. పటం 7(A)లోని వాన్ డీమ్టర్ ప్లాట్ N విలువలో తగ్గుదలను చూపిస్తుంది. మా మునుపటి అధ్యయనంతో పోలిస్తే ప్రవాహం పెరగడంతో గణనీయమైన తేడా లేదు. ప్రస్తుత పనిలో ఉపయోగించిన కణాల ఆకారం, పరిమాణం మరియు సంక్లిష్ట కాలమ్ ప్యాకింగ్ విధానాలలో మెరుగుదలల ఆధారంగా Ascentis Express RP-Amide కాలమ్‌తో పోలిస్తే PMP కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) యొక్క అధిక విభజన సామర్థ్యం ఉంది34.
(A) 0.1% TFA తో 60/40 ACN/H2O లో PMP కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) ఉపయోగించి పొందిన వాన్ డీమ్టర్ ప్లాట్ (HETP వర్సెస్ మొబైల్ ఫేజ్ లీనియర్ వెలాసిటీ). (B) 0.1% TFA తో 60/40 ACN/H2O లో అసెంటిస్ ఎక్స్‌ప్రెస్ RP-అమైడ్ కాలమ్ (100 × 1.8 mm id) ఉపయోగించి పొందిన వాన్ డీమ్టర్ ప్లాట్ (HETP వర్సెస్ మొబైల్ ఫేజ్ లీనియర్ వెలాసిటీ).
హై పర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీలో సింథటిక్ పెప్టైడ్ మిశ్రమాలు మరియు హ్యూమన్ సీరం అల్బుమిన్ (HAS) యొక్క ట్రిప్సిన్ డైజెస్ట్‌లను వేరు చేయడానికి, పోలార్-ఎంబెడెడ్ పాలీస్టైరీన్ స్టేషనరీ ఫేజ్‌ను తయారు చేసి, మూల్యాంకనం చేయడం జరిగింది. పెప్టైడ్ మిశ్రమాల కోసం PMP కాలమ్‌ల క్రోమాటోగ్రాఫిక్ పనితీరు, వేరుచేసే సామర్థ్యం మరియు రిజల్యూషన్‌లో అద్భుతంగా ఉంది. PMP కాలమ్‌ల మెరుగైన వేరుచేసే పనితీరుకు సిలికా కణాల పరిమాణం మరియు రంధ్రాల పరిమాణం, స్టేషనరీ ఫేజ్ యొక్క నియంత్రిత సంశ్లేషణ, మరియు సంక్లిష్టమైన కాలమ్ ప్యాకింగ్ వంటి అనేక కారణాలు ఉన్నాయి. అధిక వేరుచేసే సామర్థ్యంతో పాటు, అధిక ఫ్లో రేట్ల వద్ద తక్కువ కాలమ్ బ్యాక్ ప్రెజర్ ఉండటం ఈ స్టేషనరీ ఫేజ్ యొక్క మరో ప్రయోజనం. PMP కాలమ్‌లు మంచి పునరుత్పత్తి సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శిస్తాయి మరియు పెప్టైడ్ మిశ్రమాల విశ్లేషణకు, అలాగే వివిధ ప్రోటీన్‌ల ట్రిప్సిన్ డైజెషన్‌కు ఉపయోగించవచ్చు. లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీలో సహజ ఉత్పత్తులు, ఔషధ మొక్కల నుండి లభించే బయోయాక్టివ్ సమ్మేళనాలు మరియు శిలీంధ్రాల సారాలను వేరు చేయడానికి ఈ కాలమ్‌ను ఉపయోగించాలని మేము భావిస్తున్నాము. భవిష్యత్తులో, ప్రోటీన్లు మరియు మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీలను వేరు చేయడానికి కూడా PMP కాలమ్‌లను మూల్యాంకనం చేయడం జరుగుతుంది.
ఫీల్డ్, JK, యూర్‌బై, MR, లా, J., థోగర్సెన్, H. & పీటర్సన్, P. రివర్స్డ్ ఫేజ్ క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా పెప్టైడ్ విభజన వ్యవస్థలపై పరిశోధన భాగం I: కాలమ్ క్యారెక్టరైజేషన్ ప్రోటోకాల్ అభివృద్ధి. J. క్రోమాటోగ్రఫీ. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
గోమెజ్, బి. మరియు ఇతరులు. అంటు వ్యాధుల చికిత్స కోసం రూపొందించిన మెరుగైన క్రియాశీల పెప్టైడ్‌లు. బయోటెక్నాలజీ. అడ్వాన్స్‌డ్. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
వ్లీఘే, పి., లిసోవ్స్కీ, వి., మార్టినెజ్, జె. & ఖ్రెస్ట్‌చాటిస్కీ, ఎం. సింథటిక్ థెరప్యూటిక్ పెప్టైడ్స్: సైన్స్ మరియు మార్కెట్. డ్రగ్ డిస్కవరీ. 15 (1-2) టుడే, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
క్సీ, ఎఫ్., స్మిత్, ఆర్.డి & షెన్, వై. అడ్వాన్స్‌డ్ ప్రోటియోమిక్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ. జె. క్రోమాటోగ్రఫీ.ఎ 1261, 78–90 (2012).
లియు, W. మరియు ఇతరులు. అధునాతన లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ విస్తృతంగా లక్ష్యంగా చేసుకున్న మెటాబోలోమిక్స్ మరియు ప్రోటీయోమిక్స్ యొక్క ఏకీకరణను అనుమతిస్తుంది. ఆనస్.చిమ్.ఆక్టా 1069, 89–97 (2019).
చెస్నట్, SM & సాలిస్‌బరీ, JJ ఔషధ అభివృద్ధిలో UHPLC పాత్ర. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
వు, ఎన్. & క్లాసెన్, ఎ.ఎం. వేగవంతమైన విభజనల కోసం అల్ట్రాహై ప్రెజర్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ యొక్క ప్రాథమిక మరియు ఆచరణాత్మక అంశాలు. జె. సెప్. సై. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
రెన్, SA & చెలిట్చెఫ్, P. ఔషధ అభివృద్ధిలో అల్ట్రా-హై పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ యొక్క అనువర్తనం. J. క్రోమాటోగ్రఫీ. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
గు, హెచ్. మరియు ఇతరులు. ఎంటరోవైరస్‌ల సమర్థవంతమైన శుద్ధీకరణ కోసం ఆయిల్-ఇన్-వాటర్ అధిక అంతర్గత దశ ఎమల్షన్‌ల నుండి తయారు చేయబడిన మోనోలిథిక్ మాక్రోపోరస్ హైడ్రోజెల్‌లు. కెమికల్.బ్రిటన్.జె. 401, 126051 (2020).
షి, వై., జియాంగ్, ఆర్., హోర్వాత్, సి. & విల్కిన్స్, జెఎ ప్రోటీయోమిక్స్‌లో లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ పాత్ర. జె. క్రోమాటోగ్రఫీ.ఎ 1053(1-2), 27-36 (2004).
ఫెకెటే, ఎస్., వూతే, జె.-ఎల్. & గిల్లార్మ్, డి. చికిత్సా పెప్టైడ్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌ల రివర్స్డ్-ఫేజ్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ విభజనలలో అభివృద్ధి చెందుతున్న పోకడలు: సిద్ధాంతం మరియు అనువర్తనాలు. జె. ఫార్మసీ. బయోమెడికల్ సైన్స్. ఆనస్. 69, 9-27 (2012).
గిలార్, ఎం., ఒలివోవా, పి., డాలీ, ఏఈ & గెబ్లర్, జేసీ మొదటి మరియు రెండవ విభజన కొలతలలో వేర్వేరు pH విలువలను ఉపయోగించి RP-RP-HPLC వ్యవస్థను ఉపయోగించి పెప్టైడ్‌ల ద్విమితీయ విభజన. జె. సెప్. సై. 28(14), 1694-1703 (2005).
ఫెలెట్టి, S. మరియు ఇతరులు. C18 సబ్-2 μm పూర్తిగా మరియు ఉపరితలంగా రంధ్రాలు గల కణాలతో నింపబడిన అధిక-సామర్థ్యం గల క్రోమాటోగ్రాఫిక్ కాలమ్‌ల యొక్క ద్రవ్యరాశి బదిలీ లక్షణాలు మరియు గతిశాస్త్ర పనితీరును పరిశోధించారు. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
పియోవెసానా, ఎస్. మరియు ఇతరులు. మొక్కల జీవక్రియాశీల పెప్టైడ్‌ల ఐసోలేషన్, ఐడెంటిఫికేషన్ మరియు వాలిడేషన్‌లో ఇటీవలి పోకడలు మరియు విశ్లేషణాత్మక సవాళ్లు. అనస్.బయోలాజికల్ అనస్.కెమికల్.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
ముల్లర్, JB మరియు ఇతరులు. జీవరాజ్యం యొక్క ప్రోటీయోమిక్ స్వరూపం. నేచర్ 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
డిలూకా, సి. మరియు ఇతరులు. ప్రిపరేటివ్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా చికిత్సా పెప్టైడ్‌ల డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రాసెసింగ్. మాలిక్యూల్ (బాసెల్, స్విట్జర్లాండ్) 26(15), 4688(2021).
యాంగ్, వై. & గెంగ్, ఎక్స్. మిక్స్డ్-మోడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు బయోపాలిమర్లకు దాని అనువర్తనం. జె. క్రోమాటోగ్రఫీ.ఎ 1218(49), 8813–8825 (2011).
ఝావో, జి., డాంగ్, ఎక్స్.-వై. & సన్, వై. మిక్స్డ్-మోడ్ ప్రోటీన్ క్రోమాటోగ్రఫీ కోసం లిగాండ్‌లు: సూత్రం, లక్షణీకరణ మరియు రూపకల్పన. జె. బయోటెక్నాలజీ. 144(1), 3-11 (2009).